CN115666586A - 通过激活iNKT细胞清除衰老细胞 - Google Patents

Abstract

激活的iNKT细胞起衰老细胞裂解剂的作用，从而从身体的靶组织、器官和区室去除衰老细胞。提供了通过施用iNKT细胞激活剂如α‑半乳糖神经酰胺或变体或通过iNKT细胞或前体的过继转移清除衰老细胞的病理累积的方法，从而使得能够治疗衰老相关状况如糖尿病、肺纤维化和其他状况。

Description

通过激活iNKT细胞清除衰老细胞

与相关申请的相互参照：本申请要求2020年4月23日提交的名称为“通过激活iNKT细胞清除衰老细胞”的美国临时专利申请序列号63/014,694的优先权利益，其内容特此引入作为参考。

关于联邦政府资助的研究或开发的声明：不适用。

发明背景

细胞衰老是一个过程，其中细胞周期停滞，且细胞进入功能性但非分裂状态。据信，所述细胞途径进化以在已经累积了损害DNA的损伤的细胞中进行保护以防遗传不稳定性和癌症，且因此衰老防止不受限制的细胞增殖。还有证据表明，衰老针对病毒感染起作用，从而抑制被病毒劫持的复制过程。

衰老细胞产生许多细胞因子和趋化因子。在短时间尺度内，所述反应被认为是适应性的，其中促炎信号将免疫元件募集到受折磨的区域，从而使得对潜在致癌或受感染细胞的免疫监视成为可能。在健康和年轻的个体中，据信免疫系统有效地去除衰老细胞。

然而，在患病或年老的个体中，免疫系统去除衰老细胞看来似乎是受损的。在这种情况下，衰老细胞累积，且这些细胞的促炎作用可能变成病态的。随着时间的过去，衰老细胞以愈来愈大的数目累积，且它们分泌的信号传导分子变得对周围组织有害，从而引起炎症、以异常方式重塑组织并可能促进癌症的发作而不是抑制它。衰老细胞的存在很可能使许多年龄相关的疾病和过程的进展恶化。在一些情况下，延长的未解决的应激的状态导致衰老细胞表现出所谓的衰老相关性分泌表型SASP。SASP细胞分泌多种炎症信号分子，包括细胞因子、趋化因子和其他因子。这种SASP分泌蛋白质组（secretome）可能深刻影响邻近的非衰老细胞，从而也损害它们的功能并促进它们向衰老细胞的转变。

因此，衰老细胞的累积被认为构成了许多疾病状况和与年龄相关的病理学的基础。例如，衰老细胞的累积已和诸如动脉粥样硬化斑块的病变的形成、糖尿病、神经变性和其他状况牵连。因此，已经提出使用衰老细胞裂解剂（senolytics）来预防和治疗由衰老细胞介导的状况。

衰老细胞裂解剂是通过各种机制选择性地去除衰老细胞的组合物。示例性的衰老细胞裂解剂包括BCl抑制剂，如navitoclax和维奈托克（venetoclax），它们已经针对多种形式的癌症（如某些白血病）进行了测试，具有积极的结果。然而，这些药物具有各种副作用，包括睾丸毒性和血小板减少症。因此，本领域仍然需要可以安全地促进衰老细胞去除的新种类的衰老细胞裂解剂（senolytic agents）。

同时，恒定自然杀伤T细胞（iNKTs）是在循环中发现的特化T细胞亚型，且也是生物身体的各种组织、器官或其他区室中的定居细胞。iNKT T细胞受体（TCR）通过高度受限制的体细胞重组形成，从而结果产生恒定TCR谱。iNKT细胞和各种免疫系统功能牵连，例如对微生物感染的反应和抗肿瘤免疫，并且也和免疫系统功能异常牵连，如在哮喘、变态反应和自身免疫性状况中。

正在开发用于调节iNKT细胞的数目和活性的各种治疗方法。在治疗癌症的背景中，激活的iNKT细胞迅速分泌Th1和Th2细胞因子两者，并激活NK和其他免疫细胞以刺激抗肿瘤免疫应答。因此，许多通过激活iNKT细胞起作用的肿瘤免疫治疗正在研究和开发中。

也已探索了在其他背景中iNKT激活的使用。在一项研究中，iNKT激活用于治疗小鼠模型中的肺纤维化，其中断定产生IFN-γ的NKT细胞通过调节TGF-β1的产生在肺纤维化中具有抗纤维化活性，如Kim, 2005. Natural killer T (NKT) cells attenuatebleomycin-induced pulmonary fibrosis by producing interferon-gamma. TheAmerican journal of pathology, 167(5), 1231–1241中所述的。在肝纤维化的背景中，发现自然杀伤细胞在体外和体内优先杀死衰老的激活的星状细胞，从而促进纤维化的消退，如Krizhanovsky等人, 2008. Senescence of activated stellate cells limitsliver fibrosis. Cell, 134(4), 657–667中所述的。在治疗微生物感染的背景中，已发现iNKT细胞的激活增强先天和获得性免疫过程，例如，如Kinjo等人, 2018. Functions ofCD1d-Restricted Invariant Natural Killer T Cells in Antimicrobial Immunityand Potential Applications for Infection Control, Front Immunol. 9: 1266中所述的。已经发现用α-GalCer激活iNKT细胞逆转HFD小鼠模型中的不利代谢表型，例如，如Lynch等人, 2012. Adipose Tissue Invariant NKT Cells Protect against Diet-Induced Obesity and Metabolic Disorder through Regulatory CytokineProduction. Immunity 37, 574–587；Schipper等人, 2012. Natural killer T cellsin adipose tissue prevent insulin resistance. J. Clin. Invest. 122, 3343–3354；Ji等人, 2012. Activation of natural killer T cells promotes M2macrophage polarization in adipose tissue and improves systemic glucosetolerance via interleukin-4 (IL-4)/STAT6 protein signaling axis in obesity.J. Biol. Chem. 287, 13561–13571中所述的。虽然已在这些不同的背景中探索了治疗性iNKT激活，但以前尚未报道iNKT激活和衰老细胞之间的联系。

发明概述

本公开内容的发明人已有利地发现了促进衰老细胞的免疫系统清除的方法。本公开内容的发明人已做出了如下无先例的发现，即，某些iNKTs的激活实现了衰老细胞病理累积的去除。

在第一个方面，本发明的范围包括新的通过激活iNKT细胞来清除衰老细胞的方法。iNKT细胞的激活可以通过使用各种iNKT-激活配体（包括糖脂）来实现。在备择的方法中，靶组织、器官或区室中激活的iNKT细胞的丰度通过施用iNKT细胞或iNKT细胞前体而增加。

通过清除衰老细胞，实现了各种预防和治疗效果，包括衰老细胞丰度的降低、减轻SASP表型以及预防和治疗由衰老细胞累积介导的疾病和年龄相关的状况。

在一个方面，本发明的范围包括通过治疗性施用iNKT细胞激活剂来治疗与衰老细胞有关的状况的方法。在本文公开的许多实施方案中，治疗的状况可包括各种炎症或自身免疫性状况、神经变性状况、心血管状况和年龄相关的状况。

下面详细描述本发明的各种实现。

附图简述

图1A、1B、1C和1D. 衰老的前脂肪细胞由高SA-βgal活性定义，并在HFD小鼠的白脂肪组织中累积。图1A：来自食物和HFD小鼠的CD45-耗尽的eWAT SVF细胞上衰老标记的qRT-PCR。数据是来自每组n = 6只小鼠的平均值±SEM。图1B：从食物和HFD小鼠分离的eWAT SVF上的CD1d表达。将细胞用CD45和CD31抗体（以门控掉（gate out）免疫和内皮细胞）以及荧光底物C₁₂FDG和抗-CD1d抗体染色。然后将衰老的前脂肪细胞（DAPI- CD45^-CD31^- C12FDG^Hi）关于相对CD1d表达进行门控。来自食物和HFD小鼠的CD45^- CD31^- C12FDG^Hi亚型的CD1d表达的定量显示在右图中。数据表示为来自每个实验n=4的平均值±SD。图1C：来自食物或HFD小鼠的C₁₂FDG⁺细胞的定量。数据是来自每组n = 4只小鼠的平均值±SD。图1D：与（g）中相同的食物和HFD小鼠中整个CD45^-CD31^-群体的C₁₂FDG MFI的定量。数据是来自每组n = 4只小鼠的平均值±SD。*p < 0.05，**p < 0.005，***p< 0.0005，双尾T-检验（two-tailed T-tests）。

图 2A、2B、2C和2D. 具有高SA-βgal活性的衰老的前脂肪细胞表达SASP基因，并优先由衰老细胞裂解（senolytic）处理消除。图2A：C₁₂FDG^Lo和C₁₂FDG^Hi群体的C₁₂FDG MFI。数据来自每组n = 3只小鼠的平均值±SD。图 2B：C₁₂FDG^Hi中的衰老标记相对于来自相同HFD小鼠的C₁₂FDG^Lo细胞的qRT-PCR。数据是来自每组n = 3只小鼠的平均值±SD。图2C：来自媒介物和ABT-737处理的HFD小鼠的C₁₂FDG^Hi亚型中阳性细胞的定量。图2D：来自媒介物和ABT-737处理的HFD小鼠的C₁₂FDG^Lo亚型中阳性细胞的定量。数据是来自每组n = 3只小鼠的平均值±SD。*p < 0.05，**p < 0.005，***p <0.0005，双尾T-检验。

图3A、3B、3C和3D. iNKT细胞的激活导致HFD小鼠白脂肪组织中衰老细胞的清除。图3A：来自每组食物（n = 4）、HFD对照（n = 5）和HFD+GC（n = 5）小鼠的CD45^-细胞的C₁₂FDG^Hi亚群的C₁₂FDG荧光和定量的代表性直方图。数据是平均值±SD。图3B：在α-GalCer注射后10天进行葡萄糖耐量试验（GTT）。在14小时禁食后通过腹膜内（i.p.）注射给小鼠施用2g/kg葡萄糖。葡萄糖注射后在0、15、30、60和120测量血糖。数据是来自每组n = 8-9只小鼠的平均值±SEM。图3C：使用方程式HOMA-IR =（以mmol/L为单位的葡萄糖x以mIU/mL为单位的胰岛素）/22.5基因空腹血糖和空腹胰岛素浓度在α-GalCer注射后 10 天评估HOMA-IR。数据是来自每组n = 8-9只小鼠的平均值±SEM。图3D：来自每组小鼠的CD45^- CD31^-亚型的C₁₂FDG^Hi亚群百分比的定量。数据是来自n = 2实验的平均值±SD。*p < 0.05，**p < 0.005，***p<0.0005，单因素方差分析。

图4A、4B、4C、4D、4E、4F和4G. iNKT细胞的激活优先消除鼠肺损伤模型以及在体外使用人细胞中的衰老细胞。图4A：来自CD45^-肺实质细胞中每组n = 3只小鼠的平均值±SD的C₁₂FDG荧光和定量的代表性直方图。图4B：CD45-耗尽的肺细胞中衰老和SASP的qRT-PCR，从而显示了每组n = 3只小鼠的平均值±SD，*p < 0.05，单因素方差分析。图4C：iNKT细胞作为来自与（b）相同的小鼠的T细胞比例的百分比，每组n = 2只小鼠的平均值±SD。图4D：每组对照（n = 5）、Bleo（n = 10）和Bleo+GC（n = 10）小鼠中通过羟脯氨酸（HP）浓度的纤维化的定量，误差棒为SD。***p < 0.0005，*p < 0.05，单因素方差分析Krusak-Wallis检验。图4E：用气管内博来霉素（4 U/kg）损伤并在第5天注射⍺-GalCer或媒介物（箭标）的小鼠的Kaplan Meier存活曲线。每组N=10只小鼠。通过对数秩（Log-rank）（Mantel-Cox）检验计算显著性。图4F：显示指示的样品的测定的18小时内平均细胞溶解百分比的细胞溶解测定的时间过程。每个时间点测量结果来自每个样品的n = 3个生物重复实验。图4G：对于指示的1:2靶效应物比（各自n = 3个生物重复实验）的8小时和18小时的平均百分比细胞溶解，误差棒为SD。*p < 0.05，***p < 0.0005单因素方差分析。

发明详述

本文公开的各种发明基于激活的iNKT实现衰老细胞清除的无先例的发现，其导致预防和治疗与衰老细胞累积有关的病理状况。清除可以通过iNKT细胞的直接作用和/或通过由iNKT监视募集的其他细胞的作用来实现。

iNKT细胞. iNKT细胞具有识别由CD1d呈递的糖脂抗原的恒定αβ TCRs。CD1d是由抗原呈递细胞表达的非经典MHC蛋白，例如造血细胞如树突细胞、B细胞、T细胞和巨噬细胞，并且还由各种内皮细胞和上皮细胞表达。这种细胞中的自身和外源糖脂通过CD1d呈递在细胞表面。如果呈递的配体是激活种类，其将与iNKT细胞的恒定TCR结合，并将激活各种细胞毒性和/或免疫应答。

在人中，iNKT细胞表达恒定Vα24-Jα18链。在小鼠中，iNKT细胞表达Vα14-Jα18 TCRα链。iNKT细胞可能在功能上特征在于它们对α-半乳糖神经酰胺（GalCer，如下文所讨论的）的反应性。在iNKT细胞群体中，发现了各种亚类，包括iNKT1、iNKT2、iNKT17、iNKT10和记忆滤泡辅助iNKT（iNKT_FH）细胞。iNKT类型通过TCR亲和力和激活应答相互区分。在不受特定操作理论束缚的情况下，本公开内容的发明人假设衰老细胞的清除主要由iNKT1细胞实现。iNKT1细胞是iNTK细胞的亚型，其特征可以在于它们在激活时产生Th-1型应答，例如，产生大量的IFNγ和Il-2以及几乎不产生IL-4。在主要的实施方案中，本文公开的方法的iNKT细胞是iNKT1细胞。然而，将理解的是，在备择实现中，可以激活或使用其他类型的iNKT细胞，包括iNKT2、iNKT17、iNKT10和记忆滤泡辅助iNKT（iNKT_FH）细胞。

I. iNKT试剂

本文中公开的各种发明涉及在本文中将被称为iNKT试剂的物质。如本文所用的，“iNKT试剂”意指通过iNKT细胞的直接和/或间接作用促进身体的靶器官、组织或区室中衰老细胞清除的试剂。iNKT作用可能是直接的，其中激活的iNKT细胞的细胞毒活性杀死衰老细胞。INKT作用可能是间接的，其中激活的iNKT细胞募集杀死衰老细胞的其他免疫元件，或诱导衰老细胞中的凋亡。iNKT试剂可以通过多种机制实现对衰老细胞的增加的清除，包括通过激活定居iNKT细胞、增加iNKT细胞的数目和/或将iNKT细胞募集到靶。

在主要实现中，iNKT试剂是iNKT激活剂。iNKT激活剂是激活iNKT细胞例如iNKT1细胞的物质组合物。iNKT细胞的激活导致免疫因子的快速释放，并且激活的细胞以高速率增殖。INKT激活剂可包括多种组合物，主要是糖脂，例如GalCer及其变体。在其他实施方案中，iNKT试剂是增加iNKT1细胞向靶器官、组织或区室募集的物质组合物。在其他实施方案中，iNKT试剂是细胞，包括iNKT1细胞或iNKT1细胞前体。下面更详细地描述用于实践本发明的各种iNKT试剂。

iNKT激活剂. 在主要的实施方案中，本发明的iNKT试剂是iNKT激活剂。如上文所定义的，iNKT激活剂是用于激活iNKT细胞例如iNKT1细胞的物质组合物。激活剂一般将通过与iNKT细胞的TCR相互作用发挥作用，其中与受体的结合启动免疫因子由细胞的加强的细胞外分泌和细胞快速分裂。

iNKT1细胞的激活导致1型炎症应答，包括干扰素-γ（IFNγ）、白细胞介素（IL）-2和肿瘤坏死因子-α的分泌。在一些实施方案中，激活的iNKT1细胞诱导几乎没有或没有Th2应答的情况下的主要的Th1应答。在一些实施方案中，本发明的激活的细胞诱导混合的Th1和Th2应答。iNKT应答通常是快的，细胞因子分泌在激活的数小时内开始，从而使得iNKT细胞被认为是病毒和其他感染的“第一反应者”。

在各种实施方案中，iNKT激活可包括以下任何一项：免疫因子分泌的可测量的增加，例如增加的（IFNγ）、白细胞介素（IL）-2 产生；选择的免疫应答的可测量的增加，例如Th-1应答；iNKT细胞丰度的可测量的增加；以及iNKT细胞增殖速率的可测量的增加。增加可以是任何增加，例如至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%的增加，例如，增加是与类似的、未激活的iNKT细胞中的iNKT激活的选择的量度相比的增加。

GalCer和变体。众所周知的iNKT激活剂是α-半乳糖神经酰胺（GalCer），也称为KRN7000。化合物1：

在各种实施方案中，iNKT激活剂是“GalCer变体”，GalCer变体包含与GalCer共享结构相似性并且也具有iNKT1激活性质的组合物。GalCer的结构由通过糖苷键结合到具有酰胺连接的饱和的C26脂肪酰链的C18植物鞘氨醇碱的α-半乳糖组成。GalCer变体包括对鞘氨醇链、N-酰基链、糖苷键和碳水化合物头部分中的修饰。GalCer类似物的例子包括：具有比起GalCer来改进的溶解度的分支酰基链α-GalCer类似物；氟化的3',4'-双脱氧α-GalCer类似物，例如4'-脱氧α-GalCer类似物；α-C-GalCer；α-S-GalCer；ThrCer；PBS-57；Nu-α-GalCer；和α-GalCer的碳环形式，例如RCAI-56。

在一些实施方案中，激活剂可以是GalCer衍生物，其中半乳糖（iNKT TCR识别的关键元件）被非糖苷取代所取代，例如，如Silk等人, Cutting Edge: Nonglycosidic CD1dLipid Ligands Activate Human and Murine Invariant NKT Cells, J Immunol 2008;180:6452-6456中所述的。示例性GalCer变体包括苏糖醇神经酰胺（threitolceramide）阿拉伯糖醇神经酰胺（arabinitolceramide）和甘油神经酰胺（glycerolceramide）。在一个实施方案中，iNKT激活剂是被修饰以在糖首基中具有受限制的柔性的苏糖醇神经酰胺，例如，通过将苏糖醇单位并入碳环如六元环或七元环中，例如，如Jukes等人, Non-glycosidiccompounds can stimulate both human and mouse iNKT cells, Eur. J. Immunol.2016. 46: 1224–1234中所述的。

在一个实施方案中，iNKT激活剂是GalCer变体，其包含在植物鞘氨醇链的脂肪酰链或末端苯环处具有修饰的GalCer，例如，糖脂，7DW8-5，如由Li等人, Design of apotent CD1d-binding NKT cell ligand as a vaccine adjuvant PNAS, 2010, 107:3010–13015所述的。

在一个实施方案中，iNKT激活剂是GalCer变体，其包含α-半乳糖神经酰胺中的碳水化合物和鞘氨醇类（sphingoid）碱修饰，例如，如Chennamadhavuni等人, DualModifications of a-Galactosylceramide Synergize to Promote Activation ofHuman Invariant Natural Killer T Cells and Stimulate Anti-tumor Immunity,2018, Cell Chemical Biology 25, 571–584中所述的。

在一个实施方案中，iNKT激活剂是GalCer变体，其包含在糖和脂质部分之间的E-烯接头，例如，GCK152，其具有在酰基链的尾中的芳环，例如，如Li等人, Invariant TCRRather Than CD1d Shapes the Preferential Activities of C-Glycoside AnaloguesAgainst Human Versus Murine Invariant NKT Cells, J Immunol 2009; 183:4415-4421中所述的。

其他iNKT激活剂. iNKT激活剂可包括iNKT细胞的其他糖脂激活剂。在一个实施方案中，iNKT激活剂是合成的氨基环醇神经酰胺，例如HS44，例如，如Kerzerho等人,Structural and functional characterization of a novel non-glycosidic iNKTagonist with immunomodulatory properties J Immunol. 2012年3月1日; 188(5):2254–2265中所述的。

在一个实施方案中，iNKT激活剂包含鞘糖脂、α-糖基(Gal/Glc)二酰甘油、β-葡糖鞘氨醇、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、双磷脂酰甘油、溶血磷脂酰胆碱或苯基2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酸酯，例如，如在Macho-Fernandez和Brigl, Theextended family of CD1d- restricted NKT cells: sifting through a mixed bag ofTCRs, antigens, and functions, Front. Immun. 2015, Vol. 6, Article 362中所述的。

在一些实施方案中，iNKT激活剂是充当iNKT细胞的激活剂的衍生自微生物病原体的天然存在的糖脂抗原，例如：来自鞘氨醇单胞菌科（Sphingomonadaceae）细菌物种的糖基神经酰胺，包括例如，GSL-1、GSL-1'、GSL-3和GSL-4；从布氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）分离的半乳糖二酰甘油；来自肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的半乳糖二酰甘油；原生动物溶组织内阿米巴（Entamoeba histolytica）的α-连接的葡糖基DAGs和二糖Gal-Glu-DAG；来自曲霉属（Aspergillus）物种的asperamide B；来自糖多孢菌属（Saccharopolyspora）的α-甘露糖基1-3 (6'-O-酰基α-甘露糖基)-1-1单酰甘油；胆固醇基6'-O-酰基α-甘露糖苷，发现于白色假丝酵母（Candida albicans）；和来自幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）的PI57。

在一些实施方案中，iNKT激活剂是由CD1d呈递的内源性哺乳动物糖脂，例如异球三己糖神经酰胺（isoglobotrihexosylceramide）、β-葡糖神经酰胺、溶血磷脂酰胆碱和溶血鞘磷脂（lysosphingomelin）。

在一些实现中，iNKT激活剂是抗体，其结合iNKT细胞的TCR，并通过这种结合导致它们的激活。示例性抗体包括针对iNKT TCR-α CDR3环的6B11单克隆抗体，公开于Exley等人, Selective activation, expansion, and monitoring of human iNKT cells witha monoclonal antibody specific for the TCR α‐chain CDR3 loop, Eur. J.Immunol. 2008. 38: 1756–1766中。额外的iNKT激活抗体包括NKTT320，这是一种重组、人源化的单克隆抗体，其选择性地且以高亲和力结合人iNKT TCR，如Patel等人, 2020,Cancer Immunotherapeutic Potential of NKTT320, a Novel, Invariant, NaturalKiller T Cell-Activating, Humanized Monoclonal Antibody, Int J Mol Sci. 2020年6月; 21: 4317中所述的。

在一些实施方案中，iNKT激活剂是iNKT细胞的小分子激活剂。

作为iNKT试剂的iNKT细胞. 在一些实现中，通过将iNKT细胞或iNKT细胞前体转移至靶器官、组织或区室来实现靶器官、组织或区室中iNKT细胞的增加。在所述实现中，iNKT细胞或前体衍生自一个来源；扩充；且然后引入主体的靶组织、器官或区室中。可在转移前或转移后通过使用一种或多种选择的iNKT激活剂激活细胞。

在一些实施方案中，iNKT细胞是从主体分离、扩充且然后引入回同一主体的自体细胞。在备择实现中，iNKT细胞是衍生自除主体以外的个体的同种异体细胞，。

移植的iNKT细胞用于癌症免疫治疗的用途是已知的。因此，本领域已知有多种方法用于iNKT细胞的分离、扩充和移植。使用扩充的iNKT细胞的过继细胞转移的临床试验例如在Wolf等人, Novel Approaches to Exploiting Invariant NKT Cells in CancerImmunotherapy, Front. Immun. 2018, Volume 9, Article 384中进行了综述。

从生物材料如外周血分离iNKT细胞可以通过各种方式实现。iNKT细胞可以通过显示iNKT标记例如CD3、CD4和CD8的细胞的FACS选择来分离。另一方面，加载有糖脂的CD1d二聚体或四聚体可用作选择工具，例如，如Watarai等人, Methods for detection,isolation and culture of mouse and human invariant NKT cells, NatureProtocols, 2008, 3:70-77中所述的。另一方面，可以使用对iNKT细胞具有选择性的抗体来分离它们，例如，抗- Vα24Jα18 CDR3环抗体，如Exley等人, Selective activation,expansion, and monitoring of human iNKT cells with a monoclonal antibodyspecific for the TCR α‐chain CDR3 loop, Eur. J. Immunol. 2008. 38: 1756–1766中所述的。

分离后，iNKT细胞可通过本领域中已知的许多平台先体外后体内地有效扩充。细胞可以在具有iNKT激活剂的脉冲添加的适当的培养基例如RPMI 1640培养基中培养，以刺激高增殖速率。扩充iNKTs的示例性方法例如在Chiba等人, Rapid and reliablegeneration of invariant natural killer T-cell lines in vitro, Immunology,128, 324–333中描述。

在过继转移方法的变化形式中，施用的细胞可以是iNKT前体，其是在输注后在体内后来分化成或产生iNKT细胞的细胞。例如，已经在癌症治疗的背景中证明了使用发育成iNKT细胞的人工改造的造血干细胞，例如，如Zhu等人, Development of HematopoieticStem Cell-Engineered Invariant Natural Killer T Cell Therapy for Cancer, CellStem Cell 25: 542-557中所述的。

iNKT试剂药物组合物. 选择的iNKT试剂可以以各种形式和制剂呈递给靶组织、器官或区室。在一些实现中，选择的iNKT激活剂与额外的组合物组合用于改善的递送和活性。

可以配制药物组合物用于通过选择的途径的有效递送。在各种实现中，iNKT激活剂被配制用于多种途径施用，包括，例如，口服、静脉内、动脉内、腹膜内、肺内、口服、吸入、膀胱内（intravesicular）、肌内、气管内、皮下、眼内、鞘内、经黏膜和经皮递送。

本发明的药物组合物将包含许多适合于所选递送途径并促进通过所选递送途径递送的组分。如本领域中已知的，iNKT激活剂可以与药学上可接受的赋形剂、载体、稀释剂、释放制剂和其他药物递送或药物靶向媒介物组合配制。在一个实施方案中，iNKT激活剂药物组合物包含与聚合物材料的混合的选择的治疗剂，用于试剂的时控释放洗脱，例如，以防止材料在消化道中过早消化。在一个实施方案中，iNKT激活剂被包被在植入物或药物洗脱设备上。

在一些实现中，选择的iNKT激活剂与CD1d蛋白复合，例如，重组产生的CD1d寡聚体，如CD1d二聚体或四聚体。制备这种CD1d寡聚体的示例性方法见于Karadimitris等人,2001, Human CD1d–glycolipid tetramers generated by in vitro oxidativerefolding chromatography, PNAS 2001年3月13日 98 (6) 3294-3298中。

在一些实现中，选择的iNKT激活剂被加载到泡囊或类似的泡囊体中，例如外来体，以促进递送，例如，如Gehrmann等人, 2013. Synergistic induction of adaptiveantitumor immunity by codelivery of antigen with alpha-galactosylceramide onexosomes. Cancer Res. (2013) 73:3865–76中所述的。

在一个实施方案中，iNKT激活剂被加载到含有选择的活性剂或用选择的活性剂功能化的纳米颗粒上或以其他方式用所述纳米颗粒配制，用于通过基于纳米颗粒的递送方法递送。例如，Ferandez等人, 2014 Targeted Delivery of α-Galactosylceramide to CD8α⁺ Dendritic Cells Optimizes Type I NKT Cell–Based Antitumor Responses topromote strong anti-tumour iNKT activity, J Immunol 193: 961-969显示了加载有GalCer的基于聚(乳酸-共乙醇酸)（PLGA）的纳米颗粒；

在各种实现中，本发明的药物组合物可包含靶向部分，其优先将选择的iNKT试剂指向身体的靶组织、器官或区室。在一些实施方案中，靶向部分可包含抗体或其抗原结合片段，其选择性地结合在靶组织或细胞类型中发现的表位。例如，上面引用的Fernandez等人证明了通过用针对CD205的抗体链进行功能化将加载有GalCer的纳米颗粒向CD8+细胞的靶向递送。在一些实施方案中，药物组合物包含与抗原结合部分例如抗体或其抗体结合片段融合的CD1蛋白或寡聚体，其中抗原结合部分促进iNKT试剂递送至选择的靶细胞类型，例如，如Corgnac等人, 2013 CD1d-antibody fusion proteins target iNKT cells to thetumor and trigger long-term therapeutic responses. Cancer Immunol Immunother.(2013) 62:747–60中所证明的。

在一些实现中，选择的iNKT激活剂提供在已加载了选择的试剂的细胞上。iNKT激活糖脂可以加载到CD1d表达细胞上或由其呈递，包括树突细胞、单核细胞衍生的树突细胞或其他单核细胞衍生的抗原呈递细胞。生产、加载和递送这种iNKT激活剂功能化细胞的示例性方法描述于Toura等人, 1999. Cutting edge: inhibition of experimental tumormetastasis by dendritic cells pulsed with alpha-galactosylceramide. J Immunol(1999) 163:2387–91；Chang等人, 2005. Sustained expansion of NKT cells andantigen-specific T cells after injection of alpha-galactosyl-ceramide loadedmature dendritic cells in cancer patients. J. Exp. Med. 201: 1503–1517；和Fujii等人, 2002. Prolonged IFN-gamma-producing NKT response induced withalpha-galactosylceramide-loaded DCs. Nat. Immunol. 3: 867–874中。

II. iNKT试剂对衰老细胞的治疗性清除

本文公开的各种发明涉及通过增加iNKT数目和活性来清除衰老细胞用于治疗和预防疾病和其他状况。在第一个实施方案中，本发明的范围包括iNKT试剂，其用于减少主体身体的靶器官、组织或区室中衰老细胞数目的方法中。在所述方法中，以足以增加靶中的iNKT活性的治疗有效量向主体施用iNKT试剂，从而导致其中衰老细胞的数目减少。

在第二个实施方案中，本发明的范围包括iNKT试剂，其用于减少主体身体的靶器官、组织或区室中衰老细胞的病理效应的方法中。在所述方法中，以足以增加靶中的iNKT活性的治疗有效量向主体施用iNKT试剂，从而导致其中衰老细胞的数目减少和改善衰老细胞的病理效应。在一些实施方案中，衰老细胞的病理效应是SASP-相关效应，并通过由iNKT细胞增强的SASP细胞去除而得到改善。

在第三个实施方案中，本发明的范围包括iNKT试剂，其用于治疗主体中衰老相关状况的方法中。在所述方法中，将iNKT试剂施用于主体以增加靶中的iNKT衰老细胞清除活性，从而导致其中衰老细胞的数目减少并提供针对衰老相关状况的治疗效果。

在主要的实施方案中，本发明的范围包括通过向主体施用治疗有效量的iNKT试剂来治疗需要治疗的主体中的衰老相关状况的方法。在相关的实施方案中，本发明的范围包括iNKT试剂，其用于治疗衰老相关状况的方法中。在另一个方面，本发明的范围包括在制备用于治疗衰老相关状况的方法中的药物中使用iNKT试剂的方法。下面描述本发明的各种方法。

衰老细胞. 本发明的方法包括施用iNKT试剂以减少靶组织、器官或区室中衰老细胞的数目。衰老细胞包括许多与细胞衰老有关的病理特征。衰老细胞包括具有许多标记或特征的细胞，包括细胞周期停滞，细胞周期负调节剂的上调，染色质“瘢痕（scars）”和衰老相关性异染色质病灶，脂质沉积，端粒缩短，g-H2AX核点的诱导，上调的p15，p16ink4a，p21p53和ADP-核糖基化因子（ARF），衰老相关的β半乳糖苷酶（SA-β-gal），脂质体中的脂褐素聚集体以及本领域已知的作为衰老细胞特性的指示物的其他标记。

某些衰老细胞获得了SASP表型。SASP细胞是衰老细胞，其对邻近的非衰老细胞表现出旁分泌促炎或促衰老（pro-senescent）作用。SASP因子包括SASP的驱动因素（drivers），例如布罗莫结构域和超末端基序（bromodomain and extra-terminal motif）（BET）蛋白（例如BRD2、BRd3和BRD4）、p38MAPK、JAK、NF-κB和CCAAT-增强子结合蛋白（C/EBP）。SASP因子可以进一步包括细胞环境中分泌的SASP因子，例如分泌的因子，如IL-6、Serpine1、G-CSF、Ccl2、Mmp9、Mmp12、Igfpb3、IL1、IL8、CXCL1、CXCL2、单核细胞趋化蛋白3、胰岛素样生长因子结合蛋白（包括IGFBP2、IGFBP3、IGFBP4、IGFBP5和PGFBP6）、集落刺激因子、MMP-3、MMP-10和丝氨酸蛋白酶。SASP细胞可以定义为表达或展示任何已知的SASP状况的生物标志的那些细胞。

主体. 本发明的方法涉及预防和治疗与主体中衰老细胞的病理累积有关的各种状况。主体可以是人主体，例如，在一些背景中，患者。主体可以进一步包括任何物种的非人动物，包括试验动物、兽医主体、宠物和家畜，例如，小鼠、大鼠、狗、猫、绵羊、山羊、牛、猪、马、非人类灵长类动物或其他动物的任一种。

在各种实施方案中，主体是具有如下所述的衰老相关状况的主体，例如，需要针对列举的状况进行治疗的主体。在各种实施方案中，主体是处于获得、进展为或以其他方式具有列举的状况的风险中的主体，例如，需要预防性治疗的主体。

随着变老，个体清除衰老细胞的能力看来似乎下降。在某些实施方案中，主体是老年主体，例如，至少40岁、至少50岁或至少60岁的主体。在非人动物主体的情况下，老年主体将根据适于所述主体物种的标准来定义。例如，18-24个月大的小鼠可能与约55-70岁的人相关。

iNKT试剂的施用. 将iNKT试剂以治疗有效量施用于主体，所述治疗有效量是足以诱导可测量的选择的生物效应和/或选择的治疗效应的量。在主要的实施方案中，治疗有效量是足以可测量地减少靶中衰老细胞数目的量。例如，在各种实施方案中，减少可以是与治疗前的靶相比或与类似的未治疗的靶相比，至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%的减少，或可包括衰老细胞的基本上完全消除。在其他实现中，治疗有效量是足以实现可测量治疗结果的量，如下文所述的。

iNKT试剂的精确剂量将根据iNKT试剂的药理性质、递送途径、靶位点特征、治疗需要和考虑的其他因素来确定。示例性剂量在0.1 ng至1 mg/kg的范围内，例如1-100 μg/kg。备择的剂量范围是每平方米体表50-5,000微克，例如，如Giaccone等人, A phase I studyof the natural killer T-cell ligand alpha-galactosylceramide (KRN7000) inpatients with solid tumors. Clin Cancer Res. 2002;8:3702–3709中所述的。在iNKT试剂包含细胞的情况下，例如iNKT细胞、iNKT细胞前体或加载有iNKT激活剂（例如GalCer）的表达CD1d的细胞，用于人的示例性治疗有效剂量可能在每次治疗1-5亿个细胞的范围内。

施用的时间控制将根据待治疗的状况、选择的试剂的性质和期望的治疗结果来确定。在一般实现中，应用本文公开的方法以从靶清除或基本上去除有害的衰老细胞。在一些实施方案中，应用单一治疗以实现所述结果。在其他实现中，应用几种治疗以实现衰老细胞的减少。在一些情况下，每隔一定时间施用iNKT试剂以使衰老细胞数目保持在病理水平以下，例如，施用是每周一次或每月一次、每季度一次、每半年一次或每年一次，这取决于治疗因素。在一些实现中，其中要将iNKT试剂的活性维持在期望的且稳定的水平，施用可以每天多次或每天一次。然而，一般说来，仅仅必须定期清除衰老细胞的累积，例如，每隔四个星期或一个月。

在本文公开的方法的有限的实现中，进行了iNKT试剂的全身应用。然而，正如已在全身施用的衰老细胞裂解剂的情况下所发现的，衰老细胞的全身消融可能具有显著且有害的脱靶（off-target）效应。因此，在大多数实现中，本发明的方法涉及选择性地或优先地减少身体的靶组织、器官或区室中衰老细胞的数目，其中衰老细胞的累积正导致有害的效应。靶可以包括身体的组织、器官、细胞类型、区室或其他部分中的任一种。例如，在各种实施方案中，如本文所用的，靶可以包括外周血，淋巴系统，脑，肾，肝，胰，肺；脂肪组织；白脂肪组织；棕脂肪组织；骨骼肌；心；胰；肾；肠；结肠；下丘脑；心脏组织；肝；膀胱，脾；淋巴结；真皮；胃；肺；胰，脑；眼组织；外耳道或耳细胞如毛细胞；脊髓；心，食管，窦组织；睾丸，卵巢，骨，外周神经，软骨，软组织，循环系统的元件，毛囊，表皮，生殖器官；消化道，膀胱，呼吸道，造血区室或骨髓；整个主体，或任何其他选择的组织、器官或细胞类型组织、器官或区室可以是存在于主体身体中的任一种。

可以进行对靶的局部施用。在其他实现中，试剂被递送至循环系统并被输送至靶。在一些实现中，靶向部分实现对靶的优先或选择性递送。在其他实现中，前药制剂促进靶中iNKT试剂的选择性激活。iNKT试剂可以通过多种途径施用，包括，例如，口服、静脉内、动脉内、腹膜内、肺内、口服、吸入、膀胱内、肌内、气管内、皮下、眼内、鞘内、皮内、经黏膜和经皮递送。示例性施用技术包括皮下注射到脂肪组织中、通过干粉吸入器或雾化器吸入递送、用导管经皮递送以及本领域中已知的用于将试剂递送到身体的靶组织、器官或区室的其他方法。

治疗和治疗效果. 本发明的范围包括各种治疗本文将称为“衰老相关状况”的疾病的方法。衰老相关状况包括与衰老细胞累积有关的任何状态或状况。本发明的范围涉及这种衰老相关状况的治疗。如本文所用的，“治疗”意指达到任何预防或治疗效果。

在一些实施方案中，治疗效果是增加iNKT细胞的丰度。iNKT细胞丰度的增加可以包括选择的靶中iNKT细胞的增加，所述靶包括身体的组织、器官、区室或其他部分。在相关实施方案中，治疗效果是iNKT细胞激活的增加，例如，作为被激活的iNKT细胞的数目或比例的增加，或通过选择的区室中iNKT细胞的活性水平所测量的。

在一些实施方案中，治疗效果是主体中衰老细胞丰度的降低，例如，其中治疗效果包括选择的区室中衰老细胞数目的减少。减少可以是细胞数目的绝对减少，或衰老细胞与非衰老细胞的比例的成比例的减少。在各种实施方案中，治疗效果被定义为与治疗前的靶相比，或与类似的未治疗的靶相比，至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%的选择的区室中衰老细胞的减少。

在某些实施方案中，治疗效果是选择的区室中SASP细胞或SASP因子的丰度降低。SASP细胞或SASP因子的减少可以是与治疗前的靶相比或与类似的未治疗的靶相比，选择的区室中SASP细胞或因子的绝对数目的任何减少，例如，至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%的减少。

在另一个实施方案中，免疫浸润是疾病和疾病进展的主要驱动因素，且治疗效果是免疫浸润的减少，例如，一种或多种选择的免疫细胞类型的浸润的减少，例如T淋巴细胞、B淋巴细胞、树突细胞或巨噬细胞，包括单核细胞。

在各种实施方案中，治疗效果是关于选择的状况定义的，其中所述状况由衰老细胞的累积引起、介导、加重或者是衰老细胞累积的结果。关于选择的状况，示例性治疗效果包括：改善状况的一种或多种症状或病态、逆转状况的一种或多种病态、治愈状况的一种或多种症状或病态、减慢状况的进展、停止状况的发展或减少作为状况基础的病理过程。如本文所用的，治疗将也包括预防性治疗。关于选择的状况，示例性的预防性治疗效果包括，例如，预防状况的发作，降低状况表现的可能性，改善促进或引起状况的生理过程，或以其他方式降低状况的风险、严重程度或进展。

衰老相关状况. 在各种实施方案中，衰老相关状况是炎性或自身免疫性状况。例如，在各种实施方案中，炎性或自身免疫性状况选自急性和慢性肺炎症、肺纤维化（包括特发性肺纤维化）、强直性椎关节炎、关节炎（包括银屑病关节炎、骨关节炎、反应性关节炎、幼年型和类风湿性关节炎）、关节病、哮喘、共济失调毛细血管扩张症、恶病质、慢性支气管炎、慢性肺阻塞性疾病、克罗恩病、囊性纤维化、埃-丹综合征、内毒素性休克、纤维肌痛、痛风、运动过度综合征、炎性肠病（克罗恩病和溃疡性结肠炎）、缺血诱导的炎症、缺血再灌注损伤、肾缺血、脊柱后凸、肢体缺血、肝纤维化、局部和全身炎症、狼疮、代谢性酸中毒、多发性硬化、骨关节炎、银屑病、少肌症、硬皮病和血管炎、脓毒病或脓毒性休克和溃疡性结肠炎。

在各种实施方案中，衰老相关状况是由与衰老细胞累积有关的代谢功能异常引起的状况。例如，在各种实施方案中，状况是与附睾（epidydmal）白脂肪组织中衰老的前脂肪细胞累积有关的代谢功能异常，例如，如在II型糖尿病中发生的那样。

在一些实施方案中，衰老相关状况是糖尿病或糖尿病相关状况。例如，在各种实施方案中，状况是I型糖尿病、II型糖尿病糖尿病相关炎症、糖尿病性溃疡、糖尿病肾病或糖尿病黏连性囊炎、与附睾白脂肪组织中衰老的前脂肪细胞累积有关的代谢功能异常、葡萄糖耐受不良、葡萄糖调节异常和其他糖尿病症状。

在一些实施方案中，衰老相关状况是心血管状况。例如，在各种实施方案中，衰老相关状况是选自下述的心血管状况：绞痛、主动脉瘤、心律失常、动脉粥样硬化、脑动脉瘤、心脏舒张功能异常、心脏纤维化、心脏应激抗性（cardiac stress resistance）、心肌病、颈动脉疾病、慢性阻塞性肺病、充血性心力衰竭、冠状动脉病、冠状动脉血栓形成、心内膜炎、高血压、高胆固醇血症、高脂血症、特发性肺纤维化、二尖瓣脱垂、心肌梗死、外周血管疾病和卒中。

在一些实施方案中，衰老相关状况是神经变性状况。例如，在各种实施方案中，衰老相关状况是选自阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿病、癫痫、慢性创伤性脑病、额颞叶痴呆、痴呆和运动神经元功能异常的神经变性状况。

在各种实施方案中，衰老相关状况是年龄相关性状况。例如，年龄相关性状况可以是选自下述的状况：肺功能丧失、黄斑变性、肾衰竭、虚弱、肌肉疲劳、肝纤维化、胰纤维化、口腔黏膜下纤维化、进行性肌肉丧失、降低的骨密度、年龄相关性记忆损伤、年龄相关性听力丧失、少肌症、皮肤萎缩、脑萎缩、动脉硬化、肺气肿、免疫功能不全、白内障、皮肤起皱和头发泛灰（graying of hair）。

示例性实施方案

在一种实现中，本发明包括试剂，其用于减少主体的选择的靶组织、器官或区室中衰老细胞数目的方法中；

其中所述试剂可以包括以下任何一种：iNKT细胞的激活剂；通过直接或间接的iNKT细胞活性促进衰老细胞去除的试剂；iNKT细胞的糖脂激活剂；GalCer；GalCer衍生物；与CD1d蛋白包括CD1d二聚体或CD1d四聚体复合的iNKT细胞的糖脂激活剂；与CD1d蛋白包括CD1d二聚体或CD1d四聚体复合的GalCer；与iNKT细胞的TCR结合的抗体；表达CD1d的细胞，其用iNKT细胞的糖脂激活剂功能化或加载；用iNKT细胞的糖脂激活剂功能化或加载的树突细胞；用GalCer或GalCer衍生物功能化或加载的表达CD1d的细胞；用GalCer或GalCer衍生物功能化或加载的树突细胞；iNKT细胞；先体外后体内扩充的自体iNKT细胞；iNKT前体；或自体iNKT细胞前体；

并且

其中所述方法包括以治疗有效量向所述主体施用一种或多种iNKT试剂。

在一些实现中，试剂被直接或局部递送至靶组织、器官或区室。在一些实现中，主体的靶组织、器官或区室包括以下任何一项：外周血，淋巴系统，脑，肾，肝，胰，肺；脂肪组织；白脂肪组织；棕脂肪组织；骨骼肌；心；胰；肾；肠；结肠；下丘脑；心脏组织；肝；膀胱，脾；淋巴结；真皮；胃；肺；胰，脑；眼组织；外耳道或耳细胞如毛细胞；脊髓；心，食管，窦组织；睾丸，卵巢，骨，外周神经，软骨，软组织，循环系统的元件，毛囊，表皮，生殖器官；消化道，膀胱，呼吸道，或整个主体。

在另一种实现中，本发明的范围包括试剂，其用于治疗主体中衰老相关状况的方法中；

其中所述试剂可以包括以下任何一种：iNKT细胞的激活剂；通过直接或间接的iNKT细胞活性促进衰老细胞去除的试剂；iNKT细胞的糖脂激活剂；GalCer；GalCer衍生物；与CD1d蛋白包括CD1d二聚体或CD1d四聚体复合的iNKT细胞的糖脂激活剂；与CD1d蛋白包括CD1d二聚体或CD1d四聚体复合的GalCer；与iNKT细胞的TCR结合的抗体；表达CD1d的细胞，其用iNKT细胞的糖脂激活剂功能化或加载；用iNKT细胞的糖脂激活剂功能化或加载的树突细胞；用GalCer或GalCer衍生物功能化或加载的表达CD1d的细胞；用GalCer或GalCer衍生物功能化或加载的树突细胞；iNKT细胞；先体外后体内扩充的自体iNKT细胞；iNKT前体；或自体iNKT细胞前体；并且

其中所述状况是以下的一种或多种：炎性状况；自身免疫性状况；急性或和慢性肺炎症，肺纤维化；特发性肺纤维化，强直性椎关节炎，关节炎；银屑病关节炎；骨关节炎；反应性关节炎；幼年型关节炎；类风湿性关节炎；关节病；哮喘；共济失调毛细血管扩张症；恶病质；慢性支气管炎；慢性肺阻塞性疾病；克罗恩病；囊性纤维化；埃-丹综合征；内毒素性休克；纤维肌痛；痛风；运动过度综合征；炎性肠病；克罗恩病；溃疡性结肠炎；缺血诱导的炎症；缺血再灌注损伤；肾缺血；脊柱后凸；肢体缺血；肝纤维化；局部或全身炎症；狼疮；代谢性酸中毒；多发性硬化；骨关节炎；银屑病；少肌症；硬皮病；血管炎；脓毒病或脓毒性休克；由与衰老细胞累积有关的代谢功能异常引起的状况；与附睾白脂肪组织中衰老的前脂肪细胞累积有关的代谢功能异常；糖尿病或糖尿病相关状况；I型糖尿病；II型糖尿病；II型糖尿病相关炎症；糖尿病性溃疡；糖尿病肾病；糖尿病黏连性囊炎；葡萄糖耐受不良；葡萄糖调节异常；心血管状况；绞痛；主动脉瘤；心律失常；动脉粥样硬化；脑动脉瘤；心脏舒张功能异常；心脏纤维化；心脏应激抗性；心肌病；颈动脉疾病；慢性阻塞性肺病；充血性心力衰竭；冠状动脉病；冠状动脉血栓形成；心内膜炎；高血压；高胆固醇血症；高脂血症；特发性肺纤维化；二尖瓣脱垂；心肌梗死；外周血管疾病；卒中；神经变性状况；阿尔茨海默病；帕金森病；多发性硬化；肌萎缩侧索硬化；亨廷顿病；癫痫；慢性创伤性脑病；额颞叶痴呆；痴呆；运动神经元功能异常；年龄相关性状况；肺功能丧失；黄斑变性；肾衰竭；虚弱；肌肉疲劳；肝纤维化；胰纤维化；口腔黏膜下纤维化；进行性肌肉丧失；降低的骨密度；年龄相关性记忆损伤；年龄相关性听力丧失；少肌症；皮肤萎缩；脑萎缩；动脉硬化；肺气肿；免疫功能不全；白内障、皮肤起皱；和头发泛灰；

其中所述方法包括以治疗有效量向所述主体施用试剂。

在另一个实施方案中，本发明包括用于减少靶组织、器官或区室中的病理过程的方法中的试剂，或用于减少与衰老相关状况有关的炎症的方法中的试剂；

其中所述试剂可以包括以下任何一种：iNKT细胞的激活剂；通过直接或间接的iNKT细胞活性促进衰老细胞去除的试剂；iNKT细胞的糖脂激活剂；GalCer；GalCer衍生物；与CD1d蛋白包括CD1d二聚体或CD1d四聚体复合的iNKT细胞的糖脂激活剂；与CD1d蛋白包括CD1d二聚体或CD1d四聚体复合的GalCer；与iNKT细胞的TCR结合的抗体；表达CD1d的细胞，其用iNKT细胞的糖脂激活剂功能化或加载；用iNKT细胞的糖脂激活剂功能化或加载的树突细胞；用GalCer或GalCer衍生物功能化或加载的表达CD1d的细胞；用GalCer或GalCer衍生物功能化或加载的树突细胞；iNKT细胞；先体外后体内扩充的自体iNKT细胞；iNKT前体；或自体iNKT细胞前体；并且

其中所述方法包括以治疗有效量向所述主体施用所述iNKT试剂。

在一些实现中，病理过程是炎症。在一些实现中，炎症是与表现出SASP的衰老细胞的累积有关的炎症。在一些实现中，病理过程是纤维化。在一些实现中，试剂被直接或局部递送至靶组织、器官或区室。在一些实现中，主体的靶组织、器官或区室包括以下任何一项：外周血，淋巴系统，脑，肾，肝，胰，肺；脂肪组织；白脂肪组织；棕脂肪组织；骨骼肌；心；胰；肾；肠；结肠；下丘脑；心脏组织；肝；膀胱，脾；淋巴结；真皮；胃；肺；胰，脑；眼组织；外耳道或耳细胞如毛细胞；脊髓；心，食管，窦组织；睾丸，卵巢，骨，外周神经，软骨，软组织，循环系统的元件，毛囊，表皮，生殖器官；消化道，膀胱，呼吸道，或整个主体。

在另一种实现中，本发明包括作为衰老细胞裂解剂的iNKT激活剂或iNKT细胞或前体，其中所述iNKT激活剂或iNKT细胞通过iNKT细胞的直接和/或间接活性促进衰老细胞的去除；

其中所述试剂可以包括以下任何一种：iNKT细胞的激活剂；iNKT细胞的糖脂激活剂；GalCer；GalCer衍生物；与CD1d蛋白包括CD1d二聚体或CD1d四聚体复合的iNKT细胞的糖脂激活剂；与CD1d蛋白包括CD1d二聚体或CD1d四聚体复合的GalCer；与iNKT细胞的TCR结合的抗体；表达CD1d的细胞，其用iNKT细胞的糖脂激活剂功能化或加载；用iNKT细胞的糖脂激活剂功能化或加载的树突细胞；用GalCer或GalCer衍生物功能化或加载的表达CD1d的细胞；用GalCer或GalCer衍生物功能化或加载的树突细胞；iNKT细胞；先体外后体内扩充的自体iNKT细胞；iNKT前体；或自体iNKT细胞前体。

实施例

实施例1. 恒定自然杀伤T细胞协调衰老细胞的去除

介绍. 组织内衰老细胞的累积可以驱动疾病的进展。虽然用衰老细胞裂解药物去除衰老细胞已作为有前途的治疗方法出现，但这些药物的普遍存在的靶使临床应用具有挑战性。在健康组织中，内源免疫监视机制通过衰老细胞的靶向去除来限制衰老细胞的累积。免疫监视未能有效识别和靶向衰老细胞清除可能导致衰老细胞的累积。介导体内衰老细胞清除的内源免疫监视的特性尚不清楚。

为了处理所述问题，研究了显示体内衰老细胞累积的组织。已报道衰老的前脂肪细胞在长期喂食高脂肪饮食（HFD）的小鼠和肥胖的人两者的白脂肪组织（WAT）中累积。（表达p16^Ink4a的细胞的）基因缺损或使用衰老细胞裂解化合物导致衰老的前脂肪细胞的消除，从而提示HFD小鼠可用作模型以研究衰老的前脂肪细胞清除中的免疫监视。为了鉴定介导WAT中这种衰老细胞的免疫监视的机制，寻找了可以介导衰老细胞与免疫细胞之间相互作用的上调的细胞表面受体。使用单细胞分析，本公开内容的发明人以前表明，I类主要组织相容性复合体（MHC）的组分编码β-2-微球蛋白（B2M）的mRNA在衰老的β细胞中高度上调，从而导致目前在来自小鼠WAT的前脂肪细胞中I类MHC-样分子的探索。鉴定了MHC I类-样分子CD1d，其正常由抗原呈递细胞表达，但在衰老的前脂肪细胞中显示出特异性升高的表达，从而提示衰老与免疫调节之间的潜在联系。

与B2M复合的CD1d将脂质抗原呈递给称为恒定自然杀伤T（iNKT）细胞的一类T淋巴细胞。iNKT细胞具有恒定T细胞受体（TCR）并且容易在人和小鼠中用加载了抗原的CD1d四聚体鉴定，从而使得这是已经过全面调查的T细胞群体。随着年老，人中iNKT细胞的频率和功能下降，但尚未假设或研究所述降低与变老或疾病期间衰老细胞的增加之间的联系。本文描述了脂质抗原呈递以激活iNKT细胞如何构成内源监视系统，所述系统可以被操作以清除疾病模型中的衰老细胞。

结果. 衰老细胞在HFD小鼠的eWAT中累积。为了表征附睾WAT（eWAT）中肥胖症相关的衰老细胞，雄性小鼠被喂食HFD（60%千卡来自脂肪）达16周（从6周一直到22周龄为止），且然后分离与eWAT有关的基质血管部分（SVF），其主要包含前脂肪细胞（~75%），但也包含间充质干细胞和内皮细胞以及定居免疫细胞。在探测食物喂食（对照）和HFD-喂食的小鼠两者中的衰老细胞之前，使用CD45抗体标记的纳米珠（nanobeads）从SVF中耗尽免疫细胞。测量了衰老相关的βgal（SA-βgal）活性，并测量了剩余SVF细胞中与衰老有关的基因的mRNA水平和衰老相关性分泌表型（SASP）。当从肥胖小鼠中分离时，所述前脂肪细胞富集的群体始终如一地显示出增加的SA-βgal染色和几种衰老（Cdkn2a ^Ink4a 、Il6）基因的升高的表达，而来自年龄匹配的对照小鼠的那些则没有（图 1A）。这类似于当比较增殖和衰老的前脂肪细胞时。与CD1d在体外衰老的前脂肪细胞上的上调一致，与食物小鼠相比，从HFD喂食的小鼠分离的前脂肪细胞中CD1d表达增加（图 1B）。

C₁₂FDG^Hi细胞标记对衰老细胞裂解剂敏感的分泌性衰老细胞。为了定量来自肥胖对瘦小鼠的eWAT的衰老的前脂肪细胞的数目，使用利用荧光底物C₁₂FDG测量SA-βgal活性的常见流式细胞术测定，如在Debacq-Chainiaux等人, 2009. Protocols to detectsenescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarkerof senescent cells in culture and in vivo. Nat. Protoc. 4, 1798–806中所述的。基于C₁₂FDG的中值荧光强度，从当与来自对照饮食喂食的对应物的那些相比具有升高的SA-βgal活性的HFD小鼠的SVF鉴定了CD45^–CD31^–前脂肪细胞亚群。CD31⁺细胞看来似乎对总的C₁₂FDG信号没有显著贡献，且随后使用CD45^–负门控来表征衰老细胞（图1C和1D）。然后，探索了SA-βgal活性水平是否可以区分衰老细胞的不同亚型，将FACS用于从HFD喂食的小鼠分离前脂肪细胞，并将高荧光（最高~25%，C₁₂FDG^Hi）与具有低荧光的那些（最低~20%，C₁₂FDG^Lo）分离，从而使得与C₁₂FDG^Lo群体比较在C₁₂FDG^Hi中的C₁₂FDG荧光水平为~30-倍高（图2A）虽然Cdkn1a和Cdkn2a ^Ink4a 在这两个前脂肪细胞亚型中以相同水平表达，但相对于来自相同肥胖小鼠的C₁₂FDG^Lo细胞，C₁₂FDG^Hi细胞具有升高的构成SASP的分泌基因如Il6和Ccl2的mRNA水平（图2B）。C₁₂FDG^Lo细胞被称为复制性衰老细胞，且C₁₂FDG^Hi被称为分泌性衰老细胞。

然后，测试了这些C₁₂FDG^Hi前脂肪细胞是否可以用衰老细胞裂解药物消融。已知Bcl2家族在衰老细胞中被上调，且体内良好耐受的BH3模拟物ABT-737通过优先在衰老细胞中诱导凋亡来充当衰老细胞裂解剂²¹。用ABT-737治疗HFD-喂食的和对照小鼠，并定量来自其eWAT的SVF的C₁₂FDG^Hi前脂肪细胞。当与媒介物治疗的对照相比时，在来自HFD-喂食的小鼠的eWAT的SVF的前脂肪细胞富集的群体中，用ABT-737治疗减少了C₁₂FDG^Hi细胞的数目并一致地增加C₁₂FDG^Lo细胞的相对数目（图2C）。

α-GalCer治疗导致eWAT中iNKT的激活和扩充. 然后，考虑iNKT细胞是否可以类似地调节肥胖小鼠WAT内分泌性衰老细胞的数目。首先，使用加载有α-GalCer以特异性检测这些细胞的的CD1d四聚体对食物喂食的小鼠和HFD-喂食的小鼠两者的eWAT中组织定居的iNKT细胞的数目进行定量。使用所述方法，发现在饮食诱导的肥胖的背景中，eWAT内相对于总的活SVF细胞归一化的iNKT细胞数目始终如一地减少。用当在体外和体内呈递在CD1d上时特异性激活iNKT细胞的众所周知的脂质抗原α-半乳糖神经酰胺（GalCer）治疗HFD小鼠与用媒介物治疗的类似肥胖小鼠相比足以显著增加iNKT细胞数目。所述发现与通过GalCer治疗激活eWAT中的iNKT细胞一致。

HFD小鼠的GalCer治疗导致衰老细胞的去除并使血糖正常化. 为了探索iNKT的激活是否调节衰老细胞，用GalCer治疗小鼠以评估eWAT的SVF部分中的衰老细胞。HFD小鼠用GalCer或媒介物进行注射，并通过关于C₁₂FDG的FACS分析eWAT-衍生的SVF细胞中的SA-βgal活性。正如所预期的那样，相对于喂食对照饮食的瘦小鼠，注射媒介物的饮食诱导的肥胖症小鼠在eWAT中具有增加的C₁₂FDG^Hi前脂肪细胞频率。对比起来，用GalCer治疗肥胖小鼠在将这些C₁₂FDG^Hi细胞的数目减少到类似于瘦对照小鼠中所见的那些的水平的能力方面是显著的（图3A）。还测试了GalCer-诱导的iNKT细胞激活是否是去除衰老细胞所需要的。我们使用缺乏T细胞受体恒定链的Traj18-缺陷小鼠³⁹。给喂食HFD的WT和Traj18 ^−/−小鼠注射GalCer，并使用C12FDG+ SVF细胞以评估衰老细胞。-GalCer治疗导致WT HFD小鼠中衰老细胞减少，但未能减少Traj18 ^−/−小鼠中的衰老细胞。为了评估消除衰老细胞对代谢健康的影响，在用GalCer治疗的HFD-喂食的小鼠中监控血糖和胰岛素水平。与媒介物治疗的HFD-喂食的小鼠相比，接受GalCer的HFD-喂食的小鼠具有显著更低的空腹葡萄糖、改进的葡萄糖耐量和改进的胰岛素敏感性，并且类似于食物喂食的小鼠（图3B）。

激活的iNKT的过继转移导致HFD小鼠中减少的衰老的前脂肪细胞. 为了确认响应于体内-GalCer递送的WAT衰老细胞的清除与任何脱靶效应相反是由激活的iNKT细胞介导的，评估了过继转移的eWAT-分离的iNKT细胞从通过以前的HFD喂食变得肥胖的接受者小鼠eWAT中清除衰老细胞的能力。使用CD1d-加载的四聚体从GalCer-治疗的HFD小鼠的eWAT中FACS-分离iNKT细胞，并且在两个独立的实验中将~150-300,000的这些iNKT细胞转移到接受者小鼠中。

显著地，相对于未治疗的对照，这种转移足以显著减少否则存在于HFD-喂食的对照接受者小鼠的eWAT中的C₁₂FDG^Hi前脂肪细胞的数目。值得注意的是，过继转移的效果表型模拟了直接用GalCer治疗HFD-喂食的小鼠的效果，其用作这些实验的阳性对照（图3D）。这些数据一起直接暗示激活的定居eWAT iNKT细胞在模型中衰老的前脂肪细胞清除中的牵连，在所述模型中所述衰老的前脂肪细胞在WAT中累积。

IPF模型中iNKT的激活导致减少的衰老细胞和减少的纤维化. 为了处理iNKT-介导的衰老细胞清除的普遍性以及这种机制是否在其他疾病背景中起作用，研究了肺中博来霉素诱导的损伤，这是一种间质性肺病模型。化疗剂博来霉素的气管内滴注法诱导上皮损伤，继之以炎性细胞浸润到肺间质和肺泡间隙。以前的研究已经证明，衰老的上皮细胞和间充质细胞在博来霉素诱导的损伤后累积，并且衰老细胞裂解剂治疗可以清除这些衰老细胞。特发性肺纤维化（IPF）患者的肺组织中也发生衰老的上皮细胞的累积，且IPF患者的开放（open-label）研究中的衰老细胞裂解剂治疗显示出益处，从而提示博来霉素诱导的损伤是肺纤维化的衰老细胞裂解剂方法的良好模型。

为了测试iNKT细胞是否可以消除博来霉素诱导的肺损伤模型中的衰老细胞，在C57BL6雄性小鼠群组中招致博来霉素诱导的损伤。损伤后十天，这些小鼠要么用GalCer进行全身治疗，要么不进行治疗，而在第10天用媒介物治疗的年龄匹配的未受损伤的小鼠充当对照。损伤后14天收获肺，并定量衰老的上皮细胞和间充质细胞的比例，以及iNKT细胞的相对数目。正如在来自HFD-喂食的小鼠的WAT-相关的前脂肪细胞中所见的，博来霉素诱导的肺损伤诱导了衰老的CD45^–肺细胞数目的显著增加，如通过使用C₁₂FDG测定定量SA-βgal活性所分析的（图4A）。重要的是，博来霉素损伤的小鼠的GalCer治疗将这种CD45^– C₁₂FDG⁺肺细胞的数目减少至与未受损伤的对照小鼠肺中的那些相等的水平。如同以前的研究一样，上皮和间充质衰老细胞两者均受到GalCer治疗的影响。为了确认SA-βgal活性的变化反映了衰老细胞，分析了衰老和SASP标记的mRNA水平。与C₁₂FDG测定一致，来自博来霉素损伤的小鼠的CD45^–肺细胞具有增加的衰老（Cdkn2a ^Ink4a ）和SASP（Ccl2, Serpine1）标记的mRNA水平。此外，博来霉素损伤的小鼠的GalCer治疗降低了这些标记基因的mRNA水平，与我们使用C₁₂FDG测定观察到的减小的SA-βgal活性一致（图4B）。如在eWAT中一样，GalCer治疗也在博来霉素诱导的损伤的背景中诱导肺实质iNKT细胞的扩充（图4C）。为了处理所述iNKT扩充及其相关的衰老细胞裂解作用是否也抑制肺纤维化，使用羟脯氨酸（HP）测定以测量用或不用GalCer治疗的博来霉素损伤的小鼠中的全肺胶原蛋白含量。重要的是，肺损伤的小鼠的-GalCer治疗显著降低了肺羟脯氨酸含量，与抑制的纤维化一致（图4D）。去除衰老和抑制纤维化对存活具有有益作用，这是因为与媒介物注射的小鼠相比， GalCer-注射的小鼠的死亡率显著降低（图4E）。这些发现通常与较早的工作一致，其中在博来霉素诱导的损伤的治疗中探索了GalCer和NKT细胞活性，包括Kimura等人, 2004. Treatment with α-Galactosylceramide Attenuates the Development of Bleomycin-Induced PulmonaryFibrosis. J. Immunol. 172, 5782–5789和Kim等人, 2005. Natural killer T (NKT)cells attenuate bleomycin-induced pulmonary fibrosis by producing interferon-gamma. The American journal of pathology, 167(5), 1231–1241。这些早期研究是更加预防性而非治疗性的，这是因为在博来霉素损伤之前施用GalCer或过继转移的iNKT细胞，从而可能减轻肺损伤的发展，而不是在其确立后逆转纤维化。重要的是，这些先前的研究没有评价其观察到的效果或将其与衰老细胞的减少联系起来。合起来看，这些结果提示，通过GalCer治疗在肺内的iNKT细胞激活减弱了博来霉素诱导的IPF期间衰老细胞的累积，从而产生了抗纤维化作用并提高了存活。

激活的iNKT细胞优先对人衰老细胞是细胞毒性的. 为了处理iNKT细胞是否可以直接作用于人中的衰老细胞，开发了体外细胞毒性测定。来自健康人供体的外周血单核细胞（PBMCs）用于生成树突细胞（DCs）和分离iNKT细胞两者，然后将其独立培养。平行地，培养人肺成纤维细胞（WI-38）并用依托泊苷处理以诱导衰老。未处理的增殖WI-38细胞用作对照。-GalCer-加载的DCs用于激活和扩充iNKT细胞。激活的iNKTs与衰老或增殖（未处理的）WI-38细胞在共培养中组合，并使用xCELLigence(TM)平台（Agilent Systems, Inc.）以测量细胞阻抗，且从而连续监控指示细胞数目和附着的实时动力学行为。不取决于细胞状态诱导快速凋亡的非特异性激酶抑制剂星形孢菌素用作细胞毒性的阳性对照（数据未显示）。将衰老或增殖WI-38细胞接种到孔中，并将激活的iNKT细胞以不同的靶效应物比添加到这些孔中。iNKT细胞保持悬浮，且不黏附至孔，且因此对阻抗的贡献可以忽略不计。计算百分比细胞溶解并用于比较激活的iNKT对衰老和非衰老WI-38靶细胞的相对功效。激活的iNKT细胞与增殖WI-38细胞的共培养在两种靶:效应物比显示最小的细胞杀伤。对比起来，将类似激活的iNKT细胞与衰老WI-38细胞共培养诱导衰老的成纤维细胞细胞溶解的显著剂量和时间依赖性增加，在18小时前在两种靶:效应物比均达到~100%的最大值（图4F）。此外，即使在1:2的最低靶:效应物比，激活的iNKT也在测定的中点（8小时）和终点（18小时）两者对衰老细胞显著更加具有细胞毒性（图4G）。这些结果表明，比起增殖细胞来，激活的原代人iNKT细胞可以优先诱导衰老细胞的细胞毒性。

讨论. 衰老表型取决于背景和诱因而变化，且显然不同的免疫细胞类型协作以去除不同组织中的衰老细胞。例如，NK 细胞介导肝中衰老的激活的星状细胞的监视，且最近的工作已表明，穿孔蛋白-粒酶途径对于在衰老和化学诱导的肝纤维化过程中消除多种组织中的衰老细胞的细胞毒性效应子功能极其重要。最近的一篇论文利用尿激酶型纤溶酶原激活物受体（uPAR）在癌基因诱导的衰老细胞上的表达以开发可以消融衰老群体的抗原特异性CAR-T细胞。所述衰老细胞裂解（senolysis）方法可能十分适合于在特定组织背景中衰老细胞表达异常抗原的情况，例如在与癌症有关的癌基因诱导的衰老中，但不在与DNA损伤诱导的衰老有关的慢性疾病中，这是因为在HFD小鼠的衰老前脂肪细胞上未鉴定uPAR。通过使用本文的iNKT细胞作为实现有效衰老细胞裂解的手段克服了对抗原特异性的依赖，并且尽管采用常见的递送方法，但通过这样做可以清除不同组织环境中不同类型的衰老细胞。iNKT细胞具有适应性和先天特征两者，这使其独特地适合于使早期应答协调异常细胞（如病毒感染的细胞或衰老细胞）的消除。已发现用GalCer激活iNKT细胞逆转HFD小鼠模型中的不利代谢表型（例如，如Lynch等人, 2012，Schipper等人, 2012和Ji等人, 2012中所公开的）以及由肺损伤引起的纤维化（如Kimura等人, 2004和Kim等人, 2005中所述的）。本文提供的结果提供了iNKT细胞可以消除这两种不同模型中的衰老细胞的首次证据，在所述模型中组织功能异常与衰老细胞的累积有关。

虽然衰老细胞裂解剂已是将衰老清除疗法发展到临床的主要方法，但几个原因使iNKT细胞的激活成为更有前途的方法。衰老细胞裂解剂靶向抗凋亡途径，所述途径不仅在衰老细胞中上调，而且这些途径在非衰老细胞中也是活性的。为避免毒性，局部施用利用衰老细胞裂解剂的临床试验以降低副作用的风险。比较起来，iNKT细胞上独特的恒定TCR允许对于脂质抗原如α-GalCer的强烈的特异性，并且本文提供的结果证实通过α-GalCer的iNKT细胞激活使它们特异性地对衰老细胞而不是非衰老细胞是细胞毒性的。另一个优点是iNKTs的激活是短寿的，从而避免了无限制和延长的细胞溶解作用。评价α-GalCer安全性的临床前和临床研究表明，它通常已在具有最小副作用的情况下在广泛的剂量范围内良好地耐受，例如，如Wolf等人, 2018. Novel Approaches to Exploiting Invariant NKTCells in Cancer Immunotherapy. Frontiers in Immunology 9, 384中所述的。如本文所证实的，通过iNKT细胞特异性激活监视应答提供了下一代方法以消除与慢性疾病有关的炎性衰老细胞。

材料和方法. 小鼠管理. 所有包括老鼠的程序都是遵循加州大学旧金山分校（University of California, San Francisco）动物委员会的伦理学批准根据IACUC标准进行的。关于食物或HFD喂食的小鼠的雄性C57BL6/J。从6周龄一直到22周龄为止，给HFD小鼠喂食高脂肪饮食（60%千卡来自脂肪）。所有关于HFD小鼠的实验均在22-24周总年龄（在HFD上16-18周）时进行。使用标准啮齿类动物食物饮食的年龄匹配的雄性C57BL6/J小鼠用作对照。对于肺损伤模型，使用了10-周大的雄性C57BL/6J小鼠。将动物分成三组：对照组、受损伤组和α-GalCer治疗的组。对照组中的动物在第10天仅接受媒介物（i.p.）。受损伤组动物在实验开始时（第0天）通过气管内途径接受博莱霉素（3U/kg）。α-GalCer治疗的组中的动物在第0天接受博来霉素（3U/kg），并且在第10天i.p.注射α-GalCer（2 μg /小鼠）。在第14天处死所有组中的动物，且同一日收获肺用于分离原代肺泡II型细胞（ATII）。对于羟脯氨酸测定，小鼠在损伤后21天被实施安死术。

附睾白脂肪组织基质血管部分（eWAT SVF）分离. 使用标准规程分离eWAT SVF。简而言之，小鼠被实施安死术，并且收获附睾脂肪垫，在D-PBS中洗涤两次并切碎。于37℃用在含有1% BSA（Sigma-Aldrich）的1XHBSS中的1 U/ml胶原酶-D（Roche）消化eWAT垫1小时。然后将消化的脂肪组织通过100 μm渗滤器渗滤两次，并用30 ml完全培养基（DMEM-F12 1:1，10% FBS，1X青霉素-链霉素）中和。样品以500g旋转5分钟，摇动以重悬浮SVF沉淀，且然后再次旋转。所得到的含有血细胞的SVF沉淀用ACKS缓冲液裂解，在D-PBS中洗涤并离心（spindown）。使用锥虫蓝对总的活SVF细胞进行计数，且然后用于各种测定。

从肺分离原代上皮细胞. 在有微小修改的情况下根据Sinah和Lowell³⁶描述的方法从鼠肺分离出原代上皮细胞。简而言之，用超剂量的异氟烷对小鼠实施安死术。进行双侧开胸术，且在剪断左心房后，经由右心室通过用含5mM EDTA的PBS灌注对肺进行放血。灌注后，肺经由气管插管法用50单位/mL分散酶滴注，并使其静置5分钟。从胸腔切除肺并于37℃在分散酶中消化45分钟。细胞通过温和梳理从肺释放，并收集在含有DNA酶I（1mg/10mL）的无菌DMEM中。为了得到单细胞悬浮液，将肺匀浆顺序通过70μm和40μm细胞渗滤器过滤，并于4℃以300g离心10分钟。通过在1 mL裂解缓冲液中重悬浮3分钟来裂解细胞沉淀中的RBCs，并使用10 mL无菌DMEM培养基中和，离心并将细胞沉淀重悬浮于1 ml含有 DNA酶I的无菌DMEM中。使用Vi-Cell XR细胞生存力分析仪分析细胞的生存力。

eWAT SVF的CD45⁺细胞耗尽. 根据产品规程，使用金属辅助的细胞分选（MACS）纳米珠将如上所述制备的eWAT SVF耗尽CD45⁺细胞。收集CD45-耗尽的（未磁化的）级分，以500g离心5分钟，且然后平板接种在组织培养物处理的平板上用于X-gal染色或用于RNA提取。对于肺细胞，ATII细胞（<10⁷/100 µl）用缓冲液洗涤，并与10 μl小鼠CD45纳米珠在冰上温育15分钟。温育后，细胞用缓冲液洗涤，以300g离心5分钟，然后重悬浮于聚丙烯管中的3ml缓冲液中，并于4℃放置于磁柱中15分钟。15分钟后，收集2.5 ml上清液作为未标记的或CD45-耗尽的级分。将CD45-耗尽的级分中的细胞以300g离心5分钟，并贮藏在300 μl RNA酶抑制性核酸提取试剂中（于-80℃一直到RNA提取为止）。

用于SA-βgal活性的X-Gal染色. 根据产品说明书，利用商业试剂盒使用X-gal对耗尽CD45⁺细胞并平板接种24小时的来自食物或HFD小鼠的腹股沟WAT前脂肪细胞或eWATSVF进行用于SA-βgal活性的染色。图像是在明视场显微镜上以10X或20X拍摄的。

C₁₂FDG流式细胞术测定. 将如上所述分离和计数的eWAT SVF细胞在完全培养基中调整至3x10⁶个细胞/ml并在37℃水浴中与33 μM C₁₂FDG温育1小时。然后将细胞以500g离心5分钟，用细胞染色缓冲液洗涤，并用各自于1:200稀度的抗-CD45-APC（克隆30F-11）和抗-CD31-PE-Cy7（克隆390）在冰上染色30分钟。然后将细胞在细胞染色缓冲液中洗涤并重悬浮于含有1X 7-AAD的细胞染色缓冲液中。在Attune声聚焦（acoustic focusing）细胞计数器上分析样品。门设置如下：细胞（FSC-A/SSC-A）、前向散射单峰（singlet）（FSC-H/FSC-A）、侧向散射单峰（SSC-H/SSC-A）、活细胞（7-AAD^-）、非免疫细胞（CD45^-）、非内皮细胞（CD31^-）并分析C₁₂FDG荧光。在一些情况下，不包括CD31，这是因为发现包括或排除所述群体不显著改变C₁₂FDG亚群的总的分布或门控。使用FlowJo（v.10）分析数据。对于肺，来自每个样品的1X10⁶个细胞用于进行测定。将细胞与66μm的C₁₂FDG在含有DNA酶的无菌DMEM中于37℃温育1小时。温育后，将细胞用细胞染色缓冲液洗涤，用抗CD16/32小鼠单克隆抗体（1:1000，由UCSF单克隆抗体核心制备）封闭，并用APC抗小鼠CD45（1:400）和7-AAD（1:1000）染色。门控策略遵循选择的7-AAD^-、CD45^-和C12FDG⁺细胞。

CD1d的流式细胞术. 收集来自不同传代的CAG-Luc小鼠的Ing或eWAT前脂肪细胞，并在细胞染色缓冲液中用抗-CD1-PE（克隆1B1）染色。然后在Attune声聚焦细胞计数器上进行流式细胞术。门设置如下：细胞（FSC-A/SSC-A）、前向散射单峰（FSC-H/FSC-A）、活细胞（GFP⁺）和CD1d荧光。

iNKT细胞的α-GalCer激活. 如Peralbo等人, 2006. Decreased frequency andproliferative response of invariant Vα24Vβ11 natural killer T (iNKT) cells inhealthy elderly. Biogerontology 7, 483–492中所述，使用α-GalCer体内激活iNKT细胞。简而言之，HFD小鼠被i.p.注射200 μl在5.6%蔗糖、5%吐温-20中配制的10 μg/ml α-GalCer溶液（总共2 μg）。在注射后第3天或第4天，小鼠被实施安死术用于各种实验，如所示的。

iNKT细胞的流式细胞术. eWAT SVF细胞用加载到由NIH四聚体核心（NIHTetramer Core）制备的CD1d-PE四聚体上的PBS57（α-GalCer-类似物）和抗-CD3-APC染色。作为用于减去eWAT SVF中背景染色的阴性对照，样品也用未加载的CD1d-PE四聚体和抗-CD3-APC染色。使用DAPI对活细胞进行计数，并在Attune声聚焦细胞计数器上进行流式细胞术。设置门以鉴定：细胞（FSC-A/SSC-A）、前向散射单峰（FSC-H/FSC-A）、侧向散射单峰（SSC-H/SSC-A）、活细胞（DAPI^-）、和PBS57::CD1d-PE⁺/CD3-APC⁺亚群。从加载的四聚体染色的群体中减去未加载的CD1d-PE⁺/CD3-APC⁺细胞的百分比，以消除背景染色的细胞的百分比。对于肺，来自每个样品的1X10⁶个细胞用于定量iNKT细胞。温育，细胞用细胞染色缓冲液洗涤，用抗CD16/32小鼠单克隆抗体（1:1000）封闭，并用DAPI，用PE标记的四聚体（α-GalCer加载的CD1d四聚体，NIH）（1:100）；APC标记的抗小鼠CD3（1:400）染色。遵循的门控策略是DAPI阴性、CD3和四聚体双阳性。iNKT-细胞计数报告为用四聚体染色阳性的CD3细胞的百分比。

代谢测量. 将17只雄性HFD-喂食的C57BL6J小鼠分为媒介物（n=8）和α-GalCer治疗的组（n=9)。使用标准啮齿类动物食物饮食的年龄匹配的雄性C57BL6/J小鼠用作对照（n=8）。α-GalCer注射后10天进行葡萄糖耐量试验。在腹膜内注射2g/kg葡萄糖之前，小鼠禁食过夜（14小时）。使用血糖测计仪在葡萄糖注射后0、15、30、60和120分钟测量血糖。

博来霉素肺损伤. 为了测量肺胶原蛋白，气管内滴注3 U/kg博来霉素，在第10天注射⍺-GalCer或媒介物，继之以在20天收获肺用于羟脯氨酸测定。对于存活研究，气管内滴注4 U/kg博来霉素，在第5天注射⍺-GalCer或媒介物。

iNKT细胞的过继转移. 如上所述用α-GalCer 治疗HFD小鼠，且然后在第3天处死，继之以如上所述进行eWAT SVF分离、iNKT细胞染色和流式细胞术。大约150-300,000个活iNKT细胞在Sony SH800S流式分选仪上分选到淋巴细胞培养基（RPMI-1640，10% FBS，1X抗生素-抗真菌剂）中。分选纯度一般为90%。然后立即将细胞离心（500g达5 分钟），在150-200μl D-PBS中重构并i.p.注射到接受者HFD小鼠中。与过继转移同时，HFD小鼠未被治疗作为阴性对照，或如上所述用α-GalCer治疗以充当阳性对照。在转移后第4天，HFD小鼠被实施安死术，并对eWAT SVF进行C₁₂FDG测定。

来自eWAT SVF的C₁₂FDG^Hi和C₁₂FDG^Lo细胞的流式分选。eWAT SVF从HFD小鼠分离，并使用C₁₂FDG染色程序用抗-CD45-APC（克隆30F-11）染色，以门控掉免疫细胞，且用DAPI染色以鉴定活细胞。样品用细胞分选仪分选。设置门以鉴定：细胞（FSC-A/SSC-A）、前向散射单峰（FSC-W/FSC-A）、侧向散射单峰（SSC-W/SSC-A）、活细胞（DAPI^-）、非免疫细胞（CD45^-）用于C₁₂FDG荧光。然后将C₁₂FDG直方图图形根据顶部~25%最高荧光亚群（C₁₂FDG^Hi）和最低~20%（C₁₂FDG^Lo）门控，并分选到两个含有RNA提取试剂的不同管中。

羟脯氨酸测定. 如本领域已所述的进行羟脯氨酸测定。简言之，将骤冻的肺样品匀浆并与50%三氯乙酸（Sigma）混合，然后将其于110℃在12 M HCl中温育过夜。第二天，样品用水重构2小时。重构后，将它们与10%异丙醇中的1.4%氯胺和0.5 M乙酸钠混合。最后，将它们与Ehrlich氏溶液混合并于65℃温育15分钟。在550 nm处测量吸光度，并根据标准曲线计算值。

RNA提取和定量反转录PCR. 使用商品化的总RNA微量制备（micro-prep）试剂盒根据产品说明书使用RNA提取试剂提取RNA。总RNA由纳米体积（nanovolume）分光光度计（photospectrometer）和荧光计定量。使用商品化的cDNA合成试剂盒，将大约200-300 ng的总RNA用于cDNA合成。在使用实时PCR系统用SYBR试剂扩增之前，将 cDNA（250 ng）1:5稀释。使用∆∆ C_T方法使用亲环蛋白A（Ppia）作为持家基因进行定量。

利用人外周血iNKT细胞的体外细胞毒性测定. 人外周血单核细胞（PBMC）iNKT分离和扩充基于如Li等人, 2013. Generation of Human iNKT Cell Lines. Bio-protocol3 (6): e418. DOI: 10.21769/BioProtoc.418中所述的方法。使用商品化的PBMC分离系统从健康患者分离 PBMCs。使用人CD14正选择试剂盒进行CD14⁺和CD14^-细胞的分离。CD14⁺和CD14^-细胞与重组蛋白一起培养：分别为20 ng/mL GM-CSF和20 ng/mL IL-4或10U/mL IL-2。基础培养基由含有1%丙酮酸钠、1%非必需氨基酸溶液、1% L-谷氨酰胺、1%抗生素抗真菌剂、1% HEPES和10%胎牛血清的RPMI-1640（完全培养基）组成。在第五天，在用PBS洗涤3次之前，CD14⁺细胞用0.05 mg/mL丝裂霉素C以5 x 10⁶个细胞/mL于37℃处理30分钟。然后将细胞用200 ng/mL α-GalCer加载一小时。使用抗-iNKT微珠从CD14^-细胞群体分离iNKT细胞。α-GalCer-加载的树突细胞和iNKTs以 5:1 的比例共培养。每隔一天用补加有20 U/mL IL-2的完全培养基进行一半的培养基更换。在第12天，细胞用抗-Vα24和抗-Vβ11染色，并在FACSAria II细胞分选仪上关于双阳性细胞进行分选。分离的iNKTs在含有20 U/ml的IL-2的完全培养基中恢复24小时。WI-38人肺成纤维细胞（ATCC）在具有1%抗生素抗真菌剂和10% FBS的含有Eagle氏极限必需培养基的培养基（维持培养基）中培养至70%汇合。将100μM依托泊苷添加到培养基中达48小时以诱导衰老。维持培养基每隔一天更换达6天。将5 μg/ml纤连蛋白包被在96孔平板的每个孔上达20分钟。在衰老诱导后第7天，将增殖对照和依托泊苷处理的衰老WI-38细胞以5000个细胞/孔接种到平板上。在进入xCELLigence(TM)（AgilentInc.）支架中之前，将细胞与100 μl /孔的维持培养基于25℃温育1小时。二十四小时后，以2:1（10,000个细胞）或5:1（25,000个细胞）的比例添加完全培养基+ 20 U/ml的IL-2中的iNKT细胞。作为完全裂解对照，将1 μM星形孢菌素添加到WI-38和依托泊苷处理的衰老WI-38细胞两者中。在24小时内每30分钟测量阻抗，并将其相对于起始值归一化（归一化的细胞指数）。对于数据分析，使用了从30分钟（在那点上信号稳定）到6小时的时间点。使用（Eq.1）计算%细胞溶解。将归一化的WI-38和依托泊苷处理的衰老WI-38条件与其在每个时间点具有效应iNKT细胞的相应条件进行比较。

定量和统计分析 对于每个实验，生物重复实验的数目（n）在图例中指示。使用对于两组的双尾T-检验，或对于三组或更多组的单因素方差分析或双因素方差分析，在小鼠组和/或具有n ≥ 3个生物重复实验或小鼠的样品之间进行统计比较，其中对多次检验进行校正。P < 0.05被认为是显著的。

所述说明书中引用的所有专利、专利申请和出版物均在好像每个独立的专利申请或出版物都具体且单独地指出被引入作为参考的相同程度上引入本文作为参考。所公开的实施方案是为了举例说明而非限制起见提出的。虽然本发明已经参照所描述的其实施方案进行了描述，但是本领域的技术人员将理解，在总的来说不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明的结构和要素进行修改。

Claims (41)

1.包含iNKT细胞激活剂、iNKT细胞或iNKT细胞前体的试剂，其用于减少主体的选择的靶组织、器官或区室中的衰老细胞数目的方法中。

2.根据权利要求1所述的试剂，其中所述主体的靶组织、器官或区室选自：脂肪组织；肺；肝；肾；脾；脑；心血管组织；胰；骨骼肌；和真皮。

3.包含iNKT细胞激活剂、iNKT细胞或iNKT细胞前体的试剂，其用于抑制与主体的选择的靶组织、器官或区室中的衰老细胞有关的病理过程的方法中。

4.根据权利要求3所述的试剂，其中所述主体的靶组织、器官或区室选自：脂肪组织；肺；肝；肾；脾；脑；心血管组织；胰；骨骼肌；和真皮。

5.根据权利要求3所述的试剂，其中所述病理过程是炎症。

6.根据权利要求5所述的试剂，其中所述病理过程是与展示SASP的衰老细胞有关的炎症。

7.根据权利要求3所述的试剂，其中所述病理过程是纤维化。

8.包含iNKT细胞激活剂、iNKT细胞或iNKT细胞前体的试剂，其用于治疗主体中衰老相关状况的方法中。

9.根据权利要求8所述的试剂，其中所述衰老相关状况是肺纤维化。

10.根据权利要求8所述的试剂，其中所述衰老相关状况是糖尿病。

11.根据权利要求8所述的试剂，其中所述衰老相关状况是炎症或自身免疫性状况。

12.根据权利要求8所述的试剂，其中所述衰老相关状况是年龄相关的状况。

13.根据权利要求8所述的试剂，其中所述衰老相关状况是神经变性状况。

14.根据权利要求8所述的试剂，其中所述治疗是预防性治疗。

15.根据权利要求1-14任一项所述的试剂，其中所述试剂包含iNKT细胞的激活剂。

16.根据权利要求15所述的试剂，其中所述试剂包含糖脂。

17.根据权利要求15所述的试剂，其中所述糖脂是α-半乳糖神经酰胺。

18.根据权利要求15所述的试剂，其中所述糖脂包含α-半乳糖神经酰胺的变体。

19.根据权利要求15所述的试剂，其中所述糖脂与CD1d蛋白或寡聚体复合。

20.根据权利要求19所述的试剂，其中所述糖脂与CD1d二聚体或四聚体复合。

21.根据权利要求1-14任一项所述的试剂，其中所述试剂是用糖脂iNKT激活剂功能化或加载的表达CD1d的细胞。

22.根据权利要求21所述的试剂，其中所述表达CD1d的细胞是树突细胞。

23.根据权利要求1-14任一项所述的试剂，其中所述试剂包含选择性结合并激活iNKT细胞的TCR的抗体。

24.根据权利要求1-14任一项所述的试剂，其中所述试剂包含iNKT细胞或iNKT前体。

25.通过向主体施用治疗有效量的包含iNKT激活剂、iNKT细胞或iNKT细胞前体的试剂来治疗需要治疗的主体中的衰老相关状况的方法，其中所述试剂促进衰老细胞的去除。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述试剂是iNKT细胞激活剂。

27.根据权利要求25所述的方法，其中所述iNKT激活剂是糖脂。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述糖脂是α-半乳糖神经酰胺。

29.根据权利要求27所述的方法，其中所述糖脂是α-半乳糖神经酰胺变体。

30.根据权利要求27所述的方法，其中所述糖脂与CD1d蛋白或寡聚体复合。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述糖脂与CD1d二聚体或四聚体复合。

32.根据权利要求26所述的方法，其中所述iNKT细胞激活剂包含用iNKT细胞的糖脂激活剂功能化或加载的表达CD1d的细胞。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述表达CD1d的细胞是树突细胞。

34.根据权利要求26所述的方法，其中所述iNKT细胞激活剂包含选择性结合iNKT细胞的TCR的抗体。

35.根据权利要求25所述的方法，其中所述试剂包含iNKT细胞或iNKT前体。

36.根据权利要求25所述的方法，其中所述衰老相关状况是肺纤维化。

37.根据权利要求25所述的方法，其中所述衰老相关状况是糖尿病。

38.根据权利要求25所述的试剂，其中所述衰老相关状况是炎症或自身免疫性状况。

39.根据权利要求25所述的方法，其中所述衰老相关状况是年龄相关的状况。

40.根据权利要求25所述的方法，其中所述衰老相关状况是神经变性状况。

41.根据权利要求25所述的方法，其中所述治疗是预防性治疗。

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