CN115671272B - 一种矿化弓形虫速殖子颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种能长期保存的矿化弓形虫速殖子颗粒的制备方法，以及该颗粒作为疫苗对小鼠的免疫保护应用。本发明以马尔文ζ电位仪测定弓形虫速殖子表面带负电荷，通过原位矿化手段，在速殖子表面引入磷酸钙外壳，制备矿化弓形虫速殖子颗粒，评价该颗粒的稳定性、毒力、致病力及其对小鼠的免疫保护效果。结果表明，矿化壳能延长弓形虫速殖子低温、常温下保存时间；矿化颗粒丧失了弓形虫的毒力和致病性；矿化速殖子颗粒对小鼠急、慢性弓形虫感染均具有免疫保护作用。本发明推动了弓形虫疫苗的制备、储存、运输，为弓形虫疫苗的制备、保存及应用提供新的研究思路和技术手段。
Description
技术领域
本发明属于兽用生物制品研究技术领域，尤其涉及一种矿化弓形虫速殖子颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
弓形虫是顶复门原虫中非常重要的人兽共患病病原，它能够感染包括人在内的几乎所有恒温动物，全球目前约有三分之一人口受其感染。健康人群感染弓形虫后多呈隐性感染，而免疫缺陷者及孕妇感染后能引起严重的并发症甚至死亡。孕妇或孕畜感染后还可能导致流产、畸胎乃至死胎。临床上主要以磺胺类药物治疗弓形虫病，然而此类药物副作用大，对慢性弓形虫病无效，随着耐药虫株的出现，进一步限制了此类药物的使用。接种疫苗是防控弓形虫病最安全有效的措施。
目前针对弓形虫疫苗的研究主要集中在灭活疫苗、虫体组分疫苗、亚单位疫苗以及核酸疫苗等，但免疫保护效果均不理想。因此，具有更强免疫效果、更高保护效率的疫苗的研究成为一个重要问题。但目前唯一商品化的弓形虫弱毒苗ToxoVax仅限于部分地区山羊和绵羊使用，具有更广泛应用范围的弓形虫减毒活疫苗仍待研究。
弓形虫减毒活疫苗稳定性较差，储存及运输条件要求较高(一般为液氮存储和运输)，一旦存储或运输条件达不到要求，疫苗极易失活，疫苗免疫效果严重下降。对理想的弓形虫疫苗的要求是，疫苗具有良好的免疫原性及保护性，毒力和致病性均极大下降或者丧失，即使高接种量也不会具有安全隐患，同时能够在常温下长时间稳定保存，对急性、慢性弓形虫感染都具有良好保护效果等。因此开发能够常温保存的弓形虫疫苗是迫切需要解决的问题。
病毒相关疫苗的保存也有采用矿化技术的，授权公告号为CN107475207B的发明公开了一种矿化口蹄疫病毒样颗粒及其制备方法和应用。该发明利用口蹄疫VLPs大肠杆菌表达组装技术平台，通过基因工程手段，将三种能有效富集钙离子的矿化肽分别插入到口蹄疫病毒结构蛋白VP1的loop环中，结果表明，嵌合矿化肽的VP1与口蹄疫病毒的结构蛋白VP0以及VP3在大肠杆菌中能够成功表达并组装成完整的VLPs，且对组装效率并未造成影响，后用矿化剂成功实现了对病毒样颗粒的矿化，同时提高了口蹄疫病毒VLPs的组装效果。目前矿化的技术手段主要应用于病毒，还未曾有人将其应用于寄生虫上，主要是由于病毒和寄生虫在生物特性存在着较大差异，难以将病毒的矿化技术直接挪用到寄生虫上。
发明内容
发明目的：本发明的第一目的是提供一种矿化弓形虫速殖子颗粒，推动弓形虫疫苗由冷链疫苗向常温疫苗转化，为常温弓形虫疫苗的应用提供新的技术手段。
本发明的第二目的是提供一种矿化弓形虫速殖子颗粒的制备方法。
本发明的第三目的是提供一种矿化弓形虫速殖子颗粒在制备疫苗方面的应用。
技术方案：为了实现上述目的，本发明提供了一种矿化弓形虫速殖子颗粒，所述矿化弓形虫速殖子颗粒包括矿化弓形虫速殖子及其表面覆盖的磷酸钙外壳。
本发明还提供了一种矿化弓形虫速殖子颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)在细胞中培养弓形虫速殖子，待速殖子在细胞中快速生长分裂并溢出时，回收并纯化速殖子；
(2)将步骤(1)回收得到的速殖子加入pH为7.0～7.5包含HPO4 2-的矿化液I中反应；
(3)向步骤(2)中的反应液中继续添加pH为7.0～7.5包含Ca2+的矿化液II，反应完毕后离心即得。
优选的，步骤(1)所述细胞包括VERO细胞，所述弓形虫速殖子包括不同基因型弓形虫速殖子。
优选的，步骤(1)所述回收并纯化速殖子的方法包括：用注射器反复吹打所述细胞使其破裂，用灭菌的滤膜过滤弓形虫速殖子，将滤液离心并去除上清，以无FBS的DMEM培养基重悬。
优选的，步骤(2)中加入矿化液I中的弓形虫速殖子数量为2.2×106～2.6×106，对应加入的矿化液I用量为7～8mL，浓度为7～9nM/L；步骤(3)对应加入的矿化液II用量为1～1.2mL，Ca2+浓度为15～18nM/L。
含HPO42-和Ca2+浓度过低，弓形虫速殖子表面形成不了矿化壳；浓度过高，形成的矿化壳过厚或者包裹的不均匀，并容易产生更多的杂质沉淀。
优选的，其特征在于，步骤(2)的反应条件具体为，在4～25℃下颠倒混匀，反应30～45min；步骤(3)的反应条件具体为：4～25℃下颠倒混匀，反应2.5～3h
优选的，所述矿化液I为(NH4)2HPO4溶液，矿化液II为Ca(NO3)2溶液。
本发明还提供了一种所述的矿化弓形虫速殖子颗粒的保存方法，将所述的矿化弓形虫速殖子颗粒保存在含有FBS的DMEM培养基中。
本发明还提供了含有所述的矿化弓形虫速殖子颗粒的疫苗。
本发明还提供了所述的矿化弓形虫速殖子颗粒或所述的疫苗在制备保护动物免受弓形虫感染的制剂中的应用。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：通过原位矿化手段，在速殖子表面引入磷酸钙外壳，制备矿化弓形虫速殖子颗粒，评价该颗粒的稳定性、毒力、致病力及其对小鼠的免疫保护效果。结果表明，矿化壳能延长弓形虫速殖子低温、常温下保存时间；该颗粒丧失了弓形虫的毒力和致病性；矿化速殖子颗粒免疫小鼠后对小鼠急、慢性弓形虫感染具有免疫保护作用；本发明推动了弓形虫疫苗的制备、储存、运输，为弓形虫疫苗的制备、保存及应用提供新的研究思路和技术手段。
附图说明
图1为不同pH条件下弓形虫速殖子表面ζ电位；
图2为矿化弓形虫速殖子颗粒的扫描电镜结果；A：未矿化弓形虫速殖子；B：矿化弓形虫速殖子颗粒；
图3为矿化弓形虫速殖子毒力致病性评价；
图4为矿化弓形虫速殖子颗粒不同条件下稳定性分析；A：在不同浓度血清的DMEM培养基中，在不同温度放置1个月矿化速殖子颗粒接种小鼠7天后的腹腔清洗液中的弓形虫速殖子镜检结果；B-D：分别为在不同浓度血清的DMEM中，在不同温度放置3(B)、6(C)、9(D)个月后的矿化速殖子颗粒接种小鼠7天后，腹腔清洗液中弓形虫B1基因PCR检测结果；lane1-2：25℃无FBS DMEM保存的颗粒；lane3-4：25℃1％FBS DMEM保存的颗粒；lane5-6：25℃5％ FBS DMEM保存的颗粒；lane 7-8：4℃无FBS DMEM保存的颗粒；lane 9-10：4℃1％FBS DMEM保存的颗粒；lane 11-12：4℃5％FBS DMEM保存的颗粒；lane 13：阴性对照；
图5为矿化弓形虫速殖子颗粒免疫小鼠后的抗体水平；28d为一免后28d(28DPI)，88d为二免后59d(88DPI)；
图6为二免后59d(88DPI)矿化弓形虫速殖子颗粒免疫小鼠后不同细胞因子的表达水平；
图7为矿化弓形虫速殖子颗粒对小鼠急性感染的保护率；
图8为矿化弓形虫速殖子颗粒对小鼠慢性感染的保护；A：感染后小鼠存活率；B：PRU速殖子感染后30天，小鼠脑包囊数的减少情况。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1矿化弓形虫速殖子颗粒的制备
1、弓形虫RH株速殖子的收集
在细胞瓶中以VERO细胞体外培养RH株弓形虫速殖子(实验室保存)，虫体约70～80％溢出时，用巴氏吸管刮下残余贴壁细胞，以5mL注射器反复吹打VERO细胞使其破裂，用灭菌3μm滤膜过滤纯化弓形虫速殖子。过滤后，以700×g离心10min，弃上清，以无FBS DMEM培养基(Gibco货号：2445690)重悬。
分别配制pH＝4.1、5.4、6.4、7.0、7.5、8.0、8.5、9.3缓冲液，缓冲液成分为磷酸氢二钠/磷酸二氢钠混合液。将新鲜收集的RH株速殖子置于不同pH条件的缓冲液中，以马尔文粒子分析仪测量ζ电位，如图1所示，在此酸碱范围内，RH株速殖子表面均携带负电荷，过酸过碱均会破坏速殖子结构，同时也不利于矿化壳形成，所以采用pH7～7.5作为反应条件。
2、弓形虫速殖子颗粒的矿化
矿化率＝(1－反应后上清中速殖子数目/反应前加入的速殖子数目)*100％
用血细胞计数板计数2.4×106个新鲜收集的RH株速殖子，加入7.5mL pH7.5的8nM/L的(NH4)2HPO4中，在4℃下颠倒混匀，反应45min；然后向反应液中加入1.1mL pH＝7的16nM/L的Ca(NO3)2，4℃颠倒混匀，反应3h，350×g离心10min，分别收集上清和沉淀，通过血细胞计数板统计上清中未包被矿化壳的弓形虫速殖子数目，计算矿化率。之后用扫描电镜进行形态观察，结果显示该反应条件下，矿化壳杂质极少，而矿化率能达到85％。如图2所示，在扫描电镜下发现收集的沉淀中，矿化处理过的速殖子表面包裹有矿化壳，表明上述矿化处理可得到包裹矿化壳的矿化弓形虫速殖子颗粒。
矿化弓形虫速殖子颗粒安全性评价：将上述步骤制备得到的矿化弓形虫速殖子颗粒，以107个/只的剂量接种于ICR雄鼠(来源于扬州大学实验动物中心)腹腔，同时以100个/只新鲜收集的RH株弓形虫速殖子腹腔接种小鼠作为对照。如图3所示，对照组小鼠在接种后6～8天内全部死亡，而接种107个/只矿化弓形虫速殖子颗粒小鼠一直存活，表明该颗粒对小鼠的致病性及毒力几乎完全丧失。
实施例2矿化后弓形虫速殖子的保存
将实施例1中矿化后的同一批矿化弓形虫速殖子颗粒分别放在4℃、25℃，分别以无FBS、1％ FBS、5％ FBS DMEM作为存放介质，分别在放置1个月、3个月、6个月、9个月时取样，接种于ICR雄鼠(来源于扬州大学实验动物中心)腹腔，接种7d后取腹腔清洗液镜检。取小鼠腹腔清洗液提组织DNA，通过巢式PCR检测弓形虫特异基因B1基因(GENE ID：MN542678.1)确定矿化弓形虫速殖子颗粒的稳定性，B1基因为弓形虫特异性基因，基因全长194bp。如图4A所示，放置1个月的矿化弓形虫速殖子颗粒接种小鼠，腹腔清洗液中观察到速殖子存在；如图4B、C、D所示，放置3个月、6个月、9个月的矿化弓形虫速殖子颗粒接种小鼠7天后，均有B1基因条带，PCR鉴定结果呈阳性，表明矿化处理后弓形虫速殖子的完整性及活性在上述存放介质中可维持至少9个月。
实施例3矿化弓形虫速殖子颗粒免疫应答评价
生存率＝(1－每组存活小鼠数目/每组腹腔注射小鼠数目)*100％
矿化率＝(1－反应后上清中速殖子数目/反应前加入的速殖子数目)*100％
将新鲜收集的RH株速殖子按照实施例1方法进行矿化处理，计算得到矿化率为85％。取7周龄ICR雄鼠(来源于扬州大学实验动物中心)40只，每只注射0.4mL疫苗悬液(5％FBS DMEM+107个矿化弓形虫速殖子颗粒)，作为实验组；取7周龄ICR雄鼠(来源于扬州大学实验动物中心)40只，每只注射0.4mL不含矿化矿化弓形虫速殖子颗粒的保存液(5％ FBSDMEM)，作为对照组。
一免后28d，同时对实验组和对照组采血，通过ELISA测定血清中抗体水平。
一免后29d，再次对实验组每只小鼠注射0.4mL疫苗悬液(5％ FBS DMEM+107个矿化弓形虫速殖子颗粒)，对照组每只注射0.4mL不含矿化弓形虫速殖子颗粒的保存液(5％FBS DMEM)。
二免后59d，即一免后88d，再次对实验组和对照组采血，通过ELISA测定血清中抗体水平。同时取小鼠脾细胞，以本实验室制备的弓形虫全虫裂解抗原(TLA)刺激后，收集上清液，通过ELISA测定细胞因子水平。具体方法为，将细胞上清液按照ELISA试剂盒说明书(上海酶联生物科技有限公司；IL-4，货号：ml064310；IL-5，货号：ml063157；IL-6，货号：YJ063159；IL-10，货号：YJ037873；IL-23，货号：ml063140；IFN-γ，货号：YJ002277)稀释5倍，加入试剂盒预包被ELISA板反应孔中，37℃孵育1h；洗涤5次，拍干洗涤液，加入酶标试剂，37℃孵育15min后，加入终止液。加入终止液后15min内，用酶标仪测量OD值，带入标准曲线即可得到细胞因子含量。
结果表明，两次免疫后抗体水平均显著升高，且持续存在时间较长，一免后，矿化弓形虫速殖子可引起小鼠较强体液免疫，抗体水平均显著上升(图5)；二免后IgG1水平显著高于一免后(图5)，脾脏Th1和Th2型细胞因子(IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-23、IFN-γ)显著分泌，Th2型免疫应答更强烈(图6)。
矿化弓形虫速殖子颗粒对小鼠的免疫保护应用：急性感染保护试验，在上述实验组二免后，从中随机取10只小鼠，每只腹腔注射100个新鲜收集RH速殖子；从上述对照组随机取10只小鼠，同样每只腹腔注射100个新鲜收集RH速殖子。对两组小鼠生存率进行监测。结果如图7所示，矿化速殖子颗粒对弓形虫急性感染具有90％保护率，表明矿化弓形虫速殖子颗粒对小鼠急性弓形虫病具有良好的免疫保护性。
慢性感染保护试验，在上述实验组二免后，从中随机取10只小鼠，每只腹腔注射105个新鲜收集PRU速殖子(实验室保存)；从上述对照组随机取10只小鼠，同样每只腹腔注射105个新鲜收集PRU速殖子；每日观察并记录小鼠存活情况，持续观察30天。结果如图8所示，矿化速殖子颗粒免疫小鼠慢性感染存活率达100％，并且脑包囊数目显著减低，实验组比对照组降低超过80％。
上述结果说明，本实验的矿化弓形虫速殖子颗粒不仅对小鼠急性弓形虫感染具有免疫保护效果，对慢性弓形虫感染也具有免疫保护能力。
Claims (8)
1.一种矿化弓形虫速殖子颗粒，其特征在于，所述矿化弓形虫速殖子颗粒包括矿化弓形虫速殖子及其表面覆盖的磷酸钙外壳，所述矿化弓形虫速殖子颗粒的制备方法，包括以下步骤：
（1）在细胞中培养弓形虫速殖子，待速殖子在细胞中快速生长分裂并溢出时，回收并纯化速殖子；
（2）将步骤（1）回收得到的速殖子加入pH为7.0～7.5包含HPO42-的矿化液I中反应；
（3）向步骤（2）的反应液中继续添加pH为7.0～7.5包含Ca2+的矿化液II，反应完毕后离心即得；
步骤（2）中加入矿化液I中的弓形虫速殖子数量为2 .2×106～2 .6×106个，对应加入的矿化液I用量为7～8mL，HPO42-浓度为7～9nM/L；步骤（3）对应加入的矿化液II用量为1～1.2mL，Ca2+浓度为15～18nM/L；
步骤（2）的反应条件具体为，在4～25℃下颠倒混匀，反应30～45min；步骤（3）的反应条件具体为 4～25℃下颠倒混匀，反应2 .5～3h。
2.权利要求1所述的一种矿化弓形虫速殖子颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）在细胞中培养弓形虫速殖子，待速殖子在细胞中快速生长分裂并溢出时，回收并纯化速殖子；
（2）将步骤（1）回收得到的速殖子加入pH为7.0~7.5包含HPO42-的矿化液I中反应；
（3）向步骤（2）的反应液中继续添加pH为7.0~7.5包含Ca2+的矿化液II，反应完毕后离心即得；
步骤（2）中加入矿化液I中的弓形虫速殖子数量为2 .2×106～2 .6×106个，对应加入的矿化液I用量为7～8mL，HPO42-浓度为7～9nM/L；步骤（3）对应加入的矿化液II用量为1～1.2mL，Ca2+浓度为15～18nM/L；
步骤（2）的反应条件具体为，在4～25℃下颠倒混匀，反应30～45min；步骤（3）的反应条件具体为 4～25℃下颠倒混匀，反应2 .5～3h。
3.根据权利要求2所述的一种矿化弓形虫速殖子颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述细胞包括VERO细胞，所述弓形虫速殖子包括不同基因型弓形虫速殖子。
4.根据权利要求2所述的一种矿化弓形虫速殖子颗粒的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述回收并纯化速殖子的方法包括：用注射器反复吹打所述细胞使其破裂，用灭菌的滤膜过滤弓形虫速殖子，将滤液离心并去除上清，以无FBS的DMEM培养基重悬。
5.根据权利要求2所述的一种矿化弓形虫速殖子颗粒的制备方法，其特征在于，所述矿化液I为（NH4）2HPO4溶液，所述矿化液II为Ca（NO3）2溶液。
6.一种权利要求1所述的矿化弓形虫速殖子颗粒的保存方法，其特征在于，将权利要求1所述的矿化弓形虫速殖子颗粒保存在含有FBS的DMEM培养基中。
7.含有权利要求1所述的矿化弓形虫速殖子颗粒的疫苗。
8.权利要求1所述的矿化弓形虫速殖子颗粒或权利要求7所述的疫苗在制备保护动物免受弓形虫感染的制剂中的应用。
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