CN115671112A - 阿法替尼在防治二型糖尿病中的新用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种阿法替尼或其药学上可接受的盐在治疗和/预防二型糖尿病中的新用途，属于医药技术领域。本发明实验结果表明Afatinib可以通过PKC和AMPK上调L6肌细胞中GLUT4的表达及转位及葡萄糖摄取，为治疗和/预防二型糖尿病的提供了一种新药物和思路。
Description
技术领域
本发明属于医疗领域，具体的说，涉及一种阿法替尼在防治二型糖尿病中的用新途。
背景技术
二型糖尿病(Type 2diabetes mellitus,T2DM)作为糖尿病的主要发病类型，占该疾病的90％以上。随着社会经济的发展和生活方式的改变，二型糖尿病的发病率在过去几十年中都显著增加。二型糖尿病是一种多基因遗传性复杂疾病，其特征为胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足，伴随因胰岛素分泌或作用缺陷所引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱。大多数二型糖尿病为多个基因和多种环境因素共同参与并相互作用的多基因多环境因素复杂病。胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能缺陷是二型糖尿病的基本特征。葡萄糖转运体4(GlucoseTransporter 4,GLUT4,SLC2A4)是一种跨膜的大分子蛋白，主要在骨骼肌和脂肪组织表达。GLUT4在胰岛素调控下快速响应机体的血糖变化，对维持体内的血糖稳态具有重要作用。在餐后，人体内血液中葡萄糖的增加导致胰岛素的分泌，这种激素反应会防止肝脏中的糖异生，并通过调控GLUT4表达，从细胞储存囊泡(GLUT4 storage vesicle,GSV)转运到质膜上以调控葡萄糖摄取到肌肉组织和脂肪组织中。GLUT4是正常葡萄糖稳态和胰岛素抵抗的关键参与者。目前的研究证明二型糖尿病与葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)的表达和转位缺陷有关。因此，可以针对GLUT4为靶点寻找筛选出治疗二型糖尿病的新药物。
阿法替尼(Afatinib,BIBW2992)是一种口服的、不可逆的酪氨酸激酶抑制剂，在许多肿瘤细胞中具有药物活性。其化学式为C24H25ClFN5O3，相对分子质量为485.94。至今为止，阿法替尼在临床上主要用于治疗肺癌及宫颈癌等癌症，其作用机制主要是由于阿法替尼是不可逆转的ErbB受体酪氨酸激酶家族阻断剂，能够阻断癌细胞生长和分裂的相关通道。利用Afatinib促进GLUT4表达及转运从而治疗二型糖尿病的研究，国内外尚未有相关的报道。
发明内容
本发明提供了一种阿法替尼或其药学上可接受的盐在治疗和/或预防二型糖尿病中的用途。
本发明还提供了阿法替尼或其药学上可接受的盐在制备GLUT4活性促进剂中的用途，且该GLUT4活性促进剂用于治疗和/或预防二型糖尿病。
本发明还提供了阿法替尼或其药学上可接受的盐在制备PKC激活剂中的用途，且该PKC激活剂用于治疗和/或预防二型糖尿病。
本发明还提供了阿法替尼或其药学上可接受的盐在制备AMPK激活剂中的用途，且该AMPK激活剂用于治疗和/或预防二型糖尿病。
本发明提供一种用于治疗二型糖尿病的药，该药包含阿法替尼或其药学上可接受的盐和一种或多种药学上可接受的药物载体。
进一步地，该药的剂型为片剂、散剂、汤剂、丸剂、胶囊剂。
进一步地，所述药物载体包括：表面活性剂、润滑剂、吸收促进剂、稀释剂。
进一步地，所述GLUT4活性促进剂，其剂型为片剂、散剂、汤剂、丸剂、胶囊剂。
进一步地，所述激活剂，其剂型为片剂、散剂、汤剂、丸剂、胶囊剂。
本发明的有益效果：本发明发现了阿法替尼用于治疗和/预防二型糖尿病的新用途。
附图说明
图1为Afatinib促进L6肌细胞的葡萄糖摄取实验中，测得的吸光度柱状图；
图2为Afatinib促进L6肌细胞GLUT4表达图；
图3为Afatinib促进L6肌细胞GLUT4转运图；
图4为Afatinib对L6肌细胞及GLUT4-ko-L6肌细胞葡萄糖摄取的影响；
图5为Afatinib可以通过调控L6肌细胞中PKC及AMPK的磷酸化，从而促进L6肌细胞内GLUT4的表达；
图6为Afatinib促进L6肌细胞的葡萄糖摄取与Ca2+相关；
图7为Afatinib在L6肌细胞中调控GLUT4转运及葡萄糖摄取机制总结图；
图中，Control表示对照组，Metformin表示盐酸二甲双胍阳性药物组，PMA表示佛波酯(phorbol ester，PMA)，Insulin表示胰岛素给药组，Afatinib(30μM，50μM，100μM)表示Afatinib的三个高中低剂量给药组。
具体实施方式
下述是结合具体实施例和实验例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不是用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件。
实施例
测试Afatinib对L6肌细胞GLUT4转膜与葡萄糖摄取的影响
1、实验试剂及材料
Afatinib购自Selleck公司，α-MEM培养基、胰蛋白酶(美国Gibco公司)，FBS胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，细胞培养皿、96孔板、6孔板(Nest公司)，2-NBDG葡萄糖试剂盒(英科新创科技股份有限公司)，激光共聚焦显微镜(Carl Zeiss Jena公司)，荧光酶标仪(Thermo Fisher公司)，BCA蛋白定量检测试剂盒、特超敏ECL化学发光试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒(上海雅酶生物科技有限公司)。
2、测试Afatinib对L6肌细胞的葡萄糖摄取的影响
使用葡萄糖(GLU-OX)测定试剂盒(葡萄糖氧化酶法)检测药物对细胞葡萄糖摄取活性的影响。将生长状态良好的细胞以1×104-5×104个细胞/孔的密度接种于96孔板中。待细胞生长至80-90％后，将培养基更换为分化培养基(2％FBS)诱导细胞分化为肌管细胞，每24h换液(2％FBS分化培养基)一次，连续培养7天。每个药物浓度设置6个重复孔，同时设置阴性空白对照组和阳性对照胰岛素组。将分化好的细胞用无血清α-MEM培养基饥饿2h，然后吸出所有旧液，每孔加入100μL的无血清α-MEM(空白对照)、100nM胰岛素(阳性对照)、三个梯度浓度Afatinib(30μM、50μM、100μM)共五组。药物作用30min后另取一个新的96孔板，用葡萄糖摄取测定试剂盒中的方法测定L6肌细胞的葡萄糖摄取量。酶标仪测量OD 505nm值。结果如附图1所示。
3、利用Western Blotting检测Afatinib对L6肌细胞中GLUT4蛋白的表达的影响
将分化好的L6肌细胞饥饿2h，按照设置的组别加入相应浓度的药物处理30min。将细胞置于冰上以终止药物的作用。用4℃预冷的PBS洗涤细胞3次后吸干，每皿加入100μL裂解液(RIPA缓冲液：PMSF：磷酸酶抑制剂A：磷酸酶抑制剂B＝100：1：1：1)反应2min，并收集于1.5mL的EP管中，置于冰上裂解30min。4℃，12000g离心10min，吸取含有细胞总蛋白的上清液于新的EP管中，弃去底部的细胞碎片沉淀。使用试剂盒进行检测蛋白浓度。将获得的蛋白溶液按照5:1的比例加入5×loading buffer，并置于95℃恒温加热器中反应10min，使蛋白质充分变性。所得蛋白样品经过SDS-PAGE电泳、转膜、封闭后孵育相应的一抗和二抗。然后用ECL显影检测蛋白条带。
4、免疫荧光实验检测Afatinib对L6肌细胞中GLUT4转运的影响
本发明使用稳定表达myc-GLUT4-mOrange的L6肌细胞(myc-GLUT4-mOrange-L6)作为研究对象。使用LSM 700激光共聚焦显微镜测量myc-GLUT4-mOrange-L6肌细胞内GLUT4的表达及转运情况。将生长状态良好的myc-GLUT4-mOrange-L6肌细胞接种在圆玻片上，待细胞密度长至50％左右后诱导分化。将分化好的细胞用无血清α-MEM培养基饥饿2h后药物作用30min。在室温下用3％多聚甲醛固定细胞，50μM甘氨酸以去除背景杂质，2％BSA封闭。接着，孵育相应的一抗二抗，封片剂后制成玻片。在激光共聚焦显微镜下，测定488nm和555nm激发波长下的荧光强度，观察细胞中GLUT4表达的红色荧光及GLUT4与质膜融合的FITC绿色荧光。使用Zen 2010软件对具有共定位现象的细胞进行计数。
5、利用Crispr Cas9技术构建GLUT4-ko-L6肌细胞系，检测Afatinib调控L6肌细胞的葡萄糖摄取与GLUT4的关系
通过单菌落PCR及测序筛选得到单克隆PX458表达载体，扩大培养后提取PX458质粒载体。利用BpsⅠ快切酶对PX458质粒载体进行定点酶切，得到线性的PX458质粒载体。将酶切后的线性载体与目的片段连接后转化Stb13感受态细胞，利用氨苄青霉素LB培养基筛选阳性克隆。阳性克隆扩大培养后提取质粒，进行质粒PCR检测与测序鉴定。将构建成功的PX458-SLC2A4重组载体用Lipo3000转染到L6肌细胞中，48h后用显微镜观察转染效率。将转染的细胞经流式细胞仪进行分选，得到单克隆突变株细胞，扩大培养后检测其在蛋白水平上的表达，获得成功构建的GLUT4敲除的L6肌细胞系(GLUT4-ko-L6)。并利用葡萄糖(GLU-OX)测定试剂盒(葡萄糖氧化酶法)检测Afatinib对L6肌细胞及GLUT4-ko-L6肌细胞的葡萄糖摄取活性的影响。
6、利用Western Blotting检测Afatinib对L6肌细胞中PKC及AMPK磷酸化的影响
目前的研究表明，蛋白激酶B(Protein kinase B,Akt/PKB)及其上下游蛋白的磷酸化、AMP激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)的激活、蛋白激酶C(Protein kinase,PKC)通路的磷酸化等多种信号通路都参与了GLUT4的转位。利用WesternBlotting检测Afatinib作用后，L6肌细胞中PKC及AMPK磷酸化水平。另外，钙离子作为第二信使，细胞溶质中Ca2+的增加会诱导肌肉收缩，进而促进细胞内的GLUT4转位与细胞膜融合。使用Fluo-4 AM荧光染料将细胞内Ca2+染色以确定它在细胞内的含量。在激光共聚焦显微镜下，实时监测Afatinib刺激下30min内L6肌细胞中Ca2+的变化。
实验结果
数据以平均值±标准误(X±SE)表示，组间显著性差异检验用t检验及相关分析。
图1为Afatinib促进L6肌细胞的葡萄糖摄取图。如图1所示，在用不同浓度的Afatinib(30μM、50μM或100μM)处理L6肌细胞后，使用葡萄糖(GLU-OX)测定试剂盒(葡萄糖氧化酶法)检测Afatinib对L6肌细胞葡萄糖摄取活性的影响。结果表明Afatinib可以促进L6肌细胞的葡萄糖摄取，并具有显著性。胰岛素(Insulin)作为促进葡萄糖摄取的阳性药，能够显著促进L6肌细胞的葡萄糖摄取，通过对比发现，Afatinib对L6肌细胞葡萄糖摄取的促进效果与胰岛素(Insulin)相当。
图2为Afatinib促进L6肌细胞GLUT4表达图。如图2所示，加入Afatinib作用L6肌细胞30min后，利用激光共聚焦显微镜实时监测myc-GLUT4-mOrange-L6肌细胞中的GLUT4表达水平，通过统计发现，L6肌细胞中的GLUT4表达量随时间增加呈现上升趋势。同时，在用不同浓度的Afatinib(30μM、50μM或100μM)处理L6肌细胞后，利用Western Blot技术检测L6肌细胞中GLUT4蛋白表达水平，统计发现Afatinib能够显著促进L6肌细胞中GLUT4蛋白的表达水平。结果表明Afatinib促进了L6肌细胞中GLUT4表达。
图3为Afatinib促进L6肌细胞GLUT4转运图。Insulin作为GLUT4转运的激动剂，能够上调L6肌细胞中GLUT4的表达并促进GLUT4转运至细胞质膜上。在加入Afatinib(50μM)后，myc-mOrange-L6肌细胞膜的荧光强度明显增强，说明Afatinib能够上调L6肌细胞中GLUT4的表达并促进GLUT4转运至细胞质膜上。以上结果表明Afatinib可以促进L6肌细胞GLUT4转运。
图4为Afatinib对L6肌细胞及GLUT4-ko-L6肌细胞葡萄糖摄取的影响。GLUT4作为L6肌细胞运输葡萄糖的主要葡萄糖转运体，我们发现在100nM Insulin或Afatinib作用下，GLUT4-ko-L6敲除细胞相较于L6肌细胞的葡萄糖摄取能力明显降低。结合前面的实验结果，可以发现Afatinib主要通过促进GLUT4的表达及转运来调控L6肌细胞的葡萄糖摄取。
图5为Afatinib可以通过调控L6肌细胞中PKC及AMPK的磷酸化，从而促进L6肌细胞内GLUT4的表达。分别使用Insulin、二甲双胍(Metformin,MET)和佛波酯(Phorbol ester,PMA)作为Akt、AMPK和PKC通路的阳性对照。结果显示，不同浓度的Afatinib处理后，AMPK和PKC的磷酸化水平增强。在蛋白水平上，使用PI3K/Akt通路抑制剂Wortmannin，AMPK通路抑制剂Compound C和PKC通路抑制剂
进行了验证，利用Western blot观察在抑制剂孵育30min后，Afatinib对L6肌细胞中GLUT4蛋白的表达水平的影响。结果显示，
和Compound C能够抑制Afatinib刺激的GLUT4蛋白的表达。以上结果表明，Afatinib可以通过调控L6肌细胞中PKC及AMPK的磷酸化，从而促进L6肌细胞内GLUT4的表达。
图6为Afatinib促进L6肌细胞的葡萄糖摄取与Ca2+相关。在100μM Afatinib作用30min内细胞内Ca2+水平显著提高，并以时间依赖性升高。通过检测不同的外钙条件下L6肌细胞的葡萄糖摄取情况，我们发现在没有Insulin或Afatinib的情况下，细胞的葡萄糖摄取量没有显着差异。但与2mM Ca2+(2Ca2+)环境相比，在0mM Ca2+(0Ca2+)和0mM Ca2++10μMBAPTA-AM环境细胞葡萄糖摄取能力明显低于2Ca2+环境的细胞。同样，在0Ca2++10μM BAPTA-AM环境中，Insulin或Afatinib促进葡萄糖摄取的能力被显著抑制。
实验结论
通过以上实验，我们可以得出以下结论：
Afatinib具有良好的促L6肌细胞GLUT4上膜的活性。
AMPK是调控细胞和全身能量代谢的重要蛋白。作为细胞能量的调控者，AMPK在糖脂代谢和调控代谢异常(如糖尿病，肥胖和癌症)中都起着重要的作用，因此AMPK是治疗代谢疾病的重要靶标。激活AMPK通路可以增加脂肪酸氧化，抑制脂质合成。研究显示AMPK调控大量不同的代谢通路，它也是GLUT4的调控蛋白之一。Afatinib可以通过PKC和AMPK上调L6肌细胞中GLUT4的表达及转位及葡萄糖摄取。同时，Afatinib调控L6肌细胞中葡萄糖摄取受到钙的影响。
最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其做出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (9)
1.阿法替尼或其药学上可接受的盐在治疗和/或预防二型糖尿病中的用途。
2.阿法替尼或其药学上可接受的盐在制备GLUT4活性促进剂中的用途，且该GLUT4活性促进剂用于治疗和/或预防二型糖尿病。
3.阿法替尼或其药学上可接受的盐在制备PKC激活剂中的用途，且该PKC激活剂用于治疗和/或预防二型糖尿病。
4.阿法替尼或其药学上可接受的盐在制备AMPK激活剂中的用途，且该AMPK激活剂用于治疗和/或预防二型糖尿病。
5.一种用于治疗二型糖尿病的药，其特征在于：该药包含阿法替尼或其药学上可接受的盐和一种或多种药学上可接受的药物载体。
6.根据权利要求5所述的一种用于治疗二型糖尿病的药，其特征在于：该药的剂型为片剂、散剂、汤剂、丸剂、胶囊剂。
7.根据权利要求5所述的一种用于治疗二型糖尿病的药，其特征在于：所述药物载体包括：表面活性剂、润滑剂、吸收促进剂、稀释剂。
8.根据权利要求2所述的GLUT4活性促进剂，其剂型为片剂、散剂、汤剂、丸剂、胶囊剂。
9.根据权利要求3或4所述的激活剂，其剂型为片剂、散剂、汤剂、丸剂、胶囊剂。
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