CN115656150A - 一种微流控超敏化学发光定量检测生物分子的装置及方法 - Google Patents

一种微流控超敏化学发光定量检测生物分子的装置及方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种微流控超敏化学发光定量检测生物分子的装置，其包括：微流控反应腔，在微流控反应腔中装载有至少一个可移出的固相载体；当微流控反应腔中装载有多个固相载体时，这些固相载体在微流控反应腔中以固定的顺序排布，不会随反应试剂流动而打乱顺序；固相载体与微流控反应腔内壁之间构成液体流动通道；固相载体表面具有由若干凸起或凹陷所组成的3D微纳结构，使载体表面可固定的功能配基(如氨基、羧基等)的丰度是表面光滑的固相载体的1000倍以上；功能配基为任何能够间接或直接结合靶标分子的功能基团。该装置结构简单、成本低、易于操作，具有样品用量少、多靶标联检、可快速出结果、灵敏度高、检测灵活度高等优点。

Description

一种微流控超敏化学发光定量检测生物分子的装置及方法
技术领域
本发明涉及微流控检测技术领域，尤其涉及一种微流控超敏化学发光定性定量检测生物分子的装置及方法。
背景技术
生物标志物尤其是与重大疾病相关的生物标志物在人体内的含量与多种生物学过程密切相关。这些生物标志物在疾病发生的早期阶段含量较低，传统方法难以实现准确有效的检测分析，特别是在临床诊断疾病时大多情况下都是要多项目联合检测来判断疾病的种类，指导我们的诊疗。传统的检测方法，例如用于蛋白质检测的免疫比浊法、酶联免疫法、荧光免疫法或磁珠化学发光法的检测原理为：基于溶液整体的光学信号进行检测，将检测获得的光强度信号的变化与标准曲线进行对比，从而实现定量检测。然而，这些检测都是基于单一项目逐次加样，单独分项进行检测的。常用的蛋白芯片、微流控芯片以及基于荧光流式Luminex xMAP检测平台虽然也可实现多项目联合检测的，但由于蛋白芯片、微流控芯片产品的制造工艺十分复杂、芯片的流道和反应腔结构极为精密，制备难度大、生产设备昂贵，定量不准确，终端产品昂贵等原因，使得这些产品到目前为止难以大范围推广。
鉴于疾病快速诊断的需求，人们亟需一种在临床检验应用上对样品用量少、可快速出结果、灵敏度高、定量准确、价格低廉的多项目联合检测的微流控化学发光检测技术和产品。
发明内容
(一)要解决的技术问题
鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种微流控超敏化学发光定量检测生物分子的装置，该装置结构简单、成本低廉、易于操作，可对单一样品中蛋白质、多糖、多肽、维生素、核酸或其他具有生物活性的分子，如抗生素、激素或药物分子等，进行多项目联合定性及定量检测，具有样品用量少、可快速出结果、灵敏度高、定量准确、检测灵活度高等优点。本发明还涉及采用所述装置进行生物分子化学发光定量检测的方法。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
第一方面，本发明提供一种微流控超敏化学发光定量检测生物分子的装置，其包括：微流控反应腔，在所述微流控反应腔中装载有至少一个固相载体；所述固相载体能够从所述微流控反应腔中移出；当所述微流控反应腔中装载有多个固相载体时，固相载体在微流控反应腔中以固定的顺序排布，不会随液体流动而打乱位序；所述固相载体与所述微流控反应腔的内壁之间构成液体流动微通道；
所述固相载体设有由若干凸起或凹陷所组成的3D微纳结构表面，所述3D微纳结构表面上修饰有能间接或直接结合靶标分子的功能基团；
所述3D微纳结构表面所固定的功能配基丰度是同等粒径的光滑固相载体的1000倍以上；其中，丰度是以氨基或羧基在固相载体上的最大载量来计。
其中，所述修饰方式包括化学偶联和物理吸附。
其中：所述固相载体通过蚀刻等表面处理技术形成所述3D微纳结构表面，使比表面积呈几个数量级增大，也使得3D堆叠微纳处理后微球表面所能承载的功能基团、抗体、抗原或核酸捕获探针的承载数量和密度也呈数量级倍增，可抓取结合更多靶标分子富集在毫米级3D微纳结构的固相载体上，从而使样品中的不同的待检物质富集在不同的毫米级的3D微纳结构的微球上，提高了检测灵敏度，实现了同一样品、在同一微流控反应器内实施多项目联合检测的目标。其中，蚀刻方法为采用化学蚀刻、等离子表面蚀刻或光刻机蚀刻等任何可以成数量级增加固相载体比表面积的蚀刻方法和表面处理方法。所述等离子表面蚀刻是利用等离子体生成用的高频电力从含有氢及氟的气体中生成等离子体，利用等离子体对固体球表面的氧化硅进行蚀刻。光刻机蚀刻的方法可参照芯片制造过程中的蚀刻方法。化学蚀刻方法通常会用到HF或硝酸和HF的混合物等。经过不同条件进行化学蚀刻后，采用AFM分析技术测试固相载体表面的平均粗糙度Ra值，Ra值从几个纳米到几百个纳米范围内分布，大多数分布在几十个纳米。
其中，经过蚀刻改造的3D微纳结构的每一个固相微球都是一个独立的反应体，且都可以通过偶联了特异性的抗体、抗原、探针等配体独立的捕获特定的待检物，从而实现对单一样品中蛋白质、多糖、核酸或其他具有生物活性的小分子进行单一或多项目联合定性及定量检测。
其中，所述靶标分子包括蛋白、糖蛋白、多肽、多糖、核酸(RNA或 DNA)、抗生素、维生素、激素、药物分子或其他有生物活性的小分子等。检测的样品包括全血、血清、血浆、唾液、尿液、脑脊液其它各种体液、鼻咽拭子提取液、粪便提取液、毛发提取液、食品残渣提取液以及其它各种样品提取液等。
根据本发明的较佳实施例，所述功能基团为羟基、羧基、氨基、醛基、琥珀酰亚胺酯基及磺酰基中的一种或多种；或者所述功能基团为由羟基、羧基、氨基、醛基、琥珀酰亚胺酯基及磺酰基中的一种或多种衍生出来的可偶联蛋白质、抗体、抗原、半抗原、多糖或核酸探针的化学基团。
根据本发明的较佳实施例，所述微流控反应腔包括第一端和第二端，所述第一端与吐吸驱动装置或循环驱动装置连接，所述第二端为开口端；利用吐吸驱动装置或循环驱动装置使液体试剂在微流控反应腔内往复流动，使液体试剂中的靶标分子与固相载体上的功能配基发生反应。优选地，所述微流控反应腔为类似tips形状的加样枪头。
根据本发明的较佳实施例，所述固相载体为固体球或固体柱。优选地，所述固相载体为固体球。固体球在液体样品的吐吸过程中，靶标分子与固体球上的捕获分子不断混合、结合、包括固体球的翻滚，其每个面和每个功能基团都有机会与液体样品的靶标分子或标记检测液中的标记分子快速接触并结合，提高检测效率和灵敏度。
根据本发明的较佳实施例，所述固体球直径为0.5-20mm，优选为 1-3mm。本申请中，光滑的定义是指固相载体或固体球表面没有3D微纳结构。
所述微流控反应腔的管内径略大于所述固体球的直径，使固体球能够顺利装载和取出，管内径不宜过大，否则容易导致装载在其内部的固体球在液体推动下发生排列顺序混乱的问题。
在固体球直径确定的情况下，通过3D微纳结构表面的浊刻修饰，使固体微球具有表面具有更大的粗糙度，更大的比表面积和更大的功能配基承载量。但3D微纳结构表面的浊刻修饰的平均粗糙度(Ra)也具有一定极限值，且在固体球直径确定的情况下，表面表面粗糙度越大通常来说线性范围也较宽，但我们实验发现粗糙度在一定的范围内在实施检测时会得到更好的信噪比、灵敏度和线性范围，并不是粗糙度越小或越大越好，过于小的粗糙度，过于密集的功能配基在结合大分子等靶体物质时，会产生一定的位阻效应，反而影响其检测灵敏度。因此，本发明限定固体微球的3D微纳结构表面的平均粗糙度Ra为10nm-10微米，优选为 50-500nm，更优选为52nm-200nm，65nm-200nm或75-100nm。试验数据证明，具有前述特征的3D微纳结构表面微球，应用在免疫化学发光检测试剂时，具有最规律的线性关系，较高灵敏度和信号值。在不同的应用场合，最优的平均粗糙度Ra不一定相同。
根据本发明的较佳实施例，所述固相载体表面修饰的功能基团为羟基、羧基、氨基、醛基、琥珀酰亚胺酯基及磺酰基中的一种或多种；或者是由前述基团中的任一种衍生出来的可偶联蛋白质抗体、半抗、多糖或核酸探针的化学基团。
根据本发明的较佳实施例，所述固相载体的材质为玻璃、石英、陶瓷或塑料等任何对生物分子和试剂表现惰性的固体材料。
在所述固相载体表面修饰功能配基的修饰方式包括化学偶联和物理吸附。当固相载体的材质为塑料/聚合物时，可通过物理吸附将抗体、抗原吸附包被到微球的表面。例如聚丙烯酰胺微球、聚苯乙烯微球、表面有葡聚糖包裹的微球、表面有琼脂糖包裹微球等。当然，固相载体的材质为塑料/聚合物时也可根据聚合物分子链上的基团属性采用化学修饰/衍生法连接活性化学基团。当固相载体的材质为玻璃、石英或陶瓷时，可以先将固体球置于含有浓硫酸和双氧水的改性液中浸泡处理，使固体球表面连接大量羟基；再利用该羟基作为基础基团，通过改性衍生出羧基、氨基、醛基、琥珀酰亚胺酯基、磺酰基、任何可直接或间接偶联蛋白质、多糖、半抗或核酸探针的化学基团。
第二方面，本发明提供一种微流控超敏化学发光定量检测生物分子的方法，其包括：
S1、将能够与不同靶标分子结合的捕获抗体或捕获抗原分别固定到不同的固相载体上；将固相载体按照其能够捕获的靶标分子的不同进行分组，每组包含至少1个固相载体；
S2、将固相载体装入所述微流控反应腔中，使来自同一组的固相载体在微流控反应腔相邻排列；
S3、将含有待测分子的液体样品流过所述微流控反应腔，与固相载体反应并被选择性地结合和富集到固相载体上；将含有探针分子的液体试剂流过所述微流控反应腔，探针分子与固相载体上富集的对应的待测分子特异性结合，以对该待测分子的进行标记；
S4、按顺序依次从微流控反应腔中取出所述固相载体，分别进行光学检测和分析。
第三方面，根据要检测的靶标分子不同，当待检测的靶标分子为抗体蛋白或抗原蛋白或抗原多肽时，还包括如下具体的检测步骤：
(1)、将能够与不同靶标分子结合的捕获抗体或捕获抗原分别固定到不同的固相载体上；将固相载体按照其能够捕获的靶标分子的不同进行分组，每组包含至少1个固相载体；
(2)、将固相载体装入所述微流控反应腔中，使来自同一组的固相载体在微流控反应腔相邻排列；
(3)、使含有靶标分子的液体样品流过所述微流控反应腔，各组固相载体所修饰的捕获抗体或捕获抗原与其对应的靶标分子的第一位点结合，从而在不同组的固相载体上捕获不同的靶标分子；
(4)、采用洗涤液对所述微流控反应腔进行洗涤，洗去未结合的非特异性的物质；
(5)、使含有探针分子的液体试剂流过所述微流控反应腔，各组固相载体上的靶标分子的第二位点与对应的探针分子结合；所述探针分子标记有化学发光信号物质；
(6)、将各组固相载体从微流控反应腔中取出，利用化学发光仪读取各组固相载体的光学信号的强度，计算液体样品中靶标分子的浓度；
其中，所述检测分子为标记有吖啶酯、或碱性磷酸酶AP或辣根过氧化氢酶HRP或其它任何化学发光信号物质的抗体或抗原。
或者，所述方法包括如下步骤：
步骤一、将能够与不同靶标分子结合的捕获抗体或捕获抗原分别固定到不同的固相载体上；将固相载体按照其能够捕获的靶标分子的不同进行分组，每组包含至少1个固相载体；
步骤二、将固相载体装入所述微流控反应腔中，使来自同一组的固相载体在微流控反应腔相邻排列；
步骤三、将含有靶标分子和检测分子的液体样品流过所述微流控反应腔，各组固相载体上所修饰的捕获抗体或捕获抗原与其对应的靶标分子或检测分子结合；所述检测分子标记有化学发光信号物质；所述靶标分子和检测分子为免疫竞争关系；
步骤四、采用洗涤液对所述微流控反应腔进行洗涤，洗去未结合的非特异性的物质；
步骤五、将各组固相载体从微流控反应腔中取出，利用化学发光仪读取各组固相载体的光学信号的强度，计算液体样品中靶标分子的浓度。
其中，所述检测分子为标记有吖啶酯、或碱性磷酸酶AP或辣根过氧化氢酶HRP或其它任何化学发光信号物质的抗体或抗原。
第四方面，本发明提供一种微流控超敏化学发光定量检测核酸的方法，当检测的核酸为RNA时，步骤如下：
步骤1、将能够与不同靶核酸杂交的特异性核酸捕获探针分别固定到不同的固相载体上；将固相载体按照其能够捕获的靶核酸的不同进行分组，每组包含至少1个固相载体；
步骤2、将固相载体装入所述微流控反应腔中，使来自同一组的固相载体在微流控反应腔相邻排列；
步骤3、将含有靶核酸的液体样品流过所述微流控反应腔，各组固相载体上的特异性核酸捕获探针与其对应的靶核酸杂交结合生成复合物；
步骤4、使用洗涤液流过所述微流控反应腔，洗涤除去非特异性干扰物，以分离提取出靶核酸RNA；
步骤5、使用含有RNA逆转录酶和底物的液体试剂流过所述微流控反应腔，在RNA逆转录酶、底物和特异性核酸捕获探针的共同作用下，在固相载体表面上生成双链核酸杂合分子cDNA：RNA，同时利用逆转录酶的RNAse-H的活性降解RNA，在固相载体表面保留了含有若干生物素分子(Biotin)的单链cDNA；所述底物为含有生物素分子的底物；
步骤6、使用含有标记了化学发光信号物质的链酶亲和素/亲和素/生物素抗体的液体流过所述微流控反应腔，使链酶亲和素/亲和素/生物素抗体与固相微球上单链cDNA分子中的生物素分子反应结合；
步骤7、使用洗涤液清洗所述微流控反应腔以洗涤去除非特异性干扰物和底物；
步骤8、将各组固相载体从微流控反应腔中取出，利用化学发光仪读取各组固相载体的光学信号的强度，计算液体样品中靶核酸的浓度；
在步骤5中，所述底物为dATP、dCTP、dGTP、dTTP等碱基混合物，其中部分碱基替换为生物素标记的碱基，如底物中的dCTP用biotin-dCTP 部分替代。在步骤6中，所述链酶亲和素(或亲和素或生物素抗体)标记有吖啶酯、或碱性磷酸酶AP或辣根过氧化氢酶HRP或其它任何化学发光信号物质。
第五方面，本发明提供一种微流控超敏化学发光定量检测核酸的方法，当检测的核酸为DNA时，步骤如下：
步骤①、将能够与不同靶核酸杂交的特异性核酸捕获探针分别固定到不同的固相载体上；将固相载体按照其能够捕获的靶核酸的不同进行分组，每组包含至少1个固相载体；
步骤②、将固相载体装入所述微流控反应腔中，使来自同一组的固相载体在微流控反应腔相邻排列；
步骤③、使用含有靶核酸的液体样品流过所述微流控反应腔，各组固相载体上的特异性核酸捕获探针与其对应的靶核酸杂交结合生成复合物；该液体样品预先经过加热、碱变性使双链核酸解旋；
步骤④、使用洗涤液洗涤所述微流控反应腔，以洗涤除去非特异性干扰物，分离提取出单链DNA；
步骤⑤、将含有DNA聚合酶和底物的液体试剂流过所述微流控反应腔，在DNA聚合酶、底物和特异性核酸捕获探针的共同作用下，经固相载体分离的靶核酸ssDNA分别转变成含有若干生物素分子的双链DNA 分子；所述底物为含有生物素分子的底物；
步骤⑥、使用含有标记了化学发光信号物质的链酶亲和素/亲和素/生物素抗体的液体试剂流过所述微流控反应腔，使链酶亲和素/亲和素/生物素抗体的液体与固相微球上双链DNA分子中的生物素分子反应结合；
步骤⑦、使用洗涤液洗涤所述微流控反应腔以去除非特异性干扰物和底物；
步骤⑧、将各组固相载体从微流控反应腔中取出，利用化学发光仪读取各组固相载体的光学信号的强度，计算液体样品中靶核酸的浓度。
其中，在步骤5或步骤⑤中，所述底物为dATP、dCTP、dGTP、dTTP 或dUTP的混合物，其中部分碱基替换为生物素标记的碱基；在步骤6 或步骤⑥中，所述链酶亲和素/亲和素/生物素抗体标记有吖啶酯、或碱性磷酸酶AP或辣根过氧化氢酶HRP或其它任何可以直接或间接产生化学发光信号物质。
(三)有益效果
本发明的微流控超敏化学发光定量检测装置具有如下优势：
(1)结构简单、体积小巧、易于制造、经济实用，适宜大范围推广。装置由微流控反应腔和若干固相载体组成，优选是玻璃微球、石英球或陶瓷球等。固相载体粒径为毫米级，相比具有复杂和精密流道和反应腔的微流控芯片，本发明的固体球非常易于生产，生产工艺不需要昂贵的仪器和设备，因此造价低廉、质量可控。固相载体可使用成熟的光刻、等离子蚀刻或简单的化学蚀刻(酸碱蚀刻)，在廉价易得的玻璃微球(柱) 表面进行蚀刻改造，以形成由凸起或凹陷组成的3D微纳结构表面，经改造后，单个微球比表面积产生百倍或千倍增大，大大提高了单个固相载体表面功能配基的载量和丰度，可抓取更多靶标分子并富集在单个毫米级固相载体上，增强检测信号，提高检测灵敏度。
(2)检测过程简单、易于操作、适于机器人进行检测实验，并能够实现同意一样品中多靶标分子的联合检测。在使用本发明装置过程中，由于多个毫米级的固相载体装载在微流控反应腔中，微流控反应腔可为一种加样枪头(类似于Tips形状)，其下端可插到孔板的反应孔中吸吐液体，固体微球在液体流动过程中不断微滚动，其每个面和位点都有机会与液体样品中的靶标分子或标记检测液接触并结合，可提高反应速度和检测灵敏度。相比传统的微流控芯片只能静态反应来说，本发明可以提高固相载体对液体试剂中靶标分子的结合率。
固相载体为毫米级，在反应腔中不会随着液体试剂流动而改变排位顺序，因此在对液体试剂中多靶标分子进行联检时，可从反应腔中依序取出一个具有已知结合功能的微球(该微球的功能配基为预知的，因此其能够选择性结合何种靶标分子亦为预知)，依次采用化学发光仪读取光学信号，根据光学信号对液体样品中的生物分子进行定性或定量检测。
(3)使用灵活。将微流控反应腔(加样枪头)和若干修饰有各种不同功能配基的固相载体进行组合销售。使用者可根据需要检测的可能的靶标分子或靶核酸进行随意组合，将修饰有相应配基的固相载体依照顺序装载到加样枪头中以形成一个主动式微流控反应器，通过加样枪头吐吸液体完成靶标分子/靶核酸的提取分离和化学发光标记物的连接反应，反应结束后，将固相载体从加样枪头中取出进行光学检测，实现生物分子进行定性或定量检测。因此，本发明的装置易于操作且检测灵活度高。
(4)本发明的装置可对单一样品中蛋白质、多糖、核酸或其他具有生物活性的小分子进行多项目联合定性和定量检测、所需样品少且检测效率高。能检测的靶标分子包括蛋白质、多糖、核酸或有生物活性的小分子等，特别适合对各种生物标志物，多种微生物的多项目早期准确诊断的联合检测。检测样品包括全血、血清、血浆、唾液、尿液、脑脊液其它各种体液、鼻咽拭子提取液、粪便提取液、毛发提取液、食品残渣提取液以及其它各种样品提取液等。本发明的装置以简单方式实现了超高灵敏度的多项目联合检测。
(5)可快速出结果、灵敏度高。本发明的装置能以超高的灵敏度和极低的成本应用于蛋白质、小分子抗原以及核酸的化学发光检测。经实验验证，检测灵敏度完全可替代现有的磁珠免疫化学发光的传统方法，并实现了对同一样品在同一微流控反应器内多项同时联合检测，其检测效率比现有磁珠化学发光检测效率提高了5-10倍；相对检测时间缩短了 5-10倍以上(由于实现了多项目联合检测，对同一份样品来说，检测1 个项目与检测10个项目出结果的时间几乎相同)，检测成本大幅降低。且多项目联合检测所需要的样品量也只是原来N多个项目单独检查时所需样品的1/N或更少，因此可以采用更少的样品量同时得到多项目标检测结果；通过多项目联合检测，可实现平均每分钟完成一个项目的定量检测(1.0test/min)。
在应用于蛋白质检测时，发明人惊讶地发现，一些实施方式中，灵敏度可以达到Ipg/mL；在另一些实施方式中，基于同一样品多项目联合检测所得到的结果与单独检测所得到的结果并无差异；在一些小分子实施方式中，灵敏度甚至可以达到100fg/mL水平。此外，本发明能够在保证较高检测灵敏度的基础上以较短的时间(仅用数分钟的孵育时间)实现多项目联合检测，从而大大地缩短临床上的检测时间，特别符合急诊，ICU 门诊对快速检测周转时间短的要求。
(6)核酸检测时可避免气溶胶污染带来的检测误差。在应用于核酸检测时，本发明的装置及检测方法无需像传统核酸检测那样将待核酸扩增放大再检测，而是利用核酸探针分离靶核酸，并生成含有大量生物素分子的互补链来放大发光信号，其灵敏度被证明完全可以媲美传统的荧光定量PCR。由于不需要进行PCR扩增，简化了操作步骤，节约了检测时间，减少了环境被扩增产物气溶胶污染的风险。
本发明的检测装置及方法，不但适合POCT的现场、急诊单、多项目联合检测，同时对大规模筛查，多项目联合体检更具实用意义。
附图说明
图1为玻璃珠在蚀刻前的光面玻璃珠(a)，和蚀刻后具有3D微纳结构表面的玻璃珠(b)的照片。
图2A、图2B、图2C为AFM分析技术测试本发明采用化学蚀刻方式制备的11种玻璃微球表面的平均粗糙度Ra值。
图3为直径2.5mm不同3D微纳结构表面平均粗糙度(Ra)与免疫化学发光检测灵敏度的定标曲线对比图。
图4为采用本发明微流控定量检测装置进行免疫化学发光夹心反应法检测的原理图。
图5为采用本发明微流控定量检测装置进行免疫化学发光竞争法检测的原理图。
图6为采用本发明微流控定量检测装置进行免疫检测实施例1的实验结果图。
图7为采用本发明微流控定量检测装置进行免疫检测实施例2(联合检测人血清中cTnT/Myoglobin/CK-MB)的实验结果图。
图8A-8B为采用本发明微流控定量检测装置进行RNA检测的原理图。
图9A-9B为采用本发明微流控定量检测装置进行DNA检测的原理图。
图10为采用本发明微流控定量检测装置进行核酸检测实施例1(检测Flu-A)的实验结果图。
图11为采用本发明微流控定量检测装置进行核酸检测实施例2(检测Flu-B)的实验结果图。
图12为采用本发明微流控定量检测装置进行核酸检测实施例3(检测Covid-19RNA)的实验结果图。
图13为采用本发明微流控定量检测装置进行核酸检测实施例4(联检样品中Flu-A:Flu-B:Covid-19)的实验结果图。
图14为采用本发明微流控定量检测装置进行核酸检测实施例5(检测HBV-DNA)的实验结果图。
图15为使用11种不同平均粗糙度Ra的3D微纳结构表面链酶亲和素(或亲和素或生物素抗体)玻璃微球在用于检测PCT抗原标准品浓度的发光值。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
本发明检测技术平台的特点是：每一个毫米级的3D微纳结构的微球载体在微流控反应腔中都是一个独立的反应体，都可以单独的检测一个项目，也可以把多个微球放置在微流控反应腔中联合应用，实现对单一样品中多靶标的同时联合检测。
本发明微流控超敏化学发光定量检测装置的组装，主要包括四步处理：第一步，以微球或微柱为基础材料进行表面蚀刻，在表面形成由凸起和凹陷组成的3D微纳结构表面，该3D微纳结构表面使微球或微柱的比表面积比原几何表面积增大百倍以上。第二步，通过表面修饰，在固相载体的3D微纳结构表面连接大量的活性化学基团、抗体、抗原、核酸探针等。第三步，在固相载体表面包被(偶联)捕获抗体、抗原或核酸探针。第四步，准备微流控反应腔，微流控反应腔包括第一端和第二端，第一端能够与吐吸驱动装置连接，第二端为开口端，将固相载体装载到微流控反应腔且不会从开口端出来。固相载体按照装载顺序在所述微流控反应腔中以固定的顺序排布，固相载体与微流控反应腔的内壁之间构成液体流动通道，在液体往复流动时固相载体保持固定的排列顺序。
本发明的毫米级微球载体，相较于传统的微米级甚至纳米级磁珠而言，比表面积增大106倍以上，经过表面蚀刻后，比表面积增加了108倍以上，因此能够固定活性配基的数量也增大了108倍以上。此外，由于毫米级微球具有更大的比表面积，在结合相同靶标分子时，受到空间位阻制约更少一些，因而活性功能配基参与结合靶标分子的几率更大，结合能力更强。
单个固相微球的微纳结构都可通过偶联有单一或多种特异性抗体、抗原、探针等的配体，特异地捕获靶标分子，从而实现对单一样品中蛋白质、多糖、核酸或其他具有生物活性的小分子进行单一项目或多项目联合定性及定量检测，具有样品用量少、可快速出结果、灵敏度高、定量准确、检测灵活度高等优点。
以下以玻璃/陶瓷微球为基础材料为例进行说明。
第一步：以粒径0.5-20mm的毫米级玻璃/陶瓷微球为基础材料，采用蚀刻工艺对玻璃/陶瓷微球进行改造，以增加其有效表面积，使毫米级微球表面积结合更多的功能配基(活性化学基团、抗体、抗原、核酸探针等)，提高功能配基的数量和分布密度。改造方法包括但不限于化学蚀刻、等离子表面蚀刻或光刻机蚀刻等。等离子表面蚀刻是利用等离子体生成用的高频电力从含有氢及氟的气体中生成等离子体，利用等离子体对固体球表面的氧化硅进行蚀刻。光刻机蚀刻的方法可参照芯片制造过程中的蚀刻方法。化学蚀刻方法通常会用到HF，根据微球材质不同，蚀刻方法包括：
方法1：含有硅、氧化硅等的单晶硅或多晶硅，玻璃、陶瓷等都可以在硝酸和HF的混合物中进行3D微纳结构表面的蚀刻改造。蚀刻发生的反应为：首先HNO3在硅上形成一层二氧化硅，然后HF将这一层二氧化硅去掉。总的反应是：Si+HNO3+6HFH2→SiF6+HNO2+H2+H2O。
方法2：对二氧化硅玻璃微球、玻璃陶瓷等材质的微球通常是用不同浓度的HF来进行的。在室温下HF会和二氧化硅反应，而不会和硅反应。刻蚀的方程式如下：SiO2+6HF→H2+SiF6+2H2O。
如图1所示，为2.5mm玻璃珠在蚀刻前的光面玻璃珠(a)，和蚀刻后具有3D微纳结构表面的玻璃珠(b)的照片。蚀刻前，玻璃珠为透明球体，蚀刻后玻璃珠具有一定雾度，这是因为蚀刻后，玻璃珠表面形成了由若干三维立体凸起和/或凹陷形成的3D微纳结构，使得光线发生复杂的折射和漫反射，玻璃珠表面为雾面。经过蚀刻后，玻璃珠能负载的功能配基丰度可增大至少1000倍。
采用AFM分析技术测试本发明采用化学蚀刻方式制备的11种玻璃微球表面的平均粗糙度Ra值(如图2A-2C所示)，Ra值从几个纳米到几百个纳米范围内分布，大多数分布在几十个纳米。
除以上玻璃微球外，固相载体还可是石英、塑料不限于玻璃或塑料材料制成的球状物或小圆柱状体。球状物的(微球)优选微米级、毫米级；特别优选的是毫米级，在优选选择0.5-20mm，优选的是1-3mm。固相载体按照材质分类，可为聚合物，包括各种塑料，例如：PS，PC，PVC， PMMA等，但不限于以上材质的塑料、二氧化硅及复合物、硅及其复合物或它们的复合体，如：玻璃、石英等，尤其优选为氧化硅基质的玻璃、石英。聚合物微球可为聚丙烯酰胺微球、聚苯乙烯微球、表面有葡聚糖包裹的微球、表面有琼脂糖包裹微球等。
以往认为，毫米级的玻璃珠相对表面积小，结合(偶联)抗体/抗原等蛋白的分子少，相对而言检测范围狭窄，而通过表面蚀刻处理的的玻璃微球，极大地增加了毫米级玻璃微球的比表面积，解决了毫米级玻璃微球结合(偶联)抗体/抗原量少的问题，彻底解决了检测范围狭窄的问题。同时，发明人惊讶地发现，通过对玻璃微球3D堆叠微纳改造的固相载体，可以把微量的待检物富集在一个较小的毫米级固相载体的表面，同时在对微量蛋白质等的检测时，由于玻璃微球对极微弱光几乎没有遮挡光、淬灭光和吸收光效应，相比较于棕褐色、红棕色的磁珠，可以显著减少对微弱光着有着明显的遮挡和吸收光效应。实验验证，在进行免疫化学发光检测时，使用透明玻璃微球作为载体比使用磁珠作为载体，能够获得更为优异的灵敏度，提高了低含量靶标分子的检出率(降低检测极限)。
单个具有3D微纳结构表面的微球所固定的功能配基(如氨基或羧基)的数量可通过滴定-电导率进行测算。例如以直径2.5mm的具有3D 微纳结构表面的微球为例，测算表面固定的氨基数量，测算仪器为Mettler Toledo T5自动滴定仪，试剂包括0.1M盐酸溶液和0.05M NaOH溶液，测算包括如下步骤：
①在滴定杯中加入40mL实验室用水，以直测电导的模式测定电导10s，确认电导<4μS。如所测电导高于4μS则用实验室用水润洗测定杯直至所测实验室用水电导<4μS。
②倒掉滴定杯中的水，用吸水纸小心擦干搅拌子和滴定杯，电子天平中去皮，折合固含量后，称量100粒直径2.5mm的3D堆叠改造的氨基微球(2.03g)，加入滴定杯中。
③在电子秤上准确补加实验室用水至体系总水质量40g，注意在加水时用一次性滴管将滴定杯管壁粘附的液滴冲洗到测定液中，并搅拌、浸泡1小时使其达到电导测值稳定的状态。
④将滴定杯装置于滴定仪，用0.05M NaOH进行电导滴定，通过检测电导值判断滴定终点和突变点。
⑤待滴定结束后，输入微球质量并保存，随后根据滴定曲线的三切线交点计算所测氨基微球的表面氨基含量[单位为μmol/g]。
根据氨基摩尔量R(NH2)＝(C×ΔV)。C表示氢氧化钠的摩尔浓度，ΔV 表示滴定过程中，前后两次发生电导率突变对应的体积差。R(NH2)除以微球颗数(或克数)，即得到单颗微球表面氨基摩尔量(或每克微球的氨基载量)。按照该方法，2.5mm的具有3D微纳结构表面的微球经氨基修饰后，表面氨基载量约为120-188μmol/g(1g约对应50-54颗直径2.5mm 玻璃珠)。
虽然活性功能配基的载量在一定程度上影响着单个微球能够结合的靶标分子数量，但是靶标分子通常为蛋白质、多肽、核酸等较大分子，因此微球表面Ra若过小且活性功能配基的分布过于密集，也会因空间位阻等原因导致一些活性功能配基无法结合靶标分子。本发明的微球为毫米级，相对微米级或纳米级磁珠而言，可大大减少因空间位阻带来的“结合抑制”作用，尽量发挥各功能配基的捕捉能力。经实验对比发现，1颗直径2.5mm的3D堆叠结构的玻璃微球，其抗体偶联结合量大约相当于直径2.7微米的磁微粒0.06mg(大约350万到450万粒磁珠)，相当于直径1.0微米的磁微粒0.025mg(约800万到1100万粒磁珠)。换句话说，1颗直径2.5mm的3D堆叠结构的玻璃微球可取代350万到450万个2.7 微米的磁珠，进行靶抗体分子的偶联结合实验。
第二步：在微球的3D微纳结构表面修饰活性功能配基。修饰方法根据所连接的目标功能配基的不同，修饰方法也不同。通过表面修饰在固相载体上连接能够与蛋白，核酸进行共价偶联的活性官能团，例如羟基、羧基、氨基、醛基、琥珀酰亚胺酯基、磺酰基(如甲苯磺酰基)及它们的衍生基团中的一种或多种。按照固相载体上活性化学基团、抗体、抗原、核酸探针的固定方式不同，可分为物理吸附性固相载体和化学偶联性固相载体。对于玻璃、含氧化硅陶瓷、石英等材质，主要是通过化学修饰的方式连接活性功能配基，而塑料、聚合物等则主要是通过物理吸附的方式包被活性功能配基。
在实际生产过程中，既可按照现有常规方法进行修饰，也可参照如下方法进行修饰：(以下实施案例以直径2.5mm的玻璃微球为例。)
①羟基化：将上述3D微纳结构表面改造的玻璃微球5000粒加入 100mL的(98％H2SO4:30％H2O2＝70:30)溶液，室温浸泡120min，玻璃微球用大量去离子水漂洗，直至水的pH无变化，用100％酒精脱水，氮气吹干，得到表面修饰有丰富羟基的玻璃微球，干燥保存。
②氨基化：将上述羟基化的玻璃微球5000粒浸入25μM(3-氨丙基) 三乙氧基硅烷(APTES)500mL的甲醇溶液中，50度搅拌反应4h，将温度降至室温搅拌过夜。将上述玻璃微球用500mL的甲醇洗涤3次。氮气中吹干，得到表面修饰有丰富氨基的玻璃微球，氮气中避光保存。
③羧基化：将上述3D微纳结构表面改造的氨基化玻璃微球5000粒浸入到400mL的N，N-二甲基酰胺溶液中，再加入终浓度为20％的丁二酸酊；60度水浴摇床反应18h；弃上清，用乙醇洗净3次，再将微球浸泡在20％的乙酸酐中，30度条件下反应过夜，封闭掉未反应的氨基；用 5％的醋酸对上述3D微纳结构表面改造的玻璃微球洗涤2遍，蒸馏水洗涤2遍，再用50度风干，得到表面修饰有丰富羧基的玻璃微球，避光干燥保存。
④醛基化：将上述3D微纳结构表面改造的氨基化玻璃微球100粒浸泡在15mM的对苯二甲醛的100mL的丙酮溶液中，室温60min，取出后用去离子水摇床上漂洗2次，然后用氮气吹干室温避光、干燥、保密封存该醛基化的玻璃微球。
⑤丙烯酰亚胺化(-SMCC)：将上述3D微纳结构表面改造的氨基化玻璃微球100粒浸泡在50mM PBS，pH8.0，100mL的缓冲液中，加入100 毫克的磺胺-SMCC(TCI)，混合并在室温下反应160min。用100mM Tris-HCl pH8.0的缓冲液浸泡60min，再用相同的缓冲液洗涤上述玻璃微球3次。氮气吹干，避光干燥保存。
⑥双环氧化合物(-Epoxy)：将上述羟基化的玻璃微球100粒浸泡在含有1.5克硼氢化钠的100mL的0.6N NaOH溶液中，在搅拌中慢慢加入 15毫升1，4-丁二醇二甘油醚，25度，持续搅拌10h，用100mL的水洗涤5遍，用30％的乙醇，100mL洗涤1次，每次10min，用70％的乙醇， 100mL洗涤1次，每次10min，用100％的乙醇，100mL洗涤1次，每次 10min，用100mL的水洗涤5遍，用氮气吹干室温避光、干燥、保密封存该双环氧化的玻璃微球。
第三步：在固相载体表面包被(偶联)捕获抗体、抗原或核酸探针。
(1)在固相载体表面包被(偶联)捕获抗体、抗原，使本发明装置适宜检测试样中的蛋白质(抗体或抗原)
捕获抗体、抗原通过物理吸附或化学修饰的方式直接地固定在固相载体表面，或通过生物素-链霉亲和素体系，二抗体系或其它方式将抗体、抗原等间接地与固相载体连接。
所述捕获抗体按照抗体特异性分类，可以为多克隆抗体和单克隆抗体中的一种或两种。所述捕获抗体按照来源分类，可以为鼠源抗体、兔源抗体、羊源抗体以及羊驼源抗体中的一种或多种。具体而言，例如：南京金斯瑞单克隆抗体CK-MB mAb 8D8，CK-MB mAb 1F7；杭州博岳生物单克隆抗体Myo-101，Myo-102；PCT-101、PCT-102；cTnT-101、 cTnT-102.等。
所述检测分子(抗体)按照抗体特异性分类，可以为多克隆抗体和单克隆抗体中的一种、两种或多种。所述检测分子按照来源分类，可以为鼠源抗体、兔源抗体、羊源抗体以及羊驼源抗体中的一种或多种。具体而言，例如：厦门同仁心生物单克隆抗体E16H8、M6C5，南京金斯瑞单克隆抗体8D8，1F7；杭州博岳生物单克隆抗体Myo-101，Myo-102等。检测分子按照检测抗体来源分类，可为鼠抗体、兔抗体、羊抗体以及羊驼抗体中的一种或多种。
(2)在固相载体表面包被(偶联)核酸捕获探针，使本发明装置适宜检测试样中的核酸(RNA或DNA)
捕获探针固定在固相载体表面，并且能够与靶标核酸分子(也称为待测分子)的第一个结合位点特异性地杂交结合，使其从样品中分离。核酸捕获探针通过物理吸附或化学修饰的方式直接地固定在固相载体表面，或通过地高辛-地高辛抗体；生物素-链霉亲和素体系；或其它化学偶联方式将捕获探针直接或间接地与固相载体连接。
核酸检测探针是通过逆转录酶Reverase transcriptase将含有生物素 (biotin-dNTP)的底物分子掺入第一条合成的cDNA实现的。核酸信号探针是能够产生化学发光信号的，标记有吖啶酯、酶等物质的亲和素 (avidin)或链酶亲和素(Streptavidin)或生物素抗体。链酶亲和素可与生物素相结合，将能够产生化学发光信号连接到cDNA上。可检测的靶标分子包括各种RNA，单链DNA(ssDNA)，或经过热变性，或碱变性后得到的单链DNA，或者是经过酶促反应生成的RNA或DNA。
第四步：根据需要检测的可能的靶标分子或靶核酸进行随意组合，将修饰有相应功能配基/抗体/抗原/核酸探针等的多个固相载体依照顺序装载到加样枪头中以形成一个主动式微流控反应器，通过加样枪头状微流控反应器的吐吸液体完成靶标分子/靶核酸的提取分离和化学发光标记物的连接反应，反应结束后，将固相载体从加样枪头中取出进行光学检测，实现生物分子进行定性或定量检测。
本发明的微流控超敏化学发光定量检测装置能够检测的靶标分子或靶标物质包括蛋白质、多糖或有生物活性的小分子及小分子与蛋白质的复合物。例如：cTnl抗原、IL-6抗原、PCT(降钙素原)抗原、Nt-proBNP (脑自然肽氨基端前体蛋白)抗原、三碘甲腺原氨酸(T3)、四碘甲腺原氨酸(T4)、肿瘤标志物、维生素D、维生素B、叶酸、维生素D(2/3) -BSA复合物、叶酸-BSA复合物、细菌以及病毒等的检测。
本发明的微流控超敏化学发光定量检测装置也可以用来检测核酸。例如：RNA(如：甲流、乙流病毒的RNA)，DNA(如：HBV病毒DNA) 等。
以直径为2.5mm的链酶亲和素(或亲和素或生物素抗体)修饰的玻璃微球，研究玻璃微球3D微纳结构表面的平均粗糙度(Ra)与免疫化学发光检测灵敏度、线性范围之间的关系。实验涉及的其他信息如表1：
表1：
项目名称 PCT
仪器名称 SMART 6500
底物液批号 A:20211005；B：20210915
洗涤液批号 20211015
抗体稀释液 50mM PB pH6.8，1％BSA，0.1％ProClin 300
反应模式 样品：20μL；试剂-1:100μL；试剂-2：100μL
一抗Biotin标记物 0.5μg/mL PCT201,0.25μL-B Lot：20211005
二抗吖啶酯标记物 0.5μg/mL PCT202,3μL吖啶酯Lot：20211025
实验操作过程为：
(1)取一抗biotin标记物20μL，加入到10mL抗体稀释液中，混匀后得到应用浓度试剂-1；取二抗吖啶酯标记物20μL，加入到10mL抗体稀释液中，混匀后得到试剂-2(R2)；
(2)向每个链酶亲和素(或亲和素或生物素抗体)玻璃微球(璃微球直径2.5mm)加入100μL应用浓度试剂-1，室温孵育10min，弃上清，形成试剂-1(R1微球)；
(3)向步骤(2)所得的R1微球中加入20μL样本，吸取试剂-2(R2) 150μL，37℃吐吸混匀反应10min。
(4)在洗涤孔中吐吸洗涤5次，取出固相载体微球，放入反应杯中。
使用smart6500仪器，向反应杯中加入100μL底物A(0.1M硝酸、 0.05双氧水)，随后加入100μL底物B(0.25M NaOH、0.5％曲拉通-100) 并读取发光值，记录发光值如图15所示。
如图15所示，其中浓度值是被检样品(PCT)抗原的浓度值，S01-S11 代表图2A-2C所示的11种不同平均粗糙度Ra的3D微纳结构表面链酶亲和素(或亲和素或生物素抗体)玻璃微球在用于检测PCT抗原标准品浓度曲线时的反应度。
根据以上实验结果制作定标曲线对比图(如图3所示，其中S01-S11 代表图2A-2C所示为直径2.5mm，11种不同平均粗糙度Ra的3D微纳结构表面链酶亲和素(或亲和素或生物素抗体)玻璃微球，横坐标ng/mL 是被检抗原PCT标准品的浓度单位：ng/mL＝纳克/毫升)。由图3可知，玻璃微球平均粗糙度(Ra)在S08-S10时，有较好的线性关系，表现出低噪声，高信号值和高灵敏度。因此，应用在免疫化学发光检测试剂时，玻璃微球表面3D微纳结构表面平均粗糙度(Ra)选择在52nm-200nm之间，优选是65nm-200nm，更优选为75-100nm。
本发明的微流控超敏化学发光检测装置进行免疫检测和核酸检测，以下分别结合原理及实施例说明将本发明检测装置在免疫检测和核酸检测的具体应用方法和应用效果。实施例中使用的微流控反应腔为一种Tips 加样枪头。
免疫检测
免疫检测根据不同的检测机制，检测方法分为免疫化学发光夹心反应法和免疫化学发光竞争抑制法。
第一种：免疫化学发光夹心反应法的检测方法如下，原理参见图4 所示：
步骤一、将能够与不同靶标分子结合的捕获抗体或捕获抗原分别固定到不同的固相载体上；
步骤二、将固相载体装入所述微流控反应腔中；
步骤三、将微流控反应腔的下开口端插入到含有靶标分子的液体样品中，利用吐吸驱动装置使液体样品在微流控反应腔内往复流动，各固相载体上的捕获抗体或捕获抗原与其对应的靶标分子的第一位点结合，从而在不同固相载体上捕获不同的靶标分子；
步骤四、将微流控反应腔的下开口端插入到洗涤液中，利用吐吸驱动装置使洗涤液在微流控反应腔内往复流动洗去未结合的非特异性的物质；
步骤五、将微流控反应腔的下开口端插入到含有检测分子的液体试剂中，利用吐吸驱动装置使液体试剂在微流控反应腔内往复流动，各固相载体上的靶标分子的第二位点与对应的检测分子结合；所述检测分子标记有化学发光信号物质；
步骤六、将各固相载体从微流控反应腔中取出，利用化学发光仪读取各固相载体的光学信号的强度，计算液体样品中靶标分子的浓度。
第二种：免疫化学发光竞争抑制法的检测方法如下，原理参见图5 所示：
步骤一、将能够与不同靶标分子结合的捕获抗体或捕获抗原分别固定到不同的固相载体上；
步骤二、将固相载体装入所述微流控反应腔中；
步骤三、将所述微流控反应腔的下开口端插入到含有靶标分子和检测分子的液体样品中，利用吐吸驱动装置使液体样品在微流控反应腔内往复流动，各固相载体上的捕获抗体或捕获抗原与其对应的靶标分子或检测分子结合；所述检测分子标记有化学发光信号物质；所述靶标分子和检测分子为免疫竞争关系；
步骤四、将所述微流控反应腔的下开口端插入到洗涤液中，利用吐吸驱动装置使洗涤液在微流控反应腔内往复流动洗去未结合的非特异性的物质；
步骤五、将各固相载体从微流控反应腔中取出，利用化学发光仪读取各固相载体的光学信号的强度，计算液体样品中靶标分子的浓度。
在进行免疫检测实验之前，可按照下述方法制备需要用到的包被(偶联)捕获抗体/抗原的固相载体及纯化标记检测物：
A、抗体、抗原与玻璃微球直接包被或偶联的方法：
①羧基化的3D微纳结构表面玻璃微球100粒(直径2.5mm)浸泡在 50mM MES pH6.0，50mL的缓冲液中，室温30min。
②加入新鲜配置的10mg/mL EDC 0.5mL，充分混匀，室温反应60min。
③用50mM PB pH 7.0的缓冲液洗涤2次，每次50mL。
④将选定的抗体、抗原溶解在50mM PB pH7.0的缓冲液中，抗体、抗原的终浓度20-50μg/mL，室温混匀反应过夜。
⑤将上述偶联有抗体的玻璃微球用1×PBS缓冲液洗涤一次。
⑥将上述玻璃微球用1％BSA-PBS缓冲液室温封闭过夜。
⑦将上述玻璃微球用PBS洗涤一次，干燥保存待用。
B、抗体与玻璃微球通过链酶亲和素(或亲和素或生物素抗体)进行间接连接的包被方法：
①羧基化的玻璃微球100粒浸泡在50mM MES pH 6.0，50mL的缓冲液中，室温30min。
②加入新鲜配置的10mg/mL EDC 0.5mL，充分混匀。室温反应60min。
③用50mM PB pH 7.0的缓冲液洗涤2次，每次50mL。
④将选定的链酶亲和素(或亲和素或生物素抗体)溶解在50mM PB pH7.0的缓冲液中，终浓度100μg/mL。室温混匀反应过夜。
⑤将上述偶联有链酶亲和素(或亲和素或生物素抗体)的玻璃微球用1×PBS缓冲液洗涤一次。
⑥将上述玻璃微球用1％BSA-PBS缓冲液室温封闭过夜。
⑦将上述玻璃微球用PBS洗涤一次。
⑧将标记有生物素(Biotin)的抗体，按0.01-1.0μg抗体/玻璃微球(每个项目有所不同，按实际需求调整其比例)混匀，室温混匀反应1h。
⑨用1×PBS缓冲液洗涤一次，并在37度负压抽干备用。
C、抗体、抗原的生物素标记纯化及试剂-1(R1)的制作方法：
①取400μL标记缓冲液(50mM PB，pH7.5)；1.0mg的抗体(5mg/mL) 200μL于2mLEP管中混匀；
②混匀10min之后加入20μL的Biotin-PEG4-NHS(5mg/mL)室温，继续混匀2h；
③取脱盐离心柱(5mL柱床体积)，将柱子置于一个收集管中；
④以100×g离心力离心1min去除储存液；
⑤向柱子中缓慢加入2mL，标记缓冲液50mM PB，pH7.5，以100×g 离心力离心1min，并重复两次；
⑥将柱子置于一个新的收集管中，去掉盖子并缓慢的将EP管中的样品加到压实的树脂中心；
⑦以100×g离心力离心2min收集样品；
⑧将收集的样品转移至15mL EP管中，加入200μL丙三醇，并迅速混匀，-20℃保存备用。
⑨将上述标记了Biotin的抗体抗原稀释到应用浓度，与上述“B”制备的玻璃微球-链酶亲和素(或亲和素或生物素抗体)按比例混匀反应1h，经PBS洗涤、干燥备用。
D、抗原、抗体吖啶酯的标记纯化方法：
①取400μL标记缓冲液(50mM PB，pH7.5)；1.0mg的抗体(5mg/mL) 200μL于2mLEP管中混匀；
②混匀10min之后加入80μL的吖啶酯-NHS 5mg/mL室温，继续混匀 2小时；
③取脱盐离心柱(5mL柱床体积)，将柱子置于一个收集管中；
④以100×g离心力离心1min去除储存液；
⑤向柱子中缓慢加入2mL，标记缓冲液50mM PB，pH7.5，以100×g 离心力离心1min，并重复两次；
⑥将柱子置于一个新的收集管中，去掉盖子并缓慢的将EP管中的样品加到压实的树脂中心；
⑦以100×g离心力离心2min收集样品；
⑧将收集的样品转移至15mL EP管中，加入200μL丙三醇，并迅速混匀，-20℃保存备用。
免疫检测实施例1
本实施例的主要目的是比较具有3D微纳结构表面的玻璃微球，微流控化学发光与传统磁微粒化学发光在灵敏度和线性范围方面的特性。实验中使用的玻璃微球直径为2.5mm，Ra＝83.6nm，功能配基：1.5-3.5μmol/ 粒微球。本实验说明见表2。
表2：
项目名称 PCT
仪器名称 SMART 6500
底物液批号 A:20211005；B：20210915
洗涤液批号 20211015
抗体稀释液 50mM PB pH6.8，1％BSA，0.1％ProClin 300
反应模式 样品：20μL；试剂-1:(微球1粒)；试剂-2：150μL
一抗Biotin标记物 0.5μg/mL PCT201,0.25μL-B Lot：20211005
二抗吖啶酯标记物 0.5μg/mL PCT202,3μL吖啶酯Lot：20211025
实验方法：
(1)按上述“B”和“C”的方法分别制备标记3D微纳结构微球-链酶亲和素微球和biotin-PCT抗体1；并按一定的应用抗体浓度与3D微纳结构微球-链酶亲和素微球预混合制成试剂-1。其中PCT的捕获抗体1的应用浓度为：Biotin-Ab1(杭州博岳生物，克隆#M201)，0.5μg/mL；将试剂 -1(3D微纳结构玻璃微球-链酶亲和素-Biotin-捕获抗体)固相复合物装入微流控反应腔(tips)中。
(2)试剂-2：按上述“D”的方法标记制备PCT-吖啶酯抗体2，吖啶酯抗体2的应用浓度为0.5μg/mL(杭州博岳生物，克隆#M202)。
(3)反应步骤如下：
吸取待检样品血清20μL，吸取试剂-2(R2)150μL，37℃吐吸混匀反应10min→在洗涤孔中吐吸洗涤5次→取出微球，移至PMT读取仪中，读取发光值→绘制标准曲线图，比较传统磁珠化学发光与3D微纳结构改性微球微流控化学发光在相同条件下的结果。
记录相同浓度值下分别使用直径1.0μm的磁珠(用量：0.025毫克/ 反应)，2.7μm磁珠(用量：0.06毫克/反应)和2.5mm的3D微纳玻璃微球制备的PCT试剂的发光值，结果见图6和表3：
表3：
PCT校准点浓度值ng/mL 1μm磁珠发光值 2.7μm磁珠发光值 2.5mm玻璃微球发光值
0.00 902 1,306 3,127
0.10 4,027 4,295 17,283
0.29 17,824 16,529 35,137
0.51 31,049 36,376 75,252
1.99 153,738 186,028 373,155
6.71 638,839 764,290 1,536,561
13.96 1,284,992 1,524,799 2,860,264
43.18 3,039,384 3,536,712 7,273,419
78.31 5,839,838 6,705,668 14,011,328
121.98 7,638,290 8,624,858 24,249,722
结果表明，直径2.5mm，3D微纳结构表面的微球，1粒玻璃微球相当于直径2.7微米的磁微粒大约350万到450万粒的抗体偶联载量(0.06mg 磁微粒)；相当于直径1.0微米的磁微粒大约800万到1100万粒的抗体偶联载量(0.025mg磁微粒)；而直径2.5mm且具有3D微纳结构表面的微球，一粒固相玻璃微球足以单独的对某一个靶标进行检测。
根据上述实验结果，整理1.0μm，2.7μm磁珠和具有3D微纳结构表面的玻璃微球在免疫化学发光定标曲线斜率上的对比。由实验结果图6 可知，具有3D微纳结构表面的玻璃微球信号值高于传统磁珠定标的信号值；玻璃微球信号值低端信噪比优于传统磁珠；玻璃微球高端斜率比优于传统磁珠，使用玻璃微球有更好的灵敏度和线性范围。
免疫检测实施例2
本实施例的主要目的是比较本发明微流控超敏化学发光定量检测装置在联合检测人血清中cTnT/Myoglobin/CK-MB分子与市售检测试剂(罗氏试剂盒分别检测)的检测性能。实验中使用的玻璃微球直径为2.5mm，微球与实施例1相同。实验方法如下：
(1)3D堆叠结构链酶亲和素微球按上述“B”的方法制备。
(2)试剂1按上述“C”的方法分别标记制备：biotin-cTnT抗体1， biotin-Myoglobin抗体1，biotin-CKMB抗体1，按一定比例分别与上述不同的3D堆叠结构链酶亲和素微球预混制备得到3D堆叠微球-cTnT试剂 1、3D堆叠微球-Myoglobin试剂1、3D堆叠微球-CKMB试剂1；
(3)试剂2的制备按照步骤“D”分别制备：cTnT-吖啶酯抗体2； Myoglobin-吖啶酯抗体2；CKMB-吖啶酯抗体2，并把每种抗体按最终应用浓度稀释、混合在一起制成试剂2。
反应步骤：
①把3D微纳微球-cTnT试剂1；3D微纳微球-Myoglobin试剂1； 3D微纳微球-CKMB试剂1按顺序预装入tips头状微流控反应器中(见图 -4或图-5中，加样头状“微流控反应器”)。
②吸取样品稀释缓冲液70ul,待检样品80ul，37℃吐吸混合反应10分钟，弃反应液，并在洗涤液中吐吸洗涤1次上述微流控反应器中的 3D微纳微球-(试剂1-抗体-抗原复合物)；洗去非特异性干扰物。
③把上述tips头状微流控反应器移至预混合的试剂-2(cTnT-吖啶酯抗体2+Myoglobin-吖啶酯抗体2+CKMB-吖啶酯抗体2)反应孔中并吸取试剂-2，150微升，37℃混合吐吸反应5分钟；弃反应液，并在洗涤液中吐吸、洗涤3次上述微流控反应器中的混合3D堆叠微球-(试剂1-抗体- 抗原-试剂2复合物)，洗去非特异性干扰物。
④按序取出(3D堆叠微球-抗体1-抗原-抗体2)固相载体，放入检测杯中，加底物1，把检测杯移至Smart6500化学发光读取仪中，加底物2，读取发光值→绘制标准曲线图，比较市售磁珠化学发光试剂盒与本发明使用具有3D微纳结构表面的玻璃微球的微流控化学发光三联检的检测相关结果。其中，罗氏试剂盒的检测方法参见罗氏试剂盒及罗氏 Cobs-e411仪器使用说明书执行。
本实验抗体来源及克隆号：cTnT-配对抗体:杭州博岳生物cTnT M101 &M102；Myo-配对抗体:杭州博岳Myo-101&Myo-102；CK-MB配对抗体:南京金斯瑞8D8&1F7
比较在同一份样品中3联检cTnT、Myoglobin、CKMB与罗氏电化学发光试剂检测结果的比较。30例样品结果比较图；对照试验所用仪器：罗氏化学发光检测仪，Cobas-e411；自研3联检所用仪器：重庆科斯迈化学发光检测仪：Smart-6500。实验结果如图7所示及表4所示。
表4：
Figure BDA0003865086630000291
由图7及表4结果可知，从30例检测样本中三个检测指标(cTnT、 Myoglobin、CKMB)联合检测的结果和罗氏试剂盒分别检测的结果具有良好的相关性。
核酸检测
核酸检测根据检测的靶核酸为RNA和DNA，检测方法和流程不同。靶核酸为RNA的检测原理参见图8A-8B所示。靶核酸为DNA的检测原理参见图9A-9B所示。
靶核酸为RNA的检测方法流程如下：
步骤1、将能够与不同靶核酸杂交的特异性核酸捕获探针分别固定到不同的固相载体上。
步骤2、将固相载体装入所述微流控反应腔中。
步骤3、将所述微流控反应腔的下开口端插入到含有靶核酸的液体样品中，利用吐吸驱动装置使液体样品在微流控反应腔内往复流动，各固相载体上的特异性核酸捕获探针与其对应的靶核酸在一定的温度下杂交结合生成复合物。
步骤4、将所述微流控反应腔的下开口端插入到洗涤液中，利用吐吸驱动装置使洗涤液在微流控反应腔内往复流动，洗涤除去非特异性干扰物，分离提取出靶核酸RNA。
步骤5、将所述微流控反应腔的下开口端插入到含有RNA逆转录酶和底物的液体试剂中，该底物为含有生物素的底物；利用吐吸驱动装置使液体试剂在微流控反应腔内往复流动，在RNA逆转录酶、底物和特异性核酸捕获探针的共同作用下，在固相载体表面上生成双链核酸杂合分子cDNA：RNA，同时逆转录酶的RNAse-H的活性降解RNA，在固相载体表面保留多个掺入了若干生物素分子的单链cDNA。所述底物为dATP、 dCTP、dGTP、dTTP等碱基混合物，其中部分碱基替换为生物素标记的碱基，例如底物中的dCTP用biotin-dCTP替代。
步骤6、将所述微流控反应腔的下开口端插入到含有标记了化学发光信号物质的链酶亲和素(或亲和素或生物素抗体)的液体试剂中，利用吐吸驱动装置使液体试剂在微流控反应腔内往复流动，使链酶亲和素(或亲和素生物素抗体)与固相微球上单链cDNA分子中的生物素分子反应结合。所述链酶亲和素(或亲和素或生物素抗体)标记有吖啶酯、或碱性磷酸酶AP或辣根过氧化氢酶HRP或其它任何化学发光信号物质。
步骤7、将所述微流控反应腔的下开口端插入到洗涤液中，利用吐吸驱动装置使洗涤液在微流控反应腔内往复流动以洗涤去除非特异性干扰物和底物。
步骤8、将各固相载体从微流控反应腔中取出，利用化学发光仪读取各固相载体的光学信号的强度，计算液体样品中靶核酸的浓度。
靶核酸为DNA的检测方法流程如下：
步骤1、将能够与不同靶核酸杂交的特异性核酸捕获探针分别固定到不同的固相载体上。
步骤2、将固相载体装入所述微流控反应腔中。
步骤3、将所述微流控反应腔的下开口端插入到含有靶核酸的液体样品(该液体样品预先经过加热和碱处理，使双链核酸解旋)中，利用吐吸驱动装置使液体样品在微流控反应腔内往复流动，各固相载体上的特异性核酸捕获探针与其对应的靶核酸在一定温度下杂交结合生成复合物。
步骤4、将所述微流控反应腔的下开口端插入到洗涤液中，利用吐吸驱动装置使洗涤液在微流控反应腔内往复流动，洗涤除去非特异性干扰物，分离提取出靶核酸ssDNA。
步骤5、将所述微流控反应腔的下开口端插入到含有DNA聚合酶 (如：Bst-DNApolymerase)和底物的液体试剂中，该底物为含有生物素的底物；利用吐吸驱动装置使液体试剂在微流控反应腔内往复流动，在 DNA聚合酶、底物和特异性核酸捕获探针的共同作用下，经固相载体分离的靶核酸ssDNA分别转变成含有若干生物素分子的双链DNA分子。所述底物为dATP、dCTP、dGTP、dTTP或dUTP等碱基混合物，其中部分碱基替换为生物素标记的碱基，例如底物中的dCTP用biotin-dCTP替代。
步骤6、将所述微流控反应腔的下开口端插入到含有标记了化学发光信号物质的链酶亲和素(或亲和素或生物素抗体)的液体试剂中，利用吐吸驱动装置使液体试剂在微流控反应腔内往复流动，使链酶亲和素(或亲和素或生物素抗体)与固相微球上双链DNA分子中的生物素分子反应结合。所述链酶亲和素(或亲和素或生物素抗体)标记有吖啶酯、或碱性磷酸酶AP或辣根过氧化氢酶HRP或其它任何化学发光信号物质。
步骤7、将所述微流控反应腔的下开口端插入到洗涤液中，利用吐吸驱动装置使洗涤液在微流控反应腔内往复流动以洗涤去除非特异性干扰物和底物。
步骤8、将各固相载体从微流控反应腔中取出，利用化学发光仪读取各固相载体的光学信号的强度，计算液体样品中靶核酸的浓度。
在固相载体上偶联核酸捕获探针的方法可参照以下方法，为后续的核酸检测做好准备工作。
①制备表面含有BSA的3D微纳结构表面固相载体：
为了使3D微纳结构表面微球表面变的更亲水，减少玻璃微球表面对核酸的非特异性吸附将羧基玻璃微球表面偶联包裹一层亲水的BSA (BSA富含-NH2氨基和羧基-COOH，也可以是其它蛋白，糖类化合物等)。将表面带有羧基的直径2.5mm的3D微纳玻璃微球100粒浸泡在 50mMMES，pH 6.0，20mL的缓冲液中，室温浸泡10min；加入新鲜配置的EDC 1.0mg/mL，1mL，混匀，室温30min；用40mL，50mM pH 7.2 的PB洗涤一次。将溶解在pH 7.0，25mM磷酸盐缓冲液中的1mg/mL BSA， 10mL加到上述反应管中，室温混匀反应60min，然后用40mL，50mMpH 7.2的PB洗涤一次，室温干燥，4℃干燥密封保存待用。
②BSA-3D微纳玻璃微球上偶联核酸捕获探针的方法如下：
将上述直径为2.5mm的BSA-3D微纳玻璃微球100粒浸泡在50mM MES，pH 6.0，20mL的缓冲液中，室温浸泡10min；加入新鲜配置的EDC 1.0mg/mL，0.3mL，混匀，室温30min；用40mL，50mM pH 7.0的PB 洗涤一次。将溶解在10mL的50mM PB，pH 7.0缓冲液中，终浓度为1μM， 5’端含有氨基的靶核酸捕获探针(如：Flu-A: 5’-NH2-CAATACTAGTAGTTCTGCTA-3’)。加入上述②BSA-3D微纳玻璃微球中，并迅速混匀，室温混匀反应60min。用50mM PB pH 7.0的缓冲液洗涤2次，每次30mL。在上述(捕获探针-BSA-玻璃微球)中加入 1％BSA，1％鱼精DNA，4℃混合，封闭过夜。将上述封闭处理过的(捕获探针-BSA-玻璃微球)用50mL，1×PBS缓冲液洗涤一次，37℃干燥过夜，密封干燥保存待用。
③制作链酶亲和素(或亲和素或生物素抗体)吖啶酯信号探针：取400μL标记缓冲液(50mM磷酸盐缓冲液，pH8.0)；1.0mg的链酶亲和素(或亲和素或生物素抗体)(5mg/mL)200μL于2mLEP管中混匀。混匀10min之后加入80μL的吖啶酯-NHS 5mg/mL室温，继续混匀1小时。取脱盐离心柱(5mL柱床体积)，将柱子置于一个收集管中；以100×g 离心力离心1min去除储存液。向柱子中缓慢加入2mL，标记缓冲液50mM PB，pH8.0，以100×g离心力离心1min，并重复两次。将柱子置于一个新的收集管中，去掉盖子并缓慢的将EP管中的样品加到压实的树脂中心。 100×g离心2min收集样品。将收集的样品转移至15mL EP管中，加入 200μL丙三醇，并迅速混匀，-20℃保存备用。
检测样品：Flu-A；Flu-B；Covid-19 RNA，HBV-DNA标准参照品购自杭州博岳生物，核酸序列等详请参阅其说明书，Flu-A RNA参照品(货号：FluA-RNA-901)；Flu-B RNA参照品(货号：FLuB-RNA-901)； Covid-19 RNA参照品(货号：SC2N-RNA-901)；HBV-DNA DNA参照品(货号：HBV-DNA-901)。
核酸检测实施例1
本实施例采用微流控超敏化学发光定量检测装置进行Flu-A核酸检测。检测样品：Flu-A RNA HA gen标准参考品。Flu-A：标准参照物质，购自杭州博岳生物，Flu-A RNA参照品(货号：FluA-RNA-901)，浓度为：0.99×106copy/μL；将原始管Flu-A RNA参照品用灭菌的DEPC水做 10倍连续稀释，得到如下理论浓度0.99×105copy/μL；0.99×104copy/μL； 0.99×103copy/μL；0.99×102copy/μL；0.99×10copy/μL；0.99copy/μL；0.0 copy/μL(空白)。
Flu-A全名Influenza A virus(A/Sichuan/1/2009(H1N1))HA RNA sequence，其RNA序列见GenBank No.GQ166223.1。Flu-A捕获探针序列： 5’-NH2-CAATACTAGTAGTTCTGCTA-3’。检测方法如下：
(1)将试剂-1：参照上述“步骤②”将Flu-A捕获探针capture probe-1(序列：5’-NH2-CAATACTAGTAGTTCTGCTA-3’)偶联到3D微纳直径为 2.5mm，Ra大约70nm。
(2)试剂-2：逆转录酶【superscript SS IV，200u】50mM Tris-HC(pH8.3)， 75mMKCl，3mM MgCl2，10mM DTT，200μM dNTPs，20μM Biotin-dCTP。
(3)试剂-3：按上述“步骤③”制备吖啶酯信号探针，应用浓度为 0.25μg/mL。
(4)根据Flu-A核酸检测顺序：核酸的杂交提取分离→利用RT酶+底物(Biotin-dNTP、dNTP)，生成带有biotin的cDNA核酸产物→洗涤分离→信号探针的反应→再次洗涤分离→加化学发光底物→检测光信号的强度。实验步骤如下：
①吸取核酸提取液(硫酸铵:硫酸铵:50％，200mM EDTA，1M盐酸胍，250mM柠檬酸钠pH5.2)，20μL。
②吸取待检核酸样品180μL,50℃，吐吸混匀反应10min。(请注意：该步骤的功能是核酸提取、分离，可根据实际需求增加初始加样体积，提高检测样品中待检靶核酸的总拷贝数pies，从而提高检出率、灵敏度。)
③在洗涤液-1(硫酸铵:5g％，20mM EDTA，25mM柠檬酸钠pH6.5) 洗涤3次；在洗涤液-2(50mM Tris-HCl(pH 8.3)，30mM DTT，150mM KCl。)中吐吸洗涤1次。
④吸取试剂-2逆转录酶【superscript SS IV，200u】50mM Tris-HC(pH8.3)，75mMKCl，3mM MgCl2，10mM DTT，200μM dNTPs， 20μM Biotin-dCTP。150μL，50℃吐吸混匀反应，10min。
⑤在洗涤液-3(50mM Tris-HCl(pH 7.2)，150mM NaCl，0.1％TW-20) 中吐吸洗涤3次。
⑥吸取试剂-3(链酶亲和素吖啶酯信号探针)150μL，50℃吐吸混匀反应，10min。(注：此处的链酶亲和素为热稳定性链酶亲和素)
⑦在洗涤液-3中吐吸洗涤3次。
⑧取出微球，转移至PMT读取仪中，读取发光值。
⑨根据copy数-发光值绘制标准曲线图，如图10所示，为采用本发明的检测装置在检测数字PCR(ddPCR)标定的Flu-A RNA HA gen标准参考品(序列参见GenBankNo.GQ166223.1)的测试结果。实验表明该微流控化学发光核酸检测平台的灵敏度与ddPCR标定的标准参考品之间的量值关系。其灵敏度与传统的qPCR相当。
传统的qPCR荧光核酸检测法的灵敏度在20-200个copy/test左右。采用本发明的微流控检测装置及检测方法，方法的灵敏度可以检出 20-100copy/test，且在使用本发明的微流控检测进行检测时，检样品中核酸的分离、纯化、浓缩、检测步骤均在同一个装置内，其中待检样品分离纯化这一步的初始加样量可根据需求从10μL–100μL调整，因此可通过提高初始加样量来提高靶核酸样品的检出率、检测灵敏度，而增加初始加样量，完全可适用于本发明的检测装置和检测方法。然而，传统qPCR 核酸检测法的总反应体积一般为25-50μL，加样量一般不能超过总反应体积的1/10-1/5，限制了加入待检核酸样品的初始量，也限制了通过加入更多初始样品量来提高检测率、灵敏度的解决方案。另外，荧光定量qPCR 检测需要预先将待检测样品中的靶核酸分离、纯化、浓缩、解离等再进行荧光定量qPCR核酸检测，工序繁多，非常不适宜进行自动化检测。由此可见，采用本发明的检测装置和检测方法可以大大节省检测工序，提高检测效率，更加适宜采用自动化程序和机器人完成检测。
核酸检测实施例2
本实施例采用微流控超敏化学发光定量检测装置进行Flu-B核酸检测。检测样品：Flu-B RNA HA gen标准参考品。Flu-B：标准参照物质，购自杭州博岳生物，Flu-B RNA参照品(货号：FluA-RNA-901)，浓度为：1.04×106copy/μL；将原始管Flu-B RNA参照品用灭菌的DEPC水做 10倍连续稀释，得到如下理论浓度1.04×105copy/μL；1.04×104copy/μL； 1.04×103copy/μL；1.04×102copy/μL；1.04×10copy/μL；1.04copy/μL；0.0copy /μL(空白)。
Flu-B全名Influenza B virus(B/Hubei-Wujiagang/158/2009)，其RNA 序列见GenBank No.CY115383.1。Flu-B捕获探针序列：5’ -NH2-AAGGCAATAATTGTACTAC-3’。检测方法如下：
(1)将试剂-1：参照上述“步骤②”，将Flu-B捕获探针capture probe-1 (序列：5’-NH2-AAGGCAATAATTGTACTAC-3’)偶联到3D堆叠微纳直径为2.5mm的玻璃微球上(Ra大约70nm)。
(2)试剂-2：逆转录酶【superscript SS IV，200u】50mM Tris-HC(pH8.3)， 75mMKCl，3mM MgCl2，10mM DTT，200μM dNTPs，20μM Biotin-dCTP。
(3)试剂-3：按上述“步骤③”制备链酶亲和素吖啶酯信号探针，应用浓度为0.25μg/mL。
(4)根据Flu-B核酸检测顺序：核酸的杂交提取分离→利用RT酶+底物(Biotin-dNTP、dNTP)，生成带有biotin的cDNA核酸产物→洗涤分离→信号探针的反应→再次洗涤分离→加化学发光底物→检测光信号的强度。实验步骤如下：
①吸取核酸提取液(硫酸铵:硫酸铵:50％，200mM EDTA，1M盐酸胍，250mM柠檬酸钠pH5.2.)，20μL.
②吸取待检核酸样品180μL,50℃，吐吸混匀反应10min。(可根据实际需求增加初始加样体积，提高检测样品中待检靶核酸的总拷贝数，从而提高检出率、灵敏度。)
③在洗涤液-1(硫酸铵:5g％，20mM EDTA，25mM柠檬酸钠pH6.5) 洗涤3次；在洗涤液-2(50mM Tris-HCl(pH8.3)，30mM DTT，150mM KCl。) 中吐吸洗涤1次。
④吸取试剂-2逆转录酶【superscript SS IV，200u】50mM Tris-HC(pH8.3)，75mMKCl，3mM MgCl2，10mM DTT，200μM dNTPs， 20μM Biotin-dCTP。150μL，50℃吐吸混匀反应，10min。
⑤在洗涤液-3(50mM Tris-HCl(pH 7.2)，150mM NaCl，0.1％TW-20) 中吐吸洗涤3次。
⑥吸取试剂-3(链酶亲和素吖啶酯信号探针)150μL，50℃吐吸混匀反应，10min。(注：此处的链酶亲和素为热稳定性链酶亲和素)
⑦在在洗涤液-3中吐吸洗涤3次。
⑧取出微球，转移至PMT读取仪中，读取发光值。
⑨根据copy数-发光值绘制标准曲线图，如图11所示，为采用本发明的检测装置在检测数字PCR(ddPCR)标定的Flu-B RNA标准参考品 (序列参考：GenBank No.CY115383.1)的测试结果。实验表明该微流控化学发光核酸检测平台的灵敏度与ddPCR标定的标准参考品之间的量值关系。其灵敏度与传统的qPCR相当。
核酸检测实施例3
本实施例采用微流控超敏化学发光定量检测装置进行Covid-19核酸检测。检测样品：Covid-19标准参考品。Covid-19：标准参照物质，购自杭州博岳生物，Covid-19 RNA参照品(货号：FluA-RNA-901)，浓度为： 1.02×106copy/μL；将原始管Covid-19 RNA参照品用灭菌的DEPC水做10 倍连续稀释，得到如下理论浓度1.02×105copy/μL；1.02×104copy/μL；1.02×103copy/μL；1.02×102copy/μL；1.02×10copy/μL；1.02copy/μL；0.0copy /μL(空白)。新冠病毒SARS-CoV-2(Covid-19),GenBank NC_045512 核酸序列。
捕获探针Covid-19：5’-NH2-TTAGGCCTGAGTTGAGTCA-3’。检测方法如下：
(1)将试剂-1：参照上述“步骤②”，将Covid-19捕获探针capture probe-1 (序列：5’-NH2-TTAGGCCTGAGTTGAGTCA-3’)偶联到3D微纳结构，直径2.5mm的玻璃微球上(Ra大约70nm)。
(2)试剂-2：逆转录酶【superscript SS IV，200u】50mM Tris-HC(pH8.3)， 75mMKCl，3mM MgCl2，10mM DTT，200μM dNTPs，20μM Biotin-dCTP。
(3)试剂-3：按上述“步骤③”制备链酶亲和素吖啶酯信号探针，应用浓度为0.25μg/mL。
(4)根据SARS-CoV-2(Covid-19)核酸检测顺序：核酸的杂交提取分离→利用RT酶+底物(Biotin-dNTP、dNTP)，生成带有biotin的cDNA 核酸产物→洗涤分离→信号探针的反应→再次洗涤分离→加化学发光底物→检测光信号的强度。实验步骤如下：
①吸取核酸提取液(硫酸铵:硫酸铵:50％，200mM EDTA，1M盐酸胍，250mM柠檬酸钠pH5.2)，20μL。
②吸取待检核酸样品180μL、50℃，吐吸混匀反应10min。(可根据实际需求增加初始加样体积，提高检测样品中待检靶核酸的总拷贝数，从而提高检出率、灵敏度)
③在洗涤液-1(硫酸铵:5g％，20mM EDTA，25mM柠檬酸钠pH6.5) 洗涤3次；在洗涤液-2(50mM Tris-HCl(pH8.3)，30mM DTT，150mM KCl) 中吐吸洗涤1次。
④吸取试剂-2逆转录酶【superscript SS IV，200u】50mM Tris-HC(pH8.3)，75mMKCl，3mM MgCl2，10mM DTT，200μM dNTPs， 20μM Biotin-dCTP，150μL，50℃吐吸混匀反应，10min。
⑤在洗涤液-3(50mM Tris-HCl(pH7.2)，150mM NaCl，0.1％TW-20) 中吐吸洗涤3次。
⑥吸取试剂-3(链酶亲和素吖啶酯信号探针)150μL，50℃吐吸混匀反应，10min。(注：此处的链酶亲和素为热稳定性链酶亲和素)
⑦在在洗涤液-3中吐吸洗涤3次。
⑧取出微球，转移至PMT读取仪中，读取发光值。
⑨根据copy数-发光值绘制标准曲线图，如图12所示，为采用本发明的检测装置在检测数字PCR(ddPCR)标定的新冠病毒SARS-CoV-2 (Covid-19)标准参考品(GenBank NC_045512)的测试结果。实验表明该微流控化学发光核酸检测平台的灵敏度与ddPCR标定的标准参考品之间的量值关系。其灵敏度与传统的qPCR相当。
核酸检测实施例4
本实施例将购自杭州博岳生物的标准参考品Flu-A:Flu-B:Covid-19按体积比1:1:1混合作为样品测试本发明的定量检测装置的联检效果。
混合后的样品浓度为：(1.017×106copy/μL；1.017×105copy/μL； 1.017×104copy/μL；1.017×103copy/μL；1.017×102copy/μL； 1.017×101copy/μL)比较混合样品与单一样品的检出灵敏度。 Flu-A/Flu-B/Covid-19联合检测实验步骤如下：
①吸取核酸提取液(硫酸铵:硫酸铵:50％，200mM EDTA,1M盐酸胍， 250mM柠檬酸钠pH5.2.),20μL。
②吸取上述混合待检核酸样品180μL、50℃，吐吸混匀反应10min。 (可根据实际需求增加初始加样体积，提高检测样品中待检靶核酸的总拷贝数，从而提高检出率、灵敏度)
③在洗涤液-1(硫酸铵:5g％，20mM EDTA,25mM柠檬酸钠pH6.5) 洗涤3次；在洗涤液-2(50mM Tris-HCl(pH 8.3)，30mM DTT，150mM KCl) 中吐吸洗涤1次。
④吸取试剂-2逆转录酶【superscript SS IV,200u】50mM Tris-HC(pH8.3)，75mMKCl，3mM MgCl2，10mM DTT，200μM dNTPs， 20μM Biotin-dCTP。150μL,50℃吐吸混匀反应，10min。
⑤在洗涤液-3(50mM Tris-HCl(pH7.2)，150mM NaCl,0.1％TW-20) 中吐吸洗涤3次。
⑥吸取试剂-3(链酶亲和素吖啶酯信号探针)150μL,50℃吐吸混匀反应，10min。(注：此处的链酶亲和素为热稳定性链酶亲和素)
⑦在洗涤液-3中吐吸洗涤3次。
⑧按顺序取出微球(在同一个检测装置内，预装有3个直径为2.5mm 3D堆叠微纳玻璃微球，每个3D堆叠微纳玻璃微球上偶联有不同的捕获探针，用于捕获、检测不同的靶核酸。Ra大约70nm)，转移至PMT读取仪中，读取发光值。
⑨根据发光值，统计微流控核酸化学发光在相同条件下进行三项靶核酸(Flu-A:Flu-B:Covid-19)联合检测的结果，记录如表5和图13。
表5：
Figure BDA0003865086630000401
结合图13所示为发光强度-copy数，三条曲线基本为重合关系，这与样品是将标准参考品Flu-A:Flu-B:Covid-19按体积比1:1:1混合的已知情况相符，且三条曲线均表现出很宽的线性范围。由此说明，本发明的微流控超敏化学发光定量检测装置可以很好地应用于同一样品中多种靶核酸的定量检测。
核酸检测实施例5
检测样品：HBV-DNA标准参考品。
HBV-DNA：标准参照物质，购自杭州博岳生物，Covid-19 RNA参照品(货号：FluA-RNA-901),浓度为：1.0×106copy/μL；把原始管Covid-19 RNA参照品用灭菌的DEPC水做10倍连续稀释，得到如下理论浓度 1.0×105copy/μL；1.0×104copy/μL；1.0×103copy/μL；1.0×102copy/μL；1.0×10 copy/μL；1.0copy/μL；0.0copy/μL(空白)。Hepatitis B virus(strain ayw) 全基因组DNA序列(GenBank No.NC_003977.2)。捕获探针序列： HBV-DNA，5’-NH2-ATTCCACAACCTTCCACCAA-3’。
检测方法如下：
(1)把试剂-1：合成HBV-DNA捕获探针capture probe-1(核酸序列：5’-NH2-ATTCCACAACCTTCCACCAA-3’)按照上述准备工作中的“步骤②”偶联到直径为2.5mm的3D堆叠微纳玻璃微球上(Ra大约70nm)。
(2)吸取试剂-2:【Bst-DNA聚合酶50u，20mM Tris-HC(pH8.8)，10 mM KCl，10mM(NH4)2SO4,2mM MgSO4，0.1％Triton-X100,1mM DTT；200μM dNTPs，20μM Biotin-dCTP】。
(3)试剂-3(链酶亲和素吖啶酯信号探针)：按上述准备工作中的“步骤③”制备，其应用浓度为0.25μg/mL。
(4)HBV-DNA核酸检测的流程为：核酸的加热、碱变性，双链核酸解旋→核酸的中和杂交提取分离→利用Bst-DNA聚合酶+底物 (Biotin-dNTP、dNTP)，生成带有biotin的DNA核酸产物→洗涤分离→与信号探针的反应→再次洗涤分离→加化学发光底物，检测光信号的强度。实验操作顺序如下：
①吸取核酸提取液(5N NaOH,0.2M EDTA)，20μL。
②吸取待检核酸样品180μL、65℃，吐吸混匀反应10min。(可根据实际需求增加初始加样体积，提高检测样品中待检靶核酸的总拷贝数，从而提高检出率、灵敏度。)
③把上述反应装置及反应液一起转移至100μL的中和液中(100mM Tris-HCl(pH6.5)，30mM DTT，150mM KCl)中吐吸反应5min。
④在洗涤液-1(20mM Tris-HC(pH8.8)，10mM KCl， 10mM(NH4)2SO4,2mM MgSO4，0.1％Triton-X100,1mM DTT)中吐吸洗涤 3次。
⑤吸取试剂-2(Bst-DNA聚合酶50u，20mM Tris-HC(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4,2mM MgSO4，0.1％Triton-X100，1mM DTT；200μM dNTPs，20μM Biotin-dCTP。150μL,65℃吐吸混匀反应，10min。
⑥在洗涤液-2(50mM Tris-HCl(pH7.0)，150mM NaCl,0.1％TW-20) 中吐吸洗涤3次。
⑦吸取试剂-3(链酶亲和素吖啶酯信号探针)150μL,50℃吐吸混匀反应，10min。(注：实验中所用的链酶亲和素为热稳定性链酶亲和素)
⑧在洗涤液-2(50mM Tris-HCl(pH7.0)，150mM NaCl,0.1％TW-20) 中吐吸洗涤3次。
⑨取出微球，转移至PMT读取仪中，读取发光值。
⑩根据发光值，绘制浓度-发光值标准曲线图，实验结果如图14所示。
由图14可知，本发明化学发光定量检测装置用于检测液体样品中 HBV-DNA的浓度时，具有很高的灵敏度和很宽的线性范围。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (14)

1.一种微流控超敏化学发光定量检测生物分子的装置，其特征在于，包括：微流控反应腔，在所述微流控反应腔中装载有至少一个固相载体；所述固相载体能够从所述微流控反应腔中移出；当所述微流控反应腔中装载有多个固相载体时，固相载体在微流控反应腔中以固定的顺序排布，不会随液体流动而打乱位序；所述固相载体与所述微流控反应腔的内壁之间构成液体流动微通道；
所述固相载体设有由若干凸起或凹陷所组成的3D微纳结构表面，所述3D微纳结构表面上修饰有能间接或直接结合靶标分子的功能基团；
所述3D微纳结构表面所固定的功能配基丰度是同等粒径的光滑固相载体的1000倍以上；其中，丰度是以氨基或羧基在固相载体上的最大载量来计。
2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述靶标分子是蛋白、糖蛋白、多肽、多糖、核酸、抗生素、维生素、激素或药物分子；所述功能基团为羟基、羧基、氨基、醛基、琥珀酰亚胺酯基及磺酰基中的一种或多种；或者所述功能基团为由羟基、羧基、氨基、醛基、琥珀酰亚胺酯基及磺酰基中的一种或多种衍生出来的可偶联蛋白质、抗体、抗原、半抗原、多糖或核酸探针的化学基团。
3.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述修饰方式包括化学偶联和物理吸附。
4.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述微流控反应腔包括第一端和第二端，所述第一端与吐吸驱动装置或循环驱动装置连接，所述第二端为开口端；利用吐吸驱动装置或循环驱动装置使液体试剂在微流控反应腔内往复流动，使液体试剂中的靶标分子与固相载体上的功能配基发生反应。
5.根据权利要求4所述的装置，其特征在于，所述微流控反应腔为加样枪头。
6.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述固相载体为固体球或固体柱。
7.根据权利要求6所述的装置，其特征在于，所述固体球直径为0.5-20mm。
8.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述固相载体的3D微纳结构表面的平均粗糙度Ra为10nm-10微米。
9.根据权利要求1或6-8任一项所述的装置，其特征在于，所述固相载体的材质为玻璃、石英、陶瓷或有机聚合物。
10.一种利用权利要求1-9任一项所述的装置进行生物分子检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将能够与不同靶标分子结合的捕获抗体或捕获抗原分别固定到不同的固相载体上；将固相载体按照其能够捕获的靶标分子的不同进行分组，每组包含至少1个固相载体；
S2、将固相载体装入所述微流控反应腔中，使来自同一组的固相载体在微流控反应腔相邻排列；
S3、将含有待测分子的液体样品流过所述微流控反应腔，与固相载体反应并被选择性地结合和富集到固相载体上；将含有探针分子的液体试剂流过所述微流控反应腔，探针分子与固相载体上富集的对应的待测分子特异性结合，以对该待测分子的进行标记；
S4、按顺序依次从微流控反应腔中取出所述固相载体，分别进行光学检测和分析。
11.一种利用权利要求1-9任一项所述的装置进行生物分子检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)、将能够与不同靶标分子结合的捕获抗体或捕获抗原分别固定到不同的固相载体上；将固相载体按照其能够捕获的靶标分子的不同进行分组，每组包含至少1个固相载体；
(2)、将固相载体装入所述微流控反应腔中，使来自同一组的固相载体在微流控反应腔相邻排列；
(3)、使含有靶标分子的液体样品流过所述微流控反应腔，各组固相载体所修饰的捕获抗体或捕获抗原与其对应的靶标分子的第一位点结合，从而在不同组的固相载体上捕获不同的靶标分子；
(4)、采用洗涤液对所述微流控反应腔进行洗涤，洗去未结合的非特异性的物质；
(5)、使含有探针分子的液体试剂流过所述微流控反应腔，各组固相载体上的靶标分子的第二位点与对应的探针分子结合；所述探针分子标记有化学发光信号物质；
(6)、将各组固相载体从微流控反应腔中取出，利用化学发光仪读取各组固相载体的光学信号的强度，计算液体样品中靶标分子的浓度；
或者，所述方法包括如下步骤：
步骤一、将能够与不同靶标分子结合的捕获抗体或捕获抗原分别固定到不同的固相载体上；将固相载体按照其能够捕获的靶标分子的不同进行分组，每组包含至少1个固相载体；
步骤二、将固相载体装入所述微流控反应腔中，使来自同一组的固相载体在微流控反应腔相邻排列；
步骤三、将含有靶标分子和检测分子的液体样品流过所述微流控反应腔，各组固相载体上所修饰的捕获抗体或捕获抗原与其对应的靶标分子或检测分子结合；所述检测分子标记有化学发光信号物质；所述靶标分子和检测分子为免疫竞争关系；
步骤四、采用洗涤液对所述微流控反应腔进行洗涤，洗去未结合的非特异性的物质；
步骤五、将各组固相载体从微流控反应腔中取出，利用化学发光仪读取各组固相载体的光学信号的强度，计算液体样品中靶标分子的浓度。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，
步骤(3)中，所述靶标分子抗体蛋白或抗原蛋白或抗原多肽等；
步骤三中，所述靶标分子为抗体蛋白或抗原蛋白或抗原多肽；所述检测分子为标记有吖啶酯、或碱性磷酸酶AP或辣根过氧化氢酶HRP或其它任何化学发光信号物质的抗体或抗原。
13.一种利用权利要求1-9任一项所述的装置进行核酸检测的方法，其特征在于，方法包括如下步骤：
步骤1、将能够与不同靶核酸杂交的特异性核酸捕获探针分别固定到不同的固相载体上；将固相载体按照其能够捕获的靶核酸的不同进行分组，每组包含至少1个固相载体；
步骤2、将固相载体装入所述微流控反应腔中，使来自同一组的固相载体在微流控反应腔相邻排列；
步骤3、将含有靶核酸的液体样品流过所述微流控反应腔，各组固相载体上的特异性核酸捕获探针与其对应的靶核酸杂交结合生成复合物；
步骤4、使用洗涤液流过所述微流控反应腔，洗涤除去非特异性干扰物，以分离提取出靶核酸RNA；
步骤5、使用含有RNA逆转录酶和底物的液体试剂流过所述微流控反应腔，在RNA逆转录酶、底物和特异性核酸捕获探针的共同作用下，在固相载体表面上生成双链核酸杂合分子cDNA：RNA，同时利用逆转录酶的RNAse-H的活性降解RNA，在固相载体表面保留了含有若干生物素分子的单链cDNA；所述底物为含有生物素分子的底物；
步骤6、使用含有标记了化学发光信号物质的链酶亲和素/亲和素/生物素抗体的液体流过所述微流控反应腔，使链酶亲和素/亲和素/生物素抗体与固相微球上单链cDNA分子中的生物素分子反应结合；
步骤7、使用洗涤液清洗所述微流控反应腔以洗涤去除非特异性干扰物和底物；
步骤8、将各组固相载体从微流控反应腔中取出，利用化学发光仪读取各组固相载体的光学信号的强度，计算液体样品中靶核酸的浓度；
或者，所述方法包括如下步骤：
步骤①、将能够与不同靶核酸杂交的特异性核酸捕获探针分别固定到不同的固相载体上；将固相载体按照其能够捕获的靶核酸的不同进行分组，每组包含至少1个固相载体；
步骤②、将固相载体装入所述微流控反应腔中，使来自同一组的固相载体在微流控反应腔相邻排列；
步骤③、使用含有靶核酸的液体样品流过所述微流控反应腔，各组固相载体上的特异性核酸捕获探针与其对应的靶核酸杂交结合生成复合物；该液体样品预先经过加热、碱变性使双链核酸解旋；
步骤④、使用洗涤液洗涤所述微流控反应腔，以洗涤除去非特异性干扰物，分离提取出单链DNA；
步骤⑤、将含有DNA聚合酶和底物的液体试剂流过所述微流控反应腔，在DNA聚合酶、底物和特异性核酸捕获探针的共同作用下，经固相载体分离的靶核酸ssDNA分别转变成含有若干生物素分子的双链DNA分子；所述底物为含有生物素分子的底物；
步骤⑥、使用含有标记了化学发光信号物质的链酶亲和素/亲和素/生物素抗体的液体试剂流过所述微流控反应腔，使链酶亲和素/亲和素/生物素抗体的液体与固相微球上双链DNA分子中的生物素分子反应结合；
步骤⑦、使用洗涤液洗涤所述微流控反应腔以去除非特异性干扰物和底物；
步骤⑧、将各组固相载体从微流控反应腔中取出，利用化学发光仪读取各组固相载体的光学信号的强度，计算液体样品中靶核酸的浓度。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，在步骤5或步骤⑤中，所述底物为dATP、dCTP、dGTP、dTTP或dUTP的混合物，其中部分碱基替换为生物素标记的碱基；在步骤6或步骤⑥中，所述链酶亲和素/亲和素/生物素抗体标记有吖啶酯、或碱性磷酸酶AP或辣根过氧化氢酶HRP或其它任何可以直接或间接产生化学发光信号物质。
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