CN115645354A

CN115645354A - 一种水凝胶及其制备方法和在杀伤肿瘤核糖体中的应用

Info

Publication number: CN115645354A
Application number: CN202211356487.8A
Authority: CN
Inventors: 秦燕; 孙立欣; 黄卓越
Original assignee: Institute of Biophysics of CAS
Current assignee: Institute of Biophysics of CAS
Priority date: 2022-11-01
Filing date: 2022-11-01
Publication date: 2023-01-31

Abstract

本发明提供了一种水凝胶、其制备方法及应用，所述水凝胶包括酪氨酸衍生物和光敏剂，所述酪氨酸衍生物选自Fmoc基团保护的酪氨酸如N‑Fmoc‑L‑酪氨酸和Fmoc‑L‑酪氨酸，所述光敏剂选自卟吩类光敏剂，所述卟吩类光敏剂选自由二氢卟吩e6、二氢卟吩e6铜化合物、二氢卟吩e6锌化合物、二氢卟吩e6锰化合物和二氢卟酚e6三葡甲胺盐组成的组。所述水凝胶可作为一种注射型的材料，原位植入到肿瘤中，进行可持续的药物缓释。

Description

一种水凝胶及其制备方法和在杀伤肿瘤核糖体中的应用

技术领域

本发明涉及医用材料领域，具体涉及一种水凝胶及其制备方法和在杀伤肿瘤细胞核糖体中的应用。所述水凝胶由酪氨酸衍生物(Fmoc-L-Tyrosine)和光敏剂二氢卟吩e6(Ce6)共组装得到，所述水凝胶可用于光动力治疗肿瘤，尤其是杀伤肿瘤核糖体。

背景技术

由氨基酸和短肽组装而成的低分子量水凝胶(LMWHs)是一种很有前途的药物传递途径。因为这些分子都是生物来源的，无毒，具有良好的生物相容特性，它们组装可以形成特定的二级、三级和四级结构。氨基酸作为生物分子中较为简单和基本的单元，在其固有的非免疫原性、分子的简单性和稳定性等方面都比蛋白质或多肽具有明显的优势。同时，与传统的水凝胶相比，氨基酸基水凝胶具有更好的注射性和流动性。当将它们以溶液的形式注射到伤口或肿瘤中时，它们可以在原位形成凝胶，从而不断地释放药物。

光动力疗法(PDT)是一种微创的癌症治疗策略，在光照射下激活光敏剂产生活性氧(ROS)。常见的是光敏剂具有水溶性差、无肿瘤特异性、瘤内聚集量低和耐药等问题。目前通常采用载体负载光敏剂的方法，能够在人体特定区域聚集或靶向，以可控的方式释放光敏剂，提高肿瘤的选择性。可注射水凝胶在微创治疗领域具有巨大的发展潜力，可注射水凝胶通常被设计成通过共价键或者超分子作用力在原位形成凝胶。在原位形成的可注射水凝胶中，水凝胶的前驱体在温和的条件下通过注射装置被运送到组织所需的位置，并随着时间的推移转化为水凝胶。

因此，需要可注射、可持续产生大量ROS的水凝胶，来解决传统光敏剂分子体内缺乏靶向性和易聚集的问题，用于原位植入肿瘤和药物的可持续释放。

发明内容

鉴于此，本发明提供一种水凝胶，其特征在于，所述水凝胶包括酪氨酸衍生物和光敏剂，所述酪氨酸衍生物选自Fmoc基团保护的酪氨酸如N-Fmoc-L-酪氨酸和Fmoc-L-酪氨酸，所述光敏剂选自卟吩类光敏剂，优选地，所述卟吩类光敏剂选自由二氢卟吩e6、二氢卟吩e6铜化合物、二氢卟吩e6锌化合物、二氢卟吩e6锰化合物和二氢卟酚e6三葡甲胺盐组成的组。

在一些实施方案中，所述酪氨酸衍生物和光敏剂的重量比范围为10:1至5:1。

在一些实施方案中，所述酪氨酸衍生物的含量为2mg mL^-1至4mg mL^-1。

在一些实施方案中，所述光敏剂的含量为80μg mL^-1至400μg mL^-1。

在一些实施方案中，所述水凝胶具有纳米纤维结构，经切线分析其厚度约为1至5nm，优选3nm。

在一些实施方案中，所述水凝胶通过酪氨酸衍生物和光敏剂的共组装获得。

在一些实施方案中，所述水凝胶的红外图谱相对于酪氨酸衍生物的红外图谱发生了红移。

另一方面，本发明提供一种水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.用第一溶剂溶解光敏剂，所述光敏剂选自卟吩类光敏剂，优选地，所述卟吩类光敏剂选自由二氢卟吩e6、二氢卟吩e6铜化合物、二氢卟吩e6锌化合物、二氢卟吩e6锰化合物和二氢卟酚e6三葡甲胺盐组成的组；

b.用第二溶剂溶解酪氨酸衍生物，所述酪氨酸衍生物选自Fmoc基团保护的酪氨酸如N-Fmoc-L-酪氨酸和Fmoc-L-酪氨酸；

c.将步骤a和步骤b所得产物混匀，并加入水。

在一些实施方案中，所述第一溶剂和第二溶剂各自选自由二甲基亚砜、丙酮、四氢呋喃、乙醇、甲醇和N,N-二甲基甲酰胺组成的组。

在一些实施方案中，所述第一溶剂为二甲基亚砜。

在一些实施方案中，所述第二溶剂为二甲基亚砜。

另一方面，本发明提供上述方法制备的水凝胶。

另一方面，本发明提供上述水凝胶在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

另一方面，本发明提供上述水凝胶在肿瘤治疗中的应用。

在一些实施方案中，所述肿瘤包括但不限于宫颈癌、乳腺癌、食管癌、肺癌、脑癌、膀胱癌和鼻咽癌。

在一些实施方案中，所述肿瘤选自宫颈癌、乳腺癌、食管癌、肺癌、脑癌、膀胱癌和鼻咽癌。

另一方面，本发明提供酪氨酸衍生物在制备治疗肿瘤的缓释药物中的应用，其特征在于所述酪氨酸衍生物负载光敏剂分子，在肿瘤部位形成水凝胶，所述酪氨酸衍生物选自Fmoc基团保护的酪氨酸如N-Fmoc-L-酪氨酸和Fmoc-L-酪氨酸，所述光敏剂选自卟吩类光敏剂，优选地，所述卟吩类光敏剂选自由二氢卟吩e6、二氢卟吩e6铜化合物、二氢卟吩e6锌化合物、二氢卟吩e6锰化合物和二氢卟酚e6三葡甲胺盐组成的组。

另一方面，本发明提供治疗肿瘤的方法，其特征在于，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的上述水凝胶，并进行照射。

定义

Fmoc-L-Tyr：化学名称:芴甲氧羰基-L-酪氨酸

结构式:

常用作凝胶剂和抗菌剂。

Ce6：通常可由脱镁叶绿酸a合成而得，是一种良好的光敏剂，生物活性与脱镁叶绿酸a相近。Ce6产生单线态氧的效率很高，因此适合开发用于肿瘤的光动力治疗。但同迄今为止的大部分光敏剂一样，Ce6表现为疏水性，并在溶液中容易聚集，因此在实际应用中有一定困难。

光敏剂：是一种能吸收辐射能，经激发发生光化学变化，产生具有引发聚合能力的活性中间体(自由基或阳离子)的物质。

水凝胶：水凝胶材料是一类含有大量水分的三维交联的材料，其最大的特点是在水溶液中可以快速的吸收水分溶胀而达到平衡状态；并且由于离子键和氢键的相互作用，水凝胶材料在水中是不溶的，因而水凝胶材料具有一定的机械强度和物理完整性。水凝胶材料的物化性质类似于天然组织。

FLT水凝胶：FLT水凝胶是由Fmoc-L-酪氨酸通过在不同的溶剂中自组装制备的。

FLTC水凝胶：FLTC水凝胶是由Fmoc-L-酪氨酸和二氢卟吩e6在不同溶剂中通过共组装制备的一种新型水凝胶。

单线态氧和活性氧的关系：

活性氧自由基(ROS)由各种氧化分子组成，包括过氧化氢(H₂O₂)，单线态氧(¹O₂)、超氧阴离子(O_2-)和羟基自由基(·OH)等。过量的ROS含量在伤口部位大量积累导致炎症。本发明利用ROS来治疗癌症。

纳米纤维：纳米纤维是指直径为纳米尺度而长度较大的线状材料，广义上讲包括纤维直径为纳米量级的超细纤维。其具有如下优势：由于比表面积增大，体积减少，使反应性和选择性明显提高；由于分子规整排列，可实现自我组织化，从而可显现统一的功能。制造纳米纤维的方法有很多，如拉伸法、模板合成、自组装、微相分离等。

HeLa细胞：为宫颈癌细胞系，不同于其他一般的人类细胞，此细胞株不会衰老致死，并可以无限分裂下去。此细胞系与其他癌细胞株系相比，增殖异常迅速。

4T1细胞：4T1细胞株是小鼠乳腺癌细胞，是从410.4瘤株中未经诱变筛得的6-硫鸟嘌呤抗性细胞株，为贴壁依赖型上皮细胞样细胞。

有益效果

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明的水凝胶可通过注射器微创地植入到实体肿瘤内，在肿瘤微环境下，持续释放光敏剂，产生大量的ROS，对细胞内的核糖体具有强破坏力，在FLTC水凝胶和光照的作用下，细胞内核糖体发生严重的破坏，rRNA降解，抑制翻译的起始，进而诱导了细胞的凋亡。

2、本发明的水凝胶制备方法操作简单，制备过程容易控制，成功构建了基于酪氨酸衍生物的水凝胶，且制备的水凝胶负载率高，本发明中光敏剂二氢卟吩e6完全被封装在Fmoc-L-酪氨酸内，所以说负载率高。

附图说明

图1是两种水凝胶FLT和FLTC的形貌表征图；其中，A为两种水凝胶FLT和FLTC的宏观形貌；B为FLT水凝胶透射电镜图(TEM)；C为FLTC水凝胶透射电镜图；D为FLT水凝胶原子力显微镜图；E为FLTC水凝胶原子力显微镜图；F为FLTC水凝胶原子力显微镜剖面高度图；

图2是两种水凝胶FLT和FLTC的形貌表征图；其中，A为两种水凝胶FLT和FLTC的紫外-可见吸收光谱图；B为两种水凝胶FLT和FLTC的圆二色谱图；C为两种水凝胶FLT和FLTC的傅里叶变换红外光谱图；D为两种水凝胶FLT和FLTC的X-射线衍射光谱图；

图3是两种水凝胶FLT和FLTC的不同流变学曲线；A为时间扫描曲线；B为频率扫描曲线；C为黏度曲线；D为应力扫描曲线；

图4是FLTC水凝胶的不同pH环境下体外药物释放曲线；B为pH＝5.5时FLTC水凝胶体外孵育48h后的TEM图像；C为pH＝6.5时FLTC水凝胶体外孵育48h后的TEM图像；D为pH＝7.4时FLTC水凝胶体外孵育48h后的TEM图像；

图5是FLTC水凝胶单线态氧的生成曲线；A为FLTC水凝胶光照射下的DPBF紫外吸收光谱；B为游离的Ce6水溶液光照射下的DPBF紫外吸收光谱；C为DPBF吸收光谱在波长410nm处的变化；

图6A是DCFH-DA探针孵育HeLa细胞4h后细胞内ROS的产生情况；B为对图A中HeLa细胞内荧光强度的定量分析；C为DCFH-DA染色的HeLa细胞经不同处理后的流式细胞术分析；D为流式细胞术检测出C图的细胞平均荧光强度；

图7A是HeLa细胞的活性图；B为4T1细胞的活性图；C为HeLa经不同处理后的活/死细胞染色荧光图；D为4T1细胞经不同处理后的活/死细胞染色荧光图；

图8是FLTC水凝胶对HeLa细胞周期与凋亡的影响；A为细胞周期的流式细胞结果图；B为细胞周期量化图；C为细胞凋亡的流式细胞结果图；D为细胞凋亡量化图；

图9A为聚集在PBS和水凝胶组之间的基因差异表达的热图；B为水凝胶组和PBS组之间5326个差异表达基因的GO(Gene Ontology)通路富集图；C为RNA分解代谢过程和rRNA加工的富集分数谱；D为选定基因的qRT-PCR结果图；

图10A为PBS组与水凝胶组基因差异表达分析的火山图，一些排名靠前的基因被标记出来；B为筛选出的7个基因的qRT-PCR结果；

图11A为HeLa细胞细胞质核糖体免疫荧光染色图片；B为HeLa细胞线粒体核糖体免疫荧光染色图片；C为核糖体免疫荧光染色量化图；D为RNA琼脂糖凝胶电泳图；

图12是小鼠原位注射FLTC水凝胶后不同时间降解图；

图13A是小鼠体重曲线；B-F为不同处理组小鼠血液指标结果；

图14是不同Ce6含量的FLTC水凝胶的溶血率；

图15是小鼠主要器官心、肝、脾、肺和肾的组织H&E染色图；

图16是小鼠注射FLTC水凝胶后不同时间的荧光图像；

图17是FLTC水凝胶体内抗肿瘤效果分析图；A为治疗流程；B为小鼠体重随时间变化的曲线；C为肿瘤体积随时间变化的曲线；D为肿瘤图片；E为小鼠治疗后各组肿瘤的质量柱状图；

图18是两周后采集不同处理组的肿瘤组织的H&E、Ki67免疫荧光和TUNEL免疫荧光染色图；A为H&E免疫荧光染色图；B为Ki67免疫荧光染色图；C为TUNEL免疫荧光染色图；

图19是本发明的可注射水凝胶的组装及其作用的示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

实施例1FLTC水凝胶的制备

称取2.5mg二氢卟吩e6(Ce6，HEOWNS)固体粉末，将其充分溶解在500μL DMSO中，得到5mg mL^-1的二氢卟吩e6溶液。称取2mg Fmoc-L-Tyr(FLT，华威锐科)固体粉末，超声充分溶解(需要借助超声溶解，超声是为了快速溶解，因为量特别少，所以只采用了超声的方法)在10μL DMSO中。将10μL Ce6溶液，10μL Fmoc-L-Tyr溶液充分混合后，将480μL超纯水注入到混合溶液中，静置1-3min后，得到FLTC水凝胶。其中二氢卟吩e6光敏剂的浓度为100μg mL^-1。

实施例2两种水凝胶的形貌表征

1.FLTC水凝胶的表征

(1)透射电子显微镜(TEM)测试：将老化后的FLT水凝胶、FLTC水凝胶(Ce6当量100μg mL^-1)，用超纯水稀释、超声分散后，滴加在铜网上，室温下干燥24h后，在HT7700透射电子显微镜上测试，测试电压为100.0kv。

(2)原子力显微镜(AFM)测试：将FLT水凝胶和FLTC水凝胶在超纯水中稀释后，超声分散，滴加到洁净的云母片上，室温下干燥24h后，在Bruker MoltiMode 8.0原子力显微镜上测试。

可注射超分子(超分子指的是基于非共价相互作用和自组装形成的物质)水凝胶FLTC的凝胶剂为简单酪氨酸衍生物FLT(该衍生物在不做任何处理的情况下是粉末状，在不同溶剂中可通过一些超分子作用力如亲疏水、氢键、π-π堆叠等超分子作用力下可自组装形成水凝胶)，在DMSO的辅助下可溶于水(DMSO/H₂O＝1/24，该等式是DMSO和超纯水的溶剂比)，形成流动性的可注射水凝胶，FLT水凝胶和FLTC水凝胶的宏观形貌如图1A所示，FLT水凝胶在室温下半个小时左右可以缓慢地转变为半透明的水凝胶(这是水凝胶由溶液状态变成凝胶状态的现象，原因可能是因为在交联)。当光敏剂Ce6与FLT相互作用进行共组装时，可以得到类似的绿色半透明水凝胶。从透射电镜图片(图1B和图1C)中观察到，FLT水凝胶和FLTC水凝胶都具有明确的纳米纤维结构。原子力显微镜图像(图1D和图1E)表明，FLT水凝胶的纳米纤维比FLTC水凝胶的纳米纤维更高一些，进行的切线分析(这个是用原子力显微镜处理软件一键测量的)发现FLTC水凝胶的厚度约为3nm，比FLT水凝胶本身要薄3倍左右(图1F)，这说明了FLT与Ce6之间存在着相互作用，Ce6分子的引入，改变了FLT水凝胶的形貌。

2.结构与光谱性质

(1)紫外-可见吸收光谱(UV-vis)测试：将FLT水凝胶、FLTC水凝胶和Ce6水溶液制备在0.1mm光程的石英片中(Ce6当量为100μg mL^-1)，在Lambda 750紫外-可见吸收光谱仪中进行测试。

(2)圆二色谱(CD)测试：将制备在0.1mm光程石英片中的水凝胶与Ce6水溶液(Ce6当量为100μg mL^-1)在JASCO J-810圆二色光谱仪中测试。在测试过程中，扫描三次取平均值。

(3)傅里叶变换红外光谱(FT-IR)测试：先制备FLT水凝胶和FLTC水凝胶(Ce6当量为100μg mL^-1)，在室温下老化一天后，将水凝胶涂抹在氟化钙片上，在Bruker Tensor 37傅里叶变换红外光谱仪上进行测试。

(4)X-射线衍射(XRD)测试：将150μL FLT和FLTC溶胶滴在载玻片上，在真空干燥器中完全干燥后。通过Shimadzu XRD6000型X射线衍射仪测试样品。

图2A表明Ce6在FLT水凝胶中可能有轻微的J-聚集(卟吩或卟啉类光敏剂在一定浓度、pH值、离子强度等条件下，可以通过非共价键聚集成J-型聚集体(肩并肩)。卟啉分子的J-聚集大多数是由分子之间的非共价相互作用引起的，如静电作用、疏水作用、氢键作用等。FLT水凝胶和FLTC水凝胶的CD光谱(图2B)表明FLT和FLTC水凝胶均具有手性组装(手性组装是指共组装的分子具有手性，Fmoc-L-酪氨酸没有手性，二氢卟吩e6有手性，二者共组装后，圆二色谱光谱在410nm波长处有了微弱的cotton信号)。在FLTC水凝胶的CD光谱中，约408nm处的Cotton效应非常弱，这表明在FLTC水凝胶中Ce6分子的密集排列。因此，与FLT共组装可以抑制Ce6分子的强聚集，保证该体系良好的光物理性能(强聚集光敏剂会发生荧光猝灭现象)。对比FLTC水凝胶与FLT水凝胶的红外特征吸收峰的位置(图2C)发现，FLTC水凝胶的红外图谱发生了红移，且FLTC水凝胶的峰形更宽，这可能是由于Ce6分子存在，加强了体系间的分子间氢键导致的。图2D表明FLTC水凝胶共组装的结构也拥有晶体结构的性质，且FLTC水凝胶的峰强度增加，这可能因为是Ce6分子的引入，使FLT分子排列更加有序。

实施例3两种水凝胶的不同流变学特性测定

水凝胶流变学测试：FLT水凝胶与FLTC水凝胶的流变学行为是通过旋转流变仪MCR302和直径25mm、厚度1mm的不锈钢圆形板测得的。采用三种不同的测试方法：时间扫描、剪切应变扫描、频率扫描。在时间扫描测试中，将水凝胶的两种组分同时加入到圆形板中，然后立即启动测试。应变保持在1％，角频率为1Hz，25℃，持续15min。剪切应变扫描测试在25℃进行，模数从0.01％记录到1000％，频率为1Hz。然后在25℃的线性粘弹性范围内，进行恒定应变为1％时的频率扫描，记录储能模量G′和损耗模量G″值。

图3的结果表明，Ce6纳米粒子的引入影响了FLT水凝胶的流变学，增强了其力学稳定性，这可能与Ce6与Fmoc-L-Tyr的超分子相互作用(超分子相互作用，如氢键、静电相互作用、π-π堆叠、疏水作用和范德华力等)有关，其中Ce6芳香结构的掺入可能诱发了更强的π-π相互作用。FLT水凝胶纤维可能与光敏Ce6通过一些非共价相互作用，如疏水效应和静电效应，影响了共组装体的氢键。

实施例4FLTC水凝胶的药物释放情况

FLTC水凝胶体外Ce6释放测试：在培养皿底部制备1mL FLTC水凝胶，24h老化，分别加入2mL不同的PBS缓冲溶液(pH 5.5、pH 6.5和pH 7.4)。将样品置于37℃培养箱中培养48h，分别在不同的时间点取出2mL溶液，测量其在408nm处的吸光度。测试完成后，将溶液继续放回比色皿孵育。

如图4A所示，在pH＝7.4和pH＝6.5的条件下，水凝胶在10h内分别释放出约96％和90％的Ce6，FLTC水凝胶的pH敏感性可能是由于羧基的去质子化。相比之下，在接近肿瘤微环境的条件下(pH＝5.5)，48h内Ce6的释放量缓慢增加，最后约为78％，这进一步说明FLTC水凝胶在肿瘤微环境下，具有稳定的结构，可以持续地释放药物。图4B可明显看出，在接近肿瘤微环境的条件下(pH＝5.5)，培养箱内孵育48h后，水凝胶仍有稳定的纳米结构。但在pH为6.5时，FLTC水凝胶则呈现出了微花的结构(图4C)。在pH＝7.4时，水凝胶结构受到了完全的破坏(图4D)。因此，在肿瘤微环境下，FLTC水凝胶的稳定性和Ce6的控释特性是值得期待的。

实施例5FLTC水凝胶单线态氧的生成情况

1.FLTC水凝胶单线态氧产生能力与游离Ce6的比较

(1)细胞外单线态氧产量测试：采用1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)探针，通过紫外-可见吸收光谱仪测试相同浓度DPBF探针在各时间点的吸光度，来比较光敏剂在水溶液和水凝胶中产生1O₂的能力。首先，在比色皿中制备50μL Ce6水溶液及FLTC水凝胶(Ce6含量均为1.67μg mL^-1)，然后，在避光条件下加入浓度为1×10^-5mol L^-1的DPBF溶液3mL，混合均匀，立即测量样品在410nm处的吸光度。然后用660nm激光灯照射DPBF溶液2min(功率100mWcm^-2)，每隔10s用紫外-可见分光光谱仪测量探针的吸光度。

如图5A所示，410nm处FLTC水凝胶和游离Ce6的DPBF(DPBF全称1,3-二苯基异苯并呋喃)的吸光度随照射时间的延长而不断地下降，表明两种物质均产生了1O₂。图5A显示了在660nm激光灯(660nm是激光灯的波长，410nm是DPBF紫外吸收波长，两者之间没有任何直接的关系，整个申请用的激光灯波长都是660nm，但是不同的物质有不同的紫外吸收波长)的照射下FLTC水凝胶对DPBF的降解能力，与游离Ce6的相比(图5B)，FLTC水凝胶的1O₂生成能力并没有降低，反而略有提高，这可能与Ce6与FLT的非共价相互作用有关，也进一步证明了FLTC水凝胶是PDT良好的候选材料。图5C显示了410nm处DPBF紫外吸收A_t与A₀的比值(A_t是光照不同时间DPBF的吸收光度值，A_t与A₀的比值越大肯定是变化的越大，DPBF降解的越快)曲线，进一步说明FLTC水凝胶和游离Ce6在体外具有相似的PDT效率，且水凝胶更胜一筹，高5％左右。

2.体内活性氧产生能力

(1)细胞内活性氧产量测试：为了对比游离Ce6和共组装凝胶细胞内产生活性氧的能力，我们将对数生长期HeLa细胞(中国科学院生物物理所提供)或4T1细胞(华威锐科，cc-y2004)消化、离心后，接种到6孔板上，细胞密度为2×10⁵/孔。细胞培养过夜贴壁后，每孔加入80μg mL^-1(Ce6在水和共组装凝胶中的浓度)材料，继续培养过夜。光照组用激光灯每孔照射5min后将原培养液吸出，每孔加入1mL(体积比V_DCFH-DA：V_DMEM＝1：1000，体积比V_双抗：V_DMEM＝1:100)，DCFH-DA购自Beyotime，DMEM购自Gibco Life)的无血清培养基，在恒温培养箱内孵育0.5h后，用PBS至少清洗2遍，洗去多余的染料。在Nikon-EclipseTi荧光显微镜上进行拍照，记录实验结果。

(2)细胞内活性氧流式细胞实验：HeLa细胞和4T1细胞的密度和培养方法如上，所加材料浓度与细胞内活性氧产量测试实验保持一致。光照组用激光灯(200mW cm^-2)每孔照射5min后，将细胞消化，离心，清洗，每孔加入500μL(V_DCFH-DA：V_DMEM＝1：1000)的无血清培养基，在恒温培养箱内孵育0.5h后，离心，PBS洗去未进入细胞的多余探针，将细胞悬浮液转移至流式管中，用流式细胞仪检测。

如图6A和图6B所示，激光照射和不加照射PBS时产生的ROS荧光强度均不明显，无激光照射的FLTC水凝胶和游离Ce6产生的ROS荧光强度也可以忽略不计。而660nm激光照射下，经FLTC水凝胶处理的细胞表现出较强的荧光强度，且高于游离的Ce6将近一倍。如图6C所示，与对照组相比，FLTC水凝胶经激光处理后细胞的荧光密度最高。如图6D所示，经FLTC水凝胶处理后的细胞，表现出了非常高的ROS产生能力，与光照游离的Ce6相比，提升将近50％。综上，这些结果表明，Fmoc-L-Tyr与Ce6共组装后，细胞内的活性氧产生能力高过游离的Ce6，FLTC凝胶将是一个出色的PDT治疗平台。

实施例6FLTC水凝胶的细胞毒性

采用CCK-8试剂盒检测细胞活性。HeLa和4T1细胞以每孔8×10³个的密度种植在96孔板中，放入含量为5％的CO₂培养箱中过夜使其贴壁。HeLa和4T1细胞设置Ce6 0.5μg mL^-1、1μg mL^-1、2μg mL^-1、3μg mL^-1、4μg mL^-1和5μg mL^-1和(Ce6在水和共组装凝胶中的浓度)共6个实验组，对照组为不加任何材料的完全培养基。每个实验都分为光照组与不加光照组(光源：660nm激光灯，功率密度：200mW cm^-2，时间：2min)，继续培养过夜后，将原培养基吸出，按照CCK-8试剂盒说明书中的方法检测细胞活性。最后，利用EnSpire酶标仪测量的光密度值来定量细胞活力，λ＝450nm。所有测试至少平行3次取平均值。具体结果按下式计算细胞存活率。细胞存活率(％)＝OD_样品/OD_对照×100％，式中，OD_样品为含不同浓度Ce6的水凝胶在450nm处的吸光度；OD_对照为不加任何材料的PBS组在450nm处的吸光度

如图7A和图7B所示，游离Ce6和FLTC水凝胶在黑暗条件下对HeLa细胞和4T1细胞表现均出较低的细胞毒性，当等效浓度增加到5μgmL^-1时，细胞的存活率均超过80％，证明游离Ce6和FLTC水凝胶均不具备暗毒性。

实施例7FLTC水凝胶的肿瘤细胞抑制能力测定

为了更直观地观察到各处理方式的抗肿瘤效果，通过活/死细胞染色法对各组药物处理后的HeLa和4TI细胞进行表征。活/死细胞染色工作液组成：Calcein-AM(Beyotime，c2012)和PI(Beyotime，p0135)各1μL，新鲜培养基1mL。细胞培养方法如上所述(密度：20×10⁴/孔)，每孔加入80μg mL^-1(Ce6在水和FLTC中的浓度)的材料，继续培养过夜。光照组用激光灯(200mW cm^-2)每孔照射5min，继续培养7h后用PBS清洗两遍，每孔加入500μL工作液，在培养箱内继续孵育0.5h后，用PBS清洗，在尼康荧光显微镜上检测结果。

图7C、7D显示了用激光照射或不加照射HeLa和4T1细胞5min后的荧光成像。与其他的对照组相比，FLTC水凝胶组在经过激光灯的照射后，可以观察到更多的红色荧光，说明在这种处理情况下，肿瘤细胞大都死亡了。且证明了FLTC水凝胶具有更好的肿瘤细胞抑制能力。在视场范围内，可观测到将近100％的肿瘤细胞死亡。

实施例8FLTC水凝胶的细胞周期与细胞凋亡实验

(1)细胞周期实验：HeLa细胞(密度：20×10⁴/孔)在6孔板中培养24h，加入PBS、游离Ce6和FLTC水凝胶(Ce6当量浓度：80μg mL^-1)，光照组使用660nm激光灯(200mW cm^-2)照射5min后，继续培养过夜。然后，按照细胞周期检测试剂盒的使用说明处理各组细胞后，使用流式细胞仪BD FACSCalibur进行检测。

(2)细胞凋亡实验：HeLa细胞(密度：20×10⁴/孔)在6孔板中培养24h，加入PBS、游离Ce6和FLTC水凝胶(FLTC水凝胶中Ce6的浓度也为80μg mL^-1)，按照上述实验方法培养HeLa细胞(密度：20×10⁴/孔)。光照组使用660nm激光灯(200mW cm^-2)照射5min后，培养过夜。根据细胞凋亡检测试剂盒Annexin V-FITC的使用说明处理各组细胞后，使用流式细胞仪BDFACSCalibur进行检测。

在实验结果中，与对照组相比，FLTC凝胶本身对细胞周期停滞并没有明显的影响(图8A与图8B)。如图8C所示，可明显观察到在FLTC水凝胶的孵育下，经过激光照射5min后，细胞凋亡率明显增加。图8D中的定量分析结果表明，在激光灯的照射下，FLTC水凝胶组比游离Ce6组表现出更高的细胞毒性，FLTC水凝胶组共61％的凋亡细胞，游离Ce6组共凋亡细胞14.52％。这些结果表明，负载Ce6的FLTC水凝胶可有效诱导细胞凋亡，并通过干扰细胞周期的G2/M期而抑制肿瘤细胞的增殖。

实施例9FLTC水凝胶组学测序结果

按照上述实验方法培养HeLa细胞(密度：15×10⁴/孔)。用PBS和FLTC水凝胶(Ce6含量：80μg mL^-1)孵育细胞过夜，每组设置3个重复样本。PBS组避光，水凝胶组用激光(660nm，200mW cm^-2)照射5min，孵育2h后，消化、洗涤3次后，离心得到细胞沉淀，用Trizol提取各细胞样品总RNA，送往诺禾致源公司进行测序。对于RNA-seq数据，基因表达水平使用FeatureCounts(版本2.0.3)进行计算。使用DEseq2计算差异表达基因的读计数和p值的标准化。使用R package clusterProfiler对基因进行GO富集，使用Rpackage ggplot2和ggrepel生成显示基因表达变化的火山图。

图9A-D结果显示，与PBS组相比较，最显著上调的基因富集在RNA分解代谢过程、mRNA分解代谢过程、翻译起始，这些都与蛋白质生物合成机制，即核糖体有关。其次是蛋白质靶向机制，如共翻译，靶向内质网(ER)或细胞质膜的蛋白质。总之，RNA-seq数据表明，FLTC凝胶产生的ROS对RNA具有高度的破坏性，使用FLTC水凝胶处理过的癌细胞中引发了RNA的分解代谢。

图10A表明在激光的作用下，经FLTC水凝胶处理的HeLa细胞中，2598个基因表达上调，2728个基因表达下调。图10B表明FLTC水凝胶处理后，HeLa细胞的与细胞死亡相关基因CHAC1、DUSP6、NUPR1和CDKN1C基因表达水平升高，BCL9L、POLR2A和PTPRF基因表达水平降低。这7个mRNA的表达趋势与测序结果一致。这些RNA测序结果有力地支持了FLTC水凝胶在光动力学诱导的大量ROS的抗肿瘤作用中能够破坏细胞内RNA，抑制细胞翻译，阻碍蛋白质合成，诱导肿瘤凋亡的结论。

实施例10FLTC水凝胶对细胞内核糖体的影响

(1)核糖体免疫荧光染色：按照上述所述的细胞培养方法，HeLa细胞和4T1细胞在共聚焦小皿中培养12h(密度：15×10⁴/个)。然后，用PBS和FLTC水凝胶处理细胞(Ce6浓度:80μg mL^-1)。24h后，PBS组避光，水凝胶组用660nm激光灯(200mW cm^-2)照射5min，继续在培养箱中孵育4h。分别用抗RPS6抗体(Abcam，ab70227)、抗MRPL48抗体(Abcam，ab194826)和抗rRNA抗体(Abcam，sc-33678)对PBS对照组和FLTC水凝胶组处理后的细胞进行免疫荧光染色，测试前20min，用Hoechst 33342(Beyotime，C1022)对细胞核染色。蓝色的细胞核由405nm激发光激发，绿色的细胞质或线粒体核糖体蛋白由488nm激发光激发，红色的rRNA由561nm激发光激发，在共聚焦显微镜FV1000上进行观察。

(2)RNA提取：HeLa细胞(密度：20×10⁴/孔)在6孔板中培养24h，加入PBS、游离Ce6和FLTC水凝胶(FLTC水凝胶中Ce6的浓度也为80μg mL^-1)，光照与暗处理的实验方法与上述实验内容相同。在提取经不同样品和光照处理后的细胞总RNA后，琼脂糖凝胶电泳在100V下进行30min。

从图11A的结果可以明显的观察到，对于没有FLTC水凝胶和激光照射的HeLa细胞，免疫荧光染色照片清楚地显示出大量的细胞质核糖体和rRNA。与此形成鲜明对比的是，在660nm激光灯照射下，用FLTC水凝胶处理后，细胞质核糖体蛋白和rRNA的数量明显减少。这些结果揭示了FLTC水凝胶PDT对癌细胞中细胞质核糖体的严重损害。

在图11B中，当用FLTC水凝胶对HeLa细胞进行光照处理后，与PBS组对比，线粒体核糖体免疫荧光强度也明显降低了，这说明细胞中的线粒体核糖体也严重受损。可能是由于这些核糖体的RNA表面与55S核糖体的紧密蛋白外周形成对比，并且线粒体核糖体的表面蛋白以及线粒体的膜蛋白可以保护线粒体核糖体免受大量ROS爆发的破坏。

图11C可以观察到，细胞质核糖体蛋白的荧光减弱的程度明显小于线粒体核糖体。水凝胶组rRNA的荧光与PBS组相比，也明显减弱了。在图11D中，在PBS组、游离Ce6组、FLTC水凝胶组和激光照射的PBS组中可以观察到三个不同的条带(28SrRNA、18SrRNA和5SrRNA)，表明这些对照组的总核糖体数量较多，进一步说明核糖体在没有ROS处理的情况下能保持完整。值得注意的是，与纯游离Ce6处理组相比，FLTC水凝胶组处理后的28S和18S条带减少的更明显，几乎不可见，这表明FLTC水凝胶通过产生连续的ROS对rRNA产生了决定性的损害。总之，这些结果证明FLTC水凝胶在光照射下产生的ROS可以迅速破坏rRNA，损害细胞质和线粒体核糖体。

实施例11FLTC水凝胶活体安全性分析

1.FLTC水凝胶的原位成胶与体内降解情况

(1)水凝胶降解实验：小鼠被随机分为6组，每组5只，3组为光照组，另外三组避光饲养。将100μL的PBS、FLTC水凝胶和游离Ce6的水溶液(Ce6含量：2mg kg^-1，400ug/mL，指的是每只小鼠(约20g)注射的药中含有的Ce6的量)皮下注射到小鼠背部。所有的小鼠每隔1天记录一次体重，共记录2周。光照组小鼠每隔一天光照凝胶部位10min，避光组为对照组。为了证明FLTC水凝胶在体内形成的可行性和降解性，注射10min后，记录原位形成水凝胶的形态。注射后的第7天和第14天处死小鼠，记录皮下剩余水凝胶的形态。

如图12所示，明显观察到了水凝胶的形成，证实了FLTC水凝胶在体内微酸性肿瘤环境中的可注射性和快速凝胶化。第7天时，仅有一点点水凝胶未降解，注射14天后，注射部位的水凝胶几乎完全消失，表明该水凝胶具有良好的生物降解性。说明FLTC超分子水凝胶可作为一种注射型的材料，原位植入到肿瘤中，进行可持续的药物缓释。

2.小鼠血液指标分析

小鼠血液指标测试：2周后从小鼠眼眶静脉丛采集全血(约800μL)进行血液指标生化分析。眼球取血法采取全血后，在4℃下1000rpm离心15min，取上层血清，送往塞维尔(北京)生物科技公司，分别检测用药两周后各实验组小鼠的肝功能、肾功能和心功能。

由图13A可知，所有处理组小鼠的体重都在稳步增加，FLTC水凝胶并无毒性，可被小鼠稳定代谢。图13B-图13F表明检测的血液指标分别为指示肝功能的生物标志物，包括丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)；肾功能的生物标志物尿素氮(BUN)；心功能的生物标志物，肌酸激酶(CK)和肌酸激酶-MB(CK-MB)。且各项指标的实验结果与PBS对照组相比，无显著差异，证明FLTC水凝胶并无体内毒性，是一种具有生物相容性的可注射材料。

3.FLTC水凝胶溶血性实验结果分析

FLTC水凝胶溶血性测试：取0.5mL上述去除血清后的沉淀物，加入1mL PBS，4500rpm离心4min，弃上清液，然后用PBS清洗至上清液不再出现血色为止。将离心后的血红细胞分散在5mL PBS中进行稀释。每组取0.3mL稀释后的红细胞，实验组分别加入1.2mL含不同浓度FLTC水凝胶的PBS溶液，阳性对照组加入1.2mL超纯水，阴性对照组只加入1.2mLPBS。轻轻摇匀，培养箱内孵育0.5h后，取上述各离心管中的溶液，1000rpm离心5min，用EnSpire酶标仪测量上清液的光密度值，λ＝450nm。用酶标仪(EnSpire)测量上清液在波长545nm处的OD值。计算公式如下：溶血率(％)＝OD_样品-OD_阴性对照/OD_阳性对照-OD_阴性对照×100％

图14所示，说明FLTC水凝胶几乎不会引起体外溶血反应，溶血率低于5％，基本可保持血液中红细胞的完整性，具有良好的血液相容性。

4.主要器官组织H&E染色分析

小鼠主要器官的H&E染色测试：各组小鼠饲养14天后，进行解剖，收集心脏、肝、脾、肺、肾等主要器官，储存在4℃、4％的多聚甲醛中，送往塞维尔(北京)生物科技公司进行实验与处理，各器官的组织结构和细胞形态在Nikon-EclipseTi荧光显微镜下进行观察。

如图15所示，在所有的处理组(PBS组光照与不光照，二氢卟吩e6组光照与不光照，FLTC水凝胶组光照与不光照)中，细胞质、细胞核均未出现皱缩，没有发现明显的病变组织。综上，这些活体生物安全性实验共同证明了FLTC水凝胶是一种具有生物相容性的治疗平台，可降解，且不带来全身毒性，这为其进一步的生物医学应用的安全性提供了保障。

实施例12FLTC水凝胶小动物活体成像分析

BALB/c荷瘤小鼠模型构建：BALB/c雌性小鼠(6周龄)购买自北京Vital River实验动物科技有限公司。将胰酶消化后的4T1细胞分散于PBS中，约30×10⁴个/100μL。将100μL细胞分散液皮下注射到动物右侧大腿后部。

FLTC水凝胶体内荧光成像实验：肿瘤生长到约100mm³后，小鼠瘤内注射FLTC水凝胶100μL，含Ce6浓度为400μg mL^-1，分别在注射后的不同时间用荧光成像仪(Lumina 3)进行荧光成像，λex＝620nm，λem＝670nm。

如图16所示，在12h内，注射部位可以观察到明显的荧光强度，水凝胶很少扩散到周围组织。随着时间的延长，肿瘤部位的荧光强度逐渐变弱，说明水凝胶逐渐被降解。即使在植入的5天后，仍然可以观察到微弱荧光，这说明此时肿瘤部位的FLTC水凝胶大部分已被降解，少部分的凝胶仍可以在体内可以缓慢的维持Ce6的释放。

实施例13FLTC水凝胶体内抗肿瘤疗效分析

FLTC水凝胶体内抗肿瘤效果在探究FLTC水凝胶体内抗肿瘤效率的研究中，将小鼠随机分为6组(每组5只)，如上所述培养4TI荷瘤小鼠。肿瘤生长到约100mm³后，分别给予小鼠不同的瘤内原位注射：1)100μL PBS组，2)100μL PBS加光照组，3)100μL Ce6水溶液组，4)100μL Ce6水溶液加光照组，5)100μL FLTC水凝胶组，6)100μL FLTC水凝胶加光照组。Ce6在水溶液与凝胶中的剂量：400μg mL^-1。分别于第0天、第2天和第8天原位注射PBS、游离Ce6溶液和FLTC水凝胶。用660nm(功率密度：1.25W cm^-2)的激光灯照射肿瘤15min。每两天测量肿瘤体积和小鼠体重。在治疗过程中，没有任何小鼠死亡。用数显游标卡尺确定肿瘤体积，计算公式如下：肿瘤体积＝(肿瘤宽度)²×肿瘤长度²。所有测量均由同一观测者进行。治疗结束后，全麻下处死小鼠，取下肿瘤进行称量。然后将肿瘤组织保存在4℃、4％的多聚甲醛中，送往塞维尔(北京)生物科技公司进行H&E、Ki67和TUNEL组织切片处理，以观察各组织的坏死特征。

如图17所示用PBS或激光照射处理的小鼠肿瘤生长没有受到抑制，体积达到约370mm³。此外，在没有激光照射的游离Ce6或FLTC水凝胶组的肿瘤生长也没有受到抑制，而游离Ce6和FLTC水凝胶在660nm激光照射后，有明显的肿瘤抑制效率。在治疗的第12天，激光照射后，FLTC水凝胶组的肿瘤大小明显小于游离的Ce6组，抑制作用更强，FLTC水凝胶组的肿瘤体积约为11.71mm³，而游离Ce6组的体积约为241.63mm³，这说明游离FLTC水凝胶比Ce6具有更强的肿瘤抑制能力。我们也分别测量了每组肿瘤的质量，激光照射FLTC水凝胶组的肿瘤质量约为180mg，激光照射游离Ce6组肿瘤质量约为300mg，而其他处理组肿瘤质量均超400mg，与肿瘤体积趋势也保持一致。

图18结果显示在游离Ce6和FLTC水凝胶加光照的治疗组中，细胞核显著减少，而其他处理组的细胞形态很正常，水凝胶组的细胞核数量是最少的，这说明肿瘤组织经过水凝胶的12天光动力治疗，癌细胞受到了明显的损伤。在图18B中，对照组PBS组、游离Ce6不加光照组和FLTC水凝胶不加光照组的Ki67表达水平很高，这说明肿瘤细胞的增殖没有受到抑制。Ce6光照组和水凝胶光照组的Ki67表达量均很低，尤其水凝胶组的表达量是最低的，肿瘤细胞的增殖受到了很大的抑制，这说明FLTC水凝胶的肿瘤抑制效果更强。图18C表明，FLTC水凝胶可通过诱导细胞凋亡来对肿瘤进行杀伤。以上组织染色结果均显示出FLTC水凝胶光照组中坏死肿瘤组织的水平最高。

图19表明本发明采用经典的光敏剂Chlorin e6(Ce6)与简单的酪氨酸衍生物(Fmoc-L-Tyrosine，FLT)共同组装，开发了一种新型的可注射的超分子水凝胶系统(FLTC)。在近红外光的照射下，Ce6光催化产生的ROS产物主要是单线态氧(¹O2)，具有长寿命、宽pH耐受性和抗环境干扰能力等优点。该可注射水凝胶在肿瘤微环境中是稳定的，具有良好的生物相容性。体内实验表明，注射到小鼠肿瘤组织的FLTC水凝胶可提供持续的Ce6释放，并对肿瘤生长有明显的抑制作用。在癌细胞中，这种治疗伴随着显著的核糖体降解和随后的细胞凋亡。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.水凝胶，其特征在于，所述水凝胶包括酪氨酸衍生物和光敏剂，所述酪氨酸衍生物选自Fmoc基团保护的酪氨酸如N-Fmoc-L-酪氨酸和Fmoc-L-酪氨酸，所述光敏剂选自卟吩类光敏剂，优选地，所述卟吩类光敏剂选自由二氢卟吩e6、二氢卟吩e6铜化合物、二氢卟吩e6锌化合物、二氢卟吩e6锰化合物和二氢卟酚e6三葡甲胺盐组成的组。

2.根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，所述酪氨酸衍生物和光敏剂的重量比范围为10:1至5:1。

3.根据权利要求1或2所述的水凝胶，其特征在于，所述水凝胶具有纳米纤维结构，厚度为1至5nm，优选3nm。

4.水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

c.将步骤a和步骤b所得产物混匀，并加入水。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一溶剂和第二溶剂各自选自由二甲基亚砜、丙酮、四氢呋喃、乙醇、甲醇和N,N-二甲基甲酰胺组成的组，优选地，所述第一溶剂为二甲基亚砜，所述第二溶剂为二甲基亚砜。

6.水凝胶，其通过权利要求4或5所述的方法制备。

7.根据权利要求1-3和6中任一项所述的水凝胶在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述肿瘤选自宫颈癌、乳腺癌、食管癌、肺癌、脑癌、膀胱癌和鼻咽癌。

9.酪氨酸衍生物在制备治疗肿瘤的缓释药物中的应用，其特征在于所述酪氨酸衍生物负载光敏剂分子，在肿瘤部位形成水凝胶，所述酪氨酸衍生物选自Fmoc基团保护的酪氨酸如N-Fmoc-L-酪氨酸和Fmoc-L-酪氨酸，所述光敏剂分子选自卟吩类光敏剂，优选地，所述卟吩类光敏剂选自由二氢卟吩e6、二氢卟吩e6铜化合物、二氢卟吩e6锌化合物、二氢卟吩e6锰化合物和二氢卟酚e6三葡甲胺盐组成的组。

10.酪氨酸衍生物在制备治疗肿瘤的光动力治疗药物中的应用，其特征在于所述酪氨酸衍生物负载光敏剂分子，在肿瘤部位形成水凝胶，所述酪氨酸衍生物选自Fmoc基团保护的酪氨酸如N-Fmoc-L-酪氨酸和Fmoc-L-酪氨酸，所述光敏剂分子选自卟吩类光敏剂，优选地，所述卟吩类光敏剂选自由二氢卟吩e6、二氢卟吩e6铜化合物、二氢卟吩e6锌化合物、二氢卟吩e6锰化合物和二氢卟酚e6三葡甲胺盐组成的组。