CN115671024A

CN115671024A - 樱花光甘草定复合发酵液、含其产品、及其制备和应用

Info

Publication number: CN115671024A
Application number: CN202211565304.3A
Authority: CN
Inventors: 卢永杰; 张冬盈; 孙静; 张兵; 张炽坚; 艾勇; 何廷刚
Original assignee: Hua An Tang Biotech Group Co ltd
Current assignee: Hua An Tang Biotech Group Co ltd
Priority date: 2022-12-07
Filing date: 2022-12-07
Publication date: 2023-02-03
Anticipated expiration: 2042-12-07
Also published as: CN115671024B

Abstract

本申请公开了一种樱花光甘草定复合发酵液、含其产品、及其制备和应用。樱花光甘草定复合发酵液的制备方法包括如下步骤：干燥的樱花、光甘草定和水的混合物作为发酵底物，将乳杆菌接种到发酵底物中，经发酵培养，灭菌，即可；其中，干燥的樱花与光甘草定的质量比为（100~300）：1。本申请制得的樱花光甘草定复合发酵液同时兼具理想的抗氧化、舒缓肌肤和美白等功效，制备工艺简单，显著提高了光甘草定在水相体系中的分散性，使用安全性高，无刺激作用。

Description

樱花光甘草定复合发酵液、含其产品、及其制备和应用

技术领域

本申请属于发酵技术领域，尤其涉及一种樱花光甘草定复合发酵液、含其产品、及其制备和应用。

背景技术

樱花中含有丰富的天然维生素A、B、E和樱花酵素等活性物质，具有嫩肤、增亮肤色的作用，是护肤品的重要原料之一，有“青春之花”之誉。但如何从樱花中提取出有效活性成分一直是本领域重要难题，提取工艺选取不当不仅会破坏活性成分，还可能导致提取物含有刺激肌肤的物质，使用安全性低。

光甘草定是从甘草中提取得到的黄酮类化合物，光甘草定因其具有理想的美白功效被人们誉称为“美白黄金”，可消除自由基和肌底黑色素，是皮肤抗衰老和美白圣物。但光甘草定的水溶性极差，通常需要添加乳化剂提高其在水相中的分散，或者添加增溶剂增加其在水相中的溶解度，使用方法繁琐。由于光甘草定的水不溶性限制了其在化妆品中的添加量，进而导致美白功效不显著。

因此，本领域亟需研发一种可高效利用樱花和光甘草定的美容功效，研发一种使用安全性高，制备工艺简单，体系稳定，且美白效果显著的化妆品。

发明内容

本申请所要解决的技术问题是克服现有技术中樱花提取物对肌肤有刺激作用，使用安全性低；光甘草定的水不溶性导致其美白功效差等缺陷，而提供一种樱花光甘草定复合发酵液、含其产品、及其制备和应用。本申请制得的樱花光甘草定复合发酵液同时兼具理想的抗氧化、舒缓肌肤和美白等功效，制备工艺简单，显著提高了光甘草定在水相体系中的分散性，使用安全性高，无刺激作用。

本申请采用以下技术方案解决上述技术问题：

本申请提供一种樱花光甘草定复合发酵液的制备方法，具体包括如下步骤：干燥的樱花、光甘草定和水的混合物作为发酵底物，将乳杆菌接种到所述发酵底物中，经发酵培养，灭菌，制得所述樱花光甘草定复合发酵液；

其中，所述干燥的樱花与所述光甘草定的质量比为（100~300）：1。

一些实施例中，所述干燥的樱花与所述光甘草定的质量比较佳地为（100~250）：1。

一些实施例的所述发酵底物中，所述干燥的樱花占所述水的质量百分比可为5%~10%。

一些实施例中，所述干燥的樱花的目数可为本领域常规，较佳地为10~100目，更佳地为40~50目。

一些实施例中，所述发酵底物在使用前还可按照本领域常规包括灭菌的操作。

其中，所述发酵底物的所述灭菌的条件和方法可为本领域该类操作常规的条件和方法，一般可为高温灭菌法。

当采用所述高温灭菌法对所述发酵底物进行所述灭菌时，所述灭菌的温度可为本领域该类操作常规的温度，较佳地为110~121℃。

当采用所述高温灭菌法对所述发酵底物进行所述灭菌时，所述灭菌的时间可为本领域该类操作常规的时间，较佳地为15~45min，更佳地为30~40min。

当采用所述高温灭菌法对所述发酵底物进行所述灭菌时，所述灭菌的压力可为本领域该类操作常规的压力，较佳地为0.1~0.4Mpa，更佳地为0.1~0.2Mpa，例如0.15MPa。

其中，按照本领域常规，所述发酵底物的所述灭菌的操作后还可进一步包括冷却的操作，一般可为冷却至室温。

一些实施例中，所述乳杆菌可包括高加索酸奶乳杆菌（Lactobacillus kefiri）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）和瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）中至少一种。

其中，所述高加索酸奶乳杆菌可包括保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 20260 的高加索酸奶乳杆菌。保藏编号为CICC 20260 的高加索酸奶乳杆菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

其中，所述嗜酸乳杆菌可包括保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 6074的嗜酸乳杆菌。保藏编号为CICC 6074的嗜酸乳杆菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

其中，所述瑞士乳杆菌可包括保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 22171的瑞士乳杆菌。保藏编号为CICC 22171的瑞士乳杆菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

一些实施例中，单位质量的所述发酵底物中接种的所述乳杆菌的数量可为本领域常规，较佳地为10⁶~10⁹CFU/g，更佳地为10⁶~10⁷CFU/g。

一些实施例中，所述发酵培养的时间可为8~36，较佳地为15~24h。

一些实施例中，所述发酵培养的温度可为35~37℃。

一些实施例中，所述发酵培养的操作后还可进一步包括离心，收集上清液的操作。

其中，所述离心的转速可为2000~8000rpm，较佳地为4800rpm。

其中，所述离心的时间可为10~45min，较佳地为30~40min。

其中，所述离心的操作后还可进一步包括采用滤膜精滤的操作。所述滤膜的孔径可为0.2~0.5μm，较佳地为0.22μm。

一些实施例中，所述灭菌的条件和方法可为本领域常规，一般可为高温灭菌法。

当采用所述高温灭菌法进行所述灭菌时，所述灭菌的温度可为本领域该类操作常规的温度，较佳地为95~110℃。

当采用所述高温灭菌法进行所述灭菌时，所述灭菌的时间可为本领域该类操作常规的时间，较佳地为15~40min，更佳地为30~40min。

当采用所述高温灭菌法进行所述灭菌时，所述灭菌的压力可为本领域该类操作常规的压力，较佳地为0.1~0.4Mpa，更佳地为0.1~0.2MPa。

一些实施例中，所述灭菌的操作后，还可进一步包括冷却和/或与防腐剂混合的操作。

其中，按照本领域常规，所述冷却可为冷却至室温。

与所述防腐剂混合的过程中，所述混合的温度可为本领域该类操作常规的温度，较佳地为60~80℃，更佳地为70~75℃。

与所述防腐剂混合的过程中，所述防腐剂可按照本领域常规包括对羟基苯乙酮和/或1,2-己二醇。

当所述防腐剂包括所述对羟基苯乙酮和所述1,2-己二醇时，所述对羟基苯乙酮占所述灭菌后制得物料的质量百分数可为0.5%~1%，所述1,2-己二醇占所述灭菌后制得物料的质量百分数可为0.5%~1%；较佳地，所述对羟基苯乙酮占所述灭菌后制得物料的质量百分数为0.5%，所述1,2-己二醇占所述灭菌后制得物料的质量百分数为0.5%。

本申请还提供一种樱花光甘草定复合发酵液，其由如上所述的樱花光甘草定复合发酵液的制备方法制得。

本申请还提供一种如上所述的樱花光甘草定复合发酵液直接作为产品、作为添加剂或作为基底在制备皮肤外用剂中的应用。

一些实施例中，所述樱花光甘草定复合发酵液可作为所述皮肤外用剂中的抗氧化活性成分、舒缓活性成分和美白活性成分中至少一种。

本申请还提供一种皮肤外用剂，其包括如上所述的樱花光甘草定复合发酵液。

一些实施例中，所述皮肤外用剂中还可进一步包括本领域常规使用的活性成分，一般可包括保湿活性成分、美白活性成分、抗炎活性成分、抗敏活性成分和抗氧化活性成分中的至少一种。

一些实施例中，所述皮肤外用剂可按照本领域常规包括但不限于面膜、精华或爽肤水。

一些实施例中，所述樱花光甘草定复合发酵液占所述皮肤外用剂的质量百分比可为1%~100%。

一些实施例中，所述室温一般指24~26℃。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本申请各较佳实例。

本申请所用试剂和原料均市售可得。

本申请的积极进步效果在于：本申请制得的樱花光甘草定复合发酵液高效利用樱花中活性成分，在无需添加任何有机溶剂对光甘草定进行助溶的情况下，可保证光甘草定在体系中具有良好的分散性，进而促使终产品中光甘草定发挥理想的美白功效。本申请制得的樱花光甘草定复合发酵液同时兼具理想的抗氧化、舒缓肌肤和美白等功效，制备工艺简单，使用安全性高。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本申请，但并不因此将本申请限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例和对比例中高加索酸奶乳杆菌菌液的制备方法包括如下步骤：

高加索酸奶乳杆菌为购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC20260；

（1）高加索酸奶乳杆菌的活化：配置MRS液体培养基，121℃，30min高压灭菌，灭菌后室温冷却；操作间紫外灭菌后，从-80℃冰箱中取出待活化的高加索酸奶乳杆菌（CICC20260），室温融化后接种于MRS液体培养基中，放入摇床，在37℃条件下静置培养，进行菌种活化；

（2）高加索酸奶乳杆菌的纯化：将活化的高加索酸奶乳杆菌按梯度稀释，进行涂布铺板，以获得单一菌落；

（3）高加索酸奶乳杆菌的扩大培养：将纯化后的单一高加索酸奶乳杆菌接种到MRS液体培养基中，37℃，180rpm的摇床中培养，测定600nm处的吸光度，当吸光度为1.2时，即菌种已经到达对数生长期，此时菌种生长状态适合发酵，为合适的发酵浓度，可进行接种培养。

下述实施例中，嗜酸乳杆菌菌液的制备方法同高加索酸奶乳杆菌菌液的制备方法，区别在于接种的菌种为购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 6074的嗜酸乳杆菌。

下述实施例中，瑞士乳杆菌菌液的制备方法同高加索酸奶乳杆菌菌液的制备方法，区别仅在于接种的菌种为购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC22171的瑞士乳杆菌。

下述对比例2中，酵母菌菌液的制备方法同高加索酸奶乳杆菌菌液的制备方法，区别仅在于接种的菌种为购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 1747的酿酒酵母菌，发酵条件为有氧发酵。

实施例1

樱花依次放入烘干机和粉碎机中进行烘干，粉碎，过50目筛，取15g干燥并粉碎后的樱花、300g水和0.15g光甘草定混合，并于温度为121℃，压力为0.15MPa的条件下灭菌30min，降至室温，制得发酵底物；

将上述制得的高加索酸奶乳杆菌菌液（CICC 20260）接种到发酵底物中，单位质量的发酵底物中接种的高加索酸奶乳杆菌（CICC 20260）的数量为10⁶CFU/g，于37℃静置发酵培养24h，发酵后在转速为4800 rpm条件下离心30min，离心后收集上清液，上清液过0.22μm滤膜进行精滤，再于温度为95℃，压力为0.1MPa条件下灭菌30min，灭菌后冷却至室温，制得樱花光甘草定复合发酵液。

实施例2

与实施例1相比，区别仅在于发酵菌种不同，将高加索酸奶乳杆菌（CICC 20260）替换为等量的嗜酸乳杆菌（CICC 6074），于35℃静置发酵培养，其他条件参数同实施例1，制得樱花光甘草定复合发酵液。

实施例3

与实施例1相比，区别仅在于发酵菌种不同，将高加索酸奶乳杆菌替换为等量的瑞士乳杆菌（CICC 22171），于37℃静置发酵培养，其他条件参数同实施例1，制得樱花光甘草定复合发酵液。

实施例4

与实施例1相比，区别仅在于樱花和光甘草定的质量比为300：1，其他条件参数同实施例1，制得樱花光甘草定复合发酵液。

发酵底物制备工艺：樱花依次放入烘干机和粉碎机中进行烘干，粉碎，过50目筛，取15g干燥并粉碎后的樱花、300g水和0.05g光甘草定混合，并于温度为121℃，压力为0.15MPa的条件下灭菌30min，降至室温，制得发酵底物。

实施例5

与实施例1相比，区别仅在于樱花和光甘草定的质量比为250：1，其他条件参数同实施例1，制得樱花光甘草定复合发酵液。

发酵底物制备工艺：樱花依次放入烘干机和粉碎机中进行烘干，粉碎，过50目筛，取15g干燥并粉碎后的樱花与300g水和0.06g光甘草定混合，并于温度为121℃，压力为0.15MPa的条件下灭菌30min，降至室温，制得发酵底物。

对比例1

与实施例1相比，区别仅在于发酵底物不同，采用樱花水提液和光甘草定作为发酵底物，其他条件参数同实施例1，制得樱花水提液/光甘草定复合发酵液；

发酵底物的制备方法包括如下步骤：樱花依次放入烘干机和粉碎机中进行烘干，粉碎，过50目筛，取15g过筛后的樱花与300g水混合，在温度为75℃条件下水提取2h，提取后离心，收集上清液，制得樱花水提液；

将上述制得的樱花水提液与0.15g光甘草定混合，并于温度为121℃，压力为0.4MPa的条件下灭菌30min，降至室温，制得发酵底物。

对比例2

与实施例1相比区别仅在于发酵菌种不同，具体为将高加索酸奶乳杆菌（CICC20260）替换为等量的酿酒酵母菌（保藏编号为CICC1747），置于180 rpm的摇床中有氧发酵，发酵温度24℃，其他条件参数同实施例1，制得樱花光甘草定复合发酵液。

对比例3

与实施例1相比，区别仅在于发酵底物中不添加光甘草定，其他条件参数同实施例1，制得樱花发酵液。

对比例4

与实施例1相比，区别仅在于樱花与光甘草定的质量比为1000：1，其他条件参数同实施例1，制得樱花光甘草定复合发酵液。

发酵底物制备工艺：樱花依次放入烘干机和粉碎机中进行烘干，粉碎，过50目筛，取15g干燥并粉碎后的樱花、300g水和0.015g光甘草定混合，并于温度为121℃，压力为0.15MPa的条件下灭菌30min，降至室温，制得发酵底物。

效果实施例1 DPPH自由基清除率

DPPH是一种早期合成的有机自由基，常用来评估抗氧化物的供氢能力，它在有机溶剂中非常稳定，呈紫色，而且在517nm处有一个特征吸收峰，当遇到自由基清除剂时，DPPH的孤对电子被配对而使其退色，也就是在最大吸收波长处的吸光值变小。因此，可通过测定吸光值的变化来评价样品对DPPH自由基的清除效果。

待测液制备：使用去离子水将上述实施例或对比例制得的产品分别配置成体积百分数为5%的待测液。

DPPH自由基清除实验的具体实验步骤为：

（1）取等体积（1mL）的待测液与2×10^-4mol/L的DPPH溶液混匀（A₁管）；

（2）取等体积（1mL）的无水乙醇与2×10^-4mol/L的DPPH溶液混匀（A₂管）；

（3）取等体积（1mL）的无水乙醇与待测液混匀（A₃管）；

（4）避光反应30min后，在517nm下测A₁管、A₂管、A₃管吸光度值；清除率计算公式为：DPPH自由基清除率=[(A₂+A₃)-A₁]/A₂×100%。

DPPH自由基清除率结果见表1。

表1

表1中，***表示与实施例4相比，具有极其显著的统计学差异，P<0.001。

DPPH自由基清除率在一定程度上可以体现样品的体外抗氧化能力，表1结果可知，本申请实施例1~5制得产品的DPPH自由基清除率较对比例1~4制得产品相比极显著提高，说明实施例1~5制得产品的体外抗氧化能力更强。

效果实施例2 刺激性实验

1、配置pH为7.2的磷酸盐缓冲液（PBS），配制后一周内用完。

2、阳性对照（SDS溶液）：将十二烷基硫酸钠(SDS)用PBS缓冲液溶解，配置成浓度为0.1g/mL的SDS溶液。

3、待测液配制：用PBS缓冲液稀释上述实施例或对比例制得的产品，分别配置成体积百分数为20%的待测液。

4、RBC悬液的制备

制备红细胞悬液（RBC）

用一次性吸管将离心管中的血细胞沉淀转移至新的EP管中，取1mL的RBC沉淀于10mL的EP管中，加入9mL的PBS缓冲液进行10倍稀释，然后轻轻摇晃混合均匀，1500 rpm 离心5min，倒掉上清液，反复清洗三次直到管内PBS无色为止，再添加10 mL PBS缓冲液后即得到红细胞悬液。

5、实验组设置

全溶血对照组：0.75mL水+0.25mL的红细胞悬液；

阴性对照组：0.75mL的PBS缓冲液+0.25mL的红细胞悬液；

阳性对照组：0.75mL浓度为0.1g/mL的SDS溶液+0.25mL的红细胞悬液；

样品组：0.75mL待测液+0.25mL的红细胞悬液；

根据比例加样，总体积为1mL，将EP管置于150rpm，37℃摇床中培育1h，然后将各EP管放在离心机中，10000×g速度离心1min以停止培育，离心后取上层清液，在560nm处测定吸光值，记录并保存数据。

根据下述公式计算样品组和阳性对照组的溶血率，结果见表2。

样品组红细胞溶血率=（A_样品组-A_阴性对照）/（A_全溶血-A_阴性对照）Í100%；

阳性对照组红细胞溶血率=（A_{阳性对照组-}A_阴性对照）/（A_全溶血-A_阴性对照）Í100%。

表2

表2中，***表示与实施例3相比，具有极其显著的统计学差异，P<0.001。

红细胞溶血率可从一定程度检测产品对肌肤的刺激性。由表2结果可知，本申请实施例1~3制得产品的红细胞溶血率与对比例1~2制得产品相比，极显著降低，说明实施例1~3制得产品的使用安全性更高，产品更温和。

效果实施例3 酪氨酸酶抑制实验

配置pH值为6.8的PBS缓冲液。

酪氨酸酶溶液的配制：将50mg酪氨酸酶溶解于250mL（pH=6.5）PBS缓冲液中，摇匀，此操作在冰上进行。

0.1mol/L盐酸溶液的配制：取36%盐酸溶液0.865mL，用去离子水定容到100mL，混匀。

0.5mg/mL L-酪氨酸溶液的配制：称取50.7mg L-酪氨酸，先溶于35mL的0.1mol/L盐酸溶液，再加入65mL的PBS（pH=6.8）缓冲液，混匀。

待测样品配制：取上述实施例或对比例制得的产品100µL，用PBS缓冲液（pH=6.8）分别稀释成体积百分数为5%浓度的稀释液，混匀，测定其抑制酪氨酸酶活性。

阳性对照组（1mg/mL的α-熊果苷溶液）配制：准确称取0.0285g的α-熊果苷，溶于28.5mL的PBS缓冲液（pH=6.8)，混匀；

阴性对照组：水；

空白组：PBS缓冲液（pH=6.8)；

按照表3配置各组反应液。

表3

将配置完成的反应液迅速转移至比色皿中，于475nm波长处测定各反应液的吸光度，并记录。代入酪氨酸酶活性抑制率计算公式中，即可得出上述实施例或对比例制得产品经稀释后制得待测样品的酪氨酸酶活性抑制率，结果见表4。

待测样品酪氨酸酶活性抑制率=[(B-D)-(A-C)]/(B-D)Í100%；

阳性对照组酪氨酸酶活性抑制率=[(B-D)-(E-C)]/(B-D)Í100%。

表4

表4中，***表示与实施例2相比，具有极其显著的统计学差异，P<0.001。

表4结果表明，本申请实施例1~5制得产品均具有理想的抑制酪氨酸酶活性的功效，且抑制能力极其显著优于对比例1~4。可见，与对比例相比，本申请实施例1~5制得产品的美白功效更理想。

效果实施例4 细胞存活率实验

将装有生长状态良好的B16细胞的培养瓶从培养箱中取出，使用pH=7.2的PBS缓冲液清洗两遍B16细胞，每一瓶细胞加入0.5mL的胰酶，放入细胞培养箱2min，等待细胞完全消化脱壁悬浮，之后加入1mL有血清的DMEM培养基终止胰酶消化，将细胞悬浮液转移至15mL离心管中，1500rpm离心5分钟，弃上清液后将细胞沉淀与有血清的DMEM培养基吹打均匀，然后转移至T25培养瓶中，在5% CO₂，37℃的培养箱中进行传代培养两到三天，待细胞融合率为80%以上可进行之后的实验。

将8×10³个细胞/100 μL接种到96孔板中培养24h，吸弃原培养基；实验组加入100μL待测样品（用无血清DMEM培养基稀释上述实施例或对比例制得的样品，配置成浓度为2.5%的待测样品）处理24h，每孔加入10μL的 CCK-8试剂，于37℃继续孵育1h，测定吸收波长为450nm处的吸光度值OA_待测样品。对照组的每孔加入10μL有血清的DMEM培养基处理24h，每孔加入10μL CCK-8试剂，于37℃继续孵育1h，测定吸收波长为450nm处的吸光度值OA_对照。

空白组的每孔中不加细胞，只添加100μL有血清的DMEM培养基，测定吸收波长为450nm处的吸光度值OA_空白。

细胞存活率=（OA_待测样品-OA_空白）/（OA_对照-OA_空白）Í100%，按照该公式计算上述实施例或对比例制得待测样品处理细胞后的细胞存活率，结果见表5。

表5

表5结果表明，采用本申请实施例1~5制得产品处理细胞后，细胞存活率几乎不受影响，说明本申请实施例1~5制得产品具有理想的使用安全性。

效果实施例5 黑色素含量测定

取对数生长期状态良好的B16细胞计数并接种于6孔板中，置于37℃，5%CO₂环境培养箱中培养过夜，弃掉旧培养基。

实验组：加入2mL浓度为50μg/mL的组胺无血清培养基溶液，2mL实施例待测液或对比例待测液（将上述实施例或对比例制得产品分别用无血清的DMEM稀释成体积百分比为1%的待测液，并过0.22μm无菌滤膜）。

空白模型组：只加2mL无血清培养基。

组胺刺激组：加2mL浓度为50μg/mL的组胺无血清培养基。

上述各组加样后均培养48h，培养后吸弃旧培养基，使用PBS洗涤后加入500μL胰酶消化4min，加入1mL含血清培养液终止消化，1500rmp离心3min，吸弃上清液，加入0.5mL含10%DMSO的1M氢氧化钠溶液，超声分散3min，取20μL上述溶液，使用BCA试剂盒测蛋白含量；剩余溶液80℃水浴30min，振荡混匀，10000rmp离心2min，吸取上清液200μL至96孔板，于405nm读取吸光度值。

设置空白孔，即指培养板中不进行任何操作，只添加等量10%DMSO的1M氢氧化钠溶液。

组胺刺激组黑色素含量=(组胺刺激组OD值-空白孔OD值)/（空白模型组OD值-空白孔OD值）×100%；

实验组黑色素含量=(实验组OD值-空白孔OD值)/（空白模型组OD值-空白孔OD值）×100%，每一组成分重复5个样本，计算结果取平均值，结果见表6，黑色素含量需要BCA含量校正。

表6

表6中，***表示与实施例4相比，具有极其显著的统计学差异，P<0.001。

表6结果表明，采用本申请实施例1~5制得产品处理细胞后，黑色素含量同组胺刺激组相比显著下降，并且黑色素含量极其显著低于对比例1~4，说明本申请实施例1~5制得产品具有更理想的黑色素清除能力。

最后，还需要说明的是，在本申请中术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管上面已经通过本公开的具体实施例的描述对本公开进行了披露，但是，应该理解，本领域技术人员可在所附方案的精神和范围内设计对本公开的各种修改、改进或者等同物。这些修改、改进或者等同物也应当被认为包括在本公开所要求保护的范围内。

Claims

1.一种樱花光甘草定复合发酵液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：干燥的樱花、光甘草定和水的混合物作为发酵底物，将乳杆菌接种到所述发酵底物中，经发酵培养，灭菌，制得所述樱花光甘草定复合发酵液；

2.如权利要求1所述的樱花光甘草定复合发酵液的制备方法，其特征在于，所述制备方法满足下述条件中至少一种：

所述干燥的樱花与所述光甘草定的质量比为（100~250）：1；

所述发酵底物中，所述干燥的樱花占所述水的质量百分比为5%~10%；

所述干燥的樱花的目数为10~100目；

所述发酵底物在使用前还包括灭菌的操作。

3.如权利要求1或2所述的樱花光甘草定复合发酵液的制备方法，其特征在于，所述制备方法满足下述条件中至少一种：

所述乳杆菌包括高加索酸奶乳杆菌（Lactobacillus kefiri）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）和瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）中至少一种；

所述发酵培养的时间为8~36；

所述发酵培养的温度为35~37℃；

所述发酵培养的操作后还进一步包括离心，收集上清液的操作；所述离心的转速为2000~8000rpm；所述离心的时间为10~45min；所述离心的操作后还进一步包括采用滤膜精滤的操作，所述滤膜的孔径为0.2~0.5μm；

所述灭菌的方法为高温灭菌法；

所述灭菌的操作后，还进一步包括冷却和/或与防腐剂混合的操作。

4.如权利要求3所述的樱花光甘草定复合发酵液的制备方法，其特征在于，所述制备方法满足下述条件中至少一种：

所述高加索酸奶乳杆菌包括保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 20260 的高加索酸奶乳杆菌；

所述嗜酸乳杆菌包括保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC6074的嗜酸乳杆菌；

所述瑞士乳杆菌包括保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC22171的瑞士乳杆菌；

与所述防腐剂混合的过程中，所述混合的温度为60~80℃；

与所述防腐剂混合的过程中，所述防腐剂包括对羟基苯乙酮和/或1,2-己二醇。

5.如权利要求4所述的樱花光甘草定复合发酵液的制备方法，其特征在于，当所述防腐剂包括所述对羟基苯乙酮和所述1,2-己二醇时，所述对羟基苯乙酮占所述灭菌后制得物料的质量百分数为0.5%~1%，所述1,2-己二醇占所述灭菌后制得物料的质量百分数为0.5%~1%。

6.一种樱花光甘草定复合发酵液，其特征在于，由如权利要求1~5中任意一项所述的樱花光甘草定复合发酵液的制备方法制得。

7.一种如权利要求6所述的樱花光甘草定复合发酵液直接作为产品、作为添加剂或作为基底在制备皮肤外用剂中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述樱花光甘草定复合发酵液作为所述皮肤外用剂中的抗氧化活性成分、舒缓活性成分和美白活性成分中至少一种。

9.一种皮肤外用剂，其特征在于，包括如权利要求6所述的樱花光甘草定复合发酵液。

10.如权利要求9所述的皮肤外用剂，其特征在于，所述皮肤外用剂满足下述条件中至少一种：

所述皮肤外用剂中还进一步包括保湿活性成分、美白活性成分、抗炎活性成分、抗敏活性成分和抗氧化活性成分中的至少一种；

所述皮肤外用剂包括面膜、精华或爽肤水；

所述樱花光甘草定复合发酵液占所述皮肤外用剂的质量百分比为1%~100%。