CN115677672B - 一种四氢咔唑-1-甲酰胺类衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种四氢咔唑-1-甲酰胺类衍生物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种四氢咔唑‑1‑甲酰胺类衍生物及其制备方法和应用，属于药物化学技术领域。本发明提供的四氢咔唑‑1‑甲酰胺类衍生物对组蛋白去甲基化酶PHF8的抑制具备有效性，同时对高表达PHF8蛋白的肿瘤细胞体外以及体内杀伤具备有效性，且安全性好。

Description

一种四氢咔唑-1-甲酰胺类衍生物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及药物化学技术领域，尤其涉及一种四氢咔唑-1-甲酰胺类衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
组蛋白去甲基化酶PHF8是JMJC结构域去甲基化酶家族的一个成员，也称为KDM7B，可以以组蛋白H3K9me/me2、H3K27me2或H4K20me1作为底物，在亚铁离子、α-酮戊二酸和氧存在的条件下，催化底物赖氨酸残基epsilon位N原子上甲基的去甲基反应。同时，组蛋白去甲基化酶PHF8也被报道在多种肿瘤中高度异常表达，具有促进肿瘤增殖的功能，成为优异的潜在抗肿瘤药物靶标之一，如目前被报道与PHF8高度表达密切相关的癌症包括前列腺癌(PrCa)、急性早幼粒细胞白血病(APL)、成人急性淋巴细胞白血病(ALL)、食道鳞状细胞癌(ESCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、胃癌、结直肠癌(CRC)和肝细胞癌(HCC)。
目前，组蛋白去甲基化酶PHF8的抑制剂仅有一种穿膜短肽类抑制剂被报道(Chembiochem.2017,18(14):1369-1375)，还没有特异性的小分子抑制剂被发现。
发明内容
本发明的目的在于提供一种四氢咔唑-1-甲酰胺类衍生物及其制备方法和应用，本发明提供的四氢咔唑-1-甲酰胺类衍生物对组蛋白去甲基化酶PHF8的抑制具备有效性，同时对高表达PHF8蛋白的肿瘤细胞体外以及体内杀伤具备有效性，且安全性好。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种四氢咔唑-1-甲酰胺类衍生物，具有式I所示结构：
本发明提供了上述技术方案所述四氢咔唑-1-甲酰胺类衍生物的制备方法，包括以下步骤：
将2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-胺、1,4,5,6-四氢环戊并[c]吡唑-3-羧酸、活化剂、缩合剂、有机碱试剂与有机溶剂混合，进行缩合反应，得到具有式I所示结构的四氢咔唑-1-甲酰胺类衍生物。
优选地，所述缩合反应的温度为15～35℃，时间为3～5h。
优选地，所述2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-胺的制备方法，包括以下步骤：
将4-(1H-吲哚-3-基)丁酸、多聚磷酸与甲苯混合，进行分子内环化反应，得到2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-酮；
将所述2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-酮、盐酸羟胺、乙酸钠、水与乙醇混合，进行取代反应，得到2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-酮肟；
将所述2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-酮肟、氢化铝锂与四氢呋喃混合，进行还原反应，得到2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-胺。
优选地，所述分子内环化反应在回流条件下进行，所述分子内环化反应的时间为6～8h。
优选地，所述取代反应的温度为75～85℃，时间为1.5～2.5h。
优选地，所述还原反应在回流条件下进行，所述还原反应的时间为7～9h。
本发明提供了上述技术方案所述四氢咔唑-1-甲酰胺类衍生物在制备组蛋白去甲基化酶PHF8抑制剂中的应用。
本发明提供了上述技术方案所述四氢咔唑-1-甲酰胺类衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选地，所述肿瘤包括宫颈癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、肝癌或食道癌。
本发明提供了一种四氢咔唑-1-甲酰胺类衍生物，所述四氢咔唑-1-甲酰胺类衍生物(记为化合物WR-089)对组蛋白去甲基化酶PHF8的抑制具备有效性，同时对高表达PHF8蛋白的肿瘤细胞体外以及体内杀伤具备有效性。应用例的结果显示，本发明提供的化合物WR-089对PHF8体外的酶活性半抑制浓度(IC50值)为4.23μM，表明其对PHF8的抑制具备有效性。在抗肿瘤的有效性方面，本发明测定了化合物WR-089对19种高度异常表达PHF8蛋白的肿瘤细胞(涵盖宫颈癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、肝癌以及食道癌)的体外杀伤能力，其有效半抑制浓度(EC50值)为3～92μM，表明该化合物对于此类高表达PHF8的肿瘤细胞具有广泛的抗肿瘤增殖能力。同时，对于正常的肠上皮细胞CCC-HIE-2的抗增殖能力则显著降低(表现为EC50值显著增加，为302μM)，表明该化合物对于高表达PHF8蛋白的多种人源肿瘤细胞系都具备有效的体外抗肿瘤活性，同时对正常人源细胞具备选择性。在对化合物WR-089的体内有效性评价方面，本发明利用HeLa细胞的裸鼠移植瘤模型，通过腹腔注射给药方式(在100mg/kg剂量、每日1次的条件下，给药15天或30天)，可以显著地抑制在小鼠皮下的肿瘤增殖，表明该化合物具备体内抗肿瘤增殖的有效性。而且在实验过程中，小鼠并没有因给药而出现明显的体重减轻现象，表明该化合物在体内对正常细胞的杀伤性较低，具备良好的体内安全性。
附图说明
图1为2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-酮的氢谱图；
图2为2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-酮的碳谱图；
图3为2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-酮肟的氢谱图；
图4为2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-酮肟的碳谱图；
图5为2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-胺的氢谱图；
图6为2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-胺的碳谱图；
图7为化合物WR-089的氢谱图；
图8为化合物WR-089的质谱图；
图9为化合物WR-089的液相色谱图；
图10为PHF8纯化以及体外活性定量测试的路线图；
图11为PHF8的体外去甲基化酶活性检测结果图；
图12为化合物WR-089对PHF8的体外抑制的IC50值测定结果图；
图13为化合物WR-089对19种肿瘤细胞系以及正常肠上皮细胞系CCC-HIE-2的EC50值测定结果图；
图14为HeLa细胞的裸鼠成瘤实验结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种四氢咔唑-1-甲酰胺类衍生物，具有式I所示结构：
本发明提供的四氢咔唑-1-甲酰胺类衍生物化学名称为N-(2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-基)-1,4,5,6-四氢环戊并[c]吡唑-3-甲酰胺(简称为化合物WR-089)。
本发明提供了上述技术方案所述四氢咔唑-1-甲酰胺类衍生物的制备方法，包括以下步骤：
将2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-胺、1,4,5,6-四氢环戊并[c]吡唑-3-羧酸、活化剂、缩合剂、有机碱试剂与有机溶剂混合，进行缩合反应，得到具有式I所示结构的四氢咔唑-1-甲酰胺类衍生物。
在本发明中，若无特殊说明，所用制备原料均为本领域技术人员熟知的市售商品。
在本发明，所述2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-胺的制备方法，优选包括以下步骤：
将4-(1H-吲哚-3-基)丁酸、多聚磷酸与甲苯混合，进行分子内环化反应，得到2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-酮；
将所述2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-酮、盐酸羟胺、乙酸钠、水与乙醇混合，进行取代反应，得到2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-酮肟；
将所述2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-酮肟、氢化铝锂与四氢呋喃混合，进行还原反应，得到2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-胺。
在本发明中，制备所述四氢咔唑-1-甲酰胺类衍生物的反应路线如下所示：
下面结合上述反应路线对所述四氢咔唑-1-甲酰胺类衍生物的制备方法进行说明。
本发明将4-(1H-吲哚-3-基)丁酸(化合物1)、多聚磷酸(PPA)与甲苯混合，进行分子内环化反应，得到2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-酮(化合物2)。在本发明中，所述4-(1H-吲哚-3-基)丁酸与多聚磷酸的摩尔比优选为1：(1～1.5)，更优选为1:1.2；所述多聚磷酸具有强脱水性，在反应中使4-(1H-吲哚-3-基)丁酸脱去一分子水，达到分子内环化的目的。在本发明中，所述甲苯作为反应溶剂，其用量没有特殊限定，能够保证分子内环化反应顺利进行即可。在本发明中，所述4-(1H-吲哚-3-基)丁酸、多聚磷酸与甲苯混合，优选是将4-(1H-吲哚-3-基)丁酸的甲苯溶液与多聚磷酸混合。
在本发明中，所述分子内环化反应优选在回流条件下进行，所述分子内环化反应的时间优选为6～8h，更优选为7h；本发明优选通过TLC监测反应进程，按体积比计，所用展开剂优选为正己烷：乙酸乙酯＝2：1。
所述分子内环化反应后，本发明优选将所得产物体系冷却至室温，分离出产物体系中的有机层进行减压浓缩，将残余物加水稀释，在室温条件下搅拌10～15h，以使未反应的多聚磷酸充分溶解于水相中；将所得混合物用乙酸乙酯萃取，有机层依次用水与饱和食盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥后过滤，减压浓缩滤液，得到粗产物，采用硅胶柱色谱法将所述粗产物进行纯化，最终得到2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-酮，为白色固体。在本发明的实施例中，所述室温具体为25℃。在本发明中，按体积比计，所述纯化采用的洗脱剂优选为正己烷：乙酸乙酯＝5：1。
得到2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-酮后，本发明将所述2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-酮、盐酸羟胺、乙酸钠、水与乙醇混合，进行取代反应，得到2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-酮肟(化合物3)。在本发明中，所述2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-酮、盐酸羟胺与乙酸钠的摩尔比优选为1：(1.8～2.2)：(2.8～3.2)，更优选为1：2：3；所述盐酸羟胺是作为制备肟基团的原料，所述乙酸钠的作用是提供弱碱性的合成反应条件。在本发明中，所述水与乙醇的体积比优选为1：(1～2)，更优选为1：1.5；所述水与乙醇作为反应溶剂，二者总用量没有特殊限定，能够保证取代反应顺利进行即可。在本发明中，所述2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-酮、盐酸羟胺、乙酸钠、水与乙醇混合，优选是在搅拌条件下，向2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-酮的乙醇溶液中加入盐酸羟胺的水溶液和乙酸钠的水溶液，所述盐酸羟胺的水溶液和乙酸钠的水溶液的加入方式优选为滴加，更优选为逐滴加入，具体是首先将乙酸钠的水溶液逐滴加入至2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-酮的乙醇溶液中，滴加完毕后，再将盐酸羟胺的水溶液逐滴加入至体系中。本发明对所述搅拌的速率没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的搅拌速率即可。
在本发明中，所述取代反应的温度优选为75～85℃，更优选为80℃；时间优选为1.5～2.5h，更优选为2h，所述取代反应的时间具体是以盐酸羟胺的水溶液和乙酸钠的水溶液均滴加完毕开始计。在本发明中，所述取代反应优选在搅拌条件下进行，本发明对所述搅拌的速率没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的搅拌速率即可。
所述取代反应后，本发明优选将所得产物体系冷却至室温，之后进行减压浓缩，将残余物加水稀释，将所得混合物用乙酸乙酯萃取，有机层用饱和食盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥后过滤，减压浓缩滤液，最终得到2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-酮肟，为褐色固体。
得到2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-酮肟后，本发明将所述2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-酮肟、氢化铝锂(LiAlH4)与四氢呋喃混合，进行还原反应，得到2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-胺(化合物4)。在本发明中，所述2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-酮肟与氢化铝锂的摩尔比优选为1：(1.8～2.2)，更优选为1：2；所述氢化铝锂的作用是作为还原剂还原碳氮双键。在本发明中，所述四氢呋喃作为反应溶剂，用量没有特殊限定，能够保证还原反应顺利进行即可。在本发明中，所述2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-酮肟、氢化铝锂与四氢呋喃混合，优选是向2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-酮肟的四氢呋喃溶液中加入氢化铝锂的四氢呋喃溶液，所述氢化铝锂的四氢呋喃溶液的加入方式优选为滴加，更优选逐滴加入。
在本发明中，所述还原反应优选在回流条件下进行，所述还原反应的时间优选为7～9h，更优选为8h；所述还原反应的时间具体是以氢化铝锂的四氢呋喃溶液滴加完毕开始计。在本发明中，所述还原反应优选在搅拌条件下进行，本发明对所述搅拌的速率没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的搅拌速率即可。在本发明中，所述还原反应优选在保护气氛中进行，本发明对提供所述保护气氛的保护气体种类没有特殊限定，具体可以为氩气。
所述还原反应后，本发明优选将所得产物体系冷却至0℃，加入十水合硫酸钠淬灭过量的LiAlH4，之后采用硅藻土将所得体系进行过滤，用乙酸乙酯洗涤虑饼后，将过滤所得滤液以及洗涤滤饼所得洗涤液合并进行减压浓缩，得到粗产物，采用硅胶柱色谱法将所述粗产物进行纯化，最终得到2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-胺，为棕色固体。在本发明中，按体积比计，所述纯化采用的洗脱液优选为二氯甲烷：甲醇＝20：1。
得到2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-胺后，本发明将所述2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-胺、1,4,5,6-四氢环戊并[c]吡唑-3-羧酸(化合物5)、活化剂、缩合剂、有机碱试剂与有机溶剂混合，进行缩合反应，得到具有式I所示结构的四氢咔唑-1-甲酰胺类衍生物(化合物WR-089)。本发明可以采用1-羟基苯并三氮唑(HOBt)作为活化剂、乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)作为缩合剂，也可以采用2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯同时作为活化剂和缩合剂；优选采用HOBt和EDCI。在本发明中，所述有机碱试剂优选包括三乙胺或N,N-二异丙基乙胺，所述有机碱试剂能够为反应提供碱性环境。在本发明中，所述2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-胺、1,4,5,6-四氢环戊并[c]吡唑-3-羧酸、HOBt、EDCI与有机碱试剂的摩尔比优选为1：(0.9～1.1)：(1.0～1.2)：(1.0～1.2)：(2.8～3.2)，更优选为1：1：1.1：1.1：3。在本发明中，所述有机溶剂优选包括二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃或N,N-二甲基甲酰胺，更优选为二氯甲烷；所述有机溶剂的用量没有特殊限定，能够保证缩合反应顺利进行即可。本发明对所述2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-胺、1,4,5,6-四氢环戊并[c]吡唑-3-羧酸、活化剂、缩合剂、有机碱试剂与有机溶剂混合的方式没有特殊限定，能够将各组分混合均匀即可。
在本发明中，所述缩合反应的温度优选为15～35℃，更优选为20～30℃，具体可以在室温条件下进行；所述缩合反应的时间优选为3～5h，更优选为4h。在本发明中，所述缩合反应优选在搅拌条件下进行，本发明对所述搅拌的速率没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的搅拌速率即可。本发明优选通过TLC监测反应进程，按体积比计，所用展开剂优选为正己烷：乙酸乙酯＝1：1。
所述缩合反应后，本发明优选加水淬灭反应，之后将所得产物体系进行减压浓缩，将残余物溶于乙酸乙酯中，依次用饱和NaHCO3水溶液、饱和NH4Cl水溶液与饱和食盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥后过滤，减压浓缩滤液，得到粗产物，采用硅胶柱色谱法将所述粗产物进行纯化，最终得到化合物WR-089，为白色固体。在本发明中，按体积比计，所述纯化采用的洗脱液优选为正己烷：乙酸乙酯＝2：1。
在本发明中，制备化合物WR-089的各反应步骤中，涉及到采用TLC监测反应进程时，具体是采用TLC硅胶板60-F254，通过在254nm紫外线(UV)下进行观察判断反应进程；涉及到减压浓缩去除有机溶剂时，具体是采用旋转蒸发仪在减压条件下进行。本发明采用BrukerAV600 NMR光谱仪测定各中间产物以及目标产物的NMR光谱数据，其中，化学位移(δ)以ppm为单位；多重性以单峰(s)、双峰(d)、三重峰(t)、四重峰(q)、多重峰(m)和宽峰(br)显示；耦合常数J以Hz(±0.5Hz)显示；采用Thermo Q Exactive质谱仪测定高分辨率质谱数据；通过分析型反相HPLC(Agilent 1260)测定各中间产物以及目标产物的纯度均≥95％，其中，反相HPLC在COSMOSIL预装柱进行(5C18-MS-II，4.6ID×250mm，5μm)，流动相为水(A)和乙腈(B)，按体积比计，水：乙腈＝40：60，流速为1mL/min，色谱溶剂无需蒸馏即可使用。
本发明提供了上述技术方案所述四氢咔唑-1-甲酰胺类衍生物在制备组蛋白去甲基化酶PHF8抑制剂中的应用。
本发明提供了上述技术方案所述四氢咔唑-1-甲酰胺类衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。在本发明中，所述肿瘤优选包括宫颈癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、肝癌或食道癌。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
制备N-(2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-基)-1,4,5,6-四氢环戊并[c]吡唑-3-甲酰胺(化合物WR-089)，包括以下步骤：
(1)制备2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-酮(化合物2)：将多聚磷酸(PPA，10g，29.7mmol，1.2当量)与4-(1H-吲哚-3-基)丁酸(化合物1，5g，24.6mmol，1.0当量)的甲苯(40mL)溶液混合，将所得混合物在回流条件下搅拌反应7h，通过TLC监测反应进程，按体积比计，所用展开剂为正己烷：乙酸乙酯＝2：1；反应完成后，将所得产物体系冷却至室温(25℃)，分离出产物体系中的有机层进行减压浓缩，得到棕色油残余物，将所述棕色油残余物加水(200mL)稀释，并在室温条件下搅拌过夜(12h)，以使未反应的多聚磷酸充分溶解于水相中，将所得混合物用乙酸乙酯(3×50mL)萃取，合并有机层，依次用水(20mL)与饱和食盐水(20mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥后过滤，减压浓缩滤液，得到粗产物，采用硅胶柱色谱法将所述粗产物进行纯化，按体积比计，所用洗脱液为正己烷：乙酸乙酯＝5：1，最终得到的白色固体为2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-酮，产量为2.3g，收率为50.48％。
1HNMR(600MHz，DMSO-d6)δ11.58(br s，1H)，7.66(d，J＝8.44Hz，1H)，7.40(d，J＝8.44Hz，1H)，7.30(ddd，J＝8.11，7.02，1.01Hz，1H)，7.08(ddd，J＝8.11，7.02，1.01Hz，1H)，2.95(t，J＝6.05Hz，2H)，2.11-2.20(m，2H)，2.52-2.60(m，2H)；13C NMR(151MHz，DMSO-d6)191.0，138.4，131.6，128.6，126.7，125.7，121.6，20.2，113.2，38.6，25.2，21.3；HRMS(m/z)：186.09[M+H]。
图1为2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-酮的氢谱图，图2为2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-酮的碳谱图。
(2)制备2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-酮肟(化合物3)：在搅拌条件下，向2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-酮(2.3g，12.43mmol，1.0当量)的乙醇(30mL)溶液中依次逐滴加入乙酸钠(3.04g，37.30mmol，3.0当量)的水(10mL)溶液和盐酸羟胺(1.73g，24.86mmol，2.0当量)的水(10mL)溶液，滴加完毕后在80℃条件下搅拌反应2h；反应完成后，将所得产物体系冷却至室温，之后进行减压浓缩，将残余物加水(50mL)稀释，将所得混合物用乙酸乙酯(2×15mL)萃取，合并有机层，用饱和食盐水(20mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥后过滤，减压浓缩滤液，得到的褐色固体为2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-酮肟，产量为2.32g，收率为92.76％。
1H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ11.01-11.14(m，1H)，10.83-10.98(m，1H)，7.54(dd，J＝8.16，12.75Hz，1H)，7.32-7.49(m，1H)，7.09-7.20(m，1H)，6.94-7.05(m，1H)，2.82(t，J＝5.96Hz，1H)，2.75(t，J＝5.96Hz，1H)，2.70(t，J＝6.33Hz，1H)，2.51-2.56(m，1H)，1.96(quin，J＝5.96Hz，1H)，1.90(quin，J＝5.96Hz，1H)；13CNMR(151MHz，DMSO-d6)δ148.7，145.8，137.5，129.7，126.8，123.2，119.1，117.0，112.0，23.2，23.1，20.9；HRMS(m/z)：201.10[M+H]。
图3为2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-酮肟的氢谱图，图4为2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-酮肟的碳谱图。
(3)制备2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-胺(化合物4)：在氮气保护条件下，向2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-酮肟(2.32g，11.6mmol，1.0当量)的四氢呋喃(50mL)溶液中逐滴加入LiAlH4的四氢呋喃溶液(70mL，LiAlH4的浓度为2.5M，15.0当量)，滴加完毕后，在回流条件下搅拌反应8h；将所得反应体系冷却至0℃，加入十水合硫酸钠淬灭过量的LiAlH4(加入十水合硫酸钠后体系中产生大量气泡，至停止鼓泡再进行后续操作)，采用硅藻土将所得体系进行过滤，用乙酸乙酯洗涤滤饼2次，将过滤所得滤液以及洗涤滤饼所得洗涤液合并进行减压浓缩，得到粗产物，采用硅胶柱色谱法将所述粗产物进行纯化，按体积比计，所用洗脱液为二氯甲烷：甲醇＝20：1，最终得到的棕色固体为2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-胺，产量为1.92g，产率为89.03％。
1HNMR(600MHz，DMSO-d6)δ10.88(br s，1H)，7.34(d，J＝7.70Hz，1H)，7.28(d，J＝8.07Hz，1H)，7.00(t，J＝7.24Hz，1H)，6.92(t，J＝7.63Hz，1H)，4.00(brt，J＝5.78Hz，1H)，3.36-3.53(m，1H)，2.59(br t，J＝5.87Hz，2H)，2.00-2.10(m，1H)，1.96(dt，J＝7.52，5.32Hz，1H)，1.65-1.78(m，1H)，1.58(qd，J＝10.12，2.11Hz，1H)；13C NMR(151MHz，DMSO-d6)δ137.9，136.2，127.2，121.1，118.6，118.3，111.4，109.4，45.7，33.5，21.3，21.2；HRMS(m/z)：187.12[M+H]。
图5为2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-胺的氢谱图，图6为2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-胺的碳谱图。
(4)制备化合物WR-089：将2,3,4,9-四氢-1H-咔唑-1-胺(1.92g，6mmol，1.0当量)、1,4,5,6-四氢环戊并[c]吡唑-3-羧酸(化合物5，0.91g，6mmol，1.0当量)、1-羟基苯并三氮唑(HOBt，0.89g，6.6mmol，1.1当量)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI，1.26g，6.6mmol，1.1当量)、三乙胺(1.82g，18mmol，3.0当量)与二氯甲烷(DCM，40mL)混合，将所得混合物在室温条件下搅拌反应4h，通过TLC监测反应进程，按体积比计，所用展开剂为正己烷：乙酸乙酯＝1：1，之后加水(1mL)淬灭反应；将所得产物体系进行减压浓缩，将残余物溶于乙酸乙酯(50mL)中，依次用饱和NaHCO3水溶液(20mL)、饱和NH4Cl水溶液(20mL)与饱和食盐水(20mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥后过滤，减压浓缩滤液，得到粗产物，采用硅胶柱色谱法将所述粗产物进行纯化，按体积比计，所用洗脱液为正己烷：乙酸乙酯＝2：1，最终得到的白色固体为化合物WR-089，产量为1.12g，收率为58.2％。
1HNMR(600MHz，DMSO-d6)δ12.61-12.82(m，1H)，10.59-10.84(m，1H)，7.72-8.11(m，1H)，7.36-7.46(m，1H)，7.27-7.33(m，1H)，7.01-7.08(m，1H)，6.91-6.99(m，1H)，5.28(brs，1H)，3.37(s，8H)，2.67-2.78(m，4H)，2.56-2.66(m，2H)，2.46-2.56(m，3H)，2.31-2.41(m，1H)，2.05(brs，1H)，1.91-2.02(m，2H)，1.84-1.91(m，1H)，1.83(br s，1H)；13C NMR(151MHz，DMSO-d6)δ162.3，161.5，159.1，151.5，140.4，136.6，134.5，134.0，131.1，127.2，127.1，126.3，121.5，121.3，118.8，118.7，118.3，111.7，111.6，111.0，110.8、60.2、60.0、43.5、43.0、40.5、31.4、31.0、30.9、30.4、24.3、23.9、23.7、23.6、23.2、21.3、21.2、21.1、21.0、14.6；HRMS(m/z)：321.17[M+H]。
图7为化合物WR-089的氢谱图，图8为化合物WR-089的质谱图。
经反相HPLC检测，产物的保留时间t＝6.352～6.353min，纯度为99.2～99.3％。图9为化合物WR-089的液相色谱图，其中，上方为254nm检测波长条件下液相色谱图，产物纯度显示为99.3％；下方为210nm检测波长条件下液相色谱图，产物纯度显示为99.2％。具体结果列于表1中。
表1化合物WR-089的液相色谱图对应的数据
应用例1
图10为本发明中PHF8纯化以及体外活性定量测试的路线图，包括纯化具有活性的PHF8、建立体外定量测定PHF8体外去甲基化酶活性的方法、测定化合物WR-089对PHF8的IC50值、测定化合物WR-089对肿瘤细胞的EC50值，最终证实化合物WR-089具有体内抗肿瘤增殖能力，下面进行详细说明。
一、PHF8的原核表达载体构建与纯化
1、在UCSC Genome Browser网站，根据GRCh38/hg38基因组查找人源基因PHF8，根据NCBI的参考序列NM_015107.3的mRNA转录本，确定其编码PHF8蛋白(1-1024氨基酸)全长序列。其中，人源PHF8的1-447氨基酸为组蛋白去甲基化酶的底物结合与催化功能区域，其编码蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：
5’-ATGGCCTCGGTGCCGGTGTATTGCCTCTGCCGGCTGCCTTACGATGTGACCCGCTTCATGATCGAGTGTGACATGTGCCAGGACTGGTTTCATGGCAGTTGTGTTGGTGTTGAAGAGGAGAAGGCTGCTGACATTGACCTCTACCACTGCCCCAACTGTGAAGTCTTGCATGGGCCCTCCATTATGAAAAAACGCCGTGGATCTTCAAAGGGGCATGATACACACAAGGGGAAACCAGTGAAGACCGGGAGCCCTACGTTCGTCAGAGAGCTCCGGAGTAGGACTTTTGACAGCTCAGATGAAGTGATTCTGAAGCCCACTGGAAATCAACTGACCGTGGAATTCCTGGAAGAAAATAGCTTCAGTGTGCCCATCCTGGTCCTGAAGAAGGATGGGTTGGGCATGACGCTGCCCTCGCCATCATTCACTGTGAGGGATGTTGAACACTATGTTGGTTCTGACAAAGAGATTGATGTGATTGATGTGACCCGCCAGGCTGACTGCAAGATGAAGCTTGGTGATTTTGTGAAATACTATTACAGCGGGAAGAGGGAGAAAGTCCTCAATGTCATTAGTTTGGAATTCTCTGATACCAGACTTTCTAACCTTGTGGAGACACCGAAGATTGTTCGAAAGCTGTCATGGGTCGAAAACTTGTGGCCAGAGGAATGTGTCTTTGAGAGACCCAATGTACAGAAGTACTGCCTCATGAGTGTGCGAGATAGCTATACAGACTTTCACATTGACTTTGGTGGCACCTCTGTCTGGTACCATGTACTCAAGGGTGAAAAGATCTTCTACCTGATCCGCCCAACAAATGCCAATCTGACTCTCTTTGAGTGCTGGAGCAGTTCCTCTAATCAGAATGAGATGTTCTTTGGGGACCAGGTGGACAAGTGCTACAAGTGTTCCGTGAAGCAAGGACAGACACTTTTCATTCCCACAGGGTGGATCCATGCTGTGCTGACGCCTGTGGACTGCCTTGCCTTTGGAGGGAACTTCTTACACAGCCTTAACATCGAGATGCAGCTCAAAGCCTATGAGATTGAGAAGCGGCTGAGCACAGCAGACCTCTTCAGATTCCCCAACTTTGAGACCATCTGTTGGTATGTGGGAAAGCACATCCTGGACATCTTTCGCGGTTTGCGAGAGAACAGGAGACACCCTGCCTCCTACCTGGTCCATGGTGGCAAAGCCTTGAACTTGGCCTTTAGAGCCTGGACAAGGAAAGAAGCTCTGCCAGACCATGAGGATGAGATCCCGGAGACAGTGCGAACCGTACAGCTCATTAAAGATCTGGCCAGGGAGATCCGCCTGGTGGAAGACATCTTCCAACAGAAC-3’。
2、将编码人源PHF8蛋白1-447氨基酸残基的DNA序列利用PCR从人源cDNA文库中特异性地扩增出来。引物的5’端分别带有BamH1和Xho1酶切位点的pGEX-4T1载体多克隆位点的同源序列，具体的PCR引物序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，具体如下：
F:5’-GTTCCGCGTGGATCC GCCTCGGTGCCGGTGTATTGC-3’；
R:5’-ATGCGGCCGCTCGAG GTTCTGTTGGAAGATGTCTTC-3’；
具体的PCR扩增的体系和程序如下：
PCR体系如表2所示：
表2 PCR体系
PCR的程序如下：
(1)98℃5min；
(2)98℃10s；
(3)56℃30s；
(4)72℃3min；
(2)～(4)循环30次；
(5)72℃10min
(6)4℃保存。
PCR程序结束后，PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外下找到PCR产物片段大小约为1.5kb的片段，切胶，回收；最后回收的DNA片段用20μL双蒸水洗脱，用于后续的分子克隆的连接反应。
3、使用不依赖于连接酶的分子克隆方法(Ligation Independent Cloning，LIC)将PCR产物连接进入pGEX-4T1载体，获得可以在大肠杆菌中大量表达GST标签的PHF8(1-447)截断体蛋白的质粒pGEX-4T1-PHF8(1-447)。具体的LIC实验方法如下：
酶切反应所用试剂如表3所示：
表3酶切反应所用试剂
酶切反应7h后，跑DNA胶，在紫外下找到酶切好的载体片段，切胶，回收，最后回收的DNA片段用20μL超纯水洗脱，作为载体，用于后续的连接反应。
连接反应所用试剂如表4所示：
表4连接反应所用试剂
试剂 体积
10X Exonuclease III Buffer(Takara) 1μL
PCR产物DNA 3μL
酶切的载体DNA 3μL
将洗脱后所得DNA片段补加超纯水至总体积为9μL，置于冰上静置5min，加入1μL的Exonuclease III酶(200U/μL，Takara)，混匀，于冰上静置反应1h后，加入0.5μL的0.5MEDTA(pH＝8.0)终止反应，在60℃水浴条件下加热5min，使外切酶活性失活；之后于冰上静置5min，将该LIC产物加入100μL的大肠杆菌E.coli.的Turbo菌株感受态细胞中，于冰上静置30min，之后在42℃水浴条件下热激45s，采用稀释涂布法将感受态细胞均匀涂布在带有氨苄抗生素的细菌平板培养基上，37℃静置过夜；第二天挑取成功转化后形成的单克隆菌落，在带有氨苄抗生素的液体细菌培养基中摇菌，随后提取质粒，送质粒进行DNA测序，得到正确插入目的片段的测序正确的目的质粒pGEX-4T1-PHF8(1-447)。
4、将原核表达质粒pGEX-4T1-PHF8(1-447)转化进入大肠杆菌E.coli.的BL21RosettaTM菌株(Novagen)感受态细胞中。RosettaTM菌株在E.coli.中补充了6种稀有的tRNA，可实现通用翻译，有利于GST-PHF8(1-447)对较长的编码序列的翻译，避免由于tRNA不足使翻译提前终止导致的截断体碎片产生，有利于融合蛋白全长表达。GST标签的PHF8(1-447)蛋白纯化根据Glutathione Agarose(Thermo)产品说明书进行。具体的细菌转化与纯化方法如下：
(1)转化
①0.5μL质粒pGEX-4T1-PHF8(1-447)转入50μL Rosetta中，冰浴30min。
②42℃水浴热激60s。
③迅速冰浴5min。
④在预热的带有氨苄抗性的LB固体培养基平板上划线。
⑤倒置于37℃恒温箱培养过夜。
(2)诱导
①小量培养：向50mL离心管中加入20mL LB液体培养基，再加入终浓度为1mM的氨苄，挑取一个单克隆转接至50mL离心管，于摇床中以220rpm、37℃震荡培养8h。
②扩大培养：向2L的锥形瓶中加入1LLB液体培养基，再加入终浓度为1mM的氨苄，将20mL菌液转接至1LLB液体培养基中，继续于摇床中以220rpm、37℃震荡培养3～4h，至0D值为0.7～0.8，然后加入终浓度为1mM的IPTG，于摇床中以100rpm、25℃震荡培养过夜。
(3)纯化
①收菌：菌液以4500rpm/min离心15min后弃上清。
②重悬裂解：菌体用40mL PBS缓冲液进行重悬，40mg溶菌酶(1mg/mL)用2mL PBS+1％Triton-X100缓冲液溶解并加入重悬菌液中，冰浴30min，期间轻轻摇匀3次，然后加入10％Triton-X100至终浓度为1％Triton-X100；用超声波细胞粉碎机以10s on/15s off、80％对菌液进行超声15min。
③离心孵育：超声后菌液以13000～15000rpm/min、4℃离心30min，上清转移至新的50mL离心管中；500μL 50％谷胱甘肽琼脂糖珠以700G、4℃离心2min，弃上清，再用1mLPBS+1％Triton-X100缓冲液重悬混匀，以700G、4℃离心2min，弃上清，重复3次后转移至50mL离心管中，于4℃旋转孵育4h。
④离心洗脱：孵育后以1000G、4℃离心5min，弃上清保留琼脂糖珠，加入1mL PBS+1％Triton-X100缓冲液重悬混匀并转移至1.5mL EP管中以700G、4℃离心2min，弃上清，重复4次；然后再用1mL PBS缓冲液重悬混匀以700G、4℃离心2min，弃上清，重复2次；加入1mL50mM/LTris-HCl(pH＝8.0)/10mM/L还原型谷胱甘肽洗脱液孵育10min，再转移至洗脱柱中，将目的蛋白洗脱至1.5mL EP管中。
(4)蛋白纯度与鉴定
1)考马斯亮蓝(G-250)法测定蛋白浓度：首先制作标准曲线，取6个1.5mLEP管，1个EP管中加入200μL G-250试剂做空白对照，其余5个EP管中加入198μL G-250试剂，再分别加入100μg/mL、250μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL和1500μg/mL标准蛋白溶液2μL，充分混匀，使用BioPhotometer(eppendorf)按照空白对照、低浓度到高浓度的顺序测定595nm处的吸光值，并以A595nm为纵坐标、标准蛋白含量为横坐标制作标准曲线；取合适体积的蛋白至一定体积的G-250试剂中，使其测定值在标准曲线的直线范围内即可得到蛋白浓度(μg/mL)。
2)考马斯亮蓝染色(Coomassie Blue，CB)实验：
①制样，取含5μg蛋白体积的样品并加入一定体积的1×或4×SDS loadingbuffer至10μL，混匀，100℃煮10min后顺离；
②采用10％、1.5mm、15well的PAGE凝胶，1孔上5μL双色预染蛋白maker(10-250kDa)，1孔上蛋白样品10μL，打开电源并将电压调至80V、25min至蛋白maker分开，接着电压调至140V、35min使SDS loading至凝胶底部；
③回收凝胶，ddH2O洗10min，考马斯亮蓝快速免脱色染液染色15min后于ddH2O浸30min可观察到目的蛋白条带。
3)免疫印记(Immunoblotting，IB)实验：
①制样，取含100ng蛋白体积的样品并加入一定体积的1×或4×SDSloadingbuffer至10μL，混匀，100℃煮10min后顺离；
②采用10％、1.5mm、15well的PAGE凝胶，1孔上5μL双色预染蛋白maker(10～250kDa)，1孔上蛋白样品10μL，打开电源并将电压调至80V、25min至蛋白maker分开，接着电压调至140V、35min使SDS loading至凝胶底部；
③转膜，将蛋白转移至NC膜，电压调至100V、90min；
④封闭，将NC膜置于5％脱脂牛奶中室温孵育2h；
⑤一抗GST(10000-O-AP,Rabbit,1:1000)，4℃孵育过夜；
⑥1％TBST洗膜，10min/次，4次；
⑦二抗(Rabbit,1:5000)，摇床上常温孵育2h；
⑧1％TBST洗膜，10min/次，4次；
⑨显影，配制ECL发光液1mL(WesternBrightTM Peroxide：WesternBrightTM ECL(R-03031-D25)＝1:1)，将NC膜与ECL发光液孵育并用医用X射线胶片压合适的时间，先将胶片置于显影液中观察到目的蛋白条带后再置于定影液，将胶片洗干净并烘干后扫描实验结果。
本实验所用GST-PHF8(1-447)酶的纯度通过CB实验检测(如图10中的A所示)，并经过免疫印记实验确认其标签蛋白和分子量与预期一致(如图10中的B所示)。
二、建立体外定量测定PHF8体外去甲基化酶活性的方法
1、PHF8体外去甲基化酶反应
PHF8体外去甲基化酶反应根据PHF8体外催化组蛋白底物去甲基化的原理设计，体外反应条件：(1)在H3K9me/me2、H3K27me2和H4K20me1三种已知的PHF8底物中，H3K9me2是被报道的最强的反应底物，本发明选择以H3K4me3K9me2短肽作为反应底物，H3K4me3的修饰有利于PHF8识别，并去甲基化修饰H3K9me2底物。具体的，所述H3K4me3K9me2短肽是在组蛋白H3的第4位赖氨酸(K)带有3甲基化修饰同时K9位带有二甲基化修饰的一个人工合成的短肽，具体序列为：ARTK(me3)QTARK(me2)STGGKAPRKQL；该短肽上带有PHF8去甲基化酶的底物之一H3K9me2，即序列中第9位的K(me2)——该底物是被报道最多的PHF8组蛋白底物，故本申请采用该短肽作为底物；同时，在其前方第四位K的三甲基修饰，增强PHF8对该短肽的识别(Nat StructMol Biol.2010Apr；17(4):445-50)。(2)本发明选择GST-PHF8(1-447)重组蛋白(来源于大肠杆菌重组表达)作为酶。PHF8(1-447)包含PHD结构域和jmjC结构域，其中PHD结构域用于识别底物上的H3K4me3标签，增强PHF8的体外去甲基化酶活性；同时，包含核心催化区和结合区，而舍弃羧基末端的PHF8保证重组蛋白易于纯化；GST和His的体外纯化系统都有被报道用于PHF8的体外纯化，本发明选择GST系统更有利于纯化并避免咪唑置换。(3)本发明选择含有亚铁离子和α-酮戊二酸的Tris-HCl缓冲液体系(pH＝7.5)，其中加入L-Ascorbic acid作为还原性保护剂保持亚铁离子的还原态，在150mM NaCl的生理盐浓度条件下，在37℃的敞口试管中反应。
具体来说，PHF8体外去甲基化酶反应如下：将10μg的GST-PHF8(1-447)重组蛋白、1μg的合成多肽H3K4me3K9me2与10μL的去甲基化酶缓冲液中(20mM Tris-HCl(pH＝7.5)、150mM NaCl、125μM(NH4)2Fe(SO4)2、1mMα-酮戊二酸和2mM抗坏血酸)混合，在37℃的培养箱孵育反应1h；之后加入1μL的10％三氟乙酸(Trifluoroacetic acid，TFA)终止去甲基化酶反应。
2、基于MALDI-TOF质谱方法的PHF8活性检测方法
本发明利用MALDI-TOF MS质谱对去甲基化反应产生的多肽产物进行定量。具体来说，产物经过脱盐处理后，取0.5μL的反应产物与等量的10mg/mL CHCA(α-氰基-4-羟基肉桂酸，Sigma 70990)基质混合，充分干燥后，在microflex II质谱仪(Bruker)上进行测定，使用FlexAnalysis软件对H3K4me3K9me2、H3K4me3K9me1和H3K4me3K9me0的多肽峰进行定量，检测获得的峰面积与总峰强度的和用于计算底物多肽去甲基化的比例(如图10中的C和D所示)，定量PHF8的活性。采用相对于对照(不加入化合物WR-089)样品的百分比值作为PHF8活性单位。本发明梯度加入0μg、4μg、16μg、40μg的PHF8，在反应1h和4h分别取反应产物进行MALDI-TOF MS质谱检测。图11为PHF8的体外去甲基化酶活性检测结果图，图11中的A为GST-PHF8(1-447)重组蛋白以H3K4me3K9me2短肽作为底物的体外去甲基化反应经MALDI-TOF MS质谱检测的结果图，B为根据A中峰面积对PHF8体外活性进行定量的柱形图；由图11可知，H3K4me3K9me2的短肽底物随着PHF8的量梯度增加，出现分子量-14Da和-28Da的去单甲基化和去双甲基化的产物；根据短肽的信号峰面积，定量PHF8的活性，具体结果见表5。
表5 PHF8的体外去甲基化酶活性检测结果
三、测定化合物WR-089对PHF8的IC50值
将化合物WR-089溶解初始浓度为10mM，-20℃保存。将1μL的10mM化合物WR-089溶液以2倍的梯度用超纯水进行稀释，共计得到20个梯度(从10mM到19nM)，分别取1μL不同梯度的化合物WR-089溶液置于PCR管中，并以加入1μL超纯水作为对照样品；随后加入6μL的GST-PHF8(1-447)重组蛋白(约10μg)，移液枪吹吸混合；室温静置15min，使化合物WR-089与目的蛋白充分地结合；随后加入1μL的H3K4me3K9me2短肽和2μL的5X去甲基化酶缓冲液母液的预混液，于敞口的PCR管中、在37℃培养箱孵育1h；之后加入TFA终止反应，采用MALDI-TOF质谱测定每个样品的PHF8活性。不同浓度化合物WR-089处理后测定的PHF8活性数据导入Prism7软件，根据拟合的剂量反应曲线，确定抑制PHF8活性一半时所需的化合物WR-089浓度，即IC50值。
四、测定化合物WR-089对肿瘤细胞增殖的EC50值
将细胞接种于96孔板，于5％CO2培养箱培养过夜后，加药梯度稀释后处理细胞3～4天。使用CellTiter 96Aqueous细胞增殖测定试剂盒(MTS，Promega)测定细胞活力，具体是将20μL的CellTiter 96Aqueous试剂加入到100μL的培养基中，在5％CO2气氛中于37℃孵育1h。采用Spark分光光度计(Tecan)于490nm的波长处测定细胞活力。不同浓度化合物WR-089处理后测定的细胞活性数据导入Prism7软件，根据拟合的剂量反应曲线，确定抑制肿瘤细胞活性一半时所需的化合物WR-089浓度，即EC50值。
五、裸鼠移植瘤模型
1、裸鼠移植瘤模型实验经过厦门大学实验动物管理伦理委员会审查和批准，在厦门大学实验动物中心开展。其中，实验所用的雌性的BALB/c nu/nu小鼠为4～6周龄，采购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于无病原菌条件的实验室。具体实验如下：将300万左右的HeLa肿瘤细胞经胰酶消化成单细胞悬液，悬浮在PBS缓冲液中，注射于小鼠背部单侧皮下位置；当肿瘤大小达到约100mm3时，将小鼠随机分为两组，分别注射溶剂对照和化合物WR-089，其中，化合物WR-089溶解在含1％DMSO、10％PEG和10％Tween-80的生理盐水缓冲液中，并按指定剂量每天腹膜内注射给药，随后，每天用游标卡尺测量肿瘤长和宽，计算肿瘤体积，所述肿瘤体积＝长度×宽度2×0.52；同时每天测量小鼠体重，小鼠主要脏器拍照并称重，以评估化合物WR-089的体内有效性和安全性。
2、测定IC50值：使用H3K4me3K9me2的短肽作为底物测定化合物WR-089对PHF8去甲基化酶的IC50值。图12为化合物WR-089对PHF8的体外抑制的IC50值测定结果图，由图12可知，化合物WR-089对PHF8的体外抑制的IC50＝4.23±1.22μM，表明化合物WR-089对PHF8的去甲基化活性具有有效抑制作用。
3、测定EC50值：本发明评估了化合物WR-089对19种肿瘤细胞系的杀伤能力，包括HeLa细胞、7种不同的结肠癌细胞系、6种不同的肺癌细胞系、1种乳腺癌细胞系、1种胃癌细胞系、1种前列腺癌细胞系、1种肝癌细胞系和1种食道癌细胞系。图13为化合物WR-089对19种肿瘤细胞系以及正常肠上皮细胞系CCC-HIE-2的EC50值测定结果图，具体结果列于表6中。结果显示，化合物WR-089的半数最大有效浓度(EC50值)为3～92μM，其中，化合物WR-089对正常肠上皮细胞系CCC-HIE-2的细胞毒性最小(EC50＝302.54±1.12μM)，表明化合物WR-089对肿瘤细胞具有有效性与选择性杀伤的能力。
表6化合物WR-089对19种肿瘤细胞系以及正常肠上皮细胞系CCC-HIE-2的EC50值
细胞系 EC50(μM)
HCT116 6.88±1.17
SW480 10.05±1.25
HT29 14.63±1.12
SW620 16.42±1.19
HCT8 11.21±1.17
RKO 3.09±1.09
DLD1 24.18±1.12
A549 20.85±1.18
H292 53.22±1.20
H460 40.73±1.16
H3122 27.88±1.39
LC-2/ad 56.06±1.15
H1299 5.17±1.16
HeLa 7.06±1.13
CCC-HIE-2 302.54±1.12
MCF7 20.66±1.15
BGC-823 91.90±1.23
LNCaP 48.74±85.80
HepG2 15.98±1.42
KYSE-140 62.55±1.23
4、裸鼠异种成瘤实验(宫颈癌HeLa细胞系)：本发明评估了化合物WR-089在宫颈癌HeLa细胞系裸鼠移植瘤模型中的体内药效及其对小鼠体重的影响。具体来说，将300万左右的HeLa肿瘤细胞接种于小鼠背部单侧皮下位置，当肿瘤大小达到约100mm3时，将小鼠分为均值相似的两组，分别注射对照溶剂和化合物WR-089，每天测量小鼠体重与肿瘤的长和宽，计算肿瘤体积；所述对照溶剂具体为1％DMSO+10％Tween80+10％PEG400+79％生理盐水(0.9％NaCl水溶液)。实验在对照组小鼠荷瘤体积平均值达到约2000mm3时终止。图14为HeLa细胞的裸鼠成瘤实验结果图，图14中的A为对照溶剂与化合物WR-089处理下的裸鼠肿瘤体积变化的曲线图，B为对照溶剂与化合物WR-089处理下的裸鼠体重变化的曲线图；由图14可知，化合物WR-089可以显著抑制宫颈癌HeLa细胞在裸鼠体内的增殖，同时不会显著地影响小鼠体重，表明WR-089具有在体内抑制肿瘤增殖的有效性和一定的安全性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 厦门大学
<120> 一种四氢咔唑-1-甲酰胺类衍生物及其制备方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
atggcctcgg tgccggtgta ttgcctctgc cggctgcctt acgatgtgac ccgcttcatg 60
atcgagtgtg acatgtgcca ggactggttt catggcagtt gtgttggtgt tgaagaggag 120
aaggctgctg acattgacct ctaccactgc cccaactgtg aagtcttgca tgggccctcc 180
attatgaaaa aacgccgtgg atcttcaaag gggcatgata cacacaaggg gaaaccagtg 240
aagaccggga gccctacgtt cgtcagagag ctccggagta ggacttttga cagctcagat 300
gaagtgattc tgaagcccac tggaaatcaa ctgaccgtgg aattcctgga agaaaatagc 360
ttcagtgtgc ccatcctggt cctgaagaag gatgggttgg gcatgacgct gccctcgcca 420
tcattcactg tgagggatgt tgaacactat gttggttctg acaaagagat tgatgtgatt 480
gatgtgaccc gccaggctga ctgcaagatg aagcttggtg attttgtgaa atactattac 540
agcgggaaga gggagaaagt cctcaatgtc attagtttgg aattctctga taccagactt 600
tctaaccttg tggagacacc gaagattgtt cgaaagctgt catgggtcga aaacttgtgg 660
ccagaggaat gtgtctttga gagacccaat gtacagaagt actgcctcat gagtgtgcga 720
gatagctata cagactttca cattgacttt ggtggcacct ctgtctggta ccatgtactc 780
aagggtgaaa agatcttcta cctgatccgc ccaacaaatg ccaatctgac tctctttgag 840
tgctggagca gttcctctaa tcagaatgag atgttctttg gggaccaggt ggacaagtgc 900
tacaagtgtt ccgtgaagca aggacagaca cttttcattc ccacagggtg gatccatgct 960
gtgctgacgc ctgtggactg ccttgccttt ggagggaact tcttacacag ccttaacatc 1020
gagatgcagc tcaaagccta tgagattgag aagcggctga gcacagcaga cctcttcaga 1080
ttccccaact ttgagaccat ctgttggtat gtgggaaagc acatcctgga catctttcgc 1140
ggtttgcgag agaacaggag acaccctgcc tcctacctgg tccatggtgg caaagccttg 1200
aacttggcct ttagagcctg gacaaggaaa gaagctctgc cagaccatga ggatgagatc 1260
ccggagacag tgcgaaccgt acagctcatt aaagatctgg ccagggagat ccgcctggtg 1320
gaagacatct tccaacagaa c 1341
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gttccgcgtg gatccgcctc ggtgccggtg tattgc 36
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgcggccgc tcgaggttct gttggaagat gtcttc 36

Claims (3)

1.一种四氢咔唑-1-甲酰胺类衍生物在制备组蛋白去甲基化酶PHF8抑制剂中的应用，所述四氢咔唑-1-甲酰胺类衍生物具有式I所示结构：
2.一种四氢咔唑-1-甲酰胺类衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述四氢咔唑-1-甲酰胺类衍生物具有式I所示结构：
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括宫颈癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、肝癌或食道癌。
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