CN115607671A - 一种提高运动皮层尿石素a浓度的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种提高运动皮层尿石素A浓度的方法及应用，涉及超声联合微泡技术领域。本发明提供了一种提高运动皮层尿石素A浓度的方法，经试验证实可知，采用本发明所述方法对ALS转基因小鼠进行为期6周的治疗，治疗结束后发现超声联合微泡给药组小鼠的握力显著提高，爬杆时间显著缩短，悬挂时间显著延长。同时，超声联合微泡给药组小鼠SOD1蛋白表达水平显著降低了44.1％，延缓了运动神经元丢失和萎缩程度。本发明所述方法可提高尿石素A的生物利用率，并更加有效地延缓了ALS小鼠的疾病进展。

Description

一种提高运动皮层尿石素A浓度的方法及应用
技术领域
本发明涉及超声联合微泡技术领域，具体涉及一种提高运动皮层尿石素A浓度的方法及应用。
背景技术
肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)也被称为渐冻人症，是一种致命性的神经退行性疾病，其病理特征是上、下运动神经的选择性丢失，临床表现为肌肉萎缩，吞咽、呼吸困难等，给患者及其家庭带来巨大的心理和经济压力。至今为止，FDA仅批准了利鲁唑和依达拉奉这两种药物用于治疗ALS，但都只能起到一定的延缓作用。近20年来，超过50种对ALS进行治疗的药物在临床试验转化中接连失败，利用药物治疗ALS始终需要面临的瓶颈问题在于中枢神经系统中的血脑屏障(Blood-brain barrier，BBB)，它是介于中枢神经系统和外周血液循环系统之间的网状结构，主要由脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞、周细胞共同组成基底膜而构成高度复杂的动态屏障，通常情况下，BBB只允许分子量小于400Da且具有脂溶性的小分子穿过，阻止了有害物质由血液进入脑实质，从而维持了中枢神经系统的正常生理活动，保证了脑内环境的高度稳定。但也正因如此，BBB导致许多潜在治疗大脑疾病的药物不能有效进入脑组织而使得疾病治疗效果欠佳。跨血脑屏障递送药物的传统方式有注射有害物质或高渗溶液、脑室内或鞘内注射、药物脂溶性修饰、内源性介导的转运系统、电磁场等，以上方法会造成中枢神经系统不可逆损伤、药物吸收率过低等后果。
尿石素A(Urolithin A，UA)是由鞣花酸EA经肠道菌群代谢后产生的天然代谢产物，EA可通过广泛存在于水果、坚果中的鞣花单宁水解后而得到，UA的分子式为C13H8O4，分子量为228.2Da，有研究表明UA具有抗炎、增强线粒体自噬和改善线粒体功能的作用。然而，现在缺乏递送尿石素A入脑对ALS进行治疗的相关记载。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种提高运动皮层尿石素A浓度的方法，通过超声联合微泡技术安全开放运动皮层区的血脑屏障来提高尿石素A的入脑效率，可提高尿石素A的生物利用率。
为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种提高运动皮层尿石素A浓度的方法，所述方法包括如下步骤：
口服尿石素A后静脉注射微泡溶液，然后向两侧脑运动皮层区定向施加超声；所述超声的频率范围为0.5MHz-3MHz，负声压峰值为0.3MPa-0.5MPa，脉冲重复频率为1Hz-10Hz，脉宽为10000周期数-100000周期数。
优选的，所述尿石素A的给药剂量为50mg/kg-200mg/kg。
优选的，口服尿石素A10-14h后进行静脉注射。
优选的，所述微泡溶液由微泡与生理盐水混合后得到。
更优选的，所述微泡由如下步骤制备得到：
将DSPC和DSPE-PEG-2000混合后置于装有氯仿的茄形瓶中，旋蒸成膜后加入缓冲液，经加热、振荡后用全氟丙烷置换液面上方空气即得所述微泡。
更优选的，所述DSPC和DSPE-PEG-2000按质量比9：1进行混合。
更优选的，所述缓冲液由磷酸缓冲盐溶液、丙二醇和丙三醇按体积比8：1：1的比例混合得到。
更优选的，所述微泡的平均粒径范围为1-2μm。
优选的，所述微泡溶液中微泡浓度范围为2×105/g体重-1×106/g体重。
本发明还提供了上述的方法在开放血脑屏障提高运动皮层治疗肌萎缩侧索硬化症药物浓度中的应用。
本发明提供了一种提高运动皮层尿石素A浓度的方法，通过超声联合微泡技术安全开放运动皮层区的血脑屏障来提高尿石素A的入脑效率。经试验证实可知，采用本发明所述方法对ALS转基因小鼠进行为期6周的治疗，治疗结束后发现超声联合微泡给药组小鼠的握力显著提高，爬杆时间显著缩短，悬挂时间显著延长。同时，超声联合微泡给药组小鼠比模型组的SOD1蛋白表达水平降低了44.1％，比单纯给药组降低了15.6％，且延缓了运动神经元丢失和萎缩程度，本发明超声联合微泡技术开放运动皮层区的血脑屏障递送尿石素A入脑，相对于传统的给药方式，可提高尿石素A的生物利用率，并更加有效地延缓了ALS小鼠的疾病进展。
附图说明
图1为微泡的粒径分布及浓度结果。
图2为光学显微镜下微泡的形态结果。
图3为脑伊文思蓝染色结果图，其中，图左侧为脑伊文思蓝明场图，右侧为脑伊文思蓝的荧光成像图。
图4为小鼠体内UA的平均血药浓度-时间曲线。
图5为小鼠口服UA 12h后运动皮层药物浓度与是否做超声微泡处理的对比图。
图6为小鼠握力行为学测试的结果。
图7为小鼠爬杆行为学测试的结果。
图8为小鼠悬挂行为学测试的结果。
图9为脊髓染色结果。
图10为阳性信号定量结果。
具体实施方式
本发明提供了一种提高运动皮层尿石素A浓度的方法，所述方法包括如下步骤：
口服尿石素A后静脉注射微泡溶液，然后向两侧脑运动皮层区定向施加超声；所述超声的频率范围为0.5MHz-3MHz，负声压峰值为0.3MPa-0.5MPa，脉冲重复频率为1Hz-10Hz，脉宽为10000周期数-100000周期数。
本发明中，所述超声的频率范围为0.5MHz-3MHz，优选为1-2MHz，更优选为1.1MHz；所述负声压峰值为0.3MPa-0.5MPa，优选为0.4MPa；所述脉冲重复频率为1Hz-10Hz，更优选为1Hz。本发明中，所述超声辐照时长优选为60s，所述占空比优选为1％。本发明所述的超声条件既能提高尿石素A入脑的浓度，又因为采取低值的超声参数剂量，保证了递送入脑的安全性。
本发明中，所述尿石素A的给药剂量优选为50mg/kg-200mg/kg。本发明中，优选的口服尿石素A 10-14h后进行静脉注射，更优选的口服尿石素A 12h后进行静脉注射。在本发明中，所述尿石素A(UA)为治疗肌萎缩侧索硬化症(ALS)的活性药物，通过本发明所述超声联合微泡技术开放血脑屏障，将尿石素A递送入脑对ALS转基因小鼠进行治疗，能够显著提高尿石素A入脑的浓度，提高对ALS的治疗效果。
本发明中，所述微泡溶液优选的由微泡与生理盐水混合后得到；所述微泡优选的由如下步骤制备得到：将DSPC和DSPE-PEG-2000混合后置于装有氯仿的茄形瓶中，旋蒸成膜后加入缓冲液，经加热、振荡后用全氟丙烷置换液面上方空气即得所述微泡。本发明中，所述DSPC和DSPE-PEG-2000优选的按质量比9：1进行混合。本发明中，所述缓冲液优选的由磷酸缓冲盐溶液、丙二醇和丙三醇按体积比8：1：1的比例混合得到。本发明中，所述微泡的平均粒径范围优选为1-2μm；所述微泡溶液中微泡浓度范围优选为2×105/g体重-1×106/g体重。本发明中，所述加热优选为水浴加热，所述水浴加热的温度优选为50-60℃。本发明所述微泡在与生理盐水混合前优选的利用平衡针平衡内外气压并进行高速振荡。
本发明还提供了上述的方法在开放血脑屏障提高运动皮层治疗肌萎缩侧索硬化症药物浓度中的应用。
本发明所述超声联合微泡技术是利用微泡的空化效应使BBB上的细胞产生间隙，进而达到开放BBB的效果，可以安全、可逆、局部地开放血脑屏障，且不会造成组织形态学上地损伤，相对于传统的给药方式，可提高尿石素A的生物利用率，并更加有效地延缓了ALS小鼠的疾病进展。
在本发明中，所述ALS转基因小鼠(品系：B6.Cg-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J)购自美国Jackson实验室。
本发明中，所使用的聚焦超声开放BBB的平台参见(Yuanyuan Shen,LingchenHua,Chih-Kuang Yeh,Liming Shen,Ming Ying,Zaijun Zhang,Gongping Liu,ShupengLi,Siping Chen,Xin Chen*and Xifei Yang*,Ultrasound with Microbubbles ImprovesMemory,Ameliorates Pathology and Modulates Hippocampal Proteomic Changes in aTriple Transgenic Mouse Model of Alzheimer’s Disease,Theranostics,2020；10(25):11794-11819.)。
本发明中，所有数据均采用软件GraphPad Prism 8.0进行统计学分析,计量资料以平均值±标准差的形式表示,组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)或双因素方差分析(Two-way ANOVA)，两两数据比较采用非配对t检验(unpaired Student’s t-test)。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
微泡的制备和表征
采用机械振荡法自制由脂质包裹惰性气体全氟丙烷的微泡，制备过程如下：
将DSPC和DSPE-PEG-2000按照质量比9：1的比例混合在装有氯仿的茄形瓶中，置于旋转蒸发仪上旋蒸成膜，成膜均匀之后加入磷酸缓冲盐溶液、丙二醇和丙三醇按体积比8：1：1的比例混合均匀，并使用超声波清洗机进行50～60℃水浴加热，充分振荡至液体清澈透明。将瓶中液体分装至西林瓶中，并用全氟丙烷三次置换液面上方的空气，最后将制得的微泡保存于4℃。使用前用平衡针平衡瓶内外气压，用机械混汞器将西林瓶水平高速振荡即可得到呈乳白色的微泡溶液。
通过库尔特颗粒计数仪Multisizer 4测量微泡的粒径分布及浓度，结果如图1所示。通过光学显微镜观察微泡的形态大小，结果如图2所示。
可以看出，微泡粒径大多分布在0.8-2μm之间，具有一定的分散性，测量结果平均粒径为1.384μm，制备得到的微泡浓度为2.128×109/mL。通过光学显微镜观察微泡的形态可以看出，微泡的脂质壳膜包裹着惰性气体，且尺寸大小与颗粒计数仪测量的结果几乎一致，满足开放BBB需求。
实施例2
超声联合微泡技术安全开放血脑屏障
本实施例所采用的聚焦超声开放BBB的平台主要由信号发生器、功率放大器、超声换能器、脑立体定位仪和麻醉气体系统组成。具体步骤如下：
将小鼠固定在装有麻醉气体系统和超声微泡开放BBB的脑立体定位仪上，提前打开恒温加热垫使小鼠保持体温恒定，对小鼠进行脱毛处理后再将超声探头定位到小鼠的运动皮层区，给小鼠尾静脉注射微泡和生理盐水混合液后，对小鼠两侧脑运动皮层区定向施加超声，随后注射示踪剂伊文思蓝用小动物荧光成像系统检测BBB的开放程度，结果如图3所示。其中，使用的超声参数为：中心频率为1.1MHz，负声压为0.4MPa，重复频率为1Hz，超声辐照时长为60s，占空比为1％。
可以看出，只有超声辐照区域出现了蓝染现象，未被辐照的区域没有出现蓝染，只有超声辐照的运动皮层区域出现了强烈的荧光，说明超声联合微泡成功的开放了BBB。
实施例3
尿石素A的代谢及入脑效率测定
(1)血浆内尿石素A的含量测定
取24只体重在20～22g之间的C57BL/J雌鼠，随机分为六组，每组N＝4，分别为口服UA后1h组(G1组)、6h组(G2组)、8h组(G3组)、12h组(G4组)和16h组(G5组)，口服药物剂量为200mg/kg，同时设置空白对照组(G0组)，不给予任何药物处理，以上六组到对应时间后便取血，通过液相色谱串联质谱技术定量测定血浆中UA的含量，结果如图4。
可以看出，在空白对照组中的4个血浆样品中均未检测到UA，而在其他口服了UA的五个组的血浆样品中均检测到了UA。口服UA后药物能被小鼠缓慢吸收，且在12h左右时血浆中的UA含量达到了峰值(1079.27±175.84ng/mL)。
(2)开放BBB后运动皮层内尿石素A的浓度测定
取12只体重在20～22g之间的C57BL/J雌鼠，随机分为两组，空白对照组(N＝4)不给予任何药物处理，取运动皮层进行检测，给药组(N＝8)口服UA之后12h左右开放小鼠左脑运动皮层，右脑运动皮层不作超声微泡处理，开放15min之后取血浆和运动皮层，通过液相色谱串联质谱技术定量测定血浆和运动皮层中UA的浓度，结果如图5。
可以看出，在空白对照组中的4个皮层样品中均未检测到UA，口服UA 12h后未做超声微泡处理的皮层样品和经超声微泡处理的皮层样品中均检测到UA。在未做超声微泡处理组中检测到的UA药物浓度仅有126.00±18.16ng/g，而做了超声微泡处理组中检测到的UA药物浓度可达226.30±37.05ng/g，说明UA可以进入血脑屏障，但生物利用率差，使用超声联合微泡技术可以将运动皮层区的UA药物浓度提高约1.80倍(p＜0.001)，表明超声联合微泡开放脑运动皮层技术提高了尿石素A的脑生物利用率。
实施例4
行为学测试
1、所有的行为学测试均进行两次，第一次是在开始治疗前对小鼠进行行为学检测以作基准；第二次是在治疗6周之后对小鼠进行行为学检测。其中，治疗6周所采用的治疗方法和分组情况如下：
将60只ALS雄鼠随机分成六组，分别为模型组(ALS组)、超声组(FUS组)、超声微泡组(FUS/MB组)、阳性药物对照利鲁唑组(Riluzole组)、单纯尿石素A给药组(UA组)、超声联合微泡递送尿石素A组(FUS/MB+UA组)，每组N＝10，同时取10只具有相同背景的野生型小鼠作为阴性对照(WT组)。由于ALS小鼠会在13周龄时表现出轻微运动障碍，所以本实施例从小鼠13周龄时开始治疗。
FUS/MB+UA组的给药方式为每天口服，并在此基础上一周给予2次超声微泡处理，且超声微泡处理时间要在给药后12h左右进行，给药剂量为50mg/kg，连续治疗六周。FUS/MB+UA组的具体给药流程如下：将小鼠固定在装有麻醉气体系统和超声微泡开放BBB的脑立体定位仪上，提前打开恒温加热垫使小鼠保持体温恒定，对小鼠进行脱毛处理后再将超声探头定位到小鼠的运动皮层区，给小鼠尾静脉注射微泡和生理盐水混合液后，对小鼠两侧脑运动皮层区定向施加超声。其中，超声治疗的参数为：中心频率为1.1MHz，负声压为0.4MPa，重复频率为1Hz，超声辐照时长为60s，占空比为1％
2、具体的行为学测试方法如下：
(1)握力测试
将小鼠轻放置爪抓力测定仪上，待小鼠抓住网格之后再拉住小鼠尾巴向后水平拉直，待测定仪上显示出最大拉力值且保持不变时，记录下此时的抓力值，重复三次，每次至少间隔1min，同时称重作归一化处理，最终成绩取三次测试的最大值。最终小鼠握力行为学测试的结果如图6所示。
可以看出，在小鼠开始治疗之前，WT组的握力(10.677±0.7gf/g)明显高于ALS组(8.5±0.8gf/g)及其他组，随着疾病的进一步恶化，ALS组的握力下降至4.9±0.4gf/g，下降了41.8％，治疗六周之后，UA组和FUS/MB+UA组的握力均得到了改善，且FUS/MB+UA组(6.7±0.4gf/g)相对于ALS组的握力值提高了26.02％(p<0.0001)，比UA组(5.8±0.6gf/g)的握力值高15.0％(p＝0.024)。
(2)爬杆测试
将小鼠尾巴拎起头部朝下放置在木杆的顶端，待小鼠抓牢木杆之后松开鼠尾，让小鼠顺着木杆从上至下爬行，记录从开始爬行到爬到地面的所需时间，重复三次，每次至少间隔5min以恢复体力，最终成绩取三次测试的平均值。最终小鼠爬杆行为学测试的结果如图7所示。
可以看出，在小鼠开始治疗之前，各组爬杆时间相对稳定，没有显著性差异，治疗六周之后，ALS小鼠的爬杆时间由开始的5.7±0.7s增加到11.4±1.3s，增加了一倍，对比之下，UA组(9.5±1.4s)和FUS/MB+UA组(8.0±0.6s)的爬杆时间明显缩短，UA组相对于ALS组缩短了16.67％，FUS/MB+UA组相对于ALS组缩短了29.82％(p<0.001)。
(3)悬挂测试
将小鼠放置在规格为21cm×36cm的方形网格中央，再慢慢将网格翻转，小鼠会本能地抓住网格，从翻转时开始记录悬挂时间，满分记120s，如不满120s则需继续测试，测试次数不超过3次，每次至少间隔15min以恢复体力，最终成绩取最大值。最终小鼠悬挂行为学测试的结果如图8所示。
可以看出，在小鼠13周龄接受治疗之前，WT组的悬挂时间均能达到满分120s，而其他组的悬挂会存在部分小鼠达不到满分的情况，即反映出ALS在13周龄时由于疾病的影响影响到了运动耐力，六周之后，ALS组小鼠的悬挂时间由开始的112.3±10.4s缩短到了30.6±9.3s，缩短了72.8％，经过六周治疗之后，FUS/MB+UA组(58.3±9.9s)相对于ALS组的悬挂时间提高了90.52％(p<0.0001)，比UA组(44.4±9.1s)的悬挂时间提高了31.3％(p＝0.030)。
综上可知，相对于单纯UA给药，在同样的药物剂量前提下，采用超声联合微泡技术递送UA入脑对ALS小鼠进行治疗可以改善了其肌肉力量和耐力，提升了运动速度，延缓了疾病的进展。
实施例5
病理学检测
对实施例4所述治疗前和治疗6周后的各组进行病理学检测，具体如下：
通过免疫荧光染色技术对脊髓前角的运动神经元进行B8H10和ChAT共定位免疫荧光染色，使用奥林巴斯荧光显微镜对染色后的脊髓前角切片(该切片是由组织取材进行固定，脱水完成之后进行包埋得到的冰冻切片)进行观察和采集，并对脊髓前角的B8H10和ChAT进行定量分析，结果如图9和图10。
可以看出，经过六周的治疗，FUS/MB+UA组小鼠(15.7±2.4)比ALS组的B8H10平均荧光强度(即SOD1蛋白表达水平)降低了44.1％(p<0.001)，比单纯给药组降低了15.6％(p＝0.017)，随着疾病的进展，ALS组的神经元逐渐萎缩，阳性信号面积为13.7±4.5％，相比于ALS组，FUS/MB+UA组(24.95±4.7％)延缓了脊髓前角运动神经元丢失和萎缩程度可达82.12％(p<0.001)，相对于单纯给药组(18.2±2.8％)可达37.24％(p＝0.001)。表明相对于单纯UA给药，在同样的药物剂量前提下，采用超声联合微泡递送UA入脑对ALS小鼠进行治疗可以更大程度地减少错误折叠蛋白的生成，延缓运动神经元的萎缩和退化，更好的让药物在脑部发挥效用。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种提高运动皮层尿石素A浓度的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
口服尿石素A后静脉注射微泡溶液，然后向两侧脑运动皮层区定向施加超声；所述超声的频率范围为0.5MHz-3MHz，负声压峰值为0.3MPa-0.5MPa，脉冲重复频率为1Hz-10Hz，脉宽为10000周期数-100000周期数。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述尿石素A的给药剂量为50mg/kg-200mg/kg。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，口服尿石素A10-14h后进行静脉注射。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微泡溶液由微泡与生理盐水混合后得到。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述微泡由如下步骤制备得到：
将DSPC和DSPE-PEG-2000混合后置于装有氯仿的茄形瓶中，旋蒸成膜后加入缓冲液，经加热、振荡后用全氟丙烷置换液面上方空气即得所述微泡。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述DSPC和DSPE-PEG-2000按质量比9：1进行混合。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述缓冲液由磷酸缓冲盐溶液、丙二醇和丙三醇按体积比8：1：1的比例混合得到。
8.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述微泡的平均粒径范围为1-2μm。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微泡溶液中微泡浓度范围为2×105/g体重-1×106/g体重。
10.权利要求1-9任意一项所述的方法在开放血脑屏障提高运动皮层治疗肌萎缩侧索硬化症药物浓度中的应用。
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