CN115637246A - 一种抑菌用工程菌及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抑菌用工程菌及其制备方法和应用，具体公开了所述工程菌中具有释放模块、药物合成模块、释放模块启动模块和释放模块抑制模块；所述释放模块包含能够翻译分泌蛋白和或裂解蛋白的基因；释放模块中的能够翻译分泌蛋白和或裂解蛋白的基因的启动子能够被抗终止蛋白启动，抗终止蛋白能够在工程菌内合成，且抗终止蛋白合成需要启动子激活物启动；释放模块启动模块包含能够翻译提高宿主菌中启动子激活物含量的基因；释放模块抑制模块包含能够翻译降低宿主菌中启动子激活物含量的基因；药物合成模块包含能够翻译活性蛋白的基因。本发明工程菌可工业化生产，抗菌效果好，能够用于伤口愈合。

Description

一种抑菌用工程菌及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药生物领域，具体涉及一种抑菌用工程菌及其制备方法和应用。
背景技术
皮肤是人体自身保护的第一道屏障，不仅保护人体免受污染物和细菌的感染同时保护人体水分。伤口是指皮肤撕裂或黏膜破损使身体受到伤害。伤口的出现往往伴随着细菌感染，尤其对于正在进行免疫抑制疗法、患有癌症、艾滋病等免疫系统受损的患者来说细菌感染往往给患者带来极大的痛苦，严重的时候会导致患者死亡。对于感染细菌的患者来说，使用较多的仍是抗生素类药物来治疗。随着抗生素的过度使用和滥用，越来越多的病原菌产生抗生素耐药菌株使得抗生素的治疗效果越来越差甚至完全失效。新抗生素的开发是非常有限和费时，因此寻找新的抗菌药物来代替或者减少抗生素的使用一直备受各学科研究者的关注[1]。目前已经投入临床使用或者正在研究中抗菌药物可以分为广谱型和靶向型。其中广谱型的抗菌药物主要由我们生活中经常有用来清理伤口的碘酒、酒精等有机药物、纳米粒子、各种金属粒子以及金属氧化物，以及在所有生命体系中均存在的具有正电性、高度两亲性以及广谱的抗菌性的抗菌肽。这些广谱型的抗菌药物因作用效果好、价格相对低廉或基数大、有利于应对耐药性的问题被研究者寄予众望，以期成为抗生素的替代品[2]。但是广谱型抗菌药物的无差别杀菌往往也会影响正常菌落的生长进而导致菌群紊乱，对伤口的恢复不利。因此使用靶向型的抗菌药物的研究也不断被重视起来，比如在抗生素尚未普及以及可用的种类很少之前就被广泛使用的噬菌体疗法也随着抗生素耐药性问题的不断严峻而被重新的关注起来。除此之外，具有靶向性的细菌素也逐渐被关注起来。细菌素是细菌产生可被同种细菌表面特定的受体识别转运进而发挥抗菌作用的一种毒素蛋白，因此利用野生型的细菌素或者将几种细菌素的结构域进行融合均可以得到特异功能的抗菌蛋白。
对抗细菌感染尤其是超级耐药菌感染，除了开发新的药物外如何保持抗菌药物活性减少药物在未到达作用位点时的损失也一直被关注和研究，目前药物载体研究较多的水凝胶、高分子材料和细菌纤维素膜等。然而即使对抗菌药物加以载体保护在实际使用时很多具有良好抗菌性能的抗菌药物往往因为价格昂贵很难获取而无法被实际应用起来。在此之前使用未经改造的益生菌来治疗阴道疾病、肠胃疾病以及伤口感染已经[3-5]被报道和应用。随着合成生物学的不断发展，目前已经可以人工设计构建出多种功能的工程菌。而利用细菌作为抗菌药物的生产母体和载体来治疗病原菌(铜绿假单胞菌、霍乱、沙门氏菌)感染的相关研究相继被报道[6-9]。
化学药物虽然性质稳定作用效果好但是已有研究证明施加化学药物不利于伤口愈合。天然抗菌肽和人工制造的天然抗菌肽衍生物虽然基数较大有望成为抗生素的替代物，但是在实际应用中仍然存在活性较低，生产困难、渗透性差等亟待解决的问题。而近年来又被重新重视起来的噬菌体疗法虽然特异性强但是目前噬菌体基因组的研究尚未完全明朗，因此使用噬菌体来治疗伤口感染也存在一定的基因突变等未知风险。上述的方法均存在药物渗透性差的问题，而渗透性问题不仅严重影响治疗效果而且渗透性差的问题导致药物浓度不够往往会导致处于压抑制浓度的细菌产生耐药性。目前临床中用来治疗的药物大都市未经改造的野生型细菌，主要是利用细菌在伤口表面形成一层菌膜来预防其他菌种感染或作为主要菌群来竞争性排斥其他菌种功能单一。
参考文献
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发明内容
本发明提供一种抗菌工程菌，以应对伤口感染尤其是耐药菌感染治疗中药物渗透性差、抗菌功能单一、药物靶向性差等问题。
本发明一个方面提供了一种抗菌用工程菌，所述工程菌中具有释放模块、药物合成模块、释放模块启动模块和释放模块抑制模块；
所述释放模块包含能够翻译分泌蛋白或裂解蛋白的基因，以及翻译抗终止蛋白的基因；所述的分泌蛋白能够使药物合成模块合成的活性蛋白分泌到工程菌外部，所述裂解蛋白能够裂解工程菌，使药物合成模块合成的活性蛋白释放到工程菌外部；所述释放模块中的能够翻译分泌蛋白和或裂解蛋白的基因的启动子能够被抗终止蛋白启动，所述抗终止蛋白能够在工程菌内合成，且抗终止蛋白合成需要启动子激活物启动；
所述释放模块启动模块包含能够翻译调控蛋白的基因，所述调控蛋白能够被外界刺激调控进行变构，变构后的调控蛋白能够增加工程菌内启动子激活物的含量；
所述释放模块抑制模块包含能够翻译降低宿主菌中启动子激活物含量的抑制蛋白的基因；
所述药物合成模块包含能够翻译活性蛋白的基因，所述活性蛋白包括具有抗菌效果的蛋白或抗菌肽。
优选地，所述具有抗菌效果蛋白为具有抗细菌和或抗真菌效果的蛋白或抗菌肽。
优选地，所述活性蛋白为抗菌蛋白及其免疫蛋白、抗菌肽中的至少一种。
优选地，所述抑制蛋白能够降低宿主菌中启动子激活物含量至启动子激活物无法启动抗终止蛋白的表达。
优选地，所述抑制蛋白为酶，更优选为启动子激活物的裂解酶或分解酶。例如，当启动子激活物为c-di-GMP时，抑制蛋白为FscR蛋白。
优选地，所述药物合成模块中基因通过药物合成质粒转导进工程菌中。
优选地，合成所述抗终止蛋白的基因和启动子通过质粒转导进工程菌中。
优选地，所述药物合成质粒中包含至少一种编码抗菌蛋白及其免疫蛋白的基因；
更优选地，药物合成质粒中还包含编码所述抗终止蛋白的基因和启动子。所述抗终止蛋白能够激活编码分泌蛋白和或裂解蛋白基因的启动子，在工程菌内获得分泌蛋白和或裂解蛋白；调控所述抗终止蛋白的启动子能够被启动子激活物启动，进而完成抗终止蛋白的翻译。
更优选地，所述抗终止蛋白为Q蛋白、N蛋白。
优选地，所述调控蛋白能够通过外界刺激进行变构，其中外界刺激选自物理刺激或化学刺激，更优选地，所述物理刺激选自近红外光、电磁波、温度、渗透压、外力。
优选地，所述调控蛋白选自BphS。
优选地，在未获得外界刺激时，工程菌翻译抑制蛋白，抑制蛋白分解或降低启动子激活物在工程菌中的含量，启动子激活物无法启动抗终止蛋白的翻译，同时药物合成模块在工程菌内合成抗菌蛋白及其免疫蛋白；在受到外界刺激后，所述启动子激活物的含量受变构后调控蛋白的影响而升高，并通过启动抗终止蛋白的翻译，进而启动分泌蛋白和或裂解蛋白的合成。
更优选地，所述启动子激活物选自c-di-GMP、cAMP。
优选地，所述活性蛋白选自抗菌蛋白及其免疫蛋白，抗菌蛋白选自靶向抗菌蛋白和或广谱抗菌蛋白。
优选地，所述抗菌蛋白为至少两种抗菌蛋白或抗菌肽的融合蛋白或融合肽。
更优选地，所述抗菌蛋白选自绿脓杆菌素S2蛋白、绿脓杆菌素S3、绿脓杆菌素S4、大肠杆菌素E3蛋白、大肠杆菌素Ia、大肠杆菌素Ib、大肠杆菌素A、大肠杆菌素B、大肠杆菌素N、大肠杆菌素和绿脓杆菌素的融合蛋白、绿脓杆菌素和其他菌种细菌素的融合蛋白中的至少一种。
更优选地，所述活性蛋白选自S2蛋白、E3蛋白及其E3免疫蛋白IMME3的融合蛋白，或者为S2蛋白及其免疫蛋白IMMS2。
优选地，所述工程菌的宿主菌为减毒后的病原菌或益生菌。
更优选地，所述工程菌的宿主菌为减毒后的铜绿假单胞菌，例如，通过将铜绿假单胞菌中的vfr、exoS、exoT基因敲除实现减毒。
优选地，所述能够翻译活性蛋白的基因的上游还包含核糖体结合位点。
更优选地，所述核糖体结合位点如序列SEQ ID NO.6-17任一项所述。
优选地，所述的裂解蛋白选自LKD裂解蛋白、S105蛋白、X174蛋白。
本发明另一个方面提供上述工程菌的制备方法，其包括如下步骤：
1)制备质粒：所述质粒中包含至少一种编码活性蛋白，还包含编码抗终止蛋白的基因；
2)将质粒转导入宿主菌内获得工程菌，所述的宿主菌中包含沉默的释放模块，释放模块启动模块，释放模块抑制模块；
所述沉默的释放模块包含需要被抗终止蛋白启动转录的分泌蛋白和或裂解蛋白的基因；
所述释放模块启动模块包含能够翻译调控蛋白的基因，所述调控蛋白能够被外界刺激调控进行变构，变构后的调控蛋白能够增加宿主菌内启动子激活物的含量；
所述释放模块抑制模块包含能够翻译降低宿主菌中启动子激活物含量的抑制蛋白的基因。
本发明又一个方面提供了上述工程菌在制备抗菌药物中的用途。
优选地，上述工程菌在制备抗皮肤感染的药物中的用途。
本发明又一个方面提供了在制备促进伤口愈合的药物中的用途。
本发明再一个方面提供一种抗菌药物组合物，所述抗菌药物组合物包含至少一种上述工程菌。
本发明再一个方面提供一种促进伤口愈合的方法，所述方法中包含将上述工程菌施用于伤口的步骤。
优选地，所述上述工程菌作为抗菌药物组合物中的活性成分。
有益效果
1)本发明首次通过合成生物学的方法在野生型的细菌内进行基因回路设计和构建，制备获得了可以工业化生产的工程细菌，这使得本发明的工程菌制备方法可控，能够大规模用于医药用途。
2)本发明的工程菌保有野生型菌种治疗的优势，利用细菌在伤口表面形成一层菌膜来预防其他菌种感染或作为主要菌群来竞争性排斥其他菌种。
3)对工程菌的宿主细胞进行基因改造，获得的减毒的致病菌，能够激起机体自身免疫反应，实现自身免疫治疗的目的。
4)使用细菌作为药物表达载体具有良好的渗透性，同时表达靶向抗菌药物可以避免在治疗铜绿假单胞菌感染的同时对机体正常菌群生长造成影响
5)本发明的工程菌能够通过外部因素调节，例如，通过近红外光调控，实现抗菌药物释放的可调控。
6)以工程菌来表达抗菌药物同时又可以作为抗菌药物载体，能够保持抗菌药物活性减少抗菌药物治疗损失。
附图说明
图1：基因回路示意图，其中A:LPS菌株体内基因回路示意图；B:靶向抗菌蛋白及其免疫蛋白的质粒图谱；C.工程菌基因回路示意图，其中TOX为S2和SE蛋白基因的总称，imm为IMME3和IMMS2蛋白基因的总称。
图2：SE-LPS和S2-LPS菌抗菌范围验证：A.PAO1、Q-LPS、S2-LPS、SE-LPS菌在PAO1板中光照组和避光组的抑菌圈图。B.ΔS2i、Q-LPS、S2-LPS、SE-LPS菌在ΔS2i板中光照组和避光组的抑菌圈图。
图3：老鼠伤口感染模型：A.PBS、PAO1、+Q-LPS、+SE-LPS组小鼠第二天、第四天以及第十天的小鼠伤口照片。B.PBS、PAO1、+Q-LPS、+SE-LPS组伤口面积随治疗时间的变化图。C.治疗第三天时PBS,PAO1,+Q-LPS,+SE-LPS组小鼠伤口面积统计图。D.治疗第九到15天PBS,PAO1,+Q-LPS,+SE-LPS组小鼠伤口愈合比例图。图中PBS为未感染组，PAO1为感染但未治疗组，PAO1+Q-LPS简称+Q-LPS为感染后加入Q-LPS近红外光光照裂解但无药物释放组，PAO1+SE-LPS简称+SE-LPS为感染后加入SE-LPS近红外光光照裂解且有药物释放组。显著性检验中***代表P值<0.001，ns代表P值>0.05。
具体实施方式
本发明一些具体的技术方案中提供了一种抗菌用工程菌，所述工程菌中具有释放模块、药物合成模块、释放模块启动模块和释放模块抑制模块；
所述释放模块包含能够翻译分泌蛋白和或裂解蛋白的基因，以及能够翻译抗终止蛋白的基因；所述的分泌蛋白能够使药物合成模块合成的活性蛋白分泌到工程菌外部，所述裂解蛋白能够裂解工程菌，使药物合成模块合成的活性蛋白释放到工程菌外部；所述释放模块中的能够翻译分泌蛋白和或裂解蛋白的基因的启动子能够被抗终止蛋白启动，所述抗终止蛋白能够在工程菌内合成，且抗终止蛋白合成需要启动子激活物启动；
所述释放模块启动模块包含能够翻译调控蛋白的基因，所述调控蛋白能够被外界刺激调控进行变构，变构后的调控蛋白能够增加工程菌内启动子激活物的含量；
所述释放模块抑制模块包含能够翻译降低宿主菌中启动子激活物含量的抑制蛋白的基因；
所述药物合成模块包含能够翻译活性蛋白的基因，所述活性蛋白包括具有抗菌效果的蛋白。
在本发明的具体实施方案中，所述的活性蛋白可以为任意具有活性的通过基因翻译获得的抗菌肽或蛋白，在工程菌内活性蛋白的种类可以是一种或者多种。所述活性蛋白可以为抗菌肽，也可以为核酸酶等。在一些具体的实施例中，所述的活性蛋白能够抑制细菌、真菌或病毒的繁殖，杀灭细菌真菌或病毒，或降低细菌、真多或病毒的数量。
在本发明的具体实施方案中，所述活性蛋白为抗菌蛋白及其免疫蛋白、抗菌肽中的至少一种。所述免疫蛋白与抗菌蛋白以复合物的形式结合在一起，避免抗菌蛋白对于宿主细胞的产生损害。在一个具体的技术方案中，所述的活性蛋白为绿脓杆菌素S2与大肠杆菌素E3蛋白的融合蛋白SE，以及免疫蛋白IMME3的复合物。由于本发明的方法通过裂解或分泌的方式将活性蛋白排出，所以能够在工程菌中合成的任意具有活性的蛋白均可。
在本发明的具体实施方案中，所述抑制蛋白能够降低宿主菌中启动子激活物含量至启动子激活物无法启动抗终止蛋白的表达。所述的抑制蛋白通过常规启动子进行启动翻译，在未受到外界刺激时，抑制蛋白正常合成，进而抑制启动子激活物的含量，进一步地，无法启动裂解蛋白或分泌蛋白的合成。同时药物合成模块中的活性蛋白能够在宿主菌体内积累。
在本发明的具体实施方案中，所述抑制蛋白为酶，例如为启动子激活物的裂解酶或分解酶。在一个具体的实施方案中，当启动子激活物为c-di-GMP时，抑制蛋白为FscR蛋白。
在本发明的具体实施方案中，所述药物合成模块通过药物合成质粒转导进工程菌中。
在本发明的具体实施方案中，合成所述抗终止蛋白的基因和启动子通过质粒转导进工程菌中。
在本发明的具体实施方案中，通过质粒将部分基因转导到宿主菌中，所述质粒中包含至少一种编码活性蛋白的基因；还包含编码所述抗终止蛋白的基因和启动子。所述抗终止蛋白能够激活编码分泌蛋白和或裂解蛋白基因的启动子，在工程菌内合成分泌蛋白和或裂解蛋白；调控所述抗终止蛋白的启动子能够被启动子激活物启动，进而完成抗终止蛋白的翻译。在一个具体的实施方案中，所述抗终止蛋白为Q蛋白。
在本发明的具体实施方案中，所述调控蛋白能够通过外界刺激进行变构，其中外界刺激选自物理刺激或化学刺激，例如，所述物理刺激选自近红外光、电磁波、温度、渗透压、外力。变构后的调控蛋白能够增加启动子激活物的含量，使启动子激活物的含量达到能够启动抗终止蛋白转录翻译的水平。进而实现通过外界刺激，一步步诱发在宿主菌体内积累的活性蛋白的释放或分泌。具体地，在未获得外界刺激时，工程菌翻译抑制蛋白，抑制蛋白分解或降低启动子激活物在工程菌中的含量，启动子激活物无法启动抗终止蛋白的翻译，同时药物合成模块在工程菌内合成抗菌蛋白及其免疫蛋白；在受到外界刺激后，所述启动子激活物的含量受变构后调控蛋白的影响而升高，并通过启动抗终止蛋白的翻译，进而启动分泌蛋白和或裂解蛋白的合成。
在一个具体的实施方案中，所述调控蛋白选自BphS，所述启动子激活物选自c-di-GMP，所述的裂解蛋白选自LKD蛋白。
在本发明的具体实施方案中，所述活性蛋白选自抗菌蛋白及其免疫蛋白，抗菌蛋白选自靶向抗菌蛋白和或广谱抗菌蛋白。所述抗菌蛋白选自绿脓杆菌素S2蛋白、绿脓杆菌素S3、绿脓杆菌素S4、大肠杆菌素E3蛋白、大肠杆菌素Ia、大肠杆菌素Ib、大肠杆菌素A、大肠杆菌素B、大肠杆菌素N、大肠杆菌素和绿脓杆菌素的融合蛋白、绿脓杆菌素和其他菌种细菌素的融合蛋白中的至少一种。例如，所述活性蛋白选自S2蛋白、E3蛋白及其E3免疫蛋白IMME3的融合蛋白，或者为S2蛋白及其免疫蛋白IMMS2，或者例如，本发明SEQ ID NO.1-5所示。
在本发明的具体实施方案中，所述工程菌的宿主菌为减毒后的病原菌或益生菌。例如，工程菌的宿主菌为减毒后的铜绿假单胞菌，通过将铜绿假单胞菌中的vfr、exoS、exoT基因敲除实现减毒。此外，宿主菌中基因组中还需要插入释放模块、释放模块启动模块和释放模块抑制模块中的编码调控蛋白、抑制蛋白以及分泌蛋白或裂解蛋白的基因。
在本发明的具体实施方案中，所述能够翻译活性蛋白的基因的上游还包含核糖体结合位点。核糖体结合位点能够调节活性蛋白的表达量的大小。例如本发明采用了SEQ IDNO.6-17任一项所述RBS序列。
本发明另一个方面提供上述工程菌的制备方法，其包括如下步骤：
1)制备质粒：所述质粒中包含药物合成模块中的至少一种编码活性蛋白的基因，还包含编码抗终止蛋白的基因；
2)将质粒转导入宿主菌内获得工程菌，所述的宿主菌中包含沉默的释放模块，释放模块启动模块，释放模块抑制模块；
所述沉默的释放模块包含能够翻译分泌蛋白和或裂解蛋白的基因，且该基因的启动子能够被抗终止蛋白启动；
所述释放模块启动模块包含能够翻译调控蛋白的基因，所述调控蛋白能够被外界刺激调控进行变构，变构后的调控蛋白能够增加宿主菌内启动子激活物的含量；
所述释放模块抑制模块包含能够翻译降低宿主菌中启动子激活物含量的抑制蛋白的基因。
在本发明的具体技术方案中，所述沉默的释放模块中的翻译分泌蛋白和或裂解蛋白的基因，能够被释放模块中的翻译抗终止蛋白的基因翻译获得的抗终止蛋白激活启动子，进而激活翻译分泌蛋白和或裂解蛋白的基因，并完成译分泌蛋白和或裂解蛋白的表达。
本发明又一个方面提供了上述工程菌在制备抗菌药物中的用途。
在本发明的具体技术方案中，上述工程菌在制备抗皮肤感染的药物中的用途。
本发明又一个方面提供了在制备促进伤口愈合的药物中的用途。
本发明再一个方面提供一种抗菌药物组合物，所述抗菌药物组合物包含至少一种上述工程菌。
在本发明的具体技术方案中，药物组合物为外用药物。
在本发明的具体技术方案中，所述上述工程菌作为抗菌药物组合物中的活性成分。
本发明具体实施方案中还提供了一种降低伤口感染和或提高伤口愈合的方法，所述方法包括将包含上述工程菌的制剂施用于伤口的步骤。
在本发明中，术语“免疫蛋白”指能够与对应的具有抗菌功能的蛋白结合，使其无法在细菌内发挥抗菌效果的蛋白。
为了使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
本发明一些具体的实施例中的工程菌基因回路设计：
具体地，如图1A所示，选用基因组中插入可被抗终止蛋白Q调控表达的pR’-tR’启动子-终止子系统来表达裂解蛋白LKD、常启动子表达C-di-GMP分解酶FcsR以及近红外光光照后变构的C-di-GMP合成酶BphS的LPS菌株作为宿主菌株。其中LPS菌株通过铜绿假单胞野生型菌株PAO1基因组插入LKD裂解基因、bphS以及fcsR基因后又敲除vfr、exoS、exoT基因获得。
其中，近红外光光照后变构的c-di-GMP合成酶BphS，能够在获得红外光刺激后改变构型并将GTP合成为c-di-GMP。而c-di-GMP分解酶FcsR能够将c-di-GMP分解为pGpG。
如图1B所示，构建质粒，其中包含能够翻译活性蛋白的基因以及翻译抗终止蛋白的基因，所述活性蛋白包括具有抗菌效果蛋白及其免疫蛋白，还可以包含抑菌肽。所述抗终止蛋白Q蛋白的启动子能够被C-di-GMP激活启动。而抗终止蛋白Q蛋白又能够启动裂解基因的启动子，进而启动释放模块。
通过电击转化的方法将构建的质粒转入宿主菌LPS中，工程菌内基因回路如图1C所示，按功能可将工程菌体内基因回路分成四个模块：释放模块抑制模块、释放模块激活模块、释放模块以及药物合成模块。通过模块之间的相互的作用保证了细菌在光照和避光情况下发挥不同的功能。在黑暗的情况下工程菌内释放模块启动模块处于沉默状态因此释放模块抑制模块维持工程菌体内C-di-GMP水平为零或者处于很低的状态，而低的C-di-GMP水平无法开启裂解模块，细菌可以正常生长。同时正常生长的工程菌内药物合成模块的不间断表达使得抗菌蛋白和免疫蛋白复合体在工程菌内不断累积。当将工程菌从黑暗模式转为近红光光照模式后，工程菌体内释放模块启动模块开始工作使得细菌体内C-di-GMP水平提高进而开启细菌体内释放模块裂解工程菌同时释放累积的靶向抗菌药物进行靶向抗铜绿假单胞菌治疗。
实施例1质粒构建
RBSn-S2-PUCP20和RBSn-SE-PUCP20表达载体：融合蛋白SE+IMME3是由S2蛋白(1-1674bp)和E3+IMME3(1350-1923bp)通过吉布森连接法(Gibson assembly)得到。其中S2及其免疫蛋白IMMS2基因来自本实验室铜绿假单胞菌株PAO1基因组，E3及其免疫蛋白IMME3基因由上海生工生物工程有限公司合成。将末端加入终止子B1006对转录进行终止的IMMS2和IMME3基因片段分别插入本实验室载体质粒PcdrA-Q-T0/T1-PUCP20的T0/T1双终止子后，得到PcdrA-Q-T0/T1-J23108-RBSII-IMMS2-PUCP20和PcdrA-Q-T0/T1-J23108-RBSII-IMME3-PUCP20质粒。构建一系列不同强度的RBS的S2和SE片段分别反向插入PcdrA-Q-T0/T1-J23108-RBSII-IMMS2-PUCP20和PcdrA-Q-T0/T1-J23108-RBSII-IMME3-PUCP20的J23108启动子前，获得一系列不同S2表达量的质粒RBSn-S2-PUCP20：PcdrA-Q-T0/T1-PA1O4O3-RBSn-S2-J23108-RBSII-IMMS2-B1006-PUCP20和一系列不同SE表达量的质粒RBSn-SE-PUCP20质粒：PcdrA-Q-T0/T1-PR-RBSn-SE-J23108-RBSII-IMME3-B1006-PUCP20。构建得到的质粒图谱见图1B，其中RBSn代表不同的RBS，RBS名称和序列见实施例2中的表2。
如图1B所示，其中Q为抗终止蛋白，且抗终止蛋白Q的启动子PcdrA能够被C-di-GMP激活转录。其中，S2蛋白为绿脓杆菌素S2，IMMS2为绿脓杆菌素S2的免疫蛋白，SE融合绿脓杆菌素为绿脓杆菌素S2蛋白(1-1674bp)和大肠杆菌素E3的融合蛋白，IMME3为大肠杆菌素E3的免疫蛋白。
RBSn-S2-PUCP20系列质粒中包含的靶向抗铜绿假单胞菌的抗菌蛋白及免疫蛋白为绿脓杆菌素S2及其免疫蛋白IMMS2；RBSn-SE-PUCP20系列质粒中包含的靶向抗铜绿假单胞菌的抗菌蛋白及免疫蛋白为融合绿脓杆菌素SE及其免疫蛋白IMME3。
此外还准备了对照组质粒，对照组质粒为不包含靶向抗铜绿假单胞菌的抗菌蛋白及免疫蛋白的载体质粒PcdrA-Q-T0/T1-PUCP20。
其中编码的氨基酸序列见表1。
表1 靶向抗菌蛋白及其免疫蛋白的氨基酸序列融合蛋白SE氨基酸序列中斜体部分(1-557)氨基酸序列来自绿脓杆菌素S2蛋白，下划线部分(558-659)氨基酸序列部分来自大肠杆菌素E3.
Figure BDA0003169230730000101
Figure BDA0003169230730000111
Figure BDA0003169230730000121
实施例2工程菌构建以及不同RBS强度的SEn-LPS和S2n-LPS菌批量抑菌圈筛选实验宿主菌LPS
如图1A所示，选用基因组中插入可被抗终止蛋白Q调控表达的pR’-tR’启动子-终止子系统来表达裂解蛋白LKD、常启动子表达C-di-GMP分解酶FcsR以及近红外光光照后变构的C-di-GMP合成酶BphS的LPS菌株作为宿主菌株。其中LPS菌株通过铜绿假单胞野生型菌株PAO1基因组插入LKD裂解基因、bphS以及fcsR基因后又敲除vfr、exoS、exoT基因获得。
其中，近红外光光照后变构的c-di-GMP合成酶BphS，能够在获得红外光刺激后改变构型并将GTP合成为c-di-GMP。而c-di-GMP分解酶FcsR能够将c-di-GMP分解为pGpG。
通过电击转化(2.5KV,2ms)的方法将实施例1中制备得到包含不同RBS序列(RBS序列见下表2)的质粒以及对照组质粒PcdrA-Q-T0/T1-PUCP20分别转入LPS宿主菌株中得到包含不同RBS序列的工程菌以及可以响应近红外光裂解但无药物合成模块的对照菌种，以SEn-LPS、S2n-LPS和Q-LPS表示。
表2 实验中批量筛选使用的RBS名称及其对应序列
Figure BDA0003169230730000122
Figure BDA0003169230730000131
测试实验前期准备：
PAO1、ΔS2i菌以及不同RBS表达量的S2n-LPS和SEn-LPS菌株以及对照组Q-LPS菌实验前一天晚上从-80℃冰箱保种管里划线于LB+Gen30琼脂板上，第二天挑菌用FAB培养基加1μmol氯化铁、30mmol谷氨酸盐、30μg/mL的庆大抗生素(简记为FAB+++)的3mL培养，培养至OD600值约为1.0。其中，PAO1为野生铜绿假单胞菌，ΔS2i为基因组敲除S2蛋白及其免疫蛋白的IMMS2的PAO1菌。
实验操作：
将实验中所用的菌OD600统一到0.8，将PAO1和、ΔS2i菌分别与60℃的FAB++++0.25％琼脂按1：200中混匀后每9cm的培养皿中加入25mL混合液，室温下风干25分钟得到的培养板命名为PAO1板和ΔS2i板。将OD统一到0.8的不同RBS表达量的PAO1、ΔS2i、Q-LPS、S2n-LPS、SEn-LPS分别吸750μL离心(10000rpm,2min)后弃上清液并用50μL FAB+++培养基重悬得到重悬液。将不同RBS表达量的S2n-LPS、Q-LPS和ΔS2i重悬液分别吸1.5μL刺入ΔS2i板中，将不同RBS表达量的SEn-LPS、Q-LPS和PAO1重悬液分别吸1.5μL刺入PAO1板中。然后将刺入菌的PAO1和ΔS2i板分别在近红外光照和避光条件下25℃培养18小时后拍照比较抑菌圈大小。
经批量抑菌圈筛选实验发现，PAO1板上的PAO1菌与ΔS2i板上的ΔS2i菌在光照与避光下培养均可形成相同大小的白色菌圈，即PAO1与ΔS2i菌生长不受近红外光照影响；在PAO1板和ΔS2i板上的Q-LPS菌在避光条件培养下均可以正常生长而在近红外光照时发生裂解。这是因为在避光条件下Q-LPS菌体内释放模块抑制模块抑制了释放模块的开启，而使用近红外光光照时释放模块启动模块启动使得释放模块表达进而细菌发生裂解。响应近红外光光照裂解后的Q-LPS菌在PAO1板上未形成抑菌圈而在ΔS2i板上形成轻微的抑菌圈这是因为Q-LPS菌基因组中含有S2及其免疫蛋白基因,故近红外光控制裂解后可以释放少量的S2+IMMS2复合体可杀死没有免疫蛋白IMMS2的ΔS2i菌，故没有药物合成模块的工程菌响应近红外光裂解后对含有免疫蛋白IMMS2的铜绿假单胞菌无法产生抑制作用而对不含免疫蛋白IMMS2的铜绿假单胞菌无法产生明显的抑菌效果；在PAO1板培养的SEn-LPS与在ΔS2i板培养的S2n-LPS生长情况相似，所有菌在避光条件下可以正常生长并且无抑菌圈产生而在近红外光光照条件下均可裂解并且依据抗菌蛋白表达量的不同形成不同大小的抑菌圈，即有药物合成模块的工程菌裂解后均可对没对应免疫蛋白(IMMS2/IMME3)的铜绿假单胞菌产生抑菌效果。通过相同培养时间和条件下抑菌圈大小的比较，筛选得到对PAO1菌抑菌效果最适当的工程菌(其中SE蛋白RBS为RBS1000)命名为SE-LPS和对ΔS2i菌抑菌效果最适当的工程菌(其中S2蛋白RBS为RBS400)命名为S2-LPS并进行进一步实验。
实施例3体外抗菌实验
实验操作：
将实验中所用的菌OD600统一到0.8，将PAO1和、ΔS2i菌分别与60℃的FAB++++0.25％琼脂按1：200中混匀后每6cm的培养皿中加入11mL混合液，室温下风干25分钟得到的培养板命名为PAO1板和ΔS2i板。将OD统一到0.8的PAO1、ΔS2i、S2-LPS、SE-LPS、Q-LPS菌吸分别750μL离心(10000rpm,2min)后弃上清液并用50μL FAB+++培养基重悬得到重悬液。将PAO1或ΔS2i、Q-LPS、S2-LPS、SE-LPS、菌的重悬液分别吸1.5μL刺入PAO1板和ΔS2i板中，然后将刺入菌的PAO1和ΔS2i板分别在近红外光照和避光条件下25℃培养18小时后拍照。
结果如图2所示，其中A为PAO1、Q-LPS、S2-LPS、SE-LPS菌在PAO1板中光照与避光培养18小时的实验结果；B为ΔS2i、Q-LPS、S2-LPS、SE-LPS菌在ΔS2i板中光照与避光培养18小时的实验结果。图A和图B中的左图均为在近红外光照条件下培养的结果，而右图均为在避光条件下培养的结果。
如图2A,2B右图所示，PAO1和ΔS2i板上菌种在避光情况下均形成白色菌圈，即所有菌种在避光条件下均可正常生长；如图2A,2B左图所示，PAO1和ΔS2i在近红外光光照条件形成与避光条件下相同大小的白色菌圈，即其的生长不受近红外光照影响；Q-LPS菌在PAO1和ΔS2i板上近红外光照后均发生裂解但只有在ΔS2i板上形成轻微的抑菌圈，这是因为Q-LPS菌基因组中含有S2及其免疫蛋白基因,故近红外光控制裂解后可以释放少量S2+IMMS2复合体杀死无免疫蛋白IMMS2的ΔS2i菌而无法杀死含有免疫蛋白IMMS2的PAO1菌；同样的，工程菌S2-LPS菌在PAO1和ΔS2i板上近红外光照后均发生裂解但只有在ΔS2i板上形成抑菌圈，且工程菌S2-LPS菌在ΔS2i板上形成的抑菌圈远远大于相同条件下Q-LPS菌形成的抑菌圈。即使用药物合成模块表达绿脓杆菌素S2及其免疫蛋白可以大大的促进细菌的抗菌能力同时使用包括S2在内的绿脓杆菌素作为靶向抗菌药物时仅可作用于基因组中不含对应免疫蛋白的铜绿假单胞菌，作用范围较窄；与S2-LPS不同，SE-LPS菌在PAO1和ΔS2i板上均可响应近红外光光照裂解并形成明显的抑菌圈。这是由于SE蛋白是由绿脓杆菌素S2蛋白的特异性识别和转运域与大肠杆菌素E3蛋白核酸域以及免疫蛋白IMME3融合而来，融合后的SE蛋白具有绿脓杆菌素S2的靶向性质同时因其对应的免疫蛋白为大肠杆菌素E3的免疫蛋白IMME3，而绿脓杆菌中不可能具有大肠杆菌的免疫蛋白，所以SE-LPS可以杀死对S2-LPS免疫的铜绿假单胞菌，相比S2-LPS菌具有更广的抗铜绿假单胞菌范围。
综上所述，本发明的S2-LPS、SE-LPS工程菌均能够在避光条件下正常生长此时工程菌内抗菌蛋白及其免疫蛋白通过形成1：1复合体的形式保护宿主菌种正常生长并不断累积，当使用近红外光照后工程菌均可发生裂解并释放靶向抗菌药物，且两种菌靶向抑菌作用均十分明显。且工程菌SE-LPS既可以靶向的作用于铜绿假单胞菌同时相比工程菌S2-LPS具有更广的抗菌范围。
实施例4动物皮损抗菌实验
选用抗菌范围更广的SE-LPS菌株在老鼠模型中证明其良好的靶向抗铜绿假单胞菌能力和以及提前促进伤口愈合能力。
老鼠实验：
实验前期准备：
6至8周的雌性BALB/c小鼠，腹腔注射1％戊巴比妥钠(45mg/kg)麻醉后用电动剃须刀将每只动物的背部毛刮干净，然后用脱毛剂做脱毛处理。SE-LPS、Q-LPS和PAO1菌株实验前一天晚上从-80度冰箱保种管里划线于LB+Gen30琼脂板上，第二天挑单克隆菌斑用3毫升FAB+++培养基培养至对数期(OD600≈0.3-0.6)。
实验方法
选用6至8周的雌性BALB/c，首先将小鼠背部用剪刀剪出一个10毫米的圆形(78.5mm2)区域，形成切除伤口。然后将伤口形成的小鼠分组，每6-7只一组，分为未感染组(PBS)、感染未治疗组(PAO1)、感染治疗但无药物释放组(+Q-LPS)、感染治疗有药物释放组(+SE-LPS)。
对于PBS组的小鼠，形成伤口五分钟后，对其伤口滴加50μL PBS缓冲液孵育30分钟；对于其他三组的小鼠，形成伤口五分钟后首先向伤口滴加50μL含有109cfu的PAO1的PBS悬液孵育30分钟造成感染，随后向PAO1组滴加50μL PBS缓冲液孵育三十分钟；向+Q-LPS组滴加50μL(菌量为2×109cfu)近红外光光照后可以裂解但是无药物释放的Q-LPS菌孵育三十分钟；向+SE-LPS组滴加50μL近红外光光照后可以裂解且有药物释放的SE-LPS菌孵育三十分钟。
孵育结束后用透明绷带缠绕在每个小鼠伤口处保护刮皮肤的伤口；650nm激光辐照下饲养小鼠每天统计小鼠的伤口面积。治疗15天后，所有小鼠经颈椎脱位处死。
实验结果见图3，图3A为四组小鼠在第二天、第六天、第十天的伤口照片，可以看到随着受伤时间的增加四组老鼠伤口均在不断变小，其中+SE-LPS组与PBS组伤口面积相近，+Q-LPS组和PAO1组相近，且+SE-LPS与PBS组伤口面积明显小于+Q-LPS和PAO1组。说明本发明所构建的工程菌对老鼠伤口表面感染的铜绿假单胞菌具有良好的治疗效果并且这种治疗效果是因为裂解后抗菌药物SE而非细菌裂解后释放的内毒素或其他绿脓杆菌素。通过记录四组小鼠每天伤口面积(图3B)，可以发现+SE-LPS治疗见效快，在第二天的时候伤口面积开始明显的小于PAO1组，并且+SE-LPS治疗其后的老鼠伤口完全愈合时间对比PAO1和+Q-LPS组也大大的缩短。如图3C所示在对感染小鼠治疗的第三天就可以明显的看到+SE-LPS组老鼠伤口大小与未感染组的PBS相近且明显的小于感染未治疗的PAO1组以及感染治疗但无药物释放组(+Q-LPS)。即本发明的治疗菌种在老鼠伤口模型中可以有效抑制铜绿假单胞菌并且在第三天的时候伤口的愈合速度就已经与未感染组基本持平并且远小于未治疗组。图3D分别统计了四组小鼠中伤口完全愈合每组小鼠总数的比例，通过统计可以发现+SE-LPS组愈合时间早于未感染的PBS组早于PAO1组早于+Q-LPS组。其中+SE-LPS组在第十天的时候已有小鼠伤口开始愈合并且第十一天的时候+SE-LPS组中所有小鼠已经完全愈合，而PAO1组的小鼠从第十二天才开始愈合并且直到第十五天仍然有一只老鼠伤口未愈合。说明本发明工程菌不仅可以有效抑制老鼠伤口中的铜绿假单胞菌感染而且可以大大缩短感染铜绿假单胞细菌的伤口愈合时间。
在本发明中，野生型铜绿假单胞菌PAO1及改造后的铜绿假单胞菌LPS菌、ΔS2i菌均来自本发明人实验室。大肠杆菌TOP10菌株用于质粒构建和增殖。在所有实验中，大肠杆菌均使用含有适当抗生素的LB肉汤用作生长培养基，铜绿假单胞菌均使用含有适当抗生素的FAB培养基用作生长培养基。大肠杆菌培养中庆大抗生素使用浓度为15μg/mL，对于铜绿假单胞菌中庆大抗生素使用浓度为30μg/mL。所有的实验中，如非特别说明培养温度均为37℃，摇床转速均为200rpm。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院深圳先进技术研究院
<120> 一种抑菌用工程菌及其制备方法和应用
<130> CP121010470C
<160> 17
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 689
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Ala Val Asn Asp Tyr Glu Pro Gly Ser Met Val Ile Thr His Val
1 5 10 15
Gln Gly Gly Gly Arg Asp Ile Ile Gln Tyr Ile Pro Ala Arg Ser Ser
20 25 30
Tyr Gly Thr Pro Pro Phe Val Pro Pro Gly Pro Ser Pro Tyr Val Gly
35 40 45
Thr Gly Met Gln Glu Tyr Arg Lys Leu Arg Ser Thr Leu Asp Lys Ser
50 55 60
His Ser Glu Leu Lys Lys Asn Leu Lys Asn Glu Thr Leu Lys Glu Val
65 70 75 80
Asp Glu Leu Lys Ser Glu Ala Gly Leu Pro Gly Lys Ala Val Ser Ala
85 90 95
Asn Asp Ile Arg Asp Glu Lys Ser Ile Val Asp Ala Leu Met Asp Ala
100 105 110
Lys Ala Lys Ser Leu Lys Ala Ile Glu Asp Arg Pro Ala Asn Leu Tyr
115 120 125
Thr Ala Ser Asp Phe Pro Gln Lys Ser Glu Ser Met Tyr Gln Ser Gln
130 135 140
Leu Leu Ala Ser Arg Lys Phe Tyr Gly Glu Phe Leu Asp Arg His Met
145 150 155 160
Ser Glu Leu Ala Lys Ala Tyr Ser Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Gln Ile
165 170 175
Ala Ile Leu Lys Gln Thr Ser Gln Glu Leu Glu Asn Lys Ala Arg Ser
180 185 190
Leu Glu Ala Glu Ala Gln Arg Ala Ala Ala Glu Val Glu Ala Asp Tyr
195 200 205
Lys Ala Arg Lys Ala Asn Val Glu Lys Lys Val Gln Ser Glu Leu Asp
210 215 220
Gln Ala Gly Asn Ala Leu Pro Gln Leu Thr Asn Pro Thr Pro Glu Gln
225 230 235 240
Trp Leu Glu Arg Ala Thr Gln Leu Val Thr Gln Ala Ile Ala Asn Lys
245 250 255
Lys Lys Leu Gln Thr Ala Asn Asn Ala Leu Ile Ala Lys Ala Pro Asn
260 265 270
Ala Leu Glu Lys Gln Lys Ala Thr Tyr Asn Ala Asp Leu Leu Val Asp
275 280 285
Glu Ile Ala Ser Leu Gln Ala Arg Leu Asp Lys Leu Asn Ala Glu Thr
290 295 300
Ala Arg Arg Lys Glu Ile Ala Arg Gln Ala Ala Ile Arg Ala Ala Asn
305 310 315 320
Thr Tyr Ala Met Pro Ala Asn Gly Ser Val Val Ala Thr Ala Ala Gly
325 330 335
Arg Gly Leu Ile Gln Val Ala Gln Gly Ala Ala Ser Leu Ala Gln Ala
340 345 350
Ile Ser Asp Ala Ile Ala Val Leu Gly Arg Val Leu Ala Ser Ala Pro
355 360 365
Ser Val Met Ala Val Gly Phe Ala Ser Leu Thr Tyr Ser Ser Arg Thr
370 375 380
Ala Glu Gln Trp Gln Asp Gln Thr Pro Asp Ser Val Arg Tyr Ala Leu
385 390 395 400
Gly Met Asp Ala Ala Lys Leu Gly Leu Pro Pro Ser Val Asn Leu Asn
405 410 415
Ala Val Ala Lys Ala Ser Gly Thr Val Asp Leu Pro Met Arg Leu Thr
420 425 430
Asn Glu Ala Arg Gly Asn Thr Thr Thr Leu Ser Val Val Ser Thr Asp
435 440 445
Gly Val Ser Val Pro Lys Ala Val Pro Val Arg Met Ala Ala Tyr Asn
450 455 460
Ala Thr Thr Gly Leu Tyr Glu Val Thr Val Pro Ser Thr Thr Ala Glu
465 470 475 480
Ala Pro Pro Leu Ile Leu Thr Trp Thr Pro Ala Ser Pro Pro Gly Asn
485 490 495
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Lys
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<211> 93
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Pro Gly Ile Pro Lys Thr Pro Lys Gln Asn Gly Gly Gly Lys Arg Lys
485 490 495
Arg Trp Thr Gly Asp Lys Gly Arg Lys Ile Tyr Glu Trp Asp Ser Gln
500 505 510
His Gly Glu Leu Glu Gly Tyr Arg Ala Ser Asp Gly Gln His Leu Gly
515 520 525
Ser Phe Asp Pro Lys Thr Gly Asn Gln Leu Lys Gly Pro Asp Pro Lys
530 535 540
Arg Asn Ile Lys Lys Tyr Leu
545 550
<210> 4
<211> 85
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Gly Leu Lys Leu Asp Leu Thr Trp Phe Asp Lys Ser Thr Glu Asp
1 5 10 15
Phe Lys Gly Glu Glu Tyr Ser Lys Asp Phe Gly Asp Asp Gly Ser Val
20 25 30
Met Glu Ser Leu Gly Val Pro Phe Lys Asp Asn Val Asn Asn Gly Cys
35 40 45
Phe Asp Val Ile Ala Glu Trp Val Pro Leu Leu Gln Pro Tyr Phe Asn
50 55 60
His Gln Ile Asp Ile Ser Asp Asn Glu Tyr Phe Val Ser Phe Asp Tyr
65 70 75 80
Arg Asp Gly Asp Trp
85
<210> 5
<211> 659
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Met Ala Val Asn Asp Tyr Glu Pro Gly Ser Met Val Ile Thr His Val
1 5 10 15
Gln Gly Gly Gly Arg Asp Ile Ile Gln Tyr Ile Pro Ala Arg Ser Ser
20 25 30
Tyr Gly Thr Pro Pro Phe Val Pro Pro Gly Pro Ser Pro Tyr Val Gly
35 40 45
Thr Gly Met Gln Glu Tyr Arg Lys Leu Arg Ser Thr Leu Asp Lys Ser
50 55 60
His Ser Glu Leu Lys Lys Asn Leu Lys Asn Glu Thr Leu Lys Glu Val
65 70 75 80
Asp Glu Leu Lys Ser Glu Ala Gly Leu Pro Gly Lys Ala Val Ser Ala
85 90 95
Asn Asp Ile Arg Asp Glu Lys Ser Ile Val Asp Ala Leu Met Asp Ala
100 105 110
Lys Ala Lys Ser Leu Lys Ala Ile Glu Asp Arg Pro Ala Asn Leu Tyr
115 120 125
Thr Ala Ser Asp Phe Pro Gln Lys Ser Glu Ser Met Tyr Gln Ser Gln
130 135 140
Leu Leu Ala Ser Arg Lys Phe Tyr Gly Glu Phe Leu Asp Arg His Met
145 150 155 160
Ser Glu Leu Ala Lys Ala Tyr Ser Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Gln Ile
165 170 175
Ala Ile Leu Lys Gln Thr Ser Gln Glu Leu Glu Asn Lys Ala Arg Ser
180 185 190
Leu Glu Ala Glu Ala Gln Arg Ala Ala Ala Glu Val Glu Ala Asp Tyr
195 200 205
Lys Ala Arg Lys Ala Asn Val Glu Lys Lys Val Gln Ser Glu Leu Asp
210 215 220
Gln Ala Gly Asn Ala Leu Pro Gln Leu Thr Asn Pro Thr Pro Glu Gln
225 230 235 240
Trp Leu Glu Arg Ala Thr Gln Leu Val Thr Gln Ala Ile Ala Asn Lys
245 250 255
Lys Lys Leu Gln Thr Ala Asn Asn Ala Leu Ile Ala Lys Ala Pro Asn
260 265 270
Ala Leu Glu Lys Gln Lys Ala Thr Tyr Asn Ala Asp Leu Leu Val Asp
275 280 285
Glu Ile Ala Ser Leu Gln Ala Arg Leu Asp Lys Leu Asn Ala Glu Thr
290 295 300
Ala Arg Arg Lys Glu Ile Ala Arg Gln Ala Ala Ile Arg Ala Ala Asn
305 310 315 320
Thr Tyr Ala Met Pro Ala Asn Gly Ser Val Val Ala Thr Ala Ala Gly
325 330 335
Arg Gly Leu Ile Gln Val Ala Gln Gly Ala Ala Ser Leu Ala Gln Ala
340 345 350
Ile Ser Asp Ala Ile Ala Val Leu Gly Arg Val Leu Ala Ser Ala Pro
355 360 365
Ser Val Met Ala Val Gly Phe Ala Ser Leu Thr Tyr Ser Ser Arg Thr
370 375 380
Ala Glu Gln Trp Gln Asp Gln Thr Pro Asp Ser Val Arg Tyr Ala Leu
385 390 395 400
Gly Met Asp Ala Ala Lys Leu Gly Leu Pro Pro Ser Val Asn Leu Asn
405 410 415
Ala Val Ala Lys Ala Ser Gly Thr Val Asp Leu Pro Met Arg Leu Thr
420 425 430
Asn Glu Ala Arg Gly Asn Thr Thr Thr Leu Ser Val Val Ser Thr Asp
435 440 445
Gly Val Ser Val Pro Lys Ala Val Pro Val Arg Met Ala Ala Tyr Asn
450 455 460
Ala Thr Thr Gly Leu Tyr Glu Val Thr Val Pro Ser Thr Thr Ala Glu
465 470 475 480
Ala Pro Pro Leu Ile Leu Thr Trp Thr Pro Ala Ser Pro Pro Gly Asn
485 490 495
Gln Asn Pro Ser Ser Thr Thr Pro Val Val Pro Lys Pro Val Pro Val
500 505 510
Tyr Glu Gly Ala Thr Leu Thr Pro Val Lys Ala Thr Pro Glu Thr Tyr
515 520 525
Pro Gly Val Ile Thr Leu Pro Glu Asp Leu Ile Ile Gly Phe Pro Ala
530 535 540
Asp Ser Gly Ile Lys Pro Ile Tyr Val Met Phe Arg Asp Pro Asn Lys
545 550 555 560
Pro Arg Lys Gly Phe Lys Asp Tyr Gly His Asp Tyr His Pro Ala Pro
565 570 575
Lys Thr Glu Asn Ile Lys Gly Leu Gly Asp Leu Lys Pro Gly Ile Pro
580 585 590
Lys Thr Pro Lys Gln Asn Gly Gly Gly Lys Arg Lys Arg Trp Thr Gly
595 600 605
Asp Lys Gly Arg Lys Ile Tyr Glu Trp Asp Ser Gln His Gly Glu Leu
610 615 620
Glu Gly Tyr Arg Ala Ser Asp Gly Gln His Leu Gly Ser Phe Asp Pro
625 630 635 640
Lys Thr Gly Asn Gln Leu Lys Gly Pro Asp Pro Lys Arg Asn Ile Lys
645 650 655
Lys Tyr Leu
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctggtcttaa atttataagg gttagcgcat a 31
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tttacatttc ccactaaggt ccttttt 27
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atatatagta gtacgatata gtagagcgga aaa 33
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
atttagaaaa aaaaaaaggc acaact 26
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cttccctcaa ataggattag ctt 23
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cttcaaacta ctactcaagt agagaccagt a 31
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
attctattca cttagattaa taaagcta 28
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
taataagcgc aagcaaaggg ctgg 24
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gagcactaaa taagtagcgc cgtt 24
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
aaggtagact caaactttga gtaacag 27
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
aatccggaca ccagcaaagg aaatccttg 29
<210> 17
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
aagaaggaga 10

Claims (10)

1.一种抗菌用工程菌，其特征在于，所述工程菌中具有释放模块、药物合成模块、释放模块启动模块和释放模块抑制模块；
所述释放模块包含能够翻译分泌蛋白和或裂解蛋白的基因，以及能够翻译抗终止蛋白的基因；所述的分泌蛋白能够使药物合成模块合成的活性蛋白分泌到工程菌外部，所述裂解蛋白能够裂解工程菌，使药物合成模块合成的活性蛋白释放到工程菌外部；所述释放模块中的能够翻译分泌蛋白和或裂解蛋白的基因的启动子能够被抗终止蛋白启动，所述抗终止蛋白能够在工程菌内合成，且抗终止蛋白合成需要启动子激活物启动；
所述释放模块启动模块包含能够翻译调控蛋白的基因，所述调控蛋白能够被外界刺激调控进行变构，变构后的调控蛋白能够增加工程菌内启动子激活物的含量；
所述释放模块抑制模块包含能够翻译降低宿主菌中启动子激活物含量的抑制蛋白的基因；
所述药物合成模块包含能够翻译活性蛋白的基因，所述活性蛋白包括具有抗菌效果的蛋白或抗菌肽。
2.根据权利要求1所述的抗菌用工程菌，其特征在于，所述抑制蛋白能够降低宿主菌中启动子激活物含量至启动子激活物无法启动抗终止蛋白的水平；
优选地，所述抑制蛋白为酶；
更优选地，所述抑制蛋白为启动子激活物的裂解酶或分解酶；
更优选地，启动子激活物为c-di-GMP时，抑制蛋白为FscR蛋白。
3.根据权利要求1所述的抗菌用工程菌，其特征在于，所述药物合成模块中基因通过药物合成质粒转导进工程菌中；
优选地，所述药物合成质粒中包含至少一种编码抗菌蛋白及其免疫蛋白的基因；以及编码所述抗终止蛋白的基因和启动子；
更优先地，所述抗终止蛋白选自Q蛋白、N蛋白。
4.根据权利要求1所述的抗菌用工程菌，其特征在于，调控蛋白能够通过外界刺激进行变构，其中外界刺激选自物理刺激或化学刺激；
优选地，所述物理刺激选自近红外光、电磁波、温度、渗透压、外力；
更优选地，启动子激活物为c-di-GMP时，调控蛋白选自BphS。
5.根据权利要求1所述的抗菌用工程菌，其特征在于，所述活性蛋白选自抗菌蛋白及其免疫蛋白，所述抗菌蛋白选自靶向抗菌蛋白和或广谱抗菌蛋白；
优选地，所述抗菌蛋白为至少两种抗菌蛋白的融合蛋白；
优选地，所述抗菌蛋白选自绿脓杆菌素S2蛋白、绿脓杆菌素S3、绿脓杆菌素S4、大肠杆菌素E3蛋白、大肠杆菌素Ia、大肠杆菌素Ib、大肠杆菌素A、大肠杆菌素B、大肠杆菌素N、大肠杆菌素和绿脓杆菌素的融合蛋白、绿脓杆菌素和其他菌种细菌素的融合蛋白中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的抗菌用工程菌，其特征在于，所述工程菌的宿主菌为减毒后的病原菌或益生菌；
优选地，所述宿主菌基因组中还插入了入释放模块、释放模块启动模块和释放模块抑制模块中的编码调控蛋白、抑制蛋白以及分泌蛋白或裂解蛋白的基因；
更优选地，所述的裂解蛋白选自LKD蛋白、S105蛋白、X174蛋白。
7.根据权利要求1所述的抗菌用工程菌，其特征在于，能够翻译活性蛋白的基因的上游还包含核糖体结合位点。
8.根据权利要求1-7任一项所述的工程菌的制备方法，其包括如下步骤：
1)制备质粒：所述质粒中包含至少一种编码活性蛋白，还包含能够翻译抗终止蛋白的基因；
2)将质粒转导入宿主菌内获得工程菌，所述的宿主菌中包含沉默的释放模块，释放模块启动模块，释放模块抑制模块；
所述沉默的释放模块包含能够翻译分泌蛋白和或裂解蛋白的基因，且该基因的启动子能够被抗终止蛋白启动；
所述释放模块启动模块包含能够翻译调控蛋白的基因，所述调控蛋白能够被外界刺激调控进行变构，变构后的调控蛋白能够增加宿主菌内启动子激活物的含量；
所述释放模块抑制模块包含能够翻译降低宿主菌中启动子激活物含量的抑制蛋白的基因。
9.根据权利要求1-7任一项所述的抗菌用工程菌在制备抗菌药物，或在制备促进伤口愈合的药物的用途；
优选地，上述抗菌用工程菌在制备抗皮肤感染的药物中的用途；
更优选地，所述的抗菌药物为抗细菌药物或抗真菌药物。
10.一种抗菌药物组合物或者一种促进伤口愈合的药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的至少一种权利要求1-7任一项所述的抗菌用工程菌。
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