KR20050083631A - 항암 약물을 위한 스크리닝 스트래티지 - Google Patents

Abstract

본 발명은 종양 세포를 죽이거나 성장을 억제하는 화합물을 확인하는 방법 및 시약을 제공한다.

Description

항암 약물을 위한 스크리닝 스트래티지{SCREENING STRATEGY FOR ANTICANCER DRUGS}

본 발명은 종양 세포 성장을 억제하기 위한 방법 및 시약에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 화학요법 약물과 같이, 종양 세포를 죽이거나 영구적으로 성장을 억제하는 화합물을 확인하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 그러한 약물의 존재하에서 인큐베이션되고 있는 세포에 대한 세포 반응을 분석함으로써 그러한 약물을 확인하는데, 그 방법으로 세포에서 노쇠 또는 유사분열성 파국(mitotic catastrophe)을 유도하는 화합물들이 확인된다. 사람을 포함한 종양-함유 동물을 치료하기 위해 그런 약물을 사용하는 방법 또한 본 발명에 의해 제공된다.

항암제의 치료 효능은 정상 세포에 비해 우선적으로 종양 세포의 성장 또는 생존을 간섭하는 능력에 의해 측정된다. 로닌슨 등에 의해 개관된 바와 같이 (Roninson et al. 2001, Drug Resist. Updat . 4: 303-313), 화학요법 약물과 이온화 방사선을 포함하여, 임상적인 활용성이 증명된 항암제의 항증식 효과는 세 가지의 증명된 세포 반응에 의하여 중재 된다. 이들 반응은 예정된 세포 사멸 (아폽토시스, apoptosis), 세포 사멸을 초래하는 비정상적인 유사분열 (유사분열성 파국), 및 영구적인 세포 성장 정지 (노쇠)이다. 처음 두 가지의 반응은 종양 세포의 파괴와 소멸을 초래하는 한편, 노쇠는 추가의 세포 증식은 방지하지만 종양 세포를 살아있는 상태 및 대사적으로 활성인 상태는 유지한다. 로닌슨에 의해 개관된 바와 같이 (Roninson 2003, Cancer Res. 63: 2705-2715), 노쇠 종양 세포는 두 가지 유형의 분비 단백질을 생성할 수 있는데, 그것들 중 일부는 이웃하고 있는 비-노쇠 종양 세포의 성장을 자극하고 일부는 억제한다. 어떤 경우에 노쇠 종양 세포는 분비 성장-억제 단백질을 종양-촉진 단백질보다 우선적으로 과잉 생성함으로써, 종양-억제 인자의 영구적 저장소인 노쇠 세포가 종양 성장 중지를 조력하도록 만든다 (Roninson, 2003, 상기 동일).

항증식 반응의 두 가지, 즉 아폽토시스와 노쇠는 정상 세포에서도 현존하는 생리적인 항-발암 프로그램을 나타낸다. 이들 프로그램은 다른 인자들 중에서도 발암성 돌연변이, 예컨대 C-MYC의 증가된 발현 (아폽토시스를 촉진한다) 또는 RAS 돌연변이 (노쇠를 야기한다)에 의해 활성화된다. 그러나 발암 과정 중에 종양 세포는 아폽토시스 또는 노쇠 프로그램을 억제하는 다양한 유전적 및 후성(後成)적 (epigenetic) 변화를 나타내는데, 그러한 변화로는 p53 (아폽토시스와 노쇠 두 가지의 포지티브 조절제로서 작용한다) 또는 p16^Ink4a (노쇠의 조정제)의 돌연변이적 비활성화, 및 BCL-2 (아폽토시스의 억제제)의 상향조절이 있다. 이런 발암-관련 변화에도 불구하고, 여전히 특정 항암제를 사용한 치료에 의해 종양 세포에서 아폽토시스 또는 노쇠를 유도하는 것이 가능하다. 그러나 종양 세포 성장을 억제하는 아폽토시스 및 노쇠의 효능은 종양-유도된 셀 라인들 중에서 크게 달라진다 (Chang et al., 1999, Cancer Res. 59: 3761-3767; Roninson et al.,2001, 상기 동일).

치료 반응에서 아폽토시스의 중요성에 대한 분석은 아폽토시스가 자주 세포 손상의 일차 효과로서가 아니라 비정상 세포에 따른 2차 반응으로서 전개된다는 사실에 의해 복잡해진다 (Roninson, 2001, Drug Resist. Updat . 5 : 204-208). 아폽토시스가 없으면 비정상적인 유사분열은 소핵형성(micronucleation) (즉 완전히 또는 부분적으로 조각난 핵을 가지는 커다란 간기(interphase) 세포의 형성)으로 끝난다. 후-유사분열 아폽토시스와 소핵형성 두 가지 모두 유사분열성 파국의 또 다른 치명적인 결과로서 판단될 수 있다. 록과 스트리빈스킨 (Lock and Stribinskiene, 1996, Cancer Res. 56: 4006-4012) 및 루스와 로닌슨 (Ruth and Roninson, 2000, Cancer Res. 60: 2576-2578)은 약물-처리된 또는 방사선 조사된 세포에서의 아폽토시스적 프로그램의 억제가 소핵형성을 통해 죽는 세포 분획의 증가를 초래하였음을 발견하였다 (루스와 로닌슨의 연구는 또한 노쇠 세포 분획의 동시적인 증가도 나타냈다). 그 결과로서 많은 사람 종양 셀 라인에서 아폽토시스 억제는 약물-처리된 또는 방사선 조사된 세포의 증식 능력에 거의 또는 전혀 효과를 미치지 못하는 것으로 밝혀졌다 (Borst et al., 2001, Drug Resist. Update 4: 128-130; Roninson et al., 2001, 상기 동일).

아폽토시스 또는 노쇠와는 대조적으로 유사분열성 파국은 정상적인 생리적 프로그램은 나타내지 않지만 대신 차선의 조건 하에서 손상된 세포가 유사분열을 하게 되는 결과로부터 유발된다. 정상 세포는 예컨대 염색체상의 DNA가 손상된 후에, 그러나 수복 메커니즘이 손상된 DNA를 복구하기 전에 유사분열로의 불운한 시작을 방지하는 다양한 세포 사이클 체크포인트 메커니즘을 가지고 있다. 그러한 것으로는 다른 것들 중에서도 세포 사이클의 G1 또는 G2 단계 중 어느 하나에서 세포를 정지시키는 DNA 손상-유도성 체크포인트, 또는 미세관-표적화 약물에 의해 활성화된 전기(prophase) 체크포인트가 있다. 체크포인트 정지는 세포 손상, 특히 염색체상의 DNA 손상을 복구할 시간을 세포에 제공하며, 비정상적인 유사분열의 위험을 감소시킨다.

다른 한편으로 종양 세포는 거의 언제나 이들 세포 사이클 체크포인트 중 하나 또는 여러 개가 결핍되어 있으며, 이들 결핍을 이용하는 것은 실험적인 치료학에서 주요한 방침이다 (O'Connor, 1997, Cancer Surv . 29: 151-182; Pihan and Doxsey, 1999, Semin . Cancer Biol . 9: 289-302). 예를 들어 스콜닉과 할라조네티스 (Scolnick and Halazonetis, 2000, Nature 406: 430-435)는 대다수의 종양 셀 라인이 CHFR가 결핍되어 있다고 개시하였다. 항-미세관 약물의 존재시에 CHFR은 세포 사이클을 전기에서 정지시키는 것으로 여겨진다. 그러나 CHFR-결핍 세포는 약물-영향을 받은 비정상적인 중간단계로 진행되며 (Scolnick and Halazonetis, 2000, 상기 동일), 거기서 유사분열성 파국 또는 아폽토시스를 통하여 죽는다 (Torres and Horwitz, 1998, Cancer Res. 58: 3620-3626). 이들 체크포인트의 비활성화는 항암 약물 또는 방사선을 사용한 치료 후에 유사분열성 파국을 촉진하는 것으로 밝혀졌다 (Roninson et al., 2001, 상기 동일).

임상적으로 유용한 항암제에 대한 중요한 종양-특이적 항증식 반응으로서의 유사분열성 파국의 역할은 선행 기술에서는 제시되지도 않았고 실험적으로 시험 되지도 않았다. 정상 세포에 대해 우선적으로 종양 세포에서 유사분열성 파국이 유도되었던 대부분의 연구는 종양 세포가 우선적으로 유사분열을 시작하는 상황을 포함하였고, 그런 연구들은 유사하게 처리된 종양 세포와 정상 세포 사이의 달라진 정상 유사분열과 비정상 유사분열의 비율을 조사하지 않았다. 예를 들어 포웰 등은 손상-유도된 G2 체크포인트를 종식하는(abrogate) 제제인 카페인이 방사선-유도된 세포 사멸에 대해 포유류 세포를 민감하게 하고, 이 민감화가 기능성 p53이 결핍된 세포에 특이적이었음을 밝혔다 (Powell et al. 1995, Cancer Res. 55: 1643-1648). 보다 최근에는 자 등이 카페인에 의한 G2 체크포인트 종식이 종양 세포에서는 일어나지만 정상인 세포에서는 일어나지 않음을 밝혔다 (Jha et al. 2002, Radiat . Res. 157: 26-31). 잉힘 등에 의해 밝혀진 바와 같이 (Nghiem et al. 2001, Proc . Natl. Acad . Sci . USA 98: 9092-9097), G2 체크포인트 종식은 여기서는 "조숙한 염색체 응축"과 관련된 유사분열성 파국을 촉진함으로써 상이한 DNA-손상 제제에 대해 특이하게 p53-결핍 세포를 민감하게 한다. 유사하게 퀴 등은 히스톤 탈아세틸효소 억제제 (HDAC-I)가 종양 셀 라인에서가 아니라 정상인 섬유아세포에서 G2 체크포인트를 야기하였다고 보고하였다 (Qiu et al. 2000, Molec . Biol . Cell 11: 2069-2083). HDAC-I 처리에 따른 결과로 종양 세포는 비정상적인 유사분열을 시작하였고 유사분열성 파국을 통하여 죽은 한편, HDAC-I 처리된 정상 세포는 G2에서 정지되기 시작하였고 유사분열을 시작하지 않았다 (Qiu et al., 2000, 상기 동일).

상이한 유형의 연구에서 콕스웰 등은 유사분열에서 중심 역할을 하는 효소인 폴로(Polo)-유사 키나제 1 (PLK1)의 우성-네가티브 돌연변이체가 정상적인 포유류 상피 세포에 대해 우선적으로 사람 종양 세포에서 유사분열성 파국을 유도하였음을 증명하였다 (Cogswell et al. 2000, Cell Growth Differ. 11: 615-623). 이들 연구에서 콕스웰 등은 우성-네가티브 PLK1을 포함하고 있는 아데노바이러스 벡터로 감염된 정상 세포와 종양 세포 중에서 정상 및 비정상 유사분열의 빈도를 비교하였고, 그 결과 이 벡터가 정상 세포에서보다 종양 세포에서 더 자주 비정상 유사분열을 초래하였음을 보였다. 콕스웰 등은 종양 및 정상 세포의 이런 차등적인 반응이 본질적인 유사분열적 복합체 형성에 대해 잠재적으로 종양 세포의 PLK1에 대한 보다 큰 의존성을 반영할 수 있다고 시사하였다. 달리 표현하자면, 이 반응의 종양 특이성은 PLK1 억제에 특이적인 것으로 간주 되었다.

오늘날 임상적인 의료 필수품 중에서 모든 부류의 항암 약물은 유사분열성 파국과 노쇠를 유도한다 (Chang et al., 1999, 상기 동일). 그러나 이들 제제 중 어느 것도 이런 유용한 항증식 반응을 유도하는 능력을 토대로 하는 것으로 발견되지는 않았다. 종양 세포에서 유사분열성 파국 또는 노쇠 중 어느 것을 유도하는 화합물에 대한 특정된 스크리닝 스트래티지는 현재 사용되고 있는 약물보다 더 큰 효능과 종양 특이성을 가지는 제제를 찾는 데 유용해야 한다. 아직 노쇠를 유도하는 능력을 토대로 한 약물 스크리닝에 대한 보고는 없지만, 노쇠-관련 유전자를 마커로서 사용하는 것을 토대로 한 스크리닝 스트래티지는 공동-소유 및 공동-계류중인 특허 출원의 주제이다 (국제 특허 출원, 공개 번호 WO01/92578 및 WO02/061134). 오히려 선행 기술은 유사분열 정지를 유도하는 제제를 생성하는 스크리닝 스트래티지를 포함하고 있다 (Mayer et al., 1999, Science 286: 971-974; Roberge et al., 2000, Cancer Res. 60: 5052-5058; Haggarty et al., 2000, Chem . Biol . 7: 275-286). 다른 선행 기술 접근법은 G2 체크포인트보다 우선함으로써 DNA가 손상되어 있는 세포가 손상이 회복되기 전에 유사분열을 시작하는 것을 가능하게 하는 화합물을 확인하는 것을 포함하였다 (Roberge et al., 1998, Cancer Res 58: 5701- 5706); 그러나 그러한 제제는 DNA-손상 약물로 처리된 세포에서 유사분열성 파국을 직접 유도하지 못하며 오히려 촉진한다.

그러나 유사분열 또는 유사분열을 시작하는 세포에 영향을 미치는 제제들은 또한 유사분열성 파국을 유도할 수 있는 것들이다. 예를 들어 간기에서 세포 사이클을 억제하는 모든 항암 약물은 효과적으로 유사분열성 파국을 유도한다 (Chang et al., 1999, 상기 동일). 나아가 사이클린-의존성 키나제 억제제 p21^{Wafl / Cipl / Sdil}에 의해 세포활동 억제성 성장 억제된 후에 사이클에 재진입하는 종양 세포도 또한 유사분열을 시작할 때 파국을 진행한다 (Chang et al., 2000, Oncogene 19: 2165-2170).

그러나 여전히 당해 기술 분야에는 정상 세포보다는 종양 세포에서 세포 사멸을 우선적으로 촉진하기 위한 방법으로서 종양이 발생하는 조직으로부터 종양 세포와 정상 세포의 암-관련 표현형 차이를 이용하는 화합물을 확인할 필요가 있다.

도 1은 본 발명의 방법에 따라 사용된 스크리닝 스트래티지를 예시하는 개략도를 도시한다.

도 2는 유사분열성 파국의 특징인 비정상적인 유사분열상 (mitotic figure)을 보여주는 형광-염색된 염색체의 현미경사진을 도시한다.

도 3A 내지 3E는 미처리 (도 3A) 및 독소루비신-처리된 (도 3B) BJ-EN 및 BJ-ELB 세포에 대한 세포/웰의 수, 및 실시예 1에서 설명된 바와 같이 독소루비신으로 처리된 후 독소루비신이 없는 배지에서 인큐베이션된 BJ-EN 및 BJ-ELB 세포에 대한 세포/웰의 수 (도 3C), % SA-β-gal 발현 (도 3D) 및 % 유사분열 지수 (도 3E)를 보여주는 그래프이다.

도 4는 실시예 1에서 설명된 바와 같은 BJ-EN 및 BJ-ELB 세포에서 생성된 정상 및 비정상 유사분열상을 보여주는 형광-염색된 염색체의 현미경사진을 도시한다.

도 5A 및 5B는 카페인의 존재하에서 9 Gy의 방사선 조사 후 9시간 후에 분석되거나 미처리된 GSE56-변환된 세포의 MI: GF7 및 PI 염색에 대한 방사선의 효과를 보여주는 형광 활성화된 세포 분류 도면 (5A)과; 카페인의 존재 및 부재하에서 9 Gy의 방사선 조사 후에 대조 및 GSE-56 형질도입된 세포에서의 GF+7 분획의 변화의 시간 경과를 보여주는 도면 (도 5B)을 도시한다.

임상적으로 유용한 항암제는 아폽토시스 (예정된 세포 사멸), 유사분열성 파국 (비정상적인 유사분열로부터 초래되는 세포 사멸), 또는 노쇠 (영구적인 세포 성장 정지)를 유도함으로써 종양 세포의 성장을 영구적으로 정지시킨다. 이들 세 가지 과정의 성질 및 특성을 하기 표 1에 나타낸다.

	아폽토시스	유사분열성 파국	노쇠
정의	예정된 세포 사멸	비정상적인 유사분열로부터 초래된 세포 사멸	예정된 말단 성장 정지
유도 제제	모든 화학요법적 약물, 방사선, 아폽토시스 경로의 억제제(예컨대 FAS, TRAIL).	모든 화학요법적 약물, 방사선, 유사분열 단백질의 억제제(예컨대 폴로 키나제 억제제).	모든 DNA-상호작용성 약물, 방사선, 차등화제. 항-미세관 약물에 의해 약하게 유도됨.
형태학적 및 생화학적 변화	축소된 세포질, 조각난 핵, 뉴클레오솜내 DNA 단편화, 카스파제 활성화 (대부분의 경우).	(a) 비정상적인 유사분열 중에 (일시적): 응축된 크로마틴, 핵 껍질 없음, 비정상적인 유사분열상. (b) 비정상적인 유사분열 후 (안정): 큰 세포, 둘 이상의 소핵, 미응축 크로마틴. 대체 종점: 아폽토시스.	크고 평평한 세포, 증가된 과립도, pH 6.0에서의 β-갈락토시 다제 (SA-β-gal) 활성에 대한 염색.
발암과 관련된 유전적 변화의 효과	MYC 또는 사이클린 D1에 의해 자극됨; p53 또는 PTEN의 소실, Bcl2, Bcl-xL 및 다른 항아폽토시스 유전자의 활성화, Bax 및 다른 전아폽토시스 유전자의 비활성화에 의해 억제됨.	G1, G2 및 전기 체크포인트 단백질 (예컨대 p53, ATM, ATR, Chk2, Cdc25A, Cdc25B, Plk1, Prk, Mlh1, CHFR)의 결핍에 의해 자극됨.	Ras 돌연변이 및 텔로미어 축소화에 의해 자극됨; p53 또는 p16의 소실, 텔로머라제의 활성화에 의해 억제됨.

본 발명은 세포, 바람직하게는 종양 세포, 가장 바람직하게는 종양 세포가 발생하는 조직으로부터의 정상 세포보다는 종양 세포에서 유사분열성 파국 또는 노쇠를 유도하는 화합물을 확인할 수 있는 세포-기초 스크리닝 스트래티지를 제공한다. 이 스트래티지는 항암 활성을 가지는 제제에 대하여 천연 및 합성 화합물 라이브러리의 보다 효과적인 스크리닝을 위하여 사용될 수 있다.

조직 배양, 약물 처리 및 형질전환을 위한 표준 기법들 (예컨대 일렉트로포레이션, 리포펙션(lipofection))이 본 발명의 방법을 실시할 때 사용될 수 있다. 전술한 기법 및 과정들은 일반적으로 당해 기술 분야에 잘 알려져 있고 본 명세서 전체를 통해 인용되고 논의된 다양한 일반적이거나 구체적인 참조문헌들에 설명되어 있는 것과 같은 종래 방법에 따라 수행될 수 있다. (예컨대 Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., Freshney, 2000, CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE, Wiley-Liss: New York.) 특별한 규정이 없는 한 본원에서 설명된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의학 및 약제학적 화학과 관련하여 사용된 명명법, 및 실험실 과정 및 기법들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것들이다. 화학적 합성, 화학적 분석, 약제학적 제조, 제형, 및 전달, 및 환자의 치료에 대한 표준 기법들이 사용될 수 있다.

본 발명의 목적에 대해 "세포" 또는 "세포들"이란 언급은 동등한 것으로 의도되며, 구체적으로 당해 기술 분야에 공지되어 있는 것과 같이 성장되고 유지된 포유류 세포의 시험관 내 배양물을 포함한다.

본 발명의 목적에 대해 용어 "노쇠"는 예컨대 정상 세포의 증식 수명의 끝 단계에서 또는 세포독성 약물, DNA 손상 또는 다른 세포 손상에 대한 반응으로 정상 세포에서 또는 종양 세포에서 일어나는 것과 같은 DNA 복제의 영구적인 정지 및 성장 인자에 의한 가역적이지 않은 세포 성장을 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이다. 노쇠는 또한 크기의 증가, 평평해진 형태, 과립도의 증가, 및 노쇠-관련 β-갈락토시다제 활성 (SA-β-gal)을 포함한 특정한 형태학적 특징들을 특징으로 한다.

노쇠는 편리하게도 세포를 세포 성장을 억제할 용량의 세포독성제와 접촉시킴으로써 포유류 세포에서 유도될 수 있다 (Chang et al., 1999, 상기 동일). 세포 성장은 제제의 존재 및 부재하에서 배양된 세포의 수를 비교하고 동등한 배양 시간이 지난 후에 제제의 부재시보다 제제의 존재하에서 더 적은 수의 세포가 있을 때 성장 억제를 검출함으로써 측정된다. 그러한 세포독성제의 실례로는 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 독소루비신, 아피디콜린, 시스플라틴, 시타라빈, 에토포시드, 탁솔, 이온화 방사선, 레티노이드 또는 부티레이트가 있다. 적절한 용량은 상이한 세포 유형에 따라 달라질 것이며; 노쇠를 유도하는 용량의 결정은 문헌에서 설명된 바와 같이 (Chang et al., 1999, 상기 동일), 당해 기술분야에 숙련된 사람의 숙련도에 달려 있다.

본 발명의 목적에 대해 용어 "유사분열성 파국"은 세포 사멸을 초래하는 비정상적인 유사분열의 모든 형태를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 그러한 세포 사멸은 항상은 아니지만 자주 소핵이 형성된 간기 세포의 형성이 선행되고, 따라서 그것은 유사분열성 파국의 지표이다. 또한 유사분열성 파국은 아폽토시스를 유도한다. 유사분열성 파국은 편리하게도 포유류 세포에서 세포를 세포독성제와 접촉시킴으로써 유도될 수 있다 (Chang et al., 1999, 상기 동일). 유사분열성 파국은 도 2에 예시된 바와 같이 정상과 분명하게 구별되는 유사분열상을 관찰함으로써, 또는 완전하게 또는 부분적으로 상호 간에 분리될 수 있는 둘 이상의 소핵을 가지는 간기 세포를 검출함으로써 현미경적으로 측정될 수 있다. 유사분열성 파국을 유도하기에 효과적인 세포독성제의 실례로는 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 독소루비신, 아피디콜린, 시스플라틴, 시타라빈, 에토포시드, 이온화 방사선, 탁솔 또는 빈카 알카로이드가 있다. 적절한 용량은 상이한 세포 유형에 따라 달라질 것이며; 노쇠를 유도하는 용량의 결정은 문헌에서 설명된 바와 같이 (Chang et al., 1999, 상기 동일), 당해 기술분야에 숙련된 사람의 숙련도에 달려 있다.

본 발명의 목적에 대해 용어 "아폽토시스"는 축소된 세포질, 조각난 핵, 및 응축된 크로마틴을 특징으로 하는 예정된 세포 사멸의 과정을 포함하는 것으로 이해될 것이다 (Trump et al., 1997, Toxicol . Pathol . 25: 82-88). 아폽토시스는 특정 제제 (예컨대 FAS 또는 TRAIL)에 의해 직접 유도되거나 DNA 손상 또는 비정상적인 유사분열에 대한 반응으로 일어날 수 있다.

사람 고형 종양 (HT1080 세포, 수탁 번호 CCL-121, 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션, Manassas, Virginia)으로부터 유도된 셀 라인에서의 이들 세 가지 반응의 우세함은 공동 소유의 공동 계류중인 USSN 09/449,589 (1999, 11, 29에 출원됨)에 개시되어 있다. 6개의 DNA-손상제의 ID₈₅ 용량으로 HT1080 섬유육종 세포를 처리한 결과 세포의 15 내지 79 %에서 노쇠 현상이 유도되었지만, 2개의 항-미세관 약물로 처리했을 때에는 오직 3 내지 9 %의 세포만이 이 반응을 나타냈다. 다른 한편으로 유사분열성 파국은 시험한 제제 중 어느 것으로든지 처리된 세포의 45 내지 66 %에서 관찰되었고, 약물 중 어느 것으로든지 처리된 후에 매우 적은 (10 % 미만) HT1080 세포가 아폽토시스를 나타냈다. 이 분석은 동일한 정도의 적당한 독성 용량의 독소루비신으로 처리된 14개의 고형 종양-유도된 셀 라인의 패널에까지 확장되었다. 오직 2개의 셀 라인만이 배타적으로 아폽토시스 반응을 나타낸 반면, 다른 셀 라인은 모두 아폽토시스가 있거나 없는 유사분열성 파국을 나타냈다. 14개의 셀 라인 중에서 11개가 또한 독소루비신 처리 후에 노쇠 현상을 나타냈다.

아폽토시스, 유사분열성 파국 및 가속화된 노쇠 사이의 관계를 분석하기 위하여 루스와 로닌슨은 (Ruth and Roninson, 2000, 상기 동일) 방사선 내성에 대한 MDR1 P-당단백질 (다중 약물 수송제로서 잘 알려져 있는 그것의 기능과는 구별되는 메커니즘을 통해 아폽토시스를 억제한다)의 효과를 조사하였다. P-당단백질은 방사선-유도된 아폽토시스로부터 2개의 아폽토시스-경향이 있는 셀 라인을 보호하였지만, 방사선의 클론 형성적 생존을 증가시키지는 못하였다. 이 분명한 역설은 아폽토시스를 보이는 세포의 분획의 감소가 노쇠나 유사분열성 파국 중 어느 하나를 진행하는 세포의 분획의 같은 정도의 증가를 수반하였다는 사실에 의해 해결되었고, 그것은 후자의 반응이 아폽토시스 없이도 종양 세포의 증식을 중지시키기에 충분하다는 것을 시사한다.

지난 십여 년에 걸쳐 대단히 많은 노력이 종양 세포에서 아폽토시스를 유도하거나 자극하는 제제를 확인하는 데에 바쳐졌지만 암세포에서 노쇠 또는 유사분열성 파국을 유도하는 제제를 확인하는 데에는 아무런 노력도 기울여지지 않았다. 그러나 후자의 반응은 암 치료에 공통적일 뿐 아니라 암 치료 스트래티지로서 아폽토시스를 능가하는 특정한 장점들이 있다. 노쇠를 진행하는 세포들은 분할되지는 않지만 대사상으로나 합성에 있어서 활성을 유지하며 중요한 파라크린(paracrine) 활성을 가지는 분비 인자를 생성한다. 이들 인자 중 일부는 아폽토시스를 억제하거나 유사분열 촉진 물질로서 작용함으로써 종양 성장을 촉진할 수 있는 한편, 다른 인자들 (예컨대 마스핀, IGF-결합 단백질 또는 암피레굴린)은 반대로 종양-억제 효과를 나타낸다 (공동 소유의 공동 계류중인 USSN 09/861,925 (2001. 5. 21.에 출원됨), 및 국제 특허 출원 공보 번호 WO 02/066681 (2002. 8. 29.에 공개됨)에 개시되어 있다). 노쇠의 일부 유도물질, 예컨대 레티노이드는 종양-억제제의 생성을 유도하지만 종양-촉진 단백질의 생성은 유도하지 못하며 (공동 소유의 공동 계류중인 USSN 09/865,879 (2002. 5. 25.에 출원됨)), 노쇠한 종양 세포는 그것들과 이웃한 비-노쇠 세포들의 성장을 억제하는 분비 인자의 저장소로 바뀐다. 노쇠와는 대조적으로 아폽토시스를 보이는 세포들은 쉽게 죽거나 소멸하며, 따라서 치명적인 손상을 피한 종양 세포의 성장을 억제할 수 있는 어떠한 인자도 생성하지 못한다.

항암 약물 치료를 위한 치료 종점으로서 아폽토시스를 능가하는 유사분열성 파국의 장점은 다음의 고찰로부터 명백해진다. 아폽토시스는 정상 세포의 생리적인 항-발암 프로그램이다. 발암의 진행 과정에서 종양 세포는 아폽토시스 프로그램을 억제하는 다양한 변화, 예컨대 p53의 돌연변이성 비활성화 및 BCL-2 (아폽토시스의 억제제)의 상향조절을 전개한다. 그 결과로서 많은 종양 세포가 아폽토시스 반응의 감소를 나타낸다 (공동 소유의 공동 계류중인 USSN 10/032,264 (2001. 12. 21.에 출원됨)). 대조적으로 유사분열성 파국은 생리적인 프로그램이라기보다는 유사분열의 직접적인 간섭의 결과 (빈카 알카로이드 또는 탁산과 같은 항-유사분열 약물의 효과) 또는 간기에서 손상된 세포의 유사분열로의 시작의 결과이다. 후자의 상황은 세포가 DNA-손상제 또는 간기에서 약물에 노출된 후에 유사분열을 시작하도록 작용하는 다른 약물로 처리되었을 때 일어나며; 비정상적인 유사분열은 또한 DNA 손상 없이도 세포 사이클의 교란이 일어난 후에, 예컨대 사이클린-의존성 키나제 억제제 p21^{Wafl / Cipl / Sdil}에 의해 생성된 성장 정지로부터 풀려난 후에 일어날 수 있다 (공동 소유의 공동 계류중인 USSN 09/958,361 (2000. 10. 11.에 출원됨)). 정상 세포는 손상된 세포가 유사분열을 시작하는 것을 방지하는 다양한 세포 사이클 체크포인트 메커니즘을 가지고 있다. 그러한 것으로는 다른 것들 중에서도 세포 사이클의 G1 또는 G2 중 어느 하나의 단계에서 세포를 정지시키는 DNA 손상-유도성 체크포인트, 및 미세관-표적화 약물에 의해 활성화된 전기 체크포인트가 있다. 체크포인트 억제는 세포에 세포 손상, 특히 염색체상의 DNA 손상을 회복할 시간을 제공하고, 비정상적인 유사분열의 위험을 감소시킨다. 그러나 종양 세포는 거의 언제나 하나 또는 여러 개의 세포 사이클 체크포인트가 결핍되어 있다. 예를 들어 형질전환된 세포는 자주 G1 체크포인트에 필요한 종양 억제제 p53 뿐 아니라 G2 체크포인트를 중재하는 ATM 또는 ATR과 같은 유전자, 및 비-종양 세포에서 전기 체크포인트를 중재하는 CHFR 유전자를 비활성화시킨다 (Stewart and Pietenpol, 2001, "G2 checkpoints and anticancer therapy," in CELL CYCLE CHECKPOINTS AND CANCER, (Blagosklonny, ed.), Georgetown, TX: Landes Bioscience, pp. 155-178; Scolnick and Halazonetis, 2000, Nature 406: 430-435). 이들 체크포인트의 비활성화는 항암 약물 또는 방사선으로 처리된 후에 유사분열성 파국을 촉진한다. 임상적 상황에서 유사분열성 파국의 다른 장점은 (i) 유사분열성 파국이 아폽토시스보다 더 낮은 약물 용량에서 (따라서 더 낮은 전신 독성의 조건 하에서) 일어난다는 것 (Tounekti et al., 1993, Cancer Res. 53: 5462-5469; Torres and Horwitz, 1998, Cancer Res. 58: 3620-3626)과, (ii) 유사분열성 파국을 진행하는 세포와 종양은 국소적인 염증을 포함하는 괴사를 통하여 일차적으로 죽고 (Cohen-Jonathan et al., 1999, Curr . Opin . Chenz . Biol . 3: 77-83), 국소적인 염증은 추가로 남아있는 종양의 근절을 도울 수 있다 (대조적으로 아폽토시스 과정은 비-염증성이다)는 것이다.

실시예 1에서 개시되는 바와 같이 통상적으로 사용되는 항암제로서 후기 S와 G2 단계에서 세포 사이클을 정지시키는 독소루비신은, 텔로머라제 (hTERT)를 사용한 형질도입에 의해 불멸화된 정상인 BJ-EN 섬유아세포와, 그것과 동계이며 hTERT와 SV40의 초기 영역 두 가지를 사용하여 형질도입된 부분적으로 형질전환된 유도체 BJ-ELB에 대하여 차등적인 효과를 갖는다. 독소루비신이 노쇠, 아폽토시스 및 유사분열성 파국을 유도하는 능력은 BJ-EN과 BJ-ELB 라인 사이에서 비교되었다. 독소루비신은 두 가지 셀 라인에서 유사한 정도의 노쇠를 유도하였고, 아폽토시스의 유도는 상대적으로 약하였다. 그러나 이 약물은 정상적인 BJ-EN 세포에서보다 부분적으로 형질전환된 BJ-ELB에서 훨씬 더 효과적으로 유사분열성 파국을 유도하였으며, 이 차이는 BJ-EN 세포에 대한 것보다 BJ-ELB에 대한 독소루비신의 전체적으로 더 강한 억제 효과를 따라 나타났다. 이런 발견은 노쇠나 아폽토시스보다는 오히려 유사분열성 파국이 이 중요하고 임상적으로 유용한 항암 약물의 종양 특이성의 핵심적인 결정 요소라는 것을 증명한다. 이 발견은 상기 논의된 유사분열성 파국을 촉진하는 종양 세포의 체크포인트 결핍의 역할과 함께, 유사분열성 파국이 세포 사멸의 종양-특이적 메커니즘이라는 것을 증명한다. 그러므로 암세포에서 유사분열성 파국을 유도하는 화합물은 종양-특이적 효과, 즉 비-암세포에서가 아니라 암세포에서 유사분열성 파국과 세포 사멸을 유도하는 것 같다. 그러한 화합물은 유사분열성 파국의 공통적인 종점인 비정상적인 유사분열상 또는 둘 이상의 소핵을 가지는 간기 세포에 대한 현미경을 사용한 분석에 의해 확인될 수 있다. 그런 다음 그러한 화합물의 종양 특이성은 비-암세포에서 세포 사멸을 유도하지 않거나 또는 단지 약하게 유도하는 화합물을 측정함으로써 증명될 수 있다. 세포 사멸은 어떠한 표준 과정, 예컨대 아폽토시스 세포, 또는 둘 상의 소핵을 가지는 간기 세포, 또는 유동적인 세포, 또는 살아있는 세포는 침투하지 못하는 염료 (예컨대 트립판 블루)에 투과적인 세포의 출현을 검출함으로써 모니터될 수 있다.

본 발명은 또한 유사분열성 파국 또는 노쇠를 유도하는 화합물에 대한 효과적인 스크리닝 방법을 제공한다. 유사분열성 파국 또는 노쇠를 유도하는 제제에 대한 합성 또는 천연 화합물 라이브러리의 스크리닝은 시험 화합물로 처리된 후에 세포 배양물에서 유사분열 세포의 분획 (유사분열 지수, MI)을 측정하는 것을 토대로 한다. MI 측정은 유사분열 정지를 유도하는 약물에 대한 스크리닝의 기초로서 이전부터 사용되어 왔다. 증가된 MI는 신규한 항-유사분열 약물을 스크리닝하기 위한 당해 기술 분야에서 사용되었다 (Mayer et al., 1999, Science 286: 971-974; Roberge et al., 2000, Cancer Res. 60: 5052-5058; Haggarty et al., 2000, Chem . Biol. 7: 275-286). 다른 유형의 유사분열-기초 스크리닝 분석은 G2 체크포인트를 우선하는 제제 (예컨대 카페인 또는 UCN-01)를 확인하는 것을 목적으로 하는데, 그런 제제는 DNA 손상을 입힌 후에 노코다졸-처리된 세포의 MI의 감소를 방지하는 능력에 의해 확인될 수 있다 (Roberge et al., 1998, Cancer Res 58: 5701-5706).

그러나 선행 기술에서 공지된 MI-기초 분석은 유사분열시에 직접 작용하기보다는 오히려 간기에서 세포 사이클을 정지시킨 후에 유사분열성 파국을 유도하는 세포활동 정지 제제 (예컨대 DNA-손상 제제), 또는 G1 또는 G2에서 영구적인 성장 정지와 관련이 있는 노쇠를 유도하는 세포활동 정지 제제를 검출할 수 없다. 후자의 제제의 두 가지 부류는 유사분열보다는 간기에서 세포 사이클 정지를 유도하므로 MI를 증가시키기보다는 감소시킨다. 그러므로 그러한 제제의 존재하에서 MI를 측정하는 것은 제제의 두 부류에 대한 스크리닝의 첫 단계로서 사용될 수 있다. MI의 증가는 잠재적인 항-유사분열 약물을 나타낼 것이고 (앞에서 설명된 분석에서와 같이), 반면에 MI의 감소는 간기-작용 세포 사이클 억제 제제의 확인을 위한 새로운 기준을 제공한다.

노쇠 또는 유사분열성 파국을 유도하는 제제는 화합물의 존재하에서 배양물로부터 방출된 후에 MI의 변화를 모니터함으로써 구별될 수 있다. 노쇠-유도 제제는 화합물로부터 방출된 후에 MI의 전체적인 회복을 가능하게 하지 않을 것이다. 대조적으로 유사분열성 파국을 유도하는 제제는 MI의 회복을 가능하게 할 뿐 아니라, 비정상적인 유사분열이 정상적인 유사분열보다 더 오래 걸릴 것으로 예상되기 때문에 대조 세포에 비하여 MI의 증가를 유도하는 것 같다. 예를 들어 미하일로프 등은 전기 동안의 DNA 손상이 동원체 부착 및 기능의 결함으로 인하여 유사분열로부터 빠져나오는 것을 지연시킨다고 밝혔다 (Mikhailov et al. (2002, Curr . Biol 12: 1797-1806). 그러므로 화합물로부터의 방출 후에 MI 회복의 정도가 노쇠 또는 유사분열성 파국 중 어느 하나를 유도하는 화합물을 확인할 것이다. 그런 다음 그런 화합물의 효과는 이들 두 가지 반응에 대한 종래 분석에 의해 증명될 수 있다 (표 1에서 설명된 것과 같음). 이 스크리닝 스트래티지는 도 1에 개략적으로 예시된다.

도 1에서 도시된 바와 같이 본 발명의 스크리닝 방법은 일반적으로 두 단계를 포함한다. 첫 번째 단계에서 종양 세포는 시험 화합물의 존재하에서 인큐베이션되고 유사분열 지수 (MI)가 측정된다. 인큐베이션 시간은 유사분열을 시작하는 세포의 분획에 상당한 변화가 생기기에 충분하도록 길어야 한다; 그 시간은 2 내지 3 시간 정도로 짧을 수도 있고 (G2 단계의 전형적인 기간) 전체 세포 사이클의 기간만큼 (대부분의 종양 셀 라인에 대하여 20 내지 45 시간) 길거나 더 길 수도 있다.

시험 화합물의 존재 하에 인큐베이션하는 것의 유익한 결과는 MI가 증가하거나 감소한다는 것이다. MI의 증가를 보이는 화합물들은 잠재적인 항유사분열제로서 확인되며, 그것은 다음 단계로 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 방법을 사용하여 항유사분열 활성에 대해 시험 될 수 있다. 그것의 존재하에서 세포가 MI의 감소를 보이는 화합물은 간기-작용 세포 사이클 억제제로서 확인되며 분석의 두 번째 단계에서 사용된다.

두 번째 단계에서 세포는 단계 1에서 MI의 감소를 유발한 시험 화합물의 유효량과, MI의 감소가 검출되기에 충분한 시간 동안 접촉된다. 전형적으로 이 시간의 길이는 또한 본 발명의 방법의 단계 1에서 확인된다. 그런 다음 세포는 시험 화합물 처리로부터, 예컨대 시험 화합물이 없는 배양 배지에서의 성장에 의해 방출된다. 시험 화합물-유리 세포 성장에 대한 시간의 길이는 세포가 사이클에 재진입하기에 충분할 정도여야 하고, 전형적으로 1 내지 5일이 소요된다. 이 시간 동안 세포의 MI가 측정된다.

이 처리의 한가지 유익한 결과는 MI의 빈약한 (즉 작은) 증가, 예컨대 MI 값이 동일한 밀도로 성장한 미처리 세포에서 관찰된 수준에 이르지 못할 정도의 빈약한 증가이다. 이 결과는 처리된 세포의 일부가 안정하게 성장-정지되고, 그것들이 노쇠해지고 있다는 것을 반영하는 것 같다. 화합물에 의한 노쇠의 유도는 공동 소유의 공동 계류중인 국제 특허 출원 공개 번호 WO02/061134에 설명되어 있는 것과 같이, 무엇보다도 세포를 노쇠 마커, 예컨대 노쇠-관련 베타-갈락토시다제 (SA-β-gal) 발현에 대하여, 또는 노쇠-관련 유전자의 발현에 대하여 분석함으로써 실험적으로 측정될 수 있다.

또는 달리 세포는 미처리 세포의 그것들과 같이 높거나 더 높은 수준에 도달하는 MI의 커다란 증가를 나타낼 수 있다. 본원에서 알 수 있는 바와 같이 (도 3A 내지 3E 및 4), 그러한 증가는 유사분열성 파국을 진행하는 세포의 특징이고, 유사분열의 기간은 정상적인 유사분열에 비하여 크게 연장된다. 이 경우 세포는 예컨대 비정상적인 유사분열상 또는 소핵을 검출하기 위한 세포의 현미경 조사에 의해, 또는 본원에 예시적으로 설명되는 유사분열성 파국에 대한 어떠한 적절한 분석을 사용하여 유사분열성 파국에 대하여 분석된다.

이 스크리닝 스트래티지에는 개별적으로나 조합된 상태로 항암제에 대한 다른 모든 세포-기초 분석법과 구별되는 여러 가지 유용한 측면이 있다. 그러한 것으로는 다음과 같은 것들이 있다: (i) 세포 수보다는 오히려 비-특이적 성장 억제로부터 세포 사이클 교란을 구별하는 MI의 변화에 의존한다; (ii) 선행하는 MI-기초 스크리닝 스트래티지는 MI의 증가 (유사분열에서 직접 작용하는 제제에 의해 생성됨)를 검출하는 것을 목적으로 하는 반면, 본 발명의 기본적인 스크리닝 기준은 간기에서 세포를 정지하는 제제에 의해 생성되는 MI의 감소이다; (iii) 본 발명의 방법에서 구체화된 스트래티지의 단계 2는 선행 분석에서 사용된 것과 같은 화합물의 존재시보다는 유도 화합물로부터 방출된 후에 일어나는 MI의 변화를 기초로 한다; (iv) 유사분열성 파국과 아폽토시스를 구별하기 위하여 스크리닝은 바람직하게는 제한된 아폽토시스 반응을 보이는 종양 세포를 사용하여 수행되고, 일차 분석은 아폽토시스 세포보다는 유사분열에 대한 분석을 사용하여 수행된다.

하기 실시예에서 설명되는 결과는 노쇠가 아니라 유사분열성 파국 (및 그것의 결과인 아폽토시스)이, 통상적으로 사용되며 임상적으로 유용한 항암제 (독소루비신)로 처리된 후에 정상 세포보다는 우선적으로 형질전환된 세포에서 유도되는 것을 증명한다. 형질전환된 세포에서 유사분열성 파국의 증가는 약물 처리 후 유사분열의 더 높아진 속도뿐만 아니라 비정상 유사분열의 더 높은 빈도 (정상과 비교하여)와 관련되었다. 이들 발견은 유사분열성 파국을 유도하는 능력이 임상적으로 유용한 항암제의 종양 세포 특이성에 대한 기초를 제공하는 것을 입증하였다. 그러므로 종양 세포에서 유사분열성 파국을 유도하는 능력은 항암제로서 유용한 것으로 보이는 종양-특이적 세포독성 화합물을 확인하는 데 사용될 수 있다. 그러므로 본 발명에 의해 유사분열성 파국을 유도하는 제제에 대한 스크리닝 방법이 제공된다.

어떤 구체예에서 본 발명의 방법은 다음 단계들을 포함한다:

1. 종양 세포는 다중-웰 플레이트에 플레이팅되고 성장 정지를 유도하기에 충분한 시간, 예컨대 24 시간 동안 시험 화합물에 노출된다 (만약 화합물이 성장을 억제할 수 있다면).

2. 플레이트는 MPM2, TG3 또는 GF7과 같은 유사분열-특이적 항체로 염색되고, 항체 결합은 예를 들면 직접 면역 형광 표지화에 의해, 유익하게는 형광 플레이트 판독기를 사용하여 검출된다. 이 분석법에 따라 MI를 감소시키는 화합물이 확인되고 추가로 단계 3에서 스크리닝에 사용된다. 이 분석법에 따라 MI를 증가시키는 화합물도 또한 확인되고 단계 5에서 추가의 스크리닝에 사용된다.

3. 단계 2에서 MI를 감소시키는 것으로 확인된 화합물로 처리된 후에 세포는 화합물-억제된 세포가 세포 사이클에 재진입할 수 있기에 충분한 시간 (전형적으로 24 시간, 36 시간, 및 48 시간)동안 회복되도록 허용된다.

4. 단계 3으로부터의 플레이트는 단계 2에서 설명된 바와 같이 MI 측정에 사용된다. 동일한 밀도로 성장된 미처리 세포에서와 유사하거나 더 높은 MI의 증가를 유발하는 화합물이 유사분열성 파국의 강력한 유도물질로서 확인된다. MI의 증가가 없거나 약한 증가 (동일한 밀도로 성장된 미처리 세포의 MI보다 적음)를 유발하는 화합물이 또한 노쇠의 강력한 유도물질로서 확인된다.

5. MI의 증가에 의해 단계 2 또는 단계 4에서 확인된 화합물은 세포에 첨가되고, 유사분열상 형태학 (화합물로 처리되는 동안과 처리된 후의)과 소핵이 존재하는 지의 여부가 현미경 분석에 의해 분석된다.

6. MI의 지속된 감소에 의해 단계 4에서 확인된 화합물은 1 내지 5일 동안 세포에 첨가되고, 노쇠 마커 (예컨대 SA-β-gal)의 발현 또는 장기간 콜로니 형성 종식 능력에 대해 시험 된다.

상기 설명된 분석법은 종양 세포에서 유사분열성 파국 또는 노쇠를 유도할 화합물을 확인하는 데 유용하다.

유사분열성 파국의 검출

유사분열성 파국을 검출하기 위해 사용되는 가장 통상적인 방법은 조각난 핵을 포함하고 있는 세포를 기록하는 것(scoring)을 토대로 한다. 그러한 기록은 고정되지 않은 세포에 대하여 (상 대조 현미경을 사용하여), 또는 핵을 차등적으로 염색하는 어떠한 편리한 염료 (예컨대 헤마톡실리네오신)로 세포를 염색한 후에, 또는 포엘젠(Foelgen)과 같은 착색 염료 (형광 현미경에 대해) 또는 DAPI 또는 Hoechst 33342와 같은 형광 염료를 사용하여 DNA를 특이하게 염색한 후에 밝은 색-파장 현미경에 의해 시행될 수 있다. 유사분열성 파국의 종점으로서 소핵이 형성된 세포를 확인함에 있어서, 그것들을 아폽토시스 세포 (그것은 유사분열성 파국 또는 유사분열과 무관한 아폽토시스 중 어느 하나로부터 유발될 수 있다)와 구별하는 것이 중요하다. 아폽토시스 세포가 또한 조각난 핵을 가지고 있고, 그것들은 작은 크기와 축소된 세포질에 의해 구별될 수 있는 반면, 소핵이 형성된 세포는 크고, 정상 크기의 세포질을 갖는다. 나아가 DNA-특이적 염료로 염색한 결과, 아폽토시스 세포는 비정상적인 유사분열 후에 발생하는 응축된 크로마틴을 가지고 있는 간기 세포이다. 소핵이 형성된 세포는 둘 이상의 완전하게 또는 부분적으로 분리된 핵을 가질 수 있고; 부분적인 분리의 경우에 핵은 다수의 로뷸(lobule, 소엽)을 나타낸다. 유사분열성 파국 (HT1080 섬유육종 세포에서)로부터 유발되는 비정상적인 핵 형태학의 대표적인 실례는 도 2에 도시된다. 소핵을 검출하는 다른 방법은 토레스와 호르비츠에 의해 설명된 것과 같이 형광-활성화된 세포 분류법 (FACS)의 사용에 의존한다 (Torres and Horwitz, 1998, Cancer Res. 58: 3620-3626).

주어진 셀 라인에서 정상적인 유사분열의 형태학적 범위는 먼저 미처리 세포에서의 유사분열상의 조사에 의해 수립되며, 그런 다음 유사분열의 어떠한 단계에서든지 정상 형태학으로부터의 편차가 쉽게 확인될 수 있다. 소핵형성이 유사분열성 파국의 종점을 나타내는 한편, 비정상적인 유사분열의 과정 또한 표준 과정을 사용한 염료 (예컨대 DAPI)와 같은 DNA-특이적 검출 시약을 사용하여 염색된 세포의 현미경 분석에 의해 쉽게 확인될 수 있다 (Freshney, 2000, 상기 동일). 바람직한 과정은 또한 어떠한 고정(fixation) 또는 염색 과정 없이도, 무상 세포의 형광 현미경에 의해 유사분열상의 가시화를 가능하게 하는, 히스톤 H2B-GFP 융합 단백질에 대한 발현 벡터로 형질전환된 세포를 포함한다 (Kanda et al., 1998, Curr Biol 8: 377-385). 예시적으로 이 분석을 위해서 세포는 약간의 바탕(background) 형광을 제공하는 페놀 레드가 없는 배지에서 배양된다. 세포는 전화된 형광 현미경을 사용하여 조사되고, 유사분열상이 사진에 찍혀서 샘플당 유사분열 영상의 충분한 수 (전형적으로 약 100)가 수집된다. 이들 유사분열상은 조사되고 터어만과 쿤에 의해 설명된 유사분열상의 분류법 (Therman and Kuhn, 1989, Crit Rev. Oncog . l: 293-305)을 사용하여 그것들이 나타내는 정상 또는 비정상 유사분열의 유형과 관련하여 분류된다; 비정상적인 유사분열상 (DAPI-염색된 HT1080 섬유육종 세포에서)의 실례는 도 2에 도시된다. 비정상적인 방추 또는 중심체 복제는 또한 α, β 또는 γ 튜뷸린에 대한 항체로 염색함으로써 검출될 수 있다. 비정상적인 유사분열의 다른 징표는 유사분열의 상이한 단계의 빈도 분포에 따라 변경된다. 특이하게 약물-유도된 비정상 유사분열은 더 낮은 빈도의 후기 및 말기, 및 비정상적인 형태학을 특징으로 한다.

시간-경과 비디오 현미경 (상-대조, DIC 또는 형광)은 시험한 화합물에 의해 유도된 비정상 유사분열의 성질을 수립하는 데 사용될 수 있다. 이 유형의 분석의 특별한 실례에서 히스톤 H2B-GFP 융합 단백질을 발현하는 HT1080 세포의 형광 비디오 현미경이 사용될 수 있다 (Rieder and Khodjakov, 2003, Science 300: 91-96의 Science 개요에 대한 온라인 보충설명에서 예시된 바와 같다). 그러한 분석에 대해 H2B-GFP-발현 세포는 유익하게도 1"-직경의 둥근 유리 커버 슬립 위에 플레이팅되고 6-웰 플레이트의 웰에 놓인다. 시험 화합물을 함유하고 있는 (1.5 ml의 부피로) 배지가 24 시간 동안 첨가된 후 약물이 없는 배지에 놓이게 된다. 플레이트는 유사분열상의 재출현에 대해 주기적으로 조사된다. 일단 유사분열이 나타나기 시작하면 커버 슬립은 인큐베이터 시스템 챔버에 옮겨져서 가열 단계가 장착된 전화된 형광 현미경과 함께 사용된다. 챔버는 HEPES를 함유하고 있는 배지로 채워지고, 밀폐 밀봉되며, 37 ℃-가열된 스테이지에 (또는 필요에 따라 37 ℃ 온실에) 놓인다. 현미경은 영상을 취할 때만 형광 조명이 가능한 자동 셔터와 동시 작동되는 디지털 시간-경과 카메라에 연결된다. 영상은 간헐적으로, 예를 들면 3-분 주기로 수집된다. 명백한 전기의 세포가 촬영을 위해 선택되고, 핵 껍질(들)이 형성될 때까지 모니터된다. 단일 챔버의 경우 2 내지 5회의 유사분열 지속 기간이 기록된다. 최소한 20회의 유사분열이 각각의 장래의 히트(hit)를 위해 촬영되고 분류된다. 이 분석은 어떤 유형(들)의 비정상적인 유사분열이 우선적으로 시험 화합물에 의해 유도되는지를 증명해준다.

유사분열성 파국 또는 노쇠를 위한 고출력 스크리닝

현미경 분석은 어렵지 않은 반면, 고출력 스크리닝 (HTS)을 위해서는 상대적으로 느린 과정이다. 유사분열성 파국에 대한 HTS에 대한 접근법은 현미경 조사에 앞서 사용될 수 있는 간단하면서 쉽게 측정할 수 있는 과정이므로, 이 예비 스크리닝에서 포지티브로 밝혀진 화합물만을 현미경 분석을 통해 시험할 필요가 있다. 이 예비 단계는 일차 스크리닝 분석으로서 수행될 수 있거나 또는 성장 억제 활성에 대한 예비 스크리닝 (종래의 세포 성장 억제 분석을 통하여) 후에 성장-억제 화합물을 사용하여서만 사용될 수 있다. 제시된 스크리닝 과정은 도 1에 개략적으로 도시되며 종양 세포에서 노쇠를 유도하는 화합물에 대한 스크리닝에 사용될 수 있다.

유사분열성 파국의 유도와 관련하여 모든 항암 약물은 두 가지 유형으로 나누어질 수 있다. 첫 번째 유형은 직접적으로 유사분열에 영향을 미치고 종양 세포에서 유사분열 지연을 유도하는 약물을 포함한다. 이 범주는 항-미세관 제제, 예컨대 빈카 알카로이드 또는 탁산을 포함하며; HDAC-I도 또한 이 범주에 속한다. 유사분열 지수는 첫 번째 유형의 약물의 존재시에 증가하며, 약물의 존재시에 MI의 증가는 이들 화합물을 분류하는 수단이 된다. MI는 현미경 계수를 통하여서만이 아니라 훨씬 더 편리하게 MPM2, TG-3 또는 GF-7과 같은 유사분열 세포에 특이하게 결합하는 항체를 사용한 염색에 의해 측정될 수 있다 (Rumble et al.,2001, J Biol Chem. 276: 48231-48236). 유사분열-특이적 항체의 결합의 증가 (이온화 방사선에 노출된 후에)는 당해 기술 분야에서 G2 체크포인트를 종식하는 화합물의 HTS에 대한 기초로서 사용되어 왔다 (Roberge et al., 1998, 상기 동일; Rumble et al., 2001, 상기 동일).

임상적으로 가장 유용한 항암 약물 (독소루비신을 포함하여)은 두 번째 유형에 속한다. 이들 약물은 세포 사이클 간기에서 (즉 G1, S 또는 G2에서) 세포 사이클 정지를 유도하므로 MI는 이들 약물의 존재시에 증가하기보다는 감소한다. 그러나 MI는 그러한 약물을 제거하면 약물-억제된 세포가 세포 사이클에 재진입하고 유사분열을 진행하기 때문에 증가한다 (도 3E 참조). 이런 증가는 특히 유사분열성 파국을 유도하는 약물에 대해 뚜렷한데, 왜냐하면 비정상적인 유사분열이 정상적인 유사분열보다 더 시간이 많이 걸리기 때문이다. 그러므로 약물을 제거한 후에 MI의 증가는 약물 처리 후에 회복되고 있는 세포가 유사분열성 파국을 진행하고 있음을 나타낸다. 다른 한편으로 동일한 밀도로 성장된 미처리 세포에서 관찰된 수준으로 MI가 증가하지 못한 것은 처리된 세포의 일부가 노쇠의 결과일 수 있는 연장된 세포 정지를 진행하는 것을 나타낼 수 있다. 이 스크리닝 과정에 의해 확인된 화합물에 의한 유사분열성 파국 또는 노쇠 중 어느 하나의 유도는 다음 단계에서 특이적 분석을 통해 증명될 수 있다.

MI의 측정

MI를 측정하기 위한 가장 통상적인 실험실 과정은 DAPI와 같은 DNA-특이적 염료로 염색함으로써 가시화된 응축된 크로마틴을 포함하는 세포를 현미경을 사용하여 계수하는 것이다. 계수하는 것이 힘들고 시간-소모적인 과정인 데 반해, 새로운 현미경 기법, 예컨대 레이저-스캐닝 현미경을 사용하면 쉬워지고 자동화될 수 있다. MI 측정을 토대로 한 선행 기술의 스크리닝 기법은 예컨대 시판중인 것을 이용할 수 있는 MPM2 또는 TG3와 같은 유사분열 세포 특이적 항체의 결합에 의존한다 (Anderson et al., 1998, Exp . Cell Res. 238: 498-502). 두드러지게 MPM2 항체는 아폽토시스 세포가 아닌 유사분열 세포만 염색하는 것으로 보고되었다 (Yoshida etal., 1997, Exp . Cell Res. 232: 225-239). MCSA는 세포 블롯(cytoblot) (Haggarty et al., 2000, 상기 동일) 또는 변형된 ELISA 과정 (Roberge et al., 1998, 상기 동일; Roberge et al., 2000, 상기 동일) 중 어느 하나를 통하여 MI 증가에 대한 공개된 스크리닝 분석에 사용되어 왔다. 유사분열 세포의 MCSA-기초 측정을 위한 다른 방법은 MCSA-결합 세포의 분획의 정량 측정 (이것은 MI의 알맞은 근삿값이다)을 제공하는 MCSA의 사용에 의존한다. FACS 분석은 또한 그것이 MI의 측정뿐 아니라 샘플 중의 세포의 총 수까지도 측정하는 것을 가능하게 하기 때문에 유익하다. 나아가 FACS 분석은 DNA 내용물에 대한 요오드화 프로피디움 (PI) 염색과 MCSA 염색의 조합을 가능하게 하여 MI의 측정과 G1 또는 G2 성장 정지와의 조합 및 하위-G1 DNA 내용물을 가지는 아폽토시스 세포의 출현과의 조합이 가능해진다. 최근에 FACS 기계의 진보, 특히 자동 FACS 다중웰 자동 샘플러 (Becton Dickson)의 개발로 FACS를 신속한 스크리닝 과정으로서 사용하는 것이 가능해졌고, 그것은 본 발명의 방법을 실시하는 데 바람직하다.

세포 및 화합물 라이브러리

원칙적으로 어떠한 셀 라인이든지 스크리닝에 사용될 수 있지만, 스크리닝 과정의 궁극적인 목적은 종양 세포에 대하여 효과적인 새로운 약물을 확인하는 것이기 때문에 종양-유도된 셀 라인이 바람직하다. 특히 바람직한 종양 셀 라인은 아폽토시스의 발생률이 낮은 것들인데, 왜냐하면 빠른 아폽토시스의 개시가 노쇠한 세포들 또는 유사분열성 파국을 진행하는 세포들의 검출을 불분명하게 할 수 있기 때문이다. 아폽토시스-내성 라인은 원래부터 아폽토시스에 내성이거나 또는 BCL2와 같은 아폽토시스-억제 유전자의 과잉 발현에 의해 아폽토시스 내성의 경향을 띄는 라인들 중에서 선택될 수 있다. 본 발명의 방법의 실시에 편리한 셀 라인의 실례는 HT1080 사람 섬유육종이며, 그것은 아폽토시스의 발생률이 매우 낮다 (Pellegata et al., 1996, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93: 15209-15214; Chang et al., 1999, Cancer Res. 59: 3761-3767; 공동 소유의 공동 계류중인 USSN 09/958,457 (2000. 4월 7일에 출원됨)).

스크리닝은 천연 또는 합성 화합물에 대하여 시판중인 많은 것을 이용할 수 있거나 주문-제조된 라이브러리 중 어느 것을 사용하여 수행될 수 있다. 상업적으로 시판되는 라이브러리의 실례는 Chem-X 소프트웨어 버전을 사용하여 전체 컬렉션에서 파마코포어(pharmacophore)를 정량함으로써 타당하게 선택된 합성 화합물의 ChemBridge 컬렉션의 하위-세트인 ChemBridge DIVERSet이다. 그 결과의 라이브러리는 최소 수의 화합물 내에서 최대 파마코포어 다양성을 제공한다. 이 라이브러리는 많은 산업 및 학계 연구자들에 의해 다양한 세포-기초 및 세포-유리 분석법에서 성공적으로 사용되었다 (www.chembridge.com). 특히 ChemBridge 라이브러리는 유사분열 방추 양극성을 억제함으로써 유사분열을 간섭하는 모나스트롤 (Mayer et al., 1999, 상기 동일)과 MI를 증가시키는 능력에 대해 스크리닝함으로써 확인된 다른 많은 유사분열 억제제들 (Haggarty et al., 2000, 상기 동일)을 확인하는 데 사용되었다. 후자의 연구에서 ChemBridge 라이브러리로부터 16,320개의 화합물이 스크린되었고, 139개의 화합물이 MI를 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 이 결과는 유사분열시 후속 효과로 세포 사이클을 억제하는 대다수의 화합물이 동일한 라이브러리를 사용하여 발견될 수 있다는 확신을 촉진시켰다. 가장 최근의 ChemBridge 라이브러리는 예비-플레이팅되고 500 ㎕의 DMSO에 용해된 5 μmol의 샘플 중에 30,000개의 화합물을 함유한다. 본원에서 더욱 상세하게 개시된 바와 같은 본 발명의 방법에 따르면 스크리닝 분석은 각 화합물의 20 μM 농도에서 수행되고 (전형적으로 세포-기초 분석에 대해 선행 기술에서 사용된 것과 같이); 그로써 라이브러리의 각 화합물의 총 양은 250 ml의 배지를 제조하기에 충분하다. 이것은 모든 스크리닝 목적에 대해 충분한 양보다 더 많다. 보다 큰 규모의 분석을 위해 개별적인 히트가 ChemBridge에 의해 10 mg 바이알에 넣어진 채로 재공급될 수 있다.

분석 최적화

스크리닝을 위한 제제에서, 분석에 가장 적당한 다중 웰 플레이트 및 세포가 그런 플레이트에서 자랄 수 있는 밀도가 확인된다. 본 발명의 방법의 실시에 유용한 분석의 초기 최적화는 상이한 실험에서 웰-대-웰 생존 가능성과 MI 값의 범위를 측정하기 위하여 미처리 세포를 사용하여 수행된다. 이들 최적화 분석은 분석이 96-웰 포맷에서 또는 24-웰 포맷에서 이루어지는 것을 증명해준다. 제 1 단계 분석 조건이 미처리 세포를 사용하여 수립되면, 세포 사이클 억제제를 검출하는 능력은 상이한 세포 사이클 특이성을 가지는 여러 개의 공지된 약물을 사용하여 시험 된다. 그것들로는 탁솔 (세포를 유사분열 단계에서 정지시키며, 그로써 MI를 증가시킨다)과 간기에서 세포를 정지시키고, MI를 감소시키며, 유사분열성 파국 및/또는 노쇠를 유도하는 여러 개의 약물이 있다. 후자의 제제들로는 미모신 (G1/S 경계선에서 정지시킨다), 아피디콜린 (S-단계에서 정지시킨다) 및 독소루비신 (후기 S 및 G2에서 정지시킨다)이 있다. 이들 화합물을 사용하여 HT1080 세포 성장을 억제시키기 위한 용량 범위는 이미 정립되어 있다 (Levenson et al., 2000, Cancer Res. 60: 5027-5030). G1에서 일부 종양 셀 라인을 억제하는 것으로 보고된 로바스타틴 (Lovastatin)(Keyomarsi et al., 1991, Cancer Res 51: 3602-3609)은 그것이 HT1080 세포를 사용하여 종양 세포 성장을 억제하는지의 여부와 유사분열성 파국을 유도하는지의 여부를 시험하기 위한 또 다른 후보이다.

유익하게도 세포는 96-웰 분석 포맷으로 (3벌 한 세트) 여러 용량 (LD₅₀에서 LD₉₉ 까지의 범위)의 각각의 약물을 사용하여 처리되고, 24-시간 인큐베이션이 MI에 미치는 영향이 FACS 분석에 의해 수립된다. 최소한 2배의 MI 감소 (또는 탁솔의 경우 5 내지 10 배의 MI의 증가)를 유발하는 각 화합물의 가장 낮은 용량이 선택되고, 플레이트의 상이한 위치에서 다중 웰에 약물을 첨가함으로써 각 화합물의 MI에 미치는 효과의 재생성이 시험 된다. 이 분석은 분석의 재생성을 증명하고, 동일한 약물의 효과에 대한 다양성의 범위를 제공하며, 분석에서 잠재적인 위치-관련 문제를 드러낸다. 이들 약물의 하나 또는 그 이상의 수립된 용량이 화합물 라이브러리의 실제 스크리닝에 대한 포지티브 대조표준으로서 사용된다.

MI의 감소가 간기-활성 약물에 대한 바람직한 확인제를 구성하는 한편, 어떤 경우에는 첫 번째 단계에서 대체 분석법을 사용하는 것이 유리할 수도 있는데, 그때 세포는 시험 화합물과 인큐베이션된 후 공지의 항-유사분열제, 예컨대 노코다졸과 (8 시간 동안 또는 비슷한 시간 동안; Roberge et al., 1998, 상기 동일) 인큐베이션된다. MI-감소 분석과 비교하면 불리하게도 이 노코다졸 분석은 더 길고 추가의 약물을 사용하는 것을 필요로 하며; 또한 MI를 감소시키기보다는 증가시키는 화합물을 확인하는 것에는 적절하지 않다. 그럼에도 불구하고 노코다졸 분석은 측정된 신호 (즉 MI)를 증가시킨다는 강력한 장점이 있으며, 따라서 FACS 분석 (또는 세포 블롯 또는 ELISA 분석)에 대해 더 적은 수의 세포를 사용하는 것을 가능하게 할 것이다.

동일한 원형 약물이 또한 스크리닝 과정의 두 번째 과정에 대한 조건을 수립하기 위하여 사용될 수 있다. 이 분석은 3 내지 5일 동안의 세포 배양을 필요로 할 수 있으며, 바람직하게는 24-웰 포맷으로 수행된다. 전형적으로 약물은 세포에 24 시간 동안 첨가된 후 약물-유리 배지로 대체된다. 다중 웰 플레이트는 고정되고 약물로부터 방출된 후 상이한 시간 점에서 (6 내지 72 시간, 처음 24 시간 동안에는 6 시간 간격으로, 다음 48 시간 동안에는 8 시간 간격으로) 진행되며, FACS 분석이 MI를 측정하기 위해 사용된다. 이 분석은 상이한 단계에서 세포 사이클을 정지시키는 약물로부터 방출된 세포에서 MI가 회복되는 적절한 시기와 크기뿐만 아니라 방출 후 상이한 시간에 남아있는 세포의 수를 나타낸다. 이 분석을 토대로 하여 상이한 약물로 처리된 세포에 의해 유사분열에 재진입하는 시기에 상응하는 2개 (또는 필요하다면 3개)의 시간 점이 선택된다. 이 방출 분석의 재생성은 본질적으로 첫 번째 단계에서와 같이 측정된다. 이 분석의 결과는 스크리닝의 두 번째 단계에 대한 시간 매개변수를 제공하고, 스크리닝의 두 번째 단계에 대한 포지티브 대조 표준을 제공한다.

유사분열성 파국과 노쇠에 대한 형태학적 분석

세포가 화합물의 존재시에 인큐베이션될 때 MI를 감소시키지만 방출 후에는 MI의 증가를 유발하는 화합물이 실제로 유사분열성 파국을 유도하는지의 여부를 측정하기 위하여, 그러한 화합물이 상기에서 설명된 바와 같이 유사분열상의 형태학적 분석에 의해 시험 된다.

MI를 감소시키고 방출 후에 완전한 회복을 허용하지 못하는 화합물이 노쇠를 유도하는 지를 측정하기 위해서, 2일 또는 그 이상 동안 그런 화합물로 처리된 세포가 딤리 등에 의해 설명된 바와 같이 pH 6.0의 X-Gal을 사용하여 노쇠-관련 β-갈락토시다제 (SA-β-gal) 활성에 대해 염색된다 (Dimri et al., 1995, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 92: 9363-9367). 블루 염색 (광 현미경에 의해 검출 가능함)은 통상 사용되는 이 노쇠 마커의 발현을 나타낸다. 또한 노쇠한 세포는 세포 크기의 증가와 더 높은 과립도 (FACS 분석에서 증가된 측면 산란에 의해 입증된다)를 나타낸다. 노쇠에 대한 기능성 시험으로서 세포는 화합물로 처리되거나 처리되지 않은 후 저밀도 (500 내지 2000 세포/P100)로 플레이팅된 다음 콜로니가 형성되도록 방치된다. 노쇠한 세포는 미처리 세포에 비교하여 큰 콜로니의 형성이 매우 감소된 것으로 나타났지만, 현미경 관찰 결과 대부분의 플레이팅된 세포가 단일 세포로서 남아 있거나 매우 작은 클러스트를 형성한 채로 플레이트에 부착된 채로 남아있는 것으로 나타났다.

스크린된 화합물의 추가의 특성확인

상술된 과정은 유사분열성 파국 또는 노쇠 중 어느 하나를 유도하는 화합물을 확인하는 데 사용된다. 그런 다음 가장 효과적인 화합물이 잠재적인 항암 약물로서 보다 진부한 시험관 내 분석에 의해, 예컨대 다른 약물과의 비교를 위해 ID₅₀과 LD₅₀을 수립하기 위해 단기간 성장 억제와 장기간 클론 형성 분석을 사용하는 용량 반응 분석에 의해 추가로 특성 확인된다. 화합물의 활성 범위는 상이한 사람 종양 셀 라인에서, 및 특히 변형되지 않은 또는 텔로머라제-불멸화된 정상 세포 (하기 실시예 1에서 설명된 바와 같음)에서, 화합물이 종양-특이적 효과를 가지는 지를 측정하기 위하여 윤곽이 그려진다. 가장 가능성이 있는 화합물이 종래 기법에 의해 유도될 수 있고, 유도체들은 다시 노쇠 또는 유사분열성 파국에 대해 스크린될 수 있다. 계속해서 생체 내 시험으로 암의 동물 모델, 예컨대 면역결핍성 마우스에서 성장한 사람 종양의 이종 이식편, 또는 특이한 암의 유전자 도입 마우스 모델에서의 화합물의 효능이 측정될 수 있다. 종래의 동물 시험은 또한 항암 약물로서 그러한 화합물의 정당성을 입증할 임상 연구를 위한 제제 중에서 화합물의 안전성과 생체 내 활용성을 측정하는 데에도 사용될 수 있다.

본 발명의 방법은 종양 세포, 가장 바람직하게는 사람 종양 세포의 성장을 억제하는 화합물을 확인하는 데 유용하다. 본 발명은 또한 확인된 화합물 및 종양 세포, 가장 바람직하게는 사람 종양 세포 성장을 억제하기 위해 확인된 화합물을 사용하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 본원에 개시된 방법에 의해 약제학적 조성물로서 확인된 화합물의 구체예를 제공한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 그 자체로서 공지된 방식으로, 예컨대 종래의 혼합, 용해, 과립화, 당의정-제조, 가루로 만들기, 유화, 캡슐화, 엔트랩핑(entrapping) 또는 동결건조 과정에 의해 제조될 수 있다.

본 발명에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물은 그로써 약제학적으로 사용될 수 있는 제제로의 활성 화합물의 처리 과정을 용이하게 해주는 부형제 및 보조제를 포함한 하나 또는 그 이상의 생리적으로 허용될 수 있는 담체를 사용하여 종래 방식으로 제형될 수 있다. 적절한 제형은 선택된 투여 경로에 따라 좌우된다.

비-독성 약제학적 염으로는 염산, 인산, 브롬화수소산, 황산, 술핀산, 포름산, 톨루엔술폰산, 메탄술폰산, 질산, 벤조산, 시트르산, 타르타르산, 말레산, 요오드화수소산, 알칸산, 예컨대 아세트산, HOOC-(CH₂)_n-CH₃ (n은 0 내지 4이다) 등과 같은 산의 염을 포함한다. 비-독성 약제학적 염기 부가 염으로는 나트륨, 칼륨, 칼슘, 암모늄, 등과 같은 염기의 염을 포함한다. 당업자들은 다양하고 광범위한 약제학적으로 허용될 수 있는 비-독성 부가 염을 인지할 것이다.

주사용으로는 본 발명의 방법에 따라 확인된 종양 세포 성장-억제 화합물은 적절한 수용액 중에, 예컨대 생리적으로 부합하는 완충액, 예컨대 행크 용액, 링거 용액, 또는 생리 식염수 완충액 중에 제형될 수 있다. 경점막 및 경피성 투여를 위해서는, 투과될 장벽에 적절한 침투제가 제형에 사용될 수 있다. 그러한 침투제는 일반적으로 당해 기술분야에 공지되어 있다.

경구 투여를 위해서는 화합물은 활성 화합물을 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 약제학적으로 허용될 수 있는 담체와 조합시킴으로써 제형될 수 있다. 그러한 담체는 본 발명의 화합물이 치료될 환자에 의해 경구 섭취되도록 정제, 환, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로서 제형되는 것을 가능하게 한다. 경구 사용을 위한 약제학적 제제는 고형 부형제와 함께, 임의로 그 결과의 혼합물을 가루로 만들고 필요에 따라 정제 또는 당의정 코어를 얻기 위하여 적당한 보조제가 첨가된 후에 과립 혼합물을 가공 처리함으로써 얻어질 수 있다. 적당한 부형제는 특히 충전제, 예컨대 당, 이를테면 락토스, 수크로스, 만니톨, 또는 소르비톨; 셀룰로스 제제, 예컨대 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 검 트라가칸트, 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 및/또는 폴리비닐피롤리돈 (PVP)이다. 필요에 따라 붕괴제, 예컨대 교차-결합된 폴리비닐 피롤리돈, 아가, 또는 알긴산 또는 알긴산 나트륨과 같은 그것들의 염이 첨가될 수 있다.

당의정 코어는 적당한 코팅과 함께 제공된다. 이 목적을 위해서는 종래의 당 용액이 사용될 수 있는데, 그것은 임의로 아라비아 검, 탈크, 폴리비닐 피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜, 및/또는 이산화 티탄, 래커 용액, 및 적당한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 함유할 수 있다. 활성 화합물 용량의 상이한 조합을 확인 또는 특성 확인하기 위하여 염료 또는 안료가 정제 또는 당의정 코팅에 첨가될 수 있다.

경구용으로 사용될 수 있는 약제학적 제제는 젤라틴으로 만들어진 푸쉬-핏(push-fit) 캡슐뿐만 아니라 젤라틴과 가소제, 예컨대 글리세롤 또는 소르비톨로 만들어진 연질의 밀봉된 캡슐을 포함한다. 푸쉬-핏 캡슐은 예컨대 락토스와 같은 충전제, 전분과 같은 결합제, 및/또는 탈크 또는 스테아르산 마그네슘과 같은 윤활제, 및 임의로 안정화제와의 혼합 형태로 활성 성분을 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서 활성 화합물은 적당한 액체, 예를 들면 지방 오일, 액체 파라핀, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜 중에 용해되거나 현탁될 수 있다. 경구 투여용 제형은 모두 그러한 투여에 적당한 적정량이어야 한다. 구강 투여를 위해서는 조성물은 종래 방식으로 제형된 정제 또는 마름모꼴 정제의 형태를 취할 수 있다.

흡입에 의한 투여를 위해서는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 화합물은 편리하게도 가압 팩 또는 의료용 분무기로부터 에어로솔 분무 형태로 전달될 수 있으며, 적당한 추진제, 예컨대 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화 탄소 또는 다른 적당한 기체가 사용된다. 가압 에어로솔의 경우에 적정량 단위는 계량된 양을 전달하기 위하여 밸브가 제공됨으로써 결정될 수 있다. 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위해 예컨대 젤라틴으로 만들어진 캡슐과 카트리지가 락토스 또는 전분과 같은 적당한 분말 기초와 화합물의 분말 혼합물을 함유하도록 제형될 수 있다.

화합물은 주사, 예컨대 거환 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여를 위해 제형될 수 있다. 주사용 제형은 단위 적정량 형태로, 예컨대 보존제가 첨가된 앰풀 또는 다중-용량 용기로 제공될 수 있다. 조성물은 현탁액, 오일 또는 수성 비히클 중의 용액 또는 에멀션의 형태를 취할 수 있으며, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형 제제를 함유할 수 있다.

비경구 투여를 위한 약제학적 제형은 수용성 형태의 활성 화합물의 수용액을 포함한다. 또한 활성 화합물의 현탁액은 적절한 유상 주사용 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적당한 친유성 용매 또는 비히클로는 지방 오일, 예컨대 참깨 기름, 또는 합성 지방산 에스테르, 예컨대 올레산 에틸 또는 트리글리세리드, 또는 리포솜을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 높일 수 있는 물질, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨, 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 임의로, 현탁액은 또한 매우 농축된 용액의 제조가 가능해지도록 화합물의 용해도를 증가시키는 적당한 용해제 또는 제제들을 함유할 수 있다. 또는 달리 활성 성분은 사용 전에 적당한 비히클, 예컨대 발열 물질이 없는 멸균수로 재구성될 수 있는 분말 형태일 수 있다. 화합물은 또한 예컨대 코코아 버터 또는 다른 글리세리드와 같은 종래의 좌제 기초를 함유하는 좌제 또는 정체 관장제와 같은 직장 조성물로 제형될 수 있다.

앞에서 설명된 제형 외에 화합물은 또한 디폿(depot) 제제로 제형될 수 있다. 그러한 장기간 작용 제형은 이식에 의해 (예컨대 피하 또는 근육내 이식) 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 그러므로 예를 들면 화합물은 적당한 중합체 또는 소수성 물질 (예컨대 허용될 수 있는 오일 중의 에멀션으로서) 또는 이온 교환 수지와, 또는 잘 녹지 않는 유도체로서, 예를 들면 잘 녹지 않는 염으로서 제형될 수 있다.

본 발명의 소수성 화합물을 위한 약제학적 담체는 벤질 알코올, 비극성 계면활성제, 물과 혼합될 수 없는 유기 중합체, 및 수성 상을 포함하고 있는 공동 용매 시스템이다. 공동 용매 시스템은 VPD 공동 용매 시스템일 수 있다. VPD는 순수 에탄올 중의 부피로 구성된 3 % w/v 벤질 알코올, 8 % w/v의 비극성 계면활성제 폴리소르베이트 80, 및 65 % w/v의 폴리에틸렌 글리콜 300의 용액이다. VPD 공동 용매 시스템 (VPD:5W)은 수용액 중의 5 % 덱스트로스로 1:1 희석된 VPD로 이루어진다. 이 공동 용매 시스템은 소수성 화합물을 잘 녹이며, 그 자체로서 전신 투여시에 낮은 독성을 유발한다. 자연적으로 공동 용매 시스템의 비율은 그것의 용해도 및 독성 특성을 파괴하지 않는 상태에서 상당히 달라질 수 있다. 나아가 공동 용매 성분의 본질은 달라질 수 있다: 예를 들어 다른 저-독성의 비극성 계면활성제가 폴리소르베이트 80 대신 사용될 수 있고; 폴리에틸렌 글리콜의 분획 크기가 달라질 수 있으며; 다른 생체 부합성 중합체, 예컨대 폴리비닐 피롤리돈이 폴리에틸렌 글리콜을 대체할 수 있고; 다른 당 또는 다당이 덱스트로스를 대신할 수 있다.

또는 달리 다른 전달 시스템이 소수성 약제학적 화합물을 위해 사용될 수 있다. 리포솜과 에멀션이 소수성 약물을 위한 전달 비히클 또는 담체의 잘 알려져 있는 실례이다. 비록 독성이 더 크긴 하지만 특정 유기 용매, 예컨대 디메틸술폭시드가 또한 사용될 수 있다. 또는 달리 화합물은 지속된-방출 시스템, 예컨대 치료제를 함유하고 있는 고형의 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 사용하여 투여될 수 있다. 다양한 지속-방출 물질이 정립되어 있고, 당업자들에게 잘 알려져 있다. 지속-방출 캡슐은 그것들의 화학적 성질에 따라 수주에서 100일 정도에 이르기까지 화합물을 방출한다. 치료제의 화학적 성질 및 생물학적 안정성에 따라 단백질 및 핵산 안정화를 위한 추가의 스트래티지가 사용될 수도 있다.

약제학적 조성물은 또한 적당한 고체 또는 겔 상 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 그러한 담체 또는 부형제의 실례로는 그것들에 한정되는 것은 아니지만 탄산칼슘, 인산칼슘, 다양한 당, 전분, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 및 중합체, 예컨대 폴리에틸렌글리콜이 있다.

본 발명의 화합물은 약제학적으로 부합하는 카운터 이온과의 염으로서 제공될 수 있다. 약제학적으로 부합되는 염은 그것들에 한정되는 것은 아니지만 염산, 황산, 아세트산, 락트산, 타르타르산, 말산, 숙신산, 인산, 브롬화수소산, 술핀산, 포름산, 톨루엔술폰산, 메탄술폰산, 질산, 벤조산, 시트르산, 타르타르산, 말레산, 요오드화수소산, 알칸산, 예컨대 아세트산, HOOC-(CH₂)_n-CH₃ (n은 0 내지 4이다) 등을 포함하는 많은 산과 제형될 수 있다. 염은 상응하는 유리 염기 형태인 수성 또는 다른 양자성(protonic) 용매에 보다 잘 녹는 경향이 있다. 비-독성 약제학적 염기 부가 염으로는 나트륨, 칼륨, 칼슘, 암모늄 등과 같은 염기의 염을 포함한다. 당업자는 다양하고 광범위한 약제학적으로 허용될 수 있는 비-독성 부가 염을 인지할 것이다.

본 발명의 화합물의 약제학적 조성물은 다양한 수단을 통하여 제형되고 투여될 수 있는데, 이를테면 전신적으로, 국소적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다. 제형 및 투여 기법은 문헌에서 찾아볼 수 있다 (in "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA). 투여 방식은 신체의 원하는 표적 부위에 최대로 전달되도록 선택될 수 있다. 적당한 투여 경로는 예를 들면 경구, 직장, 경점막, 경피, 또는 장내 투여; 비경구 전달, 예를 들어 근육내, 피하, 척수내 주입 및 경막내(intrathecal), 직접적인 소화기관내, 정맥내, 복강내, 비강내, 또는 안내 주사일 수 있다.

또는 달리 화합물은 전신적인 방식보다는 국소적인 방식으로, 예를 들면 화합물을 직접 특정 부위에, 때로는 디폿 제형 또는 지속-방출 제형으로 주사함으로써 투여될 수 있다.

본 발명에 사용하기에 적당한 약제학적 조성물은 활성 성분이 그것의 의도된 목적을 이루기에 효과적인 양으로 함유되어 있는 조성물을 포함한다. 보다 구체적으로 치료적으로 유효한 양은 치료될 환자의 기존의 징후들의 전개를 방지하거나 완화시키기에 효과적인 양을 의미한다. 유효량의 측정은 당업자의 능력 범위 내에서, 구체적으로 본원에 제공된 상세한 설명의 관점에서 충분히 이루어진다.

본 발명의 방법에 사용된 어떠한 화합물에 대하여 치료적으로 유효량은 본원에서 설명된 바와 같이 초기에 세포 배양 분석으로부터 추정될 수 있다. 예를 들면 용량은 세포 배양물에서 측정된 바와 같은 EC₅₀ (50 % 증가에 효과적인 양)을 포함하는 순환 농도, 즉 종양 세포 성장의 최대 억제의 절반을 이룰 수 있는 시험 화합물의 농도를 이루기 위해 동물 모델에서 제형될 수 있다. 그런 정보는 사람에게서 유용한 용량을 보다 정확하게 측정하기 위해 사용될 수 있다.

그러나 어떠한 특별한 환자에 대한 구체적인 용량 수준은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 성별, 식이요법, 투여 시간, 투여 경로, 및 배설 속도, 약물 조합, 치료를 진행하고 있는 특정 질병의 심각성 및 처방하는 의사의 판단을 포함하는 다양한 요소들에 따라 좌우될 것임이 인지될 것이다.

본 발명의 바람직한 화합물은 특정한 약리학적 성질을 가질 것이다. 그러한 성질로는 그것들에 한정되는 것은 아니지만 생체 내 활용성, 낮은 독성, 낮은 혈청 단백질 결합 및 바람직한 시험관 내 및 생체 내 수명이다. 분석은 이들 바람직한 약리학적 성질을 예견하기 위하여 사용될 수 있다. 생체 내 활용성을 예견하기 위해 사용될 수 있는 분석으로는 사람 장 세포 단층, 예컨대 Caco-2 세포 단층을 가로지르는 수송을 포함한다. 혈청 단백질 결합은 알부민 결합 분석으로부터 예견될 수 있다. 그러한 분석은 문헌에 설명되어 있다 (Oravcova et al., 1996, J. Chromat . B 677: 1-27). 화합물 수명은 화합물의 적정량의 빈도에 역비례한다. 화합물의 시험관 내 수명은 문헌에 설명되어 있는 것과 같은 마이크로솜 수명의 분석으로부터 예견될 수 있다 (Kuhnz and Gieschen, 1998, DRUG METABOLISM AND DISPOSITION, Vol. 26, pp.1120-1127).

그러한 화합물의 독성 및 치료적 효능은 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약제학적 과정에 의하여, 예컨대 LD₅₀ (집단의 50 %에 치명적인 용량) 및 ED₅₀ (집단의 50 %에서 치료상 효과적인 용량)을 측정함으로써 측정될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 용량 비율은 치료 지수이고, 그것은 LD₅₀과 ED₅₀ 사이의 비율로서 표시된다. 높은 치료 효과를 나타내는 화합물이 바람직하다. 이들 세포 배양물 분석 및 동물 연구로부터 얻어진 데이터는 사람에게 사용하기 위한 적정량 범위를 제형하는데 사용될 수 있다. 그러한 화합물의 적정량은 바람직하게는 거의 또는 전혀 독성이 없는 ED₅₀을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 놓인다. 적정량은 이 범위 내에서 사용된 적정량 형태 및 사용된 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 적정량은 환자의 상태의 관점에서 개별적인 의사에 의해 선택될 수 있다 (Fingl et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch.1, p.l).

적정량 및 투여 간격은 종양 세포 성장-억제 효과를 지속시키기에 충분한 활성 부분의 혈장 수준을 제공하기 위해 개별적으로 조정될 수 있다. 전신 투여를 위한 통상적인 환자 적정량은 100 내지 2000 mg/일의 범위이다. 환자 체표면적의 관점에서 말하자면 통상적인 적정량 범위는 50 내지 910 mg/m²/일이다. 통상적인 평균 혈장 수준은 0.1 내지 1000 μM 내에서 유지되어야 한다. 국소 투여 또는 선택적 흡수의 경우에 화합물의 효과적인 국소 농도는 혈장 농도와 관련지을 수 없다.

다음의 실시예는 본 발명의 바람직한 특정 구체에를 추가로 예시할 목적으로 의도된 것이며 발명의 성질을 제한하지 않는다.

본 발명은 종양 세포를 죽이거나 성장을 영구적으로 억제하는 화합물을 확인하는 방법을 제공한다.

첫 번째 측면으로 본 발명은 정상 세포에 비해 우선적으로 종양 세포에서 세포 사멸을 유도하는 화합물을 확인하는 방법을 제공한다. 본원에서 밝혀지는 것과 같이 통상적으로 사용되는 항암 약물은 동계의(isogenic) 정상 세포에 비교하여 신생물질을 형성할 수 있도록 형질전환된 세포에서 우선적으로 유사분열성 파국 (노쇠 또는 아폽토시스보다)을 유도한다. 그러므로 종양 세포에서 유사분열성 파국을 유도하는 제제는 종양-특이적 방식으로 작용하는 것 같다. 어떤 구체예에서 본 발명의 방법은 a) 암 세포 배양물을 시험 화합물과 접촉시키고, 계속해서 화합물을 제거하거나 제거하지 않는 단계; 그리고 b) 처리된 세포에서 유사분열상 형태학을 분석하거나 배양물에서의 둘 이상의 소핵(micronuclei)을 가지는 간기 세포의 출현을 분석함으로써, 유사분열성 파국의 유도에 대하여 화합물을 분석하는 단계로 이루어진다. 추가의 측면으로 본 발명은 확인된 화합물의 종양-특이적 세포 독성을 증명하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 방법의 이 측면은 추가의 단계들, 즉 비-암 세포 배양물을 종양 세포에서 유사분열성 파국을 유도하기에 충분한 화합물 농도에서 및 그러한 시간 동안 화합물과 접촉시키는 단계; 세포 사멸의 유도에 대하여 화합물을 분석하는 단계; 그리고 비-암 세포에서 세포 사멸을 유도하지 않거나 아주 약하게 유도하는 화합물을 확인하는 단계를 포함한다.

두 번째 측면으로 본 발명은 종양 세포에서 유사분열성 파국 또는 노쇠를 유도하는 세포독성제를 확인하기 위한 효과적인 스크리닝 방법을 제공한다. 어떤 구체예에서 본 발명의 방법은 a) 암세포 배양물을 세포에서 세포 성장 정지를 유도하기에 충분한 화합물 농도에서 및 그러한 시간 동안 화합물과 접촉시키는 단계; b) 처리된 세포의 유사분열 지수의 감소를 검출하기 위하여 처리된 세포의 일부를 분석하는 단계; c) 화합물을 제거하고 세포가 세포 사이클에 재진입할 수 있기에 충분한 시간을 포함하는 회복 기간 동안 세포를 배양하는 단계; d) 회복된 세포의 유사분열 지수의 증가를 검출하기 위하여 회복된 세포의 일부를 분석하는 단계; e) 상기 세포에서 노쇠 마커의 생성을 검출함으로써, 노쇠 유도에 대하여 미처리 세포에서보다 더 작은 유사분열 지수의 증가를 생성하는 화합물을 분석하는 단계; f) 처리되고 회복된 세포에서의 유사분열상 형태학을 평가하거나 둘 이상의 소핵을 가지는 간기 세포의 배양물에서의 출현을 검출함으로써, 유사분열성 파국에 대하여 미처리 세포에서만큼 또는 그것보다 더 큰 유사분열 지수의 증가를 생성하는 화합물을 분석하는 단계; 그리고 g) 유사분열 지수의 작은 증가와 노쇠 마커의 발현을 유도하는 화합물을 암세포에서의 노쇠-유도 화합물로서 확인하고, 세포에서 비정상적인 유사분열상 또는 소핵을 유도하는 화합물을 암세포에서 유사분열성 파국을 유도하는 화합물로서 확인하는 단계로 이루어진다. 바람직한 구체예에서 세포는 사람 암세포, 보다 바람직하게는 고형 종양 세포, 가장 바람직하게는 HT1080 세포이다. 추가의 바람직한 구체예에서 세포는 유사분열 지수의 감소를 측정하기 위해 단계 (b)에서 유사분열-특이적 시약으로 처리된 세포의 일부를 염색함으로써 분석된다. 바람직하게는 세포는 현미경에 의해 또는 형광-활성화 세포 분류법에 의해 분석된다. 추가의 구체예에서 세포는 유사분열 지수의 증가를 검출하기 위해 단계 (d)에서 유사분열-특이적 시약으로 회복된 세포의 일부를 염색함으로써 분석된다. 바람직하게는 유사분열-특이적 시약은 유사분열 세포-특이적 항체이다. 어떤 구체예에서 세포는 현미경에 의해 또는 형광-활성화 세포 분류법에 의해 분석된다. 본 발명의 이 측면의 방법에 따라 인큐베이션되고 방출된 후에, 유사분열 지수의 작은 증가를 나타내는 세포가 노쇠-결합 베타-갈락토시다제 (SA-β-gal)인 노쇠 마커를 사용하여 분석되거나 장기간 콜로니 형성을 종식하는 능력에 대하여 시험 된다. 유사분열 지수의 큰 증가를 나타내는 세포에서 염색체 형태학은 유익하게도 DNA-특이적 검출 시약을 사용하여 분석되거나 또는 형광-염색된 세포 분류법에 의하여 분석된다. 또는 달리 염색체 형태학은 H2B-GFP 융합 단백질을 사용하여 분석된다.

세 번째 측면으로 본 발명은 종양 세포 성장을 억제하기 위한 방법을 제공하는데, 그 방법은 종양 세포를 본 발명의 방법에 따라 암세포에서 유사분열성 파국을 유도하는 것으로 확인된 화합물의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함한다.

네 번째 측면으로 본 발명은 비정상 세포 증식 또는 종양 세포 성장과 관련된 질병 또는 질환을 치료하는 방법을 제공하는데, 그 방법은 종양 세포를 본 발명의 방법에 따라 암세포에서 유사분열성 파국을 유도하는 것으로 확인된 화합물의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함한다.

본 발명의 다섯 번째 측면은 종양 세포 성장을 억제하는 화합물을 제공하는데, 세포에서 유사분열성 파국을 유도하는 화합물은 본 발명의 방법에 따라 확인된다.

여섯 번째 측면으로 본 발명은 암세포에서 노쇠를 유도하기 위한 방법을 제공한다. 이 구체예에서 방법은 세포가 화합물과 접촉될 때 유사분열 지수를 안정하게 감소시키는 화합물의 유효량과 종양 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다.

일곱 번째 측면으로 본 발명은 비정상 세포 증식 또는 종양 세포 성장과 관련된 질병 또는 질환을 치료하는 방법을 제공하는데, 그 방법은 세포가 화합물과 접촉될 때 유사분열 지수를 안정하게 감소시키는 화합물의 유효량과 종양 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다.

여덟 번째 측면으로 본 발명은 암세포에서 노쇠를 유도하는 화합물을 제공하는데, 상기 화합물은 세포가 화합물과 접촉될 때 유사분열 지수를 안정하게 감소시킨다.

본 발명에는 종양 세포 성장을 억제할 수 있는 본 발명의 펩티드 또는 펩티드 유사체의 치료학적으로 유효한 양과 약제학적으로 허용될 수 있는 담체 또는 희석제를 포함하는, 본 발명의 방법에 따라 효과적인 약제학적으로 허용될 수 있는 조성물 또한 제공된다.

본 발명의 구체적이고 바람직한 구체예들은 바람직한 특정 구체예 및 청구의 범위에 대한 하기의 보다 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.

실시예 1

독소루비신은 신생물질을 형성할 수 있도록 형질전환된 섬유아세포에서 유사분열성 파국을 우선적으로 유도한다.

상이한 암의 치료에 임상적인 활용성이 증명된, 통상적으로 사용되는 약물인 독소루비신을, 정상 세포에 대해 우선적으로 체크포인트-결핍 사람 세포를 죽이는 제제를 확인하기 위한 본 발명의 방법의 효능을 증명하기 위한 예시적인 화학 치료제로서 선택하였다.

이들 분석에 텔로머라제-불멸화된 사람 섬유아세포의 동계 유전자 쌍을 사용하였다. 한 쌍의 사람 섬유아세포 중 하나를 SV40의 초기 영역에 의해 형질도입시켜서, 그 결과 체크포인트 조절을 약화시키고 부분적으로 형질전환을 유발하였다. 이들 셀 라인을 사람 텔로머라제 단백질 성분 (hTERT)으로, 또는 hTERT와 큰-T(LT) 및 작은-T(ST) 발암 유전자를 코드화하는 SV40의 초기 영역과의 조합으로 레트로바이러스 형질도입 후에 BJ 일차 사람 섬유아세포 (수탁 번호 CRL-2522, 아메리칸 타입 컬춰 컬렉션, Manassas, VA)로부터 유도하였다 (Hahn et al., 1999, Nature 29: 464-468; Hahn et al., 2002, Mol . Cell. Biol . 22: 2111-2123). hTERT 만으로 형질도입된 셀 라인은 BJ-EN으로 표시하고, hTERT와 SV40의 초기 영역으로 형질도입된 셀 라인은 BJ-ELB로 표시하였다. BJ-EN과 BJ-ELB 셀 라인은 둘 다 윌리엄 한 박사(Dr. William Hahn, Massachusetts General Hospital, Boston, MA)에게서 제공받았다. 이들 셀 라인을 글루타민, 피루브산염, 페니실린 및 스트렙토마이신이 첨가되고 10 %의 우태아 혈청이 첨가된, DMEM과 배지 199의 4:1 혼합물에서 배양하였다.

hTERT-형질도입된 BJ 섬유아세포는 불멸이지만 정상 핵형, 접촉 억제, 및 연아가에서 성장하지 못하거나 동물에서 종양을 생성하지 못하는 것, 및 돌연변이 RAS에 대한 반응으로 노쇠를 진행하는 능력을 포함한, 정상 (형질전환되지 않은) 세포의 다른 모든 성질은 그대로 유지한다 (Jiang et al., 1999, Nat. Genet. 21: 111-114; Hahn et al., 1999, 상기 동일). LT와 ST를 코드화하는 SV40 초기 영역의 도입 결과 부분적으로 형질전환된 표현형이 생성된다 (Hahn et al., 2002, 상기 동일). LT는 망막아종 및 p53 종양 억제제 경로를 무능하게 함으로써 대부분의 세포 체크포인트 조절을 무능하게 한다. ST는 단백질 포스파타제 2A를 교란시키고, 그것은 세포 증식의 자극과 앵커리지(anchorage)-무관한 성장을 초래한다 (Hahn et al., 2002, 상기 동일).

BJ-EN과 BJ-ELB 셀 라인의 성장 속도를 약물이 없는 상태에서, 세포를 6-웰 플레이트에 웰 당 25,000 세포의 농도로 플레이팅하고, 그 후에 코울터 계수기를 사용하여 세포 수를 측정함으로써 비교하였다. 도 3A에 도시된 바와 같이 형질전환되지 않은 BJ-EN 세포가 부분적으로 형질전환된 BJ-ELB보다 훨씬 더 느리게 성장한다. 그런 다음 이들 셀 라인에서 세포 성장에 미치는 독소루비신의 상이한 농도에 대한 3-일 동안의 노출 효과를 측정하였다. 도 3B에 도시된 바와 같이 형질전환되지 않는 BJ-EN 세포는 BJ-ELB 세포보다 독소루비신에 대하여 더 내성이었고 (가장 낮은 약물 용량은 제외), 이것은 독소루비신이 이 시스템에서 형질전환된 세포 특이성을 보인다는 것을 나타낸다. 특이한 세포 반응의 비교 분석을 위해 30 nM 농도의 독소루비신을 선택하였는데, 그것은 두 개의 셀 라인에서 거의 같은 성장-억제 효과를 가졌다 (도 3B).

비교 분석에서 동일한 수의 세포를 플레이팅하였고, 다음날 독소루비신을 최종 농도 30 nM로 첨가하였다. 세포를 이 농도에서 3일 동안 독소루비신과 함께 배양한 후 약물이 없는 배지에 옮겨 추가로 3일 동안 배양하였다. 도 4C는 이 실험이 진행되는 동안 절대 세포 수의 변화를 나타낸다. 형질전환되지 않은 BJ-EN 세포는 독소루비신 처리 동안 본질적으로 세포 수의 변화를 나타내지 않았고, 그것은 불멸화되었지만 세포-사이클이 교란되지 않은 세포에 대한 약물의 세포 활동 정지 효과를 나타낸다; BJ-EN 세포 수는 약물로부터 방출된 후 3일 동안에 걸쳐서 유의할만하게 변화하지 않았다. 대조적으로 BJ-ELB 세포는 독소루비신과 배양한 첫째 날에 그 수가 증가하였고, 그것은 비효과적인 세포 사이클 정지가 계속된 성장을 초래하였음을 나타내지만, 방출 후 3일 후에는 (3dR) 이 셀 라인의 세포 수는 궁극적으로는 독소루비신츨 첨가했을 때 (d0)와 같은 값으로 감소하였으며, 그것은 세포 사멸을 시사한다 (도 3C).

독소루비신에 대한 상이한 세포 반응의 형태학적 평가를 위해서 일정 분량의 세포를 각 시간 점에서 문헌에 설명되어 있는 것과 같이 노쇠 마커 SA-β-gal에 대하여 염색하였고 (Dimri et al., 1985, 상기 동일), 다른 일정 분량을 메탄올/아세트산으로 고정시킨 후 형광 현미경 분석을 위해 DAPI (DNA-특이적 형광 염료)로 염색하였다. 노쇠한 (SA-β-gal 포지티브) 세포의 백분율은 두 개의 셀 라인에서 유사한 증가를 나타냈고 (도 3D), 그것은 SV40 초기 영역에 의해 생성된 형질전환-관련 변화가 약물 처리에 대한 노쇠 반응을 유의할만하게 변경시키지 못하였음을 나타낸다.

다른 한편으로 DAPI-염색된 세포의 분석 결과는 유사분열성 파국을 나타내는 형질전환되지 않은 BJ-EN에 비하여, 부분적으로 형질전환된 BJ-ELB에서 다수의 소핵을 가지는 세포의 분획에 커다란 증가가 있는 것으로 나타났다. 방출 후 2일 후에 소핵이 형성된 세포 분획은 BJ-EN 세포에서는 1.7 % 였지만, BJ-ELB 세포에서는 26.4 %였다. 아폽토시스 형태학 (응축되고 깨진 크로마틴을 포함한 축소된 세포)을 보이는 세포의 분획은 소핵이 형성된 세포의 분획만큼 높지는 않았지만, 또한 BJ-EN (0.9 %)에서보다는 BJ-ELB (6.6 %)에서 더 높았다. 상기에서 나타낸 바와 같이 독소루비신-처리된 세포의 아폽토시스는 또한 유사분열성 파국의 결과인 것 같다. 그러므로 독소루비신-유도된 유사분열성 파국은 체크포인트-결핍 형질전환된 세포에서보다 정상 세포에서 훨씬 더 드문 일이다.

형질전환된 셀 라인에서 유사분열성 파국의 증가의 원인을 확인하기 위하여 실험의 상이한 지점에서 DAPI-염색된 세포의 형광 현미경을 사용하여 유사분열 세포의 백분율 (유사분열 지수, MI)을 측정하였다. 도 3E에서 알 수 있는 바와 같이 독소루비신의 첨가는 정상 BJ-EN 세포에서 즉각적이고 완전한 유사분열의 정지를 초래하였다. 그러나 대조적으로 BJ-ELB에서는 유사분열은 단지 부분적으로 억제되었다. MI 값은 방출 후 둘째 날에 BJ-ELB 세포에서 극적으로 증가하였지만 (다음날에는 급속히 감소하였다), BJ-EN 세포에서는 유사분열의 회복이 훨씬 덜 나타났다 (도 3E). 특히 약물로부터 방출된 지 2 일째에 BJ-EN 세포의 MI는 단지 0.4 %였지만 BJ-ELB의 MI는 8.0 %로 상승하였다.

상기 결과는 부분적으로 형질전환된 세포에서의 더 높은 유사분열성 파국의 비율이 적어도 부분적으로는 독소루비신 처리 동안 및 후에 유사분열에 재진입하는 그러한 세포들의 더 높은 분획으로부터 초래된다는 것을 나타냈다. 유사분열성 파국의 증가의 추가의 원인은 약물로부터 방출된 후에 유사분열을 시작하는 BJ-EN과 BJ-ELB 세포 사이의 유사분열의 "특성-조절"의 차이일 수 있을 것이다. 이 문제를 해결하기 위하여 DAPI-염색된 세포의 형광 현미경을 사용하여 독소루비신으로부터 방출된 지 2일 후에 이들 셀 라인에서의 정상 및 비정상 유사분열상의 비율을 비교하였다. 형질전환되지 않은 BJ-EN 세포는 60 %의 정상 및 40 %의 비정상 유사분열상을 나타낸 한편, BJ-ELB 셀 라인에서는 오직 8 %의 유사분열상만이 정상으로 나타났다. 두 셀 라인의 유사분열상의 실례는 도 4에 도시된다. 특징적으로 BJ-EN 세포에서 29 %의 유사분열상이 중기 및 말기였던 반면, BJ-ELB 셀 라인에서는 단지 1 %의 유사분열상만이 후기 또는 말기를 나타냈다. 그러므로 부분적으로 형질전환되거나 형질전환되지 않은 셀 라인은 독소루비신으로부터 방출된 후 유사분열의 속도뿐만 아니라 특성 면에서도 상이하였다.

그러므로 노쇠가 아니라 유사분열성 파국 (및 그것의 결과적인 아폽토시스)이 독소루비신 처리 후 정상 세포보다는 우선적으로 형질전환된 세포에서 유도된다. 이들 결과는 정상 세포에 비해 우선적으로 형질전환된 세포에서 임상적으로 유용한 항암제 (독소루비신)가 유사분열성 파국을 유도한다는 직접적인 증거를 제공한다. 그러므로 종양 세포에서 유사분열성 파국을 유도하는 능력에 대하여 화합물을 스크리닝하는 것은 새로운 항암 약물의 확인에 대한 유용한 접근법이다.

실시예 2

유사분열 지수의 측정 및 유사분열성 파국의 증명

유사분열 지수와 유사분열성 파국의 발생을 다음과 같이 유사분열 세포 특이적 항체 (MCSA)를 사용하여 측정하였다. 3개의 상이한 MCSA를, DNA 내용물에 대하여 염색하는 요오드화 프로피디움 (PI)과 결합된 MCSA를 사용한 면역 형광 표지화를 토대로 한 형광 활성화 세포 분류법 (FACS)을 사용하여 비교하였다. 이 과정에서 세포를 세척하고, 트립신으로 처리하고, 동일한 부피의 70 % 에탄올 (얼음 상)로 고정시킨 후 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션한 다음 세척하고 이차 항체 (형광-표지됨)를 결합시켰다. 시험한 MCSA는 MPM2 (Upsate Biotechnology로부터 이용할 수 있다, Cat. #05-368) 및 데이비스 박사로부터 제공받은 2개의 항체 (Dr. P. Davies, Albert Einstein College of Medicine), 이미 특성이 확인되어 있는 TG3 (Anderson et al., 1998, Exp . Cell Res. 238: 498-502) 및 미공개된 GF7 항체를 포함하였다. 항체에 결합하고 G2/M DNA 내용물을 가지는 지수적으로 성장하는 (미처리) HT1080 세포의 분획은 GF7의 경우 2.42±0.29 %, MPM2의 경우 2.27±0.71 % 및 TG3의 경우 1.76±0.57 %였다.

MI의 증가 또는 감소 두 가지를 모두 검출하기 위한 MCSA의 활용성은 도 5A 및 5B에서 실험에 의해 예시된다. GF7/PI 염색된 세포의 FACS 분석을 사용하여 상이한 세포 사이클 체크포인트 보전 상태의 HT1080 섬유육종 세포들의 MI의 방사선-유도된 변화를 분석하였다. 이들 분석에는 다음의 세포들을 사용하였다: 기능성 G1 및 G2 체크포인트를 포함하는 야생형 HT1080 세포; G1 체크포인트를 종식하고 G2 체크포인트를 약화시키는 p53의 유전적 억제제인 GSE56으로 형질도입된 HT1080 세포; 및 G2 체크포인트를 종식하는 4 mM의 카페인으로 처리된 세포. 미처리 및 방사선 조사된 세포의 대표적인 염색은 도 5A에 도시된다. GSE56 또는 카페인의 존재 및 부재시의, 방사선 조사된 HT1080 세포의 MI의 시간 경과에 따른 변화는 도 2B에 도시된다 (도 5B의 각 지점은 3벌 1 세트 분석을 나타낸다). 카페인의 부재하에서 방사선 조사 직후 야생형 HT1080 세포는 거의 0에 가까운 MI의 일시적인 감소를 나타냈고, 이것은 G2 체크포인트 활성화를 반영한다. GSE56-형질도입된 세포 또한 야생형 세포에서만큼 완전하진 않았지만 GSE의 G2 체크포인트에 미치는 영향 때문에 MI의 감소를 나타냈다. 그러나 카페인의 존재시에 MI는 감소하지 않았고, 오히려 야생형 HT1080 세포에서는 거의 2배, 그리고 GSE56-형질도입된 세포에서는 거의 3배까지 증가하였다. 이들 결과는 MI의 MCSA-기초 FACS 측정이 상이한 조건하에서 처리된 세포에서의 MI의 증가 또는 감소 중 어느 하나를 측정하는 민감한 기법이었음을 보여주었다.

스크리닝 과정을 간편하게 하기 위하여 이차 항체 대신에 MCSA는 직접, 예를 들면 Molecular Probes (http://www.probes.com/products/zenon/)로부터 구할 수 있는 Zenon 키트를 사용하여 표지될 수 있다. 제논 기법은 일차 항체를 일차 항체의 Fc 영역에 대하여 특정된 이차 항체의 염료- 또는 효소-표지된 Fab 단편과 복합체를 형성시키는 것을 토대로 한다. 제논 표지화 조건을 제논 프로토콜에 설명된 것과 같이 MCSA에 대하여 최적화하고, 상이한 형광 염료와 포합된 제논 Fab 단편을 최적 조건에 대하여 시험하고 비교한다. 스크리닝을 위해서 세포를 분리할 수 있는 트레이가 부착된 밀리포아 멀티스크린 (Millipore MultiScreen) 96-웰 필터 플레이트 (예컨대 MultiScreen-FL)에서 성장시키는데, 그곳에서 세포는 다양한 용액과 함께 연속적으로 인큐베이션될 수 있고 동일한 플레이트에서 진공 여과에 의해 세정될 수 있다. 멀티스크린-FL 필터 플레이트는 밀리포아 기술 문헌에 따르면 유사한 면역 염색 과정에 적당한 것으로 나타났다 (http://www.millipore.com/publications.nsf/docs/PS1005EN00). 멀티스크린 필터 플레이트의 장점 중 하나는 진공 여과에 의하여 폴리카보네이트 필터 위의 세포의 초기 수집물이 부착되고 유동적인 세포와 결합하고, 그로써 우연히 유사분열 세포를 분리시키는 손해를 피할 수 있다는 것이다. 밀리포아 프로토콜로부터 시작하여, 트립신 처리, 고정, 세정 및 항체 표지화 과정을 이 구성에서 최적화하고, 면역 형광 표지화에 필요한 단계의 최소 수와 기간을 수립한다. 또는 달리 스크리닝 과정에서 항체 염색 및 세척 단계는 Zymark Cell Station과 같은 자동 로봇 시스템을 사용하여 수행할 수 있다.

FACS 분석을 위해서 항체-표지된 세포를 100 ㎍/ml의 RNAse 및 5 ㎍/ml의 PI를 함유하고 있는 50 ㎕의 PBS에 현탁시키고, 37 ℃에서 15 내지 30분 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 동일한 플레이트를 벡톤 딕킨슨 (BD) 멀티웰 자동 샘플러에 넣는다 (BD에 따르면 자동 샘플러에 대한 적절한 샘플 부피는 50 ㎕이다). 세포 현탁액을 FACS 시스템, 예컨대 BD FACSCalibur와 같은 시스템에 자동으로 로딩하고 분석한다. BD에 따르면 가공 처리 시간은 이 시스템의 경우 96-웰 플레이트에 대해 최적 세포 농도에서 14분이다. 데이터를 기록하고 BD FACStation 데이터 관리 시스템을 사용하여 분석한다. FACS 분석으로 세포의 총 수, 처리된 집단 내에서의 세포 사이클 분포, 아폽토시스 세포 (하위-G1) 분획, 및 MCSA+G2 DNA 내용물을 가지는 세포의 분획 (MI의 척도)을 알 수 있다.

그런 분석을 사용하여 유사분열 지수와 유사분열성 파국의 검출을, 종양 세포에 대하여 특이성을 나타내는 항암제를 검출하기 위한 화합물의 빠르고 고출력의 스크리닝에 사용할 수 있다.

전술한 설명은 본 발명의 구체적인 특정 구체예를 강조하는 것이고, 그것에 대한 변형 또는 변경된 동등한 내용이 첨부된 청구범위에 설명된 바와 같은 본 발명의 사상 및 범주 내에 있다는 것이 인지되어야 한다. 본원에 인용된 모든 참고문헌은 참조로 삽입된 것이다.

Claims (27)

1. a) 암세포 배양물을 시험 화합물과 접촉시키는 단계;

   b) 처리된 세포에서 유사분열상 (mitotic figure) 형태학을 평가하거나 둘 이상의 소핵을 가지는 간기 세포를 검출함으로써 유사분열성 파국의 유도를 검출하는 단계;

   c) 종양-특이적 세포 사멸의 유도물질로서 유사분열성 파국을 유도하는 화합물을 확인하는 단계를 포함하여, 종양-특이적 세포 사멸을 유도하는 화합물을 확인하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 시험 화합물이 세포와의 접촉 후에 배양물로부터 제거되고, 세포는 단계 (b)에서 유사분열성 파국의 유도를 검출하기 전에 시험 화합물의 부재하에서 배양되는 방법.
3. 제 1항에 있어서, 단계 (c)에서 확인된 화합물이 비-암세포와 접촉되고 상기 비-암세포에서 세포 사멸의 유도에 대해 분석되며, 상기 비-암세포에서 세포 사멸을 유도하지 못하거나 상기 비-암세포에서 세포 사멸을 암세포에서보다 더 적은 정도로 유도하는 화합물이 확인되는 방법.
4. a) 암세포 배양물을 세포 성장 정지를 유도하기에 충분한 화합물 농도에서 및 그러한 시간 동안 화합물과 접촉시키는 단계;

   b) 처리된 세포의 유사분열 지수의 감소를 검출하기 위해 처리된 세포의 일부를 분석하는 단계;

   c) 화합물을 제거하고, 세포가 세포 사이클에 재진입할 수 있기에 충분한 시간의 회복 기간 동안 배양하는 단계;

   d) 회복된 세포의 유사분열 지수의 증가를 검출하기 위해 회복된 세포의 일부를 분석하는 단계;

   e) 상기 세포에서 노쇠 마커의 생성 또는 장기간 성장 정지를 검출함으로써, 노쇠의 유도에 대하여 미처리 세포에서보다 더 작은 유사분열 지수를 생성하는 화합물을 분석하는 단계;

   f) 처리되고 회복된 세포에서의 유사분열상 형태학을 평가하거나 둘 이상의 소핵을 가지는 간기 세포의 출현을 검출함으로써, 유사분열성 파국에 대하여 미처리 세포에서만큼 크거나 이보다 더 큰 유사분열 지수를 생성하는 화합물을 분석하는 단계; 및

   g) 유사분열 지수의 작은 증가 및 노쇠 마커 또는 장기간 성장 정지를 유도하는 화합물을 암세포에서의 노쇠-유도 화합물로서 확인하고, 세포에서 비정상적인 유사분열상 또는 소핵을 유도하는 화합물을 암세포에서 유사분열성 파국을 유도하는 화합물로서 확인하는 단계를 포함하여, 암세포에서 유사분열성 파국 또는 노쇠를 유도하는 화합물을 확인하는 방법.
5. 제 4항에 있어서, 세포가 사람 암세포인 방법.
6. 제 4항에 있어서, 세포가 고형 종양 세포인 방법.
7. 제 4항에 있어서, 상기 세포가 HT1080 세포인 방법.
8. 제 4항에 있어서, 세포가 3시간 이상 동안 단계 (a)에서 화합물과 접촉되는 방법.
9. 제 4항에 있어서, 세포가 처리된 세포의 일부를 유사분열-특이적 시약으로 염색함으로써 유사분열 지수의 감소를 검출하기 위해 단계 (b)에서 분석되는 방법.
10. 제 9항에 있어서, 유사분열-특이적 시약이 유사분열 세포-특이적 항체인 방법.
11. 제 9항에 있어서, 세포가 현미경에 의해 분석되는 방법.
12. 제 9항에 있어서, 세포가 형광-활성화 세포 분류법에 의해 분석되는 방법.
13. 제 4항에 있어서, 세포가 회복된 세포의 일부를 유사분열-특이적 시약으로 염색함으로써 유사분열 지수의 감소를 검출하기 위해 단계 (d)에서 분석되는 방법.
14. 제 13항에 있어서, 유사분열-특이적 시약이 유사분열 세포-특이적 항체인 방법.
15. 제 13항에 있어서, 세포가 현미경에 의해 분석되는 방법.
16. 제 13항에 있어서, 세포가 형광-활성화 세포 분류법에 의해 분석되는 방법.
17. 제 4항에 있어서, 단계 (e)에서 분석된 노쇠 마커가 노쇠-관련 베타-갈락토시다제 (SA-β-gal)인 방법.
18. 제 4항에 있어서, 유사분열 형태학이 DNA-특이적 검출 시약을 사용하여 분석되는 방법.
19. 제 18항에 있어서, 상기 세포가 현미경에 의해 분석되는 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제 4항에 있어서, 염색체 형태학이 H2B-GFP 융합 단백질을 사용하여 분석되는 방법.
21. 종양 세포를 유효량의 암세포에서 유사분열성 파국을 유도하는 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하며, 화합물이 제 1항 또는 제 4항의 방법에 따라 확인된 화합물인, 종양 세포 성장을 억제하는 방법.
22. 종양 세포를 유효량의 암세포에서 유사분열성 파국을 유도하는 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하며, 화합물이 제 1항 또는 제 4항의 방법에 따라 확인된 화합물인, 비정상적인 세포 증식 또는 종양 세포 성장과 관련된 질병 또는 질환을 치료하는 방법.
23. 제 1항 또는 제 4항의 방법에 따라 확인된, 암세포에서 유사분열성 파국을 유도하는 화합물.
24. 종양 세포를 유효량의 제 4항의 방법의 단계 (g)에서 확인된 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하여, 암세포에서 노쇠를 유도하는 방법.
25. 종양 세포를 유효량의 암세포에서 노쇠를 유도하는 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하며, 화합물이 제 4항의 방법의 단계 (g)에서 확인된 화합물인, 비정상적인 세포 증식 또는 종양 세포 성장과 관련된 질병 또는 질환을 치료하는 방법.
26. 제 4항의 방법의 단계 (g)에서 확인된, 암세포에서 노쇠를 유도하는 화합물.
27. 제 4항에 있어서, 단계 (g)에서 유사분열성 파국의 유도물질로서 확인된 화합물이 비-암세포와 접촉되고 상기 비-암세포에서 세포 사멸에 대해 분석되며, 상기 비-암세포에서 세포 사멸을 유도하지 못하거나 암세포에서보다 더 적은 정도로 상기 비-암세포에서의 세포 사멸을 유도하는 화합물이 확인되는 방법.