CN114890993B - 一种查尔酮吩嗪杂化分子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种查尔酮吩嗪杂化分子及其应用，特别是作为铁死亡诱导剂在抗脑胶质瘤中的应用。本发明通过CuAAC点击反应合成了一系列新型的含有查尔酮骨架的吩嗪类化合物(C1～C13)。部分化合物在体外对U87‑MG细胞具有选择性细胞毒作用，其中化合物C4的抗增殖活性最强。通过转录、脂质过氧化和脂质ROS检测证实化合物C4可以诱导U87‑MG细胞铁死亡。转录结果表明，溶质载体家族7成员11(SLC7A11)表达上调，而GPX4和铁蛋白重链1(FTH1)表达下调。免疫印迹分析显示，化合物C4处理后，铁蛋白明显降解。本发明提出了一种新的细胞铁死亡诱导剂，也为脑胶质瘤的治疗提供了一种新的思路和方法。

Description

一种查尔酮吩嗪杂化分子及其应用

技术领域

本发明属于医学技术领域。更具体地，本发明涉及一种查尔酮吩嗪杂化分子及其应用。

背景技术

吩嗪类化合物是一大类天然含氮杂环化合物，是具有氧化还原活性的微生物的次生代谢产物。在我们以前的研究中，从海洋放线菌BM-17中分离到了一个新的天然产物N-(2-羟基苯基)-2-吩嗪胺(结构式为：

)，它对几种癌细胞具有中等的细胞毒活性。随后，我们试图将不同类型的药效团引入天然吩嗪骨架，以构建不同的天然产物化合物库。

最近，基于迈克尔受体的结构在药物发现领域被广泛用作有效的药效载体。异甘草素(Isoliquiritigenin，结构式为：

)是一种典型的查尔酮类天然产物，也是一种潜在的迈克尔受体，含有一个亲电体，通常具有生物活性，能参与调节细胞中的许多信号通路。当将含有迈克尔受体的骨架与天然化合物骨架相结合来产生新型杂化分子时，将极大地增加发现具有临床潜力的针对各种疾病的新药的可能性。此外，基于分子杂化策略，我们设计、合成和筛选了几个吩嗪杂化分子作为抗肿瘤药物。

脑胶质瘤是最常见的原发中枢神经系统肿瘤，约占所有原发颅内肿瘤的81％。胶质母细胞瘤(GBM)是新诊断的脑胶质瘤中恶性程度最高的肿瘤，具有病程短、死亡率高等特点。虽然脑胶质瘤的发病率(4.67-5.73/10万人)低于许多其他系统性肿瘤，但脑胶质瘤生长迅速，并侵袭肿瘤周围重要的生命调节中心。即使是接受化疗和放疗的患者，中位生存期也只有7至15个月，确诊患者的5年生存期仅为0.05％至4.7％。此外，目前的治疗方法对GBM的治疗效果不好，与其他系统肿瘤相比预后较差。最大限度的手术切除、放射治疗和化疗仍是脑胶质瘤的主要治疗方法。尽管开发了新的临床治疗方法，但治疗脑胶质瘤仍然面临许多挑战。因此，迫切需要寻找一种合适而有效的脑胶质瘤治疗方法。

铁死亡是2012年被报道的一种铁依赖性的非凋亡性细胞死亡形式，作为一种新的细胞死亡形式，其特征是亚铁离子蓄积和脂质过氧化导致产生更多的ROS，并引发细胞死亡。溶质载体家族7成员11(SLC7A11)和GPX4是转运L-半胱氨酸和减少脂质过氧化以抑制脂质ROS的两个关键酶。铁(一种氧化还原活性金属)水平的升高在铁死亡的诱发过程中起着至关重要的作用。铁蛋白的降解释放出大量的铁离子，造成铁过载。近年来，许多研究表明铁死亡与铁蛋白的选择性降解有关，铁蛋白重链1(FTH1)也被认为与铁蛋白释放细胞内游离铁有关。核受体辅活化子4(NCOA4)通过选择性地结合FTH1并将其传递到溶酶体来介导铁蛋白的降解。众所周知，有一些化合物被报道为铁死亡诱导剂，如Sorafennib,Lanperisome和Sulfasalazine导致谷胱甘肽耗竭；盐霉素、青蒿琥酯和纳米氧化铁靶向铁。然而，据我们所知，吩嗪类药物引起铁死亡目前仍未见报道。

发明内容

本发明合成了一系列新型查尔酮吩嗪杂化分子，其中化合物C4对人脑星形胶质母细胞瘤细胞(U87-MG)和人乳腺癌细胞(231)有明显的抗增殖作用，进一步研究发现化合物C4可以引起细胞内铁蛋白降解进而诱导U87-MG细胞铁死亡。

本发明的第一个目的是提供一种查尔酮吩嗪杂化分子，所述查尔酮吩嗪杂化分子为式(Ⅰ)所示化合物：

本发明的第二个目的是提供一种药物组合物，所述药物组合物包括前述的查尔酮吩嗪杂化分子。

本发明的第三个目的是提供前述的查尔酮吩嗪杂化分子或前述的药物组合物在制备肿瘤细胞铁死亡诱导剂中的应用。

进一步的，所述肿瘤细胞为脑胶质瘤细胞；

进一步的，所述肿瘤细胞为人脑星形胶质母细胞瘤细胞；

进一步的，所述肿瘤细胞为脑胶质瘤细胞U87-MG。

进一步的，所述铁死亡诱导剂能够上调肿瘤细胞SLC7A11基因和HOMX-1基因表达和/或下调GPX4基因和FTH基因表达。

本发明的第三个目的是提供前述的查尔酮吩嗪杂化分子或前述的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

进一步的，所述肿瘤为脑胶质瘤和/或乳腺癌。

本发明共合成了13个化合物，即后述的C1～C13所示化合物，其中C4即本发明式(Ⅰ)所示化合物。本发明C1～C13所示化合物的制备过程为：

(1)将2，3-二羟基吩嗪进行醚化反应和叠氮化反应得到化合物A：

(2)查尔酮衍生物(B1-B13)是在醚化反应和Aldol反应的基础上合成的：

/>

(3)目标化合物(C1-C13)是按照经典的CuAAC点击反应(CuAAC Click反应)合成的：

具体的，本发明式(Ⅰ))所示化合物(即C4)的制备方法如下：

将邻苯二胺(1eq.)溶解于1mol/L的稀盐酸(V＝2L/mol×n_邻苯二胺)中，然后将FeCl₃·6H₂O(5eq.)溶解于水中配成3.3mol/L的溶液缓慢滴加进去，室温反应过夜。反应完全之后析出红色晶体，收集红色晶体，用0.3M稀盐酸洗涤至无Fe³⁺，然后溶解在60℃～70℃的热水中，缓慢加入1M的NaOH溶液，调节pH＝10～11，析出红色晶体为2,3-二氨基吩嗪，过滤，滤液加热至60℃～70℃，用甲酸调节pH＝3～4，冷却之后析出红色晶体为2-羟基-3-氨基吩嗪。两个产物均不需进一步纯化。

将2,5-二羟基对苯二醌(1eq.)和邻苯二胺(1.1eq.)溶解在热水中，升温至100℃反应过夜，冷却后析出红色晶体即为2,3-二羟基吩嗪，不需进一步纯化直接用于下一步反应。

2,3-二羟基吩嗪(1eq.)和Cs₂CO₃(0.5eq.)在氮气保护下溶解于无水DMF中，然后将1,4-二溴丁烷(1.2eq.)缓慢加入反应体系中，升温至60℃，反应过夜。反应完之后萃取除去DMF用快速柱色谱分离得到淡黄色固体。黄色固体与叠氮化钠(2.5eq.)在氮气保护下溶解于DMF中，升温至60℃反应过夜，反应完之后萃取除去DMF，得到淡黄色油状物叠氮吩嗪直接用于下一步反应。

对羟基苯乙酮(1eq.)和Cs₂CO₃(0.5eq.)在氮气保护下溶解于DMF中，然后缓慢的将溴代丙炔(1eq.)滴加到反应瓶中，60℃反应8～12小时，反应完全之后萃取除去DMF，然后过柱子分离的到白色固体。白色固体(1eq.)与4-溴-3,5-二甲基苯甲醛(1eq.)溶解于无水乙醇中，然后加入40％的KOH溶液，室温反应1～3个小时逐渐析出白色固体，过滤即可得到纯度较高的白色固体B4。

将化合物叠氮吩嗪(1eq.)和化合物B4(1eq.)溶解于混合溶液(THF/H₂O＝4/1，v/v)中，加入1mol/L抗坏血酸钠水溶液和1mol/L硫酸铜水溶液(体积比为1/2)，在室温下反应24h。反应完成后，用乙酸乙酯萃取体系，用饱和氯化铵溶液、水和饱和氯化钠溶液对有机相进行三次洗涤。无水Na₂SO₄干燥后，用旋转蒸发除去有机相，再用快速柱层析对粗品进行纯化，得到最终化合物C4。

申请人研究了化合物C1-C13对四种癌细胞：人脑星形胶质母细胞瘤细胞(U87-MG)、人乳腺癌细胞(231)、人肺腺癌细胞(A549)、人肝癌细胞(Bel-7402)和两种正常细胞：人正常肝细胞(L02)、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)活性的影响。发现化合物C4对U87-MG和231细胞有明显的抑制增殖作用，但其对L02细胞的毒性较小，表明C4有较好的抗肿瘤选择性和安全性(针对L02细胞的IC₅₀值比U87-MG细胞高近3倍)。

本发明通过转录组测序发现化合物C4对U87-MG细胞中628个基因的mRNA水平有影响。同时基因集富集分析(GSEA)表明，与3个对照组：N-(2-羟基苯基)-2-吩嗪胺、异甘草素、查尔酮类似物相比，在化合物C4处理后，与铁死亡相关基因上调。

为了进一步证实化合物C4可以诱导铁死亡，我们验证了与铁死亡相关基因的表达水平。我们发现铁死亡相关基因SLC7A11、GPX4、HMOX1、TFR和FTH的mRNA水平升高。SLC7A11和GPX4通过引入半胱氨酸、合成谷胱甘肽和限制脂质ROS积聚而抑制细胞铁死亡。HMOX1、TFR和FTH与铁离子的产生、运输和释放有关。为进一步检测化合物C4对U87-MG细胞内脂质ROS水平的影响，我们分别以不同剂量化合物C4与U87-MG细胞分别作用不同时间后，发现化合物C4分别以剂量和时间依赖的方式增加脑胶质瘤细胞的脂质ROS水平。鉴于脂质过氧化是铁死亡的特征，而脂质过氧化的最终产物是丙二醛(MDA)，因此我们检测了化合物C4对脑胶质瘤细胞中丙二醛含量的影响，发现化合物C4以剂量依赖的方式显著增加细胞中丙二醛的水平。细胞内铁含量测定还显示，在化合物C4作用12、24和48h后，脑胶质瘤细胞中铁过载。因此，化合物C4诱导了脑胶质瘤细胞的铁死亡。

本发明为了进一步探讨化合物C4的作用机制,我们检测了不同浓度的化合物C4处理后这些与铁蛋白相关的关键蛋白的表达水平。免疫印迹方法分析显示，经化合物C4处理后，SLC7A11和HOMX-1蛋白水平上调，而GPX4和FTH蛋白水平均下调。GPX4利用GSH解毒脂质过氧化，抑制铁死亡。因此，我们检测了化合物C4处理后GSH/GSSH是否发生变化。结果显示化合物C4对GSH/GSSG无明显影响，表明化合物C4对SLC7A11-GPX4通路的影响可能不大。HMOX-1作为细胞内铁的重要来源之一，已被证实可诱导脂质过氧化并导致铁死亡，我们发现化合物C4处理后显著上调了HOMX1。FTH作为一种主要的细胞内储铁蛋白，参与了铁自噬作用，是铁死亡的底物。FTH的异常降解可能导致亚铁积累并引发铁死亡。在我们的结果中，FTH在化合物C4处理后更明显地下调。我们推测，化合物C4可能通过促进铁蛋白的降解而诱发铁死亡。

综上，本发明采用CuAAC点击反应的方法设计合成了一系列含有查尔酮骨架的吩嗪类化合物(C1-C13)，其中式(Ⅰ)所示化合物(化合物C4)对脑胶质瘤和乳腺癌细胞U87-MG、231细胞具有最好的抗增殖活性，并可诱导U87-MG细胞发生铁死亡，其链接键(图7中虚线框出部分

)对促进铁死亡发挥了重要作用，进而抑制脑胶质瘤细胞的增殖，并能够通过铁死亡途径消除肿瘤细胞特别是脑胶质瘤细胞，本发明的提出拓宽了吩嗪类化合物潜在的抗肿瘤作用范围。

附图说明

图1化合物C4(8μM)作用24h后，胶质瘤U87-MG细胞差异表达的mRNAs的火山图和热图：

图2为化合物C4(8μM)作用24h后，胶质瘤U87-MG细胞RT-qPCR检测铁死亡相关基因相对表达水平。

图3为化合物C4(8μM)作用24h后，胶质瘤U87-MG细胞差异表达mRNAs显著富集的KEGG途径。

图4为化合物C4(8μM)作用24h后，胶质瘤U87-MG细胞铁死亡的GSEA。

图5为化合物C4诱导胶质瘤细胞铁死亡。图5A、B为不同浓度化合物C4作用12h、24h和48h的胶质瘤细胞内脂质ROS水平，其中图5A中的FITC-A是指荧光强度，图5B中的FITC-Mean是对图A中的荧光强度进行量化，图5C为2μM和4μM化合物C4作用24h的细胞内丙二醛水平，图5D为化合物C4作用12h、24h和48h的细胞内铁水平。

图6为化合物C4通过促进铁蛋白降解诱导铁死亡。图6A为用Western blotting分析铁死亡相关蛋白的表达水平。用含2μM、4μM和8μM的化合物C4孵育U87-MG细胞48h。图6B为与铁死亡相关的蛋白质的统计数量。

图7标注链接键的结构式(Ⅰ)，其中，虚线框出部分为所述链接键。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步阐述本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

本发明所述：

DMF是指：N,N-二甲基甲酰胺；

EtOH是指：乙醇；

rt是指：常温；

sodium ascorbate是指：抗坏血酸钠；

THF是指：四氢呋喃；

solution是指：溶液；

reflux是指：回流；

μM是指：μmol/L。

实施例1：化合物A的合成

2，5-二羟基-对苯二酚(1eq.)和邻苯二胺(1.1eq.)在热水中溶解，并在100℃下反应一夜。冷却至室温后，红色结晶沉淀为2，3-二羟基吩嗪，无需进一步提纯即可直接用于下一步反应。随后，在氮气保护下将2，3-二羟基吩嗪(1eq.)和Cs₂CO₃(0.5eq.)溶解于无水DMF中，然后再将1，4-二溴丁烷(1.2eq.)慢慢加入反应体系，并加热到60℃下反应一夜。反应完成后，用快速柱层析对体系进行提取分离，得到淡黄色固体，无需进一步纯化即可直接用于下一步反应。最后，将淡黄色固体溶解在DMF中，并与叠氮化钠(2.5eq.)。在60℃氮气保护下进行过夜反应，反应完成后萃取出去DMF，得到淡黄油状液体，即化合物A，无需进一步提纯，直接用于下一步。

实施例2：化合物B1-B3合成

对羟基苯甲醛(1eq.)和Cs₂CO₃(0.5eq.)在氮气保护下溶解在DMF中，然后将溴丙基乙炔(1eq.)缓慢的加入烧瓶中，在60℃下反应8～12h，反应完成后提取体系，通过快速柱层析纯化得到白色固体4-(2-丙炔基-1-氧基)苯甲醛。随后，将白色固体(1eq.)和苯乙酮衍生物(1eq.)用无水乙醇溶解，然后加入40％KOH溶液，在室温下放置1-3h后逐渐析出白色固体。过滤后可得到纯度较高的白色固体，即化合物B1-B3。

实施例3：化合物B4-B6的合成

化合物B4-B6的合成过程与化合物B1-B3的制备方法相似，不同的是将第一步反应中的对羟基苯甲醛换成对羟基苯乙酮，将第二步反应中的苯乙酮衍生物换成了苯甲醛衍生物。

实施例4：化合物B7-B9的合成

将4-(2-丙炔基-1-氧基)苯甲醛(1eq.)和苯乙腈衍生物(1eq.)用乙醇溶解，然后加入40％KOH溶液回流反应1h，冷却至室温后逐渐析出淡黄色固体，即为化合物B7-B9。

实施例5：化合物B10-B12的合成

化合物B10-B12的合成过程与化合物B7-B9的制备方法相似，不同的是将第一步反应中的对羟基苯甲醛换成对羟基苯乙腈，将第二步反应中的苯乙腈衍生物换成苯甲醛衍生物。

实施例6：化合物B13的合成

将4-(2-丙炔基-1-氧基)苯甲醛(1eq.)和氰基乙酰胺(1eq.)在乙醇中溶解，加入40％的KOH溶液，在室温下反应1h，反应结束后逐渐析出黄色固体，即化合物B13。

实施例7：化合物C1-C13的合成

将化合物A(1eq.)和化合物B(1eq.)溶解于混合溶液(THF/H₂O＝4/1，v/v)中，加入1mol/L抗坏血酸钠水溶液和1mol/L硫酸铜水溶液(体积比为1/2)，在室温下反应24h。反应完成后，用乙酸乙酯萃取体系，用饱和氯化铵溶液、水和饱和氯化钠溶液对有机相进行三次洗涤。无水Na₂SO₄干燥后，用旋转蒸发除去有机相，再用快速柱层析对粗品进行纯化，得到最终化合物。

化合物A和B1反应得到化合物C1。收率：83％，黄色固体，Mp＞250℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ_H 8.16(s,2H),7.82(d,J＝6.5Hz,1H),7.75(t,J＝6.5Hz,3H),7.67-7.60(m,3H),7.60-7.50(m,2H),7.48(d,J＝6.3Hz,1H),7.43(d,J＝6.3Hz,1H),7.38(s,1H),7.04(d,J＝8.7Hz,2H),6.94(dd,J＝8.3,3.9Hz,1H),5.44-5.16(m,2H),4.77-4.62(m,2H),4.32(s,2H),3.98(d,J＝1.6Hz,6H),2.30-2.18(m,2H),1.93-1.84(m,2H).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ_C 207.0,188.6,176.5,171.2,159.9,153.2,152.6,149.2,144.5,143.5,131.5,130.1,130.1,129.5,129.2,128.4,122.9,122.7,119.7,115.2,115.2,110.8,110.0,108.2,104.9,69.6,62.1,60.4,56.1,56.1,49.8,30.9,30.9,29.7,28.5,21.1.HR ESI-MS[M+H]⁺m/z＝632.2513(calcd for C₃₆H₃₄N₅O₆,632.2509).

化合物A和B2反应得到化合物C2。收率：78％，黄色固体，Mp＞250℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ_H 8.21-8.13(m,2H),8.04(d,J＝8.8Hz,2H),7.81-7.73(m,4H),7.63-7.57(m,3H),7.44(d,J＝15.6Hz,1H),7.39(s,1H),7.01(dd,J＝12.9,8.7Hz,4H),5.30(s,2H),4.67(t,J＝6.3Hz,2H),4.35(t,J＝5.1Hz,2H),3.91(s,3H),2.28-2.20(m,2H),1.94-1.86(m,3H).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ_C 207.0,188.7,171.2,163.3,159.9,152.5,144.4,143.5,141.3,131.2,130.7,130.7,130.1,130.1,130.1,129.4,129.1,128.6,128.4,122.7,119.9,115.2,115.2,113.8,113.8,108.2,105.1,69.5,62.1,60.4,55.5,49.8,28.4,24.6,21.1.HR ESI-MS[M+H]⁺m/z＝602.2405(calcd for C₃₅H₃₂N₅O₅,602.2403).

化合物A和B3反应得到化合物C3。收率：75％，黄色固体，Mp＞250℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ_H 8.19-8.10(m,2H),7.86(d,J＝8.7Hz,2H),7.79-7.70(m,4H),7.56(s,1H),7.45(s,1H),7.37-7.31(m,2H),7.24(ddd,J＝7.8,1.8,0.9Hz,1H),7.16(t,J＝2.2Hz,1H),7.05(d,J＝8.8Hz,2H),6.95-6.88(m,1H),5.29(s,2H),4.64(t,J＝6.4Hz,2H),4.32(d,J＝5.4Hz,2H),3.87(s,3H),2.30-2.16(m,3H),1.93-1.81(m,2H).13C NMR(75MHz,CDCl₃)δ_C 207.0,171.2,160.1,159.8,152.7,144.3,144.3,141.8,136.1,131.2,131.2,131.2,130.0,130.0,129.5,129.1,128.5,127.0,122.8,118.4,118.2,118.2,118.2,115.2,115.2,115.2,114.4,111.4,111.4,109.0,108.0,105.0,62.1,60.4,28.5,24.6,14.2.HR ESI-MS[M+H]⁺m/z＝602.2408(calcd for C₃₅H₃₂N₅O₅,602.2403).

化合物A和B4反应得到化合物C4。收率：80％，黄色固体，Mp＞250℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ_H 8.38-8.12(m,2H),8.12-7.96(m,2H),7.94-7.76(m,4H),7.66(d,J＝15.6Hz,1H),7.56-7.39(m,2H),7.07(d,J＝6.9Hz,1H),6.92(d,J＝8.6Hz,1H),6.79(s,2H),5.33(s,2H),5.11(s,1H),4.67-4.54(m,2H),4.40-4.24(m,2H),3.97(s,6H),2.26(s,2H),2.05-1.91(m,2H).¹³CNMR(75MHz,CDCl₃)δ_C 207.0,188.5,171.2,162.0,157.4,151.8,144.2,143.7,141.7,141.4,135.2,130.9,130.9,129.2,128.9,128.8,122.4,114.7,114.7,105.3,104.5,104.5,103.7,69.5,62.1,60.4,56.6,56.6,49.8,30.9,30.9,28.5,24.6,21.1,14.2.14.2.HR ESI-MS[M+H]⁺m/z＝710.1619(calcd for C₃₆H₃₃BrN₅O₆,710.1614)

化合物A和B5反应得到化合物C5。收率：85％，黄色固体，Mp＞250℃。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ_H 8.18(d,J＝6.4Hz,2H),8.03(d,J＝8.4Hz,2H),7.78-7.74(m,4H),7.60(s,1H),7.55-7.47(m,4H),7.23(d,J＝7.7Hz,3H),7.08(d,J＝8.5Hz,2H),5.33(s,2H),4.68-4.64(m,2H),4.35(t,J＝5.5Hz,2H),2.06(s,3H),1.27(d,J＝6.9Hz,4H).¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ_C 205.8,180.3,169.3,165.6,165.6,161.8,161.1,149.1,144.4,144.4,132.2,130.8,130.8,129.7,129.7,129.4,129.1,128.4,128.4,122.8,120.7,114.6,114.6,69.5,62.1,60.4,49.8,30.9,30.9,28.4,24.6,21.5,21.5,21.1,14.2.HR ESI-MS[M+H]⁺m/z＝586.2456(calcd for C₃₅H₃₂N₅O₄,586.2454).

化合物A和B6反应得到化合物C6。收率：81％，黄色固体，Mp＞250℃。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ_H 8.24-8.14(m,2H),8.04(d,J＝8.3Hz,2H),7.98(d,J＝7.8Hz,1H),7.78(d,J＝8.1Hz,4H),7.59(d,J＝8.1Hz,3H),7.50(d,J＝15.3Hz,2H),7.43(s,1H),7.09(d,J＝8.2Hz,2H),6.98(s,1H),5.35(s,2H),4.68(d,J＝6.4Hz,2H),4.36(s,2H),4.14(q,J＝7.1Hz,3H),3.00-2.90(m,2H),2.07(s,6H).¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ_C 207.1,188.9,171.2,161.8,151.9,144.4,144.4,132.6,131.8,130.8,130.8,129.6,128.6,128.6,127.1,127.1,120.8,115.5,114.6,114.6,62.1,60.4,60.4,49.8,34.1,34.1,30.9,30.9,29.7,28.5,24.5,23.8,23.8,22.7,21.1,14.2.14.2.HR ESI-MS[M+H]⁺m/z＝614.2769(calcd for C₃₇H₃₆N₅O₄,614.2767).

化合物A和B7反应得到化合物C7。收率：77％，黄色固体，Mp＞250℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ_H 8.13(dd,J＝6.6,3.6Hz,2H),7.84(d,J＝8.7Hz,2H),7.77(s,1H),7.75-7.71(m,2H),7.57-7.53(m,3H),7.41-7.33(m,5H),7.04(d,J＝8.8Hz,2H),5.28(s,2H),4.62(d,J＝6.2Hz,2H),4.30(d,J＝5.6Hz,2H),2.22(t,J＝6.7Hz,2H),1.87(t,J＝6.2Hz,2H).¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ_C 207.0,171.2,160.0,144.3,141.9,134.8,133.2,131.3,131.3,129.2,129.2,128.4,127.0,127.0,126.8,122.7,115.3,115.3,108.0,104.8,69.7,62.1,60.4,60.4,49.8,31.4,30.9,30.9,30.2,29.7,28.5,24.5,21.1,14.2.HR ESI-MS[M+H]⁺m/z＝603.1907(calcd for C₃₄H₂₈ClN₆O₃,603.1911).

化合物A和B8反应得到化合物C8。收率：75％，黄色固体，Mp＞250℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ_H 8.17-8.11(m,2H),7.82(d,J＝8.8Hz,2H),7.77-7.70(m,3H),7.59-7.54(m,3H),7.39-7.29(m,3H),7.04(s,2H),6.93(s,2H),5.28(s,2H),4.63(t,J＝6.5Hz,2H),4.32(t,J＝5.4Hz,2H),3.85(s,3H),2.26-2.17(m,2H),1.86(q,J＝6.3Hz,2H).¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ_C 207.0,171.2,160.2,159.5,139.6,130.9,130.9,128.6,127.1,127.1,124.4,123.5,122.7,118.6,115.2,115.2,114.4,114.4,108.9,108.3,105.0,69.6,62.1,60.4,55.4,49.8,35.0,31.5,30.9,30.1,29.7,28.5,24.5,21.1,14.2.HR ESI-MS[M+H]⁺m/z＝599.2413(calcd for C₃₅H₃₁N₆O₄,599.2407).

化合物A和B9反应得到化合物C9。收率：79％，黄色固体，Mp＞250℃。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ_H 8.19(dd,J＝18.5,10.1Hz,2H),7.87(d,J＝8.7Hz,2H),7.80-7.73(m,3H),7.62(s,1H),7.46(s,1H),7.41(s,1H),7.35(t,J＝8.0Hz,1H),7.24(d,J＝7.4Hz,1H),7.16(d,J＝2.1Hz,1H),7.07(d,J＝8.7Hz,2H),6.92(dd,J＝8.3,2.5Hz,1H),5.31(s,2H),4.67(t,J＝6.7Hz,2H),4.37(s,2H),3.87(s,3H),2.94(d,J＝36.3Hz,1H),2.06(s,2H),1.89(q,J＝6.2Hz,2H).¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ_C 207.0,171.2,160.1,159.8,152.8,144.3,141.8,136.1,131.2,131.2,130.0,129.6,129.1,127.0,122.8,118.4,118.2,115.2,115.2,114.4,111.5,109.0,105.0,69.6,62.1,60.4,55.4,55.4,49.8,30.9,30.9,28.4,24.6,21.1,14.2.HR ESI-MS[M+H]⁺m/z＝599.2396(calcd for C₃₅H₃₁N₆O₄,599.2407).

化合物A和B10反应得到化合物C10。收率：73％，黄色固体，Mp＞250℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ_H 8.23-8.13(m,2H),7.97-7.89(m,1H),7.85-7.71(m,4H),7.70-7.59(m,3H),7.54(dd,J＝8.0,1.5Hz,1H),7.42(s,1H),7.35(d,J＝8.0Hz,1H),7.09(d,J＝8.9Hz,2H),5.32(s,2H),4.69(t,J＝6.4Hz,2H),4.37(t,J＝5.5Hz,2H),2.27(t,J＝6.6Hz,2H),1.95-1.83(m,2H),1.27(s,1H).¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ_C 207.0,171.2,159.5,152.3,144.4,136.4,134.6,133.7,132.6,131.5,129.5,127.8,127.8,127.6,127.6,126.7,122.7,115.4,115.4,108.4,104.9,69.6,62.2,60.4,60.4,49.8,30.9,30.9,28.6,24.5,21.1,21.1,14.2.14.2.HR ESI-MS[M+H]⁺m/z＝637.1517(calcd for C₃₄H₂₇Cl₂N₆O₃,637.1522).

化合物A和B11反应得到化合物C11。收率：78％，黄色固体，Mp＞250℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ_H 8.35-8.02(m,2H),7.90-7.74(m,3H),7.64(s,1H),7.54(d,J＝8.7Hz,2H),7.45(d,J＝7.6Hz,1H),7.01(d,J＝8.9Hz,2H),6.96-6.68(m,2H),5.29(d,J＝14.6Hz,2H),4.71-4.51(m,2H),4.40-4.24(m,2H),3.95(d,J＝6.4Hz,6H),2.25(s,2H),2.13-1.60(m,3H),1.36-1.17(m,2H).¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ_C 207.0,171.2,158.6,152.4,150.9,149.0,144.5,140.5,129.3,129.0,128.7,128.0,127.2,127.2,126.9,124.1,122.7,118.7,115.3,115.3,110.9,110.6,108.1,105.1,69.5,62.1,60.4,56.0,56.0,49.7,30.9,30.9,28.5,24.6,21.1,14.2.HR ESI-MS[M+H]⁺m/z＝629.2499(calcd for C₃₆H₃₃N₆O₅,629.2512).

化合物A和B12反应得到化合物C12。收率：83％，黄色固体，Mp＞250℃。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ_H 8.47(d,J＝33.2Hz,1H),8.22(s,1H),7.91(d,J＝12.4Hz,2H),7.79(d,J＝8.4Hz,3H),7.57(d,J＝8.8Hz,1H),7.49-7.40(m,1H),7.28(s,5H),7.15-6.92(m,2H),5.26(d,J＝10.1Hz,1H),4.69(s,1H),4.55(s,1H),4.46-4.28(m,2H),3.02-2.91(m,1H),2.28(t,J＝7.7Hz,2H),2.16-1.77(m,3H),1.29-1.26(m,6H),0.90(t,J＝6.6Hz,1H).¹³CNMR(125MHz,CDCl₃)δ_C 159.5,159.2,151.5,142.8,141.2,132.1,129.5,129.5,129.0,127.5,127.5,127.3,127.3,127.0,125.2,118.7,118.7,115.9,115.9,109.3,106.1,68.7,61.8,60.2,49.6,33.9,31.2,29.5,27.1,25.7,24.0,24.0,22.6,21.2,15.7,14.6,14.4.HRESI-MS[M+H]⁺m/z＝611.2766(calcd for C₃₇H₃₅N₆O₃,611.2771).

化合物A和B13反应得到化合物C13。收率：81％，黄色固体，Mp＞250℃。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ_H 11.96(s,1H),10.92(s,1H),8.36(s,1H),8.11(d,J＝13.0Hz,3H),7.97(d,J＝6.3Hz,2H),7.80(s,3H),7.69(s,1H),7.45(s,1H),7.24(d,J＝8.6Hz,2H),5.27(s,2H),4.55(d,J＝7.8Hz,2H),4.29(s,2H),2.19(d,J＝7.1Hz,2H),1.85(s,2H).HR ESI-MS[M+H]⁺m/z＝536.2050(calcd for C₂₉H₂₆N₇O₄,536.2046).

实施例8：细胞培养

在37℃和5％CO₂的环境中，将细胞培养在含有10％胎牛血清(FBS)(Gibco，GrandIsland，NY，USA)和1％青霉素-链霉素的培养基中。A549细胞来源于上海细胞生物研究所细胞库。U87-MG细胞(Cat.#LX78457)购自复旦大学(中国上海)。Bel-7402细胞(Cat.#FH98464)由中国上海福恒细胞中心提供。231和L02细胞来自海洋药物实验室。U87-MG和231细胞在DMEM培养液(KeyGEN BioTECH，中国)中培养。A549、Bel-7402和L02细胞在1640培养液(KeyGEN Bio-TECH，中国)中培养。

实施例9：化合物C1-C13对4种癌细胞体外毒性的测定

1、实验方法：

细胞株：四种癌细胞：人胶质瘤细胞(U87-MG)、人乳腺癌细胞(231)、人肺腺癌细胞(A549)、人肝细胞癌细胞(Bel-7402)和两种正常细胞：人正常肝细胞(L02)、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。

用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞活力后，将细胞接种在96孔板，并用不同的化合物进行培养。具体样品分别为：化合物1：

化合物2：

化合物3：/>

以及化合物C1-C13，浓度均为8μmol/L。

48h后，去掉旧的培养液，加入新的含有CCK8的培养液，37℃孵育1h，用微量分光光度计测450nm处的吸光度。所有实验每组平行做3次。

2、实验结果

细胞活性测试结果如下表1所示。

表1：不同化合物处理48h对不同细胞株的抑制率

由以上数据可以看出化合物C4对U87-MG和231细胞有明显的抑制增殖作用，而其他所有化合物对四个癌细胞和两个正常细胞的细胞毒性都较小或没有，可以看出，并非任意查尔酮吩嗪杂化分子均能在对正常细胞的细胞毒性都较小的同时，抑制增殖U87-MG和231细胞，并且对正常细胞的细胞毒性都较小。

实施例10：RNA测序分析检测化合物C4对U87-MG细胞的基因表达的影响

1、实验方法：

接种于6孔板中的U87-MG细胞用化合物C4的二甲基亚砜(DMSO)溶液(8μmol/L)处理24h，用Transzol试剂(Transgen，中国北京)提取细胞总RNA。RNA-seq转录组文库和质量控制由Majorbio(中国上海)完成。RNA质量由2100生物分析仪(Agilent)测定，并使用ND-2000(NanoDrop Technologies)进行定量。RNA-seq转录组文库按ployA方法制备。经TBS380定量后，用Illumina HiSeq xten/NovaSeq 6000测序仪(阅读长度为2×150bp)对RNA-seq转录组文库进行测序。为了识别两个不同样本之间的DEGs(差异表达基因)，根据每百万阅读转录本(TPM)方法计算每个转录本的表达水平。用Q值≤0.05的DESeq2/DEGseq/Edger进行差异表达分析，用Gotools和KOBAS进行GO功能和KEGG通路分析。

2、实验结果：

化合物C4对U87-MG细胞中628个基因的mRNA水平有影响，细胞中许多显著不同的基因与铁死亡相关(图1)，在化合物C4处理后，铁死亡相关基因SLC7A11、GPX4、HMOX1、TFR和FTH的mRNA水平升高(图2)。且发现铁死亡与化合物C4在脑胶质瘤中的抗癌机制密切相关(图3)。同样，与对照组相比，基因集富集分析(GSEA)也表明，在化合物C4处理后，与铁死亡相关基因上调(图4)。因此，我们初步推测化合物C4可能诱导脑胶质瘤细胞铁死亡。

实施例11：化合物C4诱导的细胞死亡与脂质过氧化物的积累有关

1、实验方法：

接种于6孔板中的U87-MG细胞用化合物C4的二甲基亚砜(DMSO)溶液(0μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L)处理12h、24h和48h，取出含有化合物C4的培养液，进行以下测定：

(1)脂质ROS测定：

脂质ROS用C11-BODIPY^581/591(Thermo Fisher Science,MA,USA)染色。在37℃的黑暗中用含1％C11-BODIPY^581/591的无胎牛血清培养30min。收集细胞，并在PBS中重新悬浮。用FACSCelesta流式细胞仪(Becton，Dickins on and Company，America)进行细胞计数。用Flowjo进行数据量化。所有实验中每组N≥3。

(2)丙二醛含量的测定：

脂质过氧化检测试剂盒(Cat.#S0131S，Beyotime，中国上海)用于检测细胞内丙二醛(MDA)。丙二醛在高温、酸性环境中与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红色的MDA-TBA加合物。在532nm波长处测定MDA-TBA加合物的吸光度。所有实验中每组N≥3。

2、实验结果：

2μM、4μM和8μM化合物C4作用12h、24h和48h后，细胞内脂质ROS水平发生明显变化，如图5A和5B所示，化合物C4分别以剂量和时间依赖的方式增加脑胶质瘤细胞的脂质ROS水平。因为丙二醛是脂质过氧化物在细胞内的终产物，因此我们检测了化合物C4对脑胶质瘤细胞中丙二醛(MDA)含量的影响。如图5C所示，化合物C4以剂量依赖的方式显著增加丙二醛的积累，说明化合物C4诱导的细胞死亡与脂质过氧化物的积累有关。

实施例12：化合物C4作用导致细胞内铁离子过载

1、实验方法：

接种于6孔板中的U87-MG细胞用化合物C4的二甲基亚砜(DMSO)溶液(0μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L)处理12h、24h和48h，取出含有化合物C4的培养液，进行以下测定：

铁检测试剂盒(Cat.A039-2-1，中国南京建城生物工程研究所)，用于检测胶质瘤细胞U87-MG中铁离子的含量。铁蛋白中的铁和蛋白质在酸性溶液和还原剂存在下被分离。高价铁被还原为亚铁，亚铁与联吡啶结合形成粉红色络合物，在520nm波长处测定了络合物的吸光度。所有实验中每组N≥3。

2、实验结果：

细胞内铁含量测定显示，化合物C4作用12h、24h和48h后，胶质瘤细胞中铁过载(图5D)。可以看出，化合物C4能够导致细胞内铁离子过载。

实施例13：化合物C4处理后细胞内与铁死亡有关蛋白的含量检测

1、实验方法：

接种于6孔板中的U87-MG细胞用化合物C4的二甲基亚砜(DMSO)溶液(0μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L)处理24h，取出各组含有化合物C4的培养液，进行以下测定：

(1)实时定量PCR：

用Transzol试剂(Transgen，中国，北京)从样品中提取RNA。用9μg的核糖核酸通过Revertaid Master Mix(M1631，Thermo Fisher Science)扩增。以β-肌动蛋白为内对照，使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme，中国，南京)，通过qRT-PCR检测其mRNA水平的表达。所有实验中每组N≥3。

(2)免疫印迹分析：

免疫印迹法检测蛋白水平。将每个样品10μg蛋白加载到10％-12％的凝胶上进行电泳，以分离目的蛋白。将蛋白质转移到PVDF膜上，用无蛋白快速封闭缓冲液(EpiZyme,中国上海)封闭30min后，在4℃下与一抗孵育过夜，然后在室温下与二抗孵育40min。采用ECL蛋白印迹检测试剂(#E411，Vazyme Nanjing，中国)进行检测。用于免疫印迹的主要抗体是：SLC7A11(#386116，ZENBIO Chengdu,中国)、GPX4(#381958，ZENBIO Chengdu,中国)、HMOX1(#380753，ZENBIO Chengdu,中国)、转铁蛋白受体(#AF5343，Affinity Biosciences)、铁蛋白重链(#DF6278，Affinity Biosciences)、抗β-肌动蛋白(#380624，ZENBIO Chengdu,中国)。所有实验中每组N≥3。

2、实验结果：

经化合物C4处理后，SLC7A11和HOMX-1上调，而GPX4和FTH均下调(图6A和6B)。FTH蛋白水平的明显下调证明化合物C4可能通过促进铁蛋白的降解而诱发铁死亡。

综上所述，式(Ⅰ)所示化合物(即化合物C4)对脑胶质瘤和乳腺癌细胞U87-MG、231细胞具有最好的抗增殖活性并可诱导U87-MG细胞发生铁死亡，其链接键显著提升了铁死亡活性，进而抑制脑胶质瘤细胞的增殖，并能够通过铁死亡途径消除肿瘤细胞特别是脑胶质瘤细胞，本发明的提出拓宽了吩嗪类化合物潜在的抗肿瘤作用范围。

Claims (9)

1.一种查尔酮吩嗪杂化分子，其特征在于，所述查尔酮吩嗪杂化分子为式(Ⅰ)所示化合物：

2.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的查尔酮吩嗪杂化分子。

3.权利要求1所述的查尔酮吩嗪杂化分子或权利要求2所述的药物组合物在制备肿瘤细胞铁死亡诱导剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞为脑胶质瘤细胞。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞为人脑星形胶质母细胞瘤细胞。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞为人脑星形胶质母细胞瘤细胞U87-MG。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述铁死亡诱导剂能够上调肿瘤细胞SLC7A11基因和HOMX-1基因表达和/或下调GPX4基因和FTH基因表达。

8.权利要求1所述的查尔酮吩嗪杂化分子或权利要求2所述的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为脑胶质瘤和/或乳腺癌。

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