CN115612717A - 微量细胞的精确转移方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种细胞的精确转移方法,用于减少转移中产生的细胞数量损失,精确地转移极微量的细胞。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域,具体涉及一种细胞的精确转移方法,及用于所述方法的组合物。
背景技术
在细胞实验中,将一定量的细胞从一个容器转移至另一个容器是一种非常常见的操作。在获取少量细胞时,目前通常采用将大量细胞进行梯度稀释的方法进行。在细胞量大于103(一千个)的情况下,这样的方法是适用的,即使在移液枪头上粘附少量细胞,也不会造成较大的误差。
然而,当需要移取的细胞量更少,例如所取细胞量小于103个,特别是取小于10个时,会因一部分细胞被吸附在移液枪头(吸头)内壁上而无法精确地确定细胞数。这种吸附对转移方法形成了限制,即使重复多次,实际转移的细胞数量仍旧会存在较大的误差。
目前市场上存在经过表面处理以降低枪头吸附性的产品(例如,通过等离子体表面处理获得的疏水性低吸附枪头),但这样的产品主要是为了更好地转移液体,其对细胞仍存在一定的吸附性,不适用于对吸取细胞数量的精确度要求较高、且细胞量极少的情况。作为这样的对吸取细胞数量的精确度要求较高、且细胞量极少的情况,可列举如单细胞测序、单细胞分离、捕获、单细胞内核酸量分析以及终末分化细胞中原始干细胞的残留量检测、辅助生殖技术等。因此,本领域仍然需要一种简便且普适的能够准确移取少量或微量细胞的方法。
发明内容
发明人为了解决现有在转移微量细胞时由于细胞与转移工具的粘附而造成细胞数不准确,损失细胞的问题进行了深入试验,发现通过在拾取细胞前使用对细胞温和的表面活性剂浸入细胞转移构件(可列举,移液枪头),使得打出细胞后,细胞转移构件中完全不留有细胞。换言之,使待转移的细胞能够被完全转移,不因为与细胞转移构件的粘附而遗留在细胞转移构件中,从而实现数量精准地转移。
本发明涉及一种少量细胞特别是极微量细胞的转移方法,及用于所述方法的润湿剂组合物。所述润湿剂组合物含有表面活性剂,用于在移动细胞前浸湿或浸润细胞转移构件。
因此,本发明提供以下方面。
第一方面,一种细胞转移方法,包括
1)用表面活性剂预处理细胞转移构件;以及2)使用1)中经过预处理的所述细胞转移构件吸取并转移细胞。
所述预处理为将细胞转移构件浸润并最终排空,所述浸润包括从细胞转移构件反复吸放表面活性剂数次。
第二方面,上述方法,其中被转移的细胞数优选为小于103个/次,更优选为小于102个/次,所述细胞为常见传代细胞系或原代细胞。
被转移的细胞数优选为小于103个/次,更优选为小于102个/次。
第三方面,一种用于细胞转移的润湿剂组合物,其包含表面活性剂。
所述表面活性剂可以为非离子表面活性剂,更优选选自Triton-X类, Tween类,进一步优选为Triton-X100或Tween20。所述润湿剂组合物中可包含例如0.1%~0.05%的Triton-X类或Tween类化合物,优选为 0.01%Triton-X100或0.01%的Tween20。
第四方面,一种细胞转移构件套装,包括细胞转移构件和第三方面所述的润湿剂组合物。所述细胞转移构件具有开口端和负压端。
所述细胞转移构件可以为一次性灭菌移液枪头(有无滤芯不限)、注射器针头、玻璃吸管、聚乙烯吸管,细长的微针等。所述细胞转移构件优选为食品级PP制的移液枪头,枪头的规格优选为200~10μL。枪头开口端口径可以为10-20μm。
优选地,所述第三方面的润湿剂组合物被预先制备好并单独包装于无菌管内,更优选所述无菌管具有能够使细胞转移构件的开口端伸入的部分。
第五方面,一种组合物在降低细胞转移构件的表面吸附中的用途。所述组合物包含非离子表面活性剂。
本发明的方法实现了对极微量细胞的精确转移,便于进行单细胞测序(单细胞分离捕获)、单细胞内核酸量的分析以及终末分化细胞中原始干细胞的残留量检测等。
本发明的方法用于利用气压将包含细胞的液体(例如培养)基进行转移,使得从构件排出液体后,细胞尽可能地被排出而不残留在该构件中。需要说明的是,本发明的方法并不意在以任何方式将细胞控制或停留在细胞转移构件中,或控制在该构件中的特定位置。
需要说明的是,本发明的方法的目的在于减少转移时因粘附引起的细胞数量的误差,实现彻底地转移的同时也保护细胞的完整。
本方法适用于103个以下,102个以下,特别适用于1~10个细胞的转移。本发明的方法重点并不在于降低被转移液体的体积误差,或降低分析物中非细胞的液体部分与吸头的粘附。
本发明的方法的优势至少在于如下方面。
效率高:本发明的方法提高了以微量数量转移细胞时的效率,即使细胞数较少,也能做到完全转移。
节约材料:本发明的方法大大减少了因挂壁或粘附而损失的细胞,提高了生物材料或分析样品的利用率。
实用性:本发明的方法操作简单,实施便利,不需要对细胞转移设备和细胞转移构件进行复杂的设计或进行复杂的处理,可以兼容现在大多数微量吸头、针头、微管等。使用的原料为实验室中常用的试剂,不需单独购买,因此实用性高。
适用性广:本发明的方法适用于具有细胞结构的生物样本,对细胞的类型和细胞转移构件的类型没有限制。所述方法对被转移的细胞没有影响,不易造成细胞破裂,不影响细胞活力。本发明的方法可以与细胞转移、分析、分离、分类、显微操作等检测系统组合。
无污染:本发明的方法使用的原料为实验室中常用的试剂,对实验操作人员无毒无害,操作过程也不产生任何污染。使用过的移液吸头可按正常试验废料标准进行废弃、回收等。
附图说明
图1为使用了不同种类的表面活性剂浸润后,转移细胞后枪头内残留细胞的镜下照片。
图2为使用了不同浓度的TritonX-100浸润后,转移细胞后枪头内残留细胞的镜下照片。
发明详述
定义
表面活性剂
术语“表面活性剂”指用于降低两种液体之间、气体和液体之间或液体和固体之间的表面张力的物质。表面活性剂可分为阳离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂、两性型表面活性剂。
术语“非离子表面活性剂”指具有不带电的极性基团的表面活性剂。非离子表面活性剂在水中不解离,亲水基团通常是甘油、聚乙二醇和山梨醇等多元醇,亲油基团通常是长链脂肪酸或长链脂肪醇以及烷基或芳基等。
非离子表面活性剂包括了大量不同类型和结构的化合物,如长链脂肪醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚、脂肪酸聚氧乙烯酯、聚氧乙烯烷基胺、聚氧乙烯烷基酰胺和聚醚类,聚(氧化烯)嵌段共聚物等。作为生物实验室常用的种类,具体可列举X系列、聚山梨酯类表面活性剂等。
式中,x表示醚侧链中环氧乙烷单位的平均数量。
Triton X-114 | x=7-8 |
Triton X-100 | x=9-10 |
Triton X-405(70%active) | x=40 |
Triton X-100指聚乙二醇辛基苯基醚(T-octylphenoxypolyethoxyethan ol)。
术语“聚山梨酯类”化合物或表面活性剂:聚山梨酯(PS)是一类两亲性,非离子表面活性剂家族,来自被脂肪酸酯化的乙氧基化脱水山梨糖醇或异山梨醇(山梨糖醇的衍生物)。
术语“吐温类”化合物或表面活性剂为聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯,商品名为吐温(Tween)。与司盘(Span)的命名相对应,可列举吐温(Tween)20(聚山梨酯20)、Tween40(聚山梨酯40)、Tween60(聚山梨酯60)、Tween65(聚山梨酯65)、Tween80(聚山梨酯80)和Tween85(聚山梨酯85)等多种。
细胞转移构件
术语“细胞转移构件”在本申请的上拿下文中包括生物学上能够用于转移细胞的器件。可举例的实例包括生物医学移液管、收尖吸头 (移液枪头)、微量吸头、注射器针头、毛细玻璃吸管等。本发明能够使用的细胞转移构件需要具有用于吸取细胞的开口端和能够提供负的压强的负压端。
术语“移液枪头”一般指塑料制的生物收尖吸头,包括直头、弯头、带分隔结构的枪头、带滤芯的枪头、柔性可涂布枪头、计量吸头等。作为本申请使用的移液枪头,为能够吸取和打出含细胞的液体的部分 (吸液部)内壁是光滑的那些即可。
生物方法
术语“单细胞测序(Single-cell sequencing)”指通过分离单个细胞,捕获他们的转录本,生成测序文库,测序文库中的转录本被映射到单个细胞。在单个细胞水平上对基因组或转录组进行提取扩增和高通量测序分析。
术语“显微操作”在本文中指在显微镜等显微装置下进行的接近细胞尺度数量级的试验操作。
细胞材料
单次被转移的细胞数量可以为小于103个细胞,优选为10~102个细胞,更优选为1~10个细胞。被转移的细胞可以为传代的细胞系或原代细胞。需要说明的是,被转移的细胞不限于以单个细胞(离散的细胞) 或细胞聚集体的形式存在,也不要求必须在排出时一次仅排出单个细胞 (细胞数为1个/次)。
可被检测的细胞样品:培养的细胞、组织、器官;经酶消化后的细胞悬液;含有细胞的体液如尿、血液、组织液;或在常用细胞等渗溶液(如,生理盐水,各种细胞培养基,PBS,PBST等)中的细胞。
用途
本发明的方法和润湿剂组合物可以广泛用于对细胞数量精确度要求较高且细胞量较少的试验。作为这样的试验,可列举单细胞测序(单细胞分离捕获)、单细胞内核酸量的分析以及终末分化细胞中原始干细胞的残留量检测,单细胞的转录组学分析,蛋白质组学分析,原核注射,分离病毒亚型等。
本发明包括以下内容。
1.细胞转移方法,所述方法包含以下步骤:
1)用表面活性剂预处理细胞转移构件;
2)使用1)中经预处理的所述细胞转移构件吸取并转移细胞。
2.上述项1的方法,其中步骤1)在吸取细胞的1min前进行,例如10s-1min,优选10-30s前进行。
3.上述项1或2的方法,其中所述预处理为浸润细胞转移构件并最终排空,所述浸润包括从细胞转移构件反复吸放表面活性剂大于3 次,优选为3~5次;所述排空为在所述细胞转移构件内无肉眼可见的液体;所述吸放为以移液器所调最大量程吸放即可。
4.上述项1-3中任一项的方法,其中所述表面活性剂包括非离子表面活性剂,所述非离子表面活性剂选自Triton-X类和Tween类,
Triton-X类包括Triton X-114、Triton X-100、Triton X-405;
Tween类包括Tween20(聚山梨酯20)、Tween40(聚山梨酯40)、 Tween60(聚山梨酯60)、Tween65(聚山梨酯65)、Tween80(聚山梨酯80) 和Tween85(聚山梨酯85);
作为Triton-X类优选为TritonX-100,
作为Tween类优选为Tween20。
5.上述任一项的方法,其中被转移的细胞数优选为小于103个/ 次,更优选为小于102个/次,更优选为10~1个。
6.上述任一项的方法,其中单次吸取的表面活性剂的体积可根据移液器所调量程设定,以最大量程吸放;优选反复吸放的次数为3~5 次。
7.上述任一项的方法,其中所述细胞转移构件具有开口端和负压端,所述细胞转移构件选自一次性灭菌移液枪头(有无滤芯不限)、注射器针头、玻璃吸管、聚乙烯吸管,细长的微针等;
优选地,所述细胞转移构件为一次性灭菌移液枪头;移液枪头的规格优选为200~10μL,枪头开口端口径为10-20μm。
8.上述任一项的方法,其中所述细胞为常见传代细胞系和原代细胞,例如293T,B16F10,HCT116和人多能干细胞等。
9.一种用于细胞转移的润湿剂组合物,其包含表面活性剂。
所述表面活性剂为非离子表面活性剂,更优选选自Triton-X类, Tween类,进一步优选为Triton-X100或Tween20。所述润湿剂组合物可包含例如0.1%~0.05%的Triton-X类或Tween类化合物,优选包含 0.01%Triton-X100或0.01%的Tween20。
10.一种细胞转移构件套装,包括细胞转移构件和项9所述的润湿剂组合物。
11.项10所述的套装,其中,所述第三方面的润湿剂组合物被预先制备好并单独包装于无菌管内,每管内包含润湿剂组合物 500~1000μL。
12.项11所述的套装,其中,所述无菌管被构成为能用于浸润细胞转移构件的吸取端。
13.包含非离子表面活性剂的组合物在降低细胞转移构件的表面吸附中的用途。
14.项9所述的用途,其中,所述非离子表面活性剂选自Triton-X 类,Tween类。
15.项9所述的用途,其中所述非离子表面活性剂的浓度为 0.01%~0.05%。
16.表面活性剂在制备用于微量细胞转移的润湿剂组合物中的用途,所述表面活性剂为非离子表面活性剂,更优选选自Triton-X类, Tween类,进一步优选为Triton-X100或Tween20。所述润湿剂组合物可包含例如0.1%~0.05%的Triton-X类或Tween类化合物,优选包含 0.01%Triton-X100或0.01%的Tween20,所述微量细胞转移为每次转移小于103个细胞,更优选为小于102个洗标,更优选为10~1个细胞。
具体实施方式
在一个具体实施方式中,本发明的方法包括以下步骤:
1)配制在细胞培养基或PBS中含有Triton类化合物或Tween类化合物的溶液作为润湿剂组合物,其中Triton类化合物的浓度可以为0.01-0. 05%,Tween类化合物的浓度可以为0.01-0.05%;
2)准备含有待转移的细胞的生理盐水、无菌PBS或细胞培养基;
3)将移液枪头安装到移液器上,在1)的润湿剂组合物中吸打3~5次,最后一次将枪头中的剩余液体排空;
4)用3)得到的移液枪头吸取2)的含细胞的液体并放出液体至目的容器。
在一个实施方式中,可使用的表面活性剂为细胞裂解性温和的表面活性剂,例如非离子表面活性剂。
作为非离子表面活性剂,可举例:聚乙二醇p-1,1,3,3-四甲基丁基苯基醚,聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100),叔辛基酚聚氧乙烯醚(POE(3) tert-octylphenol,TritonX-114),壬基酚聚氧乙烯醚(TritonX-405,70%活性物),Tween20等。非离子表面活性剂优选为TritonX类和Tween类,更优选为TritonX-100和Tween20。
在一个实施方式中,作为非离子表面活性剂的浓度范围,可举例 0.01%~0.05%。
在一个实施方式中,每组单次转移细胞液的体积为200~10μL,优选为50~10μL。
在一个实施方式中,非离子表面活性剂可以预制为储备液,在临用时稀释储备液而使用。
在一个实施方式中,移液枪头为塑料制生物收尖吸头,可举例包括直头、弯头、带分隔结构的枪头、带滤芯的枪头、柔性可涂布枪头、计量吸头,能够吸取和打出含细胞的液体的部分(吸液部)内壁是光滑的各种枪头。
在一个实施方式中,本方法可以与已经历低吸附处理的移液枪头如:商用低吸附枪头、硅化枪头、等离子化处理枪头等组合使用。
在一个实施方式中,被转移的细胞可以为小于103个细胞,优选为 10~102个细胞,更优选为1~10个细胞。
实施例
为了进一步说明本发明,举出以下实施例。这些实施例仅用于说明本发明的实施方式,并不用于限定本发明的范围。
实施例1.本发明的处理方法与低吸附枪头的对比
本实施例中使用了商用的低吸附移液枪头(Axygen,货号TF10-2-CS) 作为低吸附吸头对照,使用了(Axygen货号:T-300-R-S)移液枪头作为常规枪头。两种枪头均采用了通用的白色10μL规格。
材料:293T细胞。
试验操作如下。
1.用PBS分别配制0.01%TritonX-100和0.01%Tween20溶液;
2.收集细胞并计数,溶于PBS/培养基中获得细胞密度为105/mL的细胞溶液;
3.将细胞分为四组,移液枪头(吸头)分别做如下处理,
1)常规吸头组(阴性对照组),用常规吸头直接吸取并转移细胞;
2)常规吸头+0.01%Triton组,用常规吸头,在0.01%Triton溶液中浸润并来回吸放3次,然后吸取并转移细胞;
3)常规吸头+0.01%Tween组,用常规吸头,在0.01%Tween溶液中浸润并来回吸放3次,然后吸取并转移细胞;
4)低吸附吸头组(阳性对照组),用低吸附吸头直接吸取并转移细胞;每组单次转移细胞液的体积为10μL。
每个移液枪头在安装到移液器上后,在表面活性剂浸润液中吸打3 次,最后一次排净枪头中的剩余表面活性剂。
4.将含细胞的液体排空后,在显微镜下观察上述吸头及被转移的细胞,分别拍照记录在转移细胞后吸头内壁的细胞残留情况。
结果显示:常规吸头组吸取并转移细胞后,在内壁中残留较多的细胞(图1最左列,箭头示出细胞);低吸附吸头组在吸取并转移细胞后,在内壁残留的细胞虽然少于常规吸头组,但仍然残留了一定量的细胞(图1 最右列中箭头所示)。相比之下,在0.01%TritonX-100或0.01%Tween20 溶液中浸润过的常规吸头中,内壁没有残留任何细胞(图1中间的两列)。另外,通过显微镜下观察也确认了被转移的细胞的形态完整。
从上述观察结果可知,本发明的细胞转移方法可以提供优于商用低吸附处理枪头的效果。
进一步,可以期待本发明的细胞转移方法与商用低吸附处理枪头组合使用。
实施例2.不同浓度表面活性剂的处理效果比较
在本实施例中,使用了Triton的浓度梯度润湿移液枪头,进一步确定了Triton的最适使用浓度。
材料
细胞类型:293T细胞。
润湿液:用PBS配制的1%、0.1%、0.01%、0.005%TritonX-100溶液。
分组,共六组:
(1)常规枪头组,
(2)常规枪头+1%组,
(3)常规枪头+0.1%组,
(4)常规枪头+0.05%组,
(5)常规枪头+0.01%组,和
(6)常规枪头+0.005%组。
使用同实施例1的试验步骤进行了试验,区别在于使用的 TritonX-100的浓度不同,细胞类型不同。将结果示于图2。
结果显示,在常规对照组中,在枪头的内壁可见到明显的细胞残留 (图2左上小图,箭头示出细胞);在常规枪头+0.005%组中,也观察到少量细胞残留;在常规枪头+1%组,常规枪头+0.1%组,常规枪头+0.05%组,常规枪头+0.01%组中,均获得了理想的转移结果,无细胞残留(图2)。领内外,通过显微镜下观察也确认了被转移的细胞的形态完整。
考虑到枪头内残留的Triton体积显著少于吸取的含细胞的液体体积,即,吸起细胞时,吸头中的Triton X-100终浓度要远小于用于浸润的浓度,因此在用于本发明的方法和组合物时,用于浸润的Triton类浓度可推荐为0.1%-0.05%,优选所述浓度为0.01%-0.05%。
Claims (10)
1.细胞转移方法,所述方法包含以下步骤:
1)用表面活性剂预处理细胞转移构件;
2)使用1)中经预处理的细胞转移构件吸取并转移细胞。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述预处理通过将所述细胞转移构件浸润并排空进行,所述浸润包括用所述细胞转移构件反复吸入放表面活性剂大于3次。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述表面活性剂包括非离子表面活性剂,所述非离子表面活性剂选自Triton-X类和Tween类。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的方法,其中步骤1)在吸取细胞的1min,例如10s~1min,优选10~30s前进行。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的方法,其中被转移的细胞数优选为小于103个/次,更优选为小于102个/次。
6.根据权利要求1~5中任一项所述的方法,其中Tween类包括Tween20、Tween40、Tween60、Tween65、Tween80和Tween85;
Triton-X类包括Triton X-114、Triton X-100和Triton X-405。
7.根据权利要求1~6中任一项所述的方法,其中所述细胞转移构件具有开口端和负压端,
所述细胞转移构件为一次性灭菌移液枪头(有无滤芯不限)、注射器针头、玻璃吸管、聚乙烯吸管或细长的微针。
8.根据权利要求1~7中任一项所述的方法,其中所述细胞转移构件为一次性灭菌移液枪头,移液枪头的规格为200~10μL。
9.一种用于细胞转移的润湿剂组合物,其包含表面活性剂,所述表面活性剂为非离子表面活性剂。
10.一种细胞转移构件套装,包括细胞转移构件和权利要求9所述的润湿剂组合物。
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CN113150687A (zh) * | 2021-03-17 | 2021-07-23 | 苏州亚通生物医疗科技有限公司 | 移液枪头防粘附疏水涂层配方及生产工艺 |
CN114728154A (zh) * | 2019-10-09 | 2022-07-08 | 瓦克塞斯技术公司 | 基于丝素蛋白的微针及其用途 |
-
2022
- 2022-10-20 CN CN202211288170.5A patent/CN115612717A/zh active Pending
Patent Citations (3)
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CN110369011A (zh) * | 2019-06-25 | 2019-10-25 | 东南大学 | 基于液压驱动的微量液体转移装置、控制设备及控制方法 |
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