CN115669673A - 三七皂苷Fe和/或三七皂苷Fd在制备植物源杀菌剂、防治农业真菌性病害中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种三七皂苷Fe和/或三七皂苷Fd在制备植物源杀菌剂、防治农业真菌性病害中的应用，涉及生物农药技术领域。具体是提供一种三七皂苷Fe和/或三七皂苷Fd在制备植物源杀菌剂中的应用。本发明基于自然界中存在的三七植物化学防御机制，“以彼之道，还施彼身”，通过采用三七皂苷Fe和/或三七皂苷Fd作为杀菌剂的主要活性成分，三七皂苷Fe和三七皂苷Fd均能够抵抗病原菌的进一步入侵，该植物源杀菌剂不仅廉价、高效，抗菌谱广，不会对环境造成污染、不会对人体健康产生危害，而且取材成本极低，制备方法简单，并能促进三七叶资源再利用，极具开发前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物农药技术领域，具体而言，涉及一种三七皂苷Fe和/或三七皂苷Fd在制备植物源杀菌剂、防治农业真菌性病害中的应用。
背景技术
三七(Panax notoginseng(Burk)F.H.Chen)是五加科人参属多年生草本植物，是我国特有的名贵中药，因其卓越的止血和活血功效而著称于世。植物三七性喜温暖阴湿，对生长湿度、温度、水分、海拔和土壤都有一定的要求，其特殊的生长环境和较长的生长周期，容易诱发多种根部和叶部病害。已发现的三七病害种类高达20余种，以根腐病、炭疽病、圆斑病、灰霉病和黑斑病等的发生较为严重而普遍。随着三七种植年限的增加，病害的种类、发病面积及严重程度逐年增加。而且土传病虫害的增加也是导致三七连作障碍的主要原因之一(植物生态学报，2015，34:885-893)。根部病害主要有尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)引起的根腐病，是造成三七连作障碍的主要原因之一。叶部病害主要包括槭菌刺孢(Mycocentrospora acerina)引起的圆斑病和人参链格孢(Alternaria panax)引起的黑斑病，发病时传播速度快，普遍发生于各年龄阶段的三七植株中，发病率可高达80％以上，轻则叶片损伤，重则全株死亡，造成严重的经济损失。人参(Panax ginseng)和西洋参(Panax quiquefolium)与三七同属于人参属的重要药用植物，黑斑病也是其主要的叶部病害，其病原菌均为人参链格孢。因此，这些病害的发生大幅度地影响三七、人参和西洋参的产量和质量，严重掣肘人参属中药产业的可持续发展。
三七的药用部位为根部，相较于三七的根部而言，目前对三七叶的药理作用研究尚处于前期阶段，导致三七叶的应用价值被低估。三七叶由于其低廉的价格和高昂的运输成本，目前利用率仅有5％，大部分被作为废料丢弃，造成巨大的资源浪费。
目前针对三七病害的防控常采用轮作和化学防治的手段(世界科学技术-中医药现代化，2017，1635-1640)，前者周期长、不适合大面积施行，后者长期高频率使用化学农药(杀细菌剂与杀真菌剂)来防治病害，不仅会造成环境污染、药材农药残留等问题，影响三七的出口，危害人体健康，而且也会导致病原菌抗药性的产生(中药材，1999，21：167-169)。因此，开发高效、安全、无污染的植物绿色农药已成为趋势。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种三七皂苷Fe和/或三七皂苷Fd在制备植物源杀菌剂、防治农业真菌性病害中的应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供一种三七皂苷Fe和/或三七皂苷Fd在制备植物源杀菌剂中的应用。
在可选的实施方式中，杀菌剂中的活性成分包括含有三七皂苷Fe和三七皂苷Fd的三七叶总皂苷。
在可选的实施方式中，杀菌剂包括液体制剂或固体制剂中的任一种农药上允许的剂型。
优选地，制备杀菌剂包括将三七皂苷Fe和/或三七皂苷Fd溶解在有机溶剂中，再制备成农药上允许的任一剂型。
第二方面，本发明提供一种上述任一实施方式中的杀菌剂在防治农业真菌性病害中的应用。
在可选的实施方式中，农业真菌性病害包括由植物病原菌引起的农业真菌性病害。
在可选的实施方式中，农业真菌性病害包括圆斑病、黑斑病和根腐病中的至少一种。
在可选的实施方式中，植物病原菌包括槭菌刺孢、人参链格孢和尖孢镰刀菌中的至少一种。
在可选的实施方式中，包括将杀菌剂喷洒在植株上。
优选地，将杀菌剂喷洒在植株上包括将杀菌剂喷洒在植株的叶片上，或将杀菌剂进行灌根处理中的至少一种。
在可选的实施方式中，植株包括三七、人参和西洋参中的至少一种。
第三方面，本发明提供一种杀菌剂，活性成分包括三七皂苷Fe和/或三七皂苷Fd。
本发明具有以下有益效果：
本发明基于自然界中存在的植物化学防御机制，“以彼之道，还施彼身”，通过采用三七皂苷Fe和/或三七皂苷Fd作为杀菌剂的主要活性成分，三七皂苷Fe和三七皂苷Fd均能够抵抗病原菌的进一步入侵，该植物源杀菌剂不仅廉价、高效，抗菌谱广，不会对环境造成污染、不会对人体健康产生危害，而且取材成本极低，制备方法简单，并能促进三七叶资源再利用，极具开发前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为三七叶中的皂苷结构和成分表征结果图；
图1A为三七叶中皂苷的表征图谱；
图1B为三七叶受到病原菌入侵后皂苷的表征图谱；
图1C为富含三七皂苷Fe和三七皂苷Fd的三七叶总皂苷的表征图谱；
图1D为三七叶中的皂苷结构式；
图2为三七叶总皂苷作为杀菌剂对槭菌刺孢的生长速率影响图；
图3为三七叶总皂苷作为杀菌剂对人参链格孢的生长速率影响图；
图4为三七叶总皂苷作为杀菌剂对尖孢镰刀菌的生长速率影响图；
图5为三七皂苷Fd作为杀菌剂对槭菌刺孢的生长速率影响图；
图6为三七皂苷Fe作为杀菌剂对槭菌刺孢的生长速率影响图；
图7为三七叶总皂苷作为杀菌剂对三七圆斑病的发病影响图；
图8为三七皂苷Fd作为杀菌剂对三七圆斑病的发病影响图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
三七是五加科人参属多年生草本植物，是我国特有的名贵中药，因其卓越的止血和活血功效而著称于世。随着三七的广泛种植，植株三七的病害种类、发病面积及严重程度逐年增加。同时由于三七的药用部位为根部，通常情况下，种植得到的三七植株在获取药用部位后，其余植株直接丢弃，造成大量浪费。
通过长期研究发现，植物在遭受环境胁迫，如干旱、低氧、热、高盐渗透等情况，或遭受生物如昆虫、真菌、细菌等胁迫时，无法通过主动移动规避，因而植物在进化过程中产生许多复杂和巧妙的物理、化学和发育上的防御系统。植物体为有效地保护自身免受昆虫和病原体等的侵害，在长期适应进化过程中形成了复杂的化学防御体系。研究表明，植物在生长过程中，会产生大量次生代谢产物以抵抗病原菌的入侵，且不易产生抗性，安全且高效。
因此，发明人通过“以彼之道，还施彼身”的新型治疗策略，提出以下技术方案以解决目前三七种植病害严重，使用化学杀菌剂容易造成环境污染且对人体健康产生危害，及提高三七非药用部位的附加值处理中的至少一种问题。
第一方面，本发明提供一种三七皂苷Fe和/或三七皂苷Fd在制备植物源杀菌剂中的应用。
如图1所示，图1A和图1D显示了三七叶片中富含丰富的人参皂苷资源，主要包含人参皂苷Rb3(G-Rb3)、人参皂苷Rc(G-Rc)、人参皂苷Rb2(G-Rb2)和人参皂苷Rb1(G-Rb1)。
如图1B和图1D所示，发明人研究表明，三七叶在受到病原菌入侵时，植物体内的糖苷水解酶会使得三七叶的主要成分G-Rb1、G-Rc、G-Rb2和G-Rb3水解脱去C3号位上的一分子葡萄糖基，转化成相应的稀有皂苷，如绞股蓝皂苷XVII(Gyp-XVII)、三七皂苷Fe(NG-Fe)、人参皂苷Rd2(G-Rd2)和三七皂苷Fd(NG-Fd)，来抵御病原菌的进一步入侵。
因此，基于自然界中存在的植物化学防御机制，“以彼之道，还施彼身”，通过采用三七皂苷Fe和/或三七皂苷Fd作为杀菌剂的主要活性成分，三七皂苷Fe和三七皂苷Fd均能够抵抗病原菌的进一步入侵，该植物源杀菌剂不仅廉价、高效，抗菌谱广，不会对环境造成污染、不会对人体健康产生危害，而且取材成本极低，制备方法简单，并能促进三七叶资源再利用，提高三七非药用部位的附加值，极具开发前景。
如图1C和图1D所示，在可选的实施方式中，杀菌剂中的活性成分包括含有三七皂苷Fe和/或三七皂苷Fd的三七叶总皂苷。
需要说明的是，本发明中提及的三七皂苷Fe、三七皂苷Fd单体、和富含三七皂苷Fe和三七皂苷Fd的三七叶总皂苷可以通过中国专利CN106420871制得，也可以为市售的三七皂苷Fe、三七皂苷Fd的标准品。
其中，当本发明提及Fe单体时，即为三七皂苷Fe；当本发明提及Fd单体时，即为三七皂苷Fd；当本发明提及三七叶总皂苷时，即为富含三七皂苷Fe和三七皂苷Fd的三七叶总皂苷，该三七叶总皂苷中Fe单体和Fd单体的总含量≥30％。
在可选的实施方式中，杀菌剂包括液体制剂或固体制剂中的任一种农药上允许的剂型。
可以理解的是，杀菌剂中的活性成分为Fe单体、Fd单体和三七叶总皂苷中的任一种，杀菌剂中除了上述活性成分外，还可以包括农药助剂、赋形剂、表面活性剂等农药中允许的成分。
优选地，制备杀菌剂包括将三七皂苷Fe和/或三七皂苷Fd溶解在有机溶剂中，再制备成农药上允许的任一剂型。
优选地，有机溶剂包括二甲亚砜、甲醇的任一种。
优选地，当杀菌剂中的活性成分为三七叶总皂苷时，杀菌剂中三七叶总皂苷的浓度为4～6mg/mL；其中，三七叶总皂苷内三七皂苷Fd含量为50～63％，三七皂苷Fe的含量为15～24％。
优选地，当杀菌剂中的活性成分为Fe单体或Fd单体中的任一种时，杀菌剂中每个单体的浓度为2～4mM。
优选地，二甲亚砜的浓度为0.1～0.25％。
在可选的实施方式中，杀菌剂中还包括表面活性剂。
优选地，表面活性剂包括吐温80、烷基苯磺酸盐类、聚氧乙烯辛基苯酚醚-10、烷基酚聚氧乙烯醚类、苯乙基酚聚氧乙烯醚聚氧丙烯醚类、多苯乙烯苯酚聚氧乙烯醚、苯乙基酚聚氧乙烯醚类、农用阴离子-磷酸酯中的任一种或几种的混合物。
优选地，表面活性剂的浓度为0.01～0.2％，优选为0.1％。
第二方面，本发明提供一种上述任一实施方式中的杀菌剂在防治农业真菌性病害中的应用。
在可选的实施方式中，农业真菌性病害包括由植物病原菌引起的农业真菌性病害。
在可选的实施方式中，农业真菌性病害包括但不限于圆斑病、黑斑病和根腐病等真菌性病害。
在可选的实施方式中，植物病原菌包括但不限于槭菌刺孢、人参链格孢和尖孢镰刀菌等病原菌。
其中，槭菌刺孢(Mycocentrospora acerina)为圆斑病病原菌，人参链格孢(Alternaria panax)为黑斑病病原菌，尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)为根腐病病原菌。
在可选的实施方式中，包括将杀菌剂喷洒在植株上。
优选地，将杀菌剂喷洒在植株上包括将杀菌剂喷洒在植株的叶片上，或将杀菌剂进行灌根处理中的至少一种。
当杀菌剂的应用方式为将杀菌剂喷洒在植株的叶片上时，以叶片上液滴不滴落为宜。
在可选的实施方式中，植株包括三七、人参和西洋参中的至少一种，或由上述植物病原菌导致病害的其他农作物。
第三方面，本发明提供一种杀菌剂，活性成分包括三七皂苷Fe和/或三七皂苷Fd。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了三七叶总皂苷对槭菌刺孢、人参链格孢和尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制效果。
从三七圆斑病病叶上分离得到供试菌株槭菌刺孢(Mycocentrospora acerina，菌株编号SDM5，ITS序列登录号ACCESSION number:OP120946)；从三七黑斑病病叶上分离得到供试菌株人参链格孢(Alternaria panax,菌株编号:LCHB01，ITS序列登录号:ACCESSIONnumber:OP120959)；从三七根腐病病株上分离得到供试菌株尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum,菌株编号:LCGF3，ITS序列登录号ACCESSION number:ON081646)。以上3种植物病原菌由云南农业大学植物保护学院朱有勇院士植物病理实验室自行分离、鉴定并保存于云南农业大学。
供试化合物为富含Fe单体、Fd单体的三七叶总皂苷，将其溶解于二甲亚砜，制成浓度为200mg/mL的母液。用0.22μm的微孔滤膜进行过滤除菌，并用除菌后的二甲亚砜水溶液(体积浓度为0.25％)进行浓度稀释，保存备用。
PDA培养基：200g去皮马铃薯切成小块，煮沸15min后，过滤取滤汁，加入20g琼脂，加热至熔化，再加入20g葡萄糖，用水定容至1L，121℃灭菌20min。
设置空白组(Con)和三七叶总皂苷实验组。空白组加入体积浓度为0.25％的二甲亚砜。实验组中，供试菌株为人参链格孢和尖孢镰刀菌时，三七叶总皂苷实验组设置5个不同的浓度梯度，分别为0.13mg/mL、0.25mg/mL、0.50mg/mL、1.0mg/mL和2.0mg/mL。供试菌株为槭菌刺孢时，三七叶总皂苷实验组设置6个不同的浓度梯度，分别为0.13mg/mL、0.25mg/mL、0.50mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL和4.0mg/mL，每个浓度梯度重复实验3～5次。
将三七叶总皂苷按照上述浓度比例加入到灭菌后的PDA培养基中制成带药平板，对照组加入相同体积的经过滤除菌的二甲亚砜。将生长7d的槭菌刺孢、人参链格孢和尖孢镰刀菌用打孔器在菌落边缘打取直径为5mm的菌饼，并依次接种在PDA培养基上，接种好的培养皿用封口膜完全密封并倒置培养。将上述培养基置于智能人工培养箱中培养4～5d，含有槭菌刺孢的培养基培养温度为20℃，含有人参链格孢和尖孢镰刀菌的培养基培养温度均为25℃。培养过程中每24h观察一次，当对照组平板的菌种菌丝直径长至培养皿直径的2/3左右时进行测量。测量时采用十字交叉测量法，分别测量记录各组菌落生长直径。按照如下公式计算抑菌率，统计结果见图2-4。
菌丝生长抑制率＝(实验组菌落直径-对照组菌落直径)/(对照组菌落直径-菌饼直径)×100％
由图2可知，三七叶总皂苷作为杀菌剂的主要活性成分，随着三七叶总皂苷的浓度增加，槭菌刺孢的生长速率降低，当三七叶总皂苷在杀菌剂中的含量为4.0mg/mL时，槭菌刺孢的生长抑制率为90％左右。
由图3可知，三七叶总皂苷作为杀菌剂的主要活性成分，随着三七叶总皂苷的浓度增加，人参链格孢的生长速率降低，当三七叶总皂苷在杀菌剂中的含量为2.0mg/mL时，人参链格孢的生长抑制率为70～80％。
由图4可知，三七叶总皂苷作为杀菌剂的主要活性成分，随着三七叶总皂苷的浓度增加，尖孢镰刀菌的生长速率降低，当三七叶总皂苷在杀菌剂中的含量为2.0mg/mL时，人参链格孢的生长抑制率为50％左右。
因此可以发现，将含有Fe单体和Fd单体的三七叶总皂苷作为植物源杀菌剂使用时，对槭菌刺孢、人参链格孢和尖孢镰刀菌等植物病原菌的杀菌效果较好，同时三七叶总皂苷来源于植物三七的叶片，原料安全，抑菌效果好。
实施例2
本实施例提供了三七皂苷Fd对槭菌刺孢菌丝生长的抑制效果。
供试化合物为Fd单体，供试菌株为从三七斑病病叶上分离得到的槭菌刺孢(M.acerina)，实验方法与实施例1相同，其中供试化合物为Fd单体的实验浓度为0.13mM、0.25mM、0.50mM和1.00mM，记录各组菌落生长直径，并计算抑菌率，得到如图5所示结果。
由图5可知，三七皂苷Fd作为杀菌剂的主要活性成分，随着Fd单体的浓度增加，槭菌刺孢的生长速率降低，当三七皂苷Fd在杀菌剂中的含量为1.0mM时，槭菌刺孢的生长抑制率为70％左右，植物病原菌的抑制效果好。
实施例3
本实施例提供了三七皂苷Fe对槭菌刺孢菌丝生长的抑制效果。
供试化合物为三七皂苷Fe单体，供试菌株为从三七圆斑病病叶上分离得到的槭菌刺孢(M.acerina)，实验方法与实施例1相同，其中供试化合物为Fe单体的实验浓度为0.13mM、0.25mM、0.50mM和1.00mM，记录各组菌落生长直径，并计算抑菌率，得到如图6所示结果。
由图6可知，三七皂苷Fe作为杀菌剂的主要活性成分，随着Fe单体的浓度增加，槭菌刺孢的生长速率降低，当三七皂苷Fe在杀菌剂中的含量为1.0mg/mL时，槭菌刺孢的生长抑制率为50％左右，植物病原菌的抑制效果好。
实施例4
本实施例提供了三七叶总皂苷作为杀菌剂对三七圆斑病的发病程度的影响。
供试化合物为含有Fe单体和Fd单体的三七叶总皂苷，供试菌株为槭菌刺孢(M.acerina)。
供试化合物分为空白组(Con)、对照组(PC)和实验组，空白组为加入体积浓度为0.25％的二甲亚砜水溶液，对照组为多菌灵(0.20mM)，实验组加入不同浓度的三七叶总皂苷，共设置3个不同的浓度梯度，分别为2.00mM、3.00mM和4.00mM。
取一年生健康三七，每天对三七叶面进行喷施空白组(Con)、对照组(PC)和实验组的供试化合物，喷洒至叶面完全湿润，每天喷洒3次，连续喷洒3d。选取生长7d的槭菌刺孢，在菌落边缘打取直径为1mm的菌饼，接种于三七叶片上。一周后，统计各组叶片病斑面积。
数据处理：利用扫描仪(Perfection V850 Pro,Epson,Suwa,Japan)对叶片进行扫描，并利用Adobe Photoshop软件计算各叶片的病斑面积，并利用Prizm GraphPad数据处理软件进行作图，得到如图7所示结果。
由图7可知，三七叶总皂苷作为杀菌剂的主要活性成分在防治三七植株的圆斑病时，随着三七叶总皂苷的浓度增加，槭菌刺孢的生长速率降低，病斑面积减小，当三七叶总皂苷在杀菌剂中的含量为4.0mg/mL时，圆斑病的病斑面积为5mm2左右，病斑面积显著小于喷施多菌灵的对照组，本发明提供的杀菌剂对植物病原菌的抑制效果好。
实施例5
本实施例提供了三七皂苷Fd作为杀菌剂对三七圆斑病的发病程度的影响。
供试化合物为Fd单体，供试菌株为槭菌刺孢(M.acerina)。实验方法与实施例4相同，其中供试化合物为Fd单体的实验浓度为0.5mM、1.0mM和2.0mM，得到如图8所示结果。
由图8可知，三七皂苷Fd作为杀菌剂的主要活性成分在防治三七植株的圆斑病时，随着Fd单体的浓度增加，槭菌刺孢的生长速率降低，病斑面积减小，当三七皂苷Fd在杀菌剂中的含量为2.0mM时，圆斑病的病斑面积小于30mm2，本发明提供的杀菌剂对植物病原菌的抑制效果好。
综上所述，本发明提供的一种三七皂苷Fe和/或三七皂苷Fd在制备植物源杀菌剂、防治农业真菌性病害中的应用，其至少具有如下优点：
本发明基于自然界中存在的植物化学防御机制，“以彼之道，还施彼身”，通过采用三七皂苷Fe和/或三七皂苷Fd作为杀菌剂的主要活性成分，三七皂苷Fe和三七皂苷Fd均能够抵抗病原菌的进一步入侵，可有效抑制槭菌刺孢、人参链格孢、尖孢镰刀菌菌丝的生长，并可诱导三七植株产生抗性反应以减缓发病程度。该植物源杀菌剂不仅廉价、高效，抗菌谱广，不会对环境造成污染、不会对人体健康产生危害。
此外，由于杀菌剂中的活性成分来源于三七叶，促进三七叶资源的再利用，提高了三七非药用部位的附加值，取材成本极低，制备方法简单，极具开发前景。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种三七皂苷Fe和/或三七皂苷Fd在制备植物源杀菌剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述杀菌剂中的活性成分包括含有三七皂苷Fe和/或三七皂苷Fd的三七叶总皂苷。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述杀菌剂包括液体制剂或固体制剂中的任一种农药上允许的剂型；
优选地，制备所述杀菌剂包括将三七皂苷Fe和/或三七皂苷Fd溶解在有机溶剂中，再制备成农药上允许的任一剂型。
4.一种如权利要求1～3任一项所述的杀菌剂在防治农业真菌性病害中的作用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述农业真菌性病害包括由植物病原菌引起的农业真菌性病害。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述农业真菌性病害包括圆斑病、黑斑病和根腐病中的至少一种。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物病原菌包括槭菌刺孢、人参链格孢和尖孢镰刀菌中的至少一种。
8.根据权利要求5～7任一项所述的应用，其特征在于，包括将所述杀菌剂喷洒在植株上；
优选地，将所述杀菌剂喷洒在植株上包括将杀菌剂喷洒在植株的叶片上，或将杀菌剂进行灌根处理中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述植株包括三七、人参和西洋参中的至少一种。
10.一种杀菌剂，其特征在于，活性成分包括三七皂苷Fe和/或三七皂苷Fd。
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