CN115607635B - 一种灵芝复方制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种灵芝复方制剂及其制备方法和应用，属于中药技术领域。由以下原料按重量份制备而成：灵芝70‑110份，枸杞子50‑90份，核桃仁35‑55份，薏苡仁35‑55份，黑芝麻15‑25份，何首乌70‑110份，杜仲叶35‑55份。本发明制得的灵芝复方制剂，各中药组分配伍合理，能睡眠改善、镇静、增强记忆力、影响神经递质的传导，导致皮层诱导电位的变化，对脑神经有良好保健作用，具有很好的抗衰老作用，其添加的益生菌通过“脑肠轴”的作用，提高脑内GABA的含量，减少炎症因子的分泌，降低β‑淀粉样蛋白的含量，与益生元、活性组合物的协同作用下，起到很好的预防和缓解老年痴呆症的发生、发展的效果。

Description

一种灵芝复方制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及中药技术领域，具体涉及一种灵芝复方制剂及其制备方法和应用。
背景技术
痴呆已被称为世界上当前的“流行病”之一，在发达国家被估计列为第四位最常见的死亡原因。所谓的老年性痴呆症，又称为阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)，发生在老年期及老年前期的一种原发性退行性脑病，指的是一种持续性高级神经功能活动障碍，即在没有意识障碍的状态下，记忆、思维、分析判断、视空间辨认、情绪等方面的障碍。其特征性病理变化为大脑皮层萎缩，并伴有β-淀粉样蛋白沉积，神经原纤维缠结，大量记忆性神经元数目减少，以及老年斑的形成。阿尔茨海默病是一种慢性、进行性发展的神经退行性疾病，从最初的短期记忆丧失发展成为语言障碍，逐渐丧失机体功能，最终导致死亡。其主要的病理特征表现为细胞外β-淀粉样蛋白斑块的形成、细胞内tau蛋白过度磷酸化导致神经原纤维缠结。
随着社会人口老龄化日益严重，老年性痴呆的患病率也明显升高，因此，积极预防和治疗老年痴呆，是一项全人类的刻不容缓的庞大工程。对于老年痴呆症的治疗，最首要的是在疾病早期，尽早诊断，并及时用药或治疗，来保护大脑，特别是改善脑循环，避免认知功能衰退。
迄今为止，西药治疗老年痴呆效果较差，且易出现耐药及副作用。而中药在缓解衰老及衰老相关疾病的防治方面有着丰富的理论和实践经验。尤其是中药多靶点作用特征，治疗老年痴呆具有明显的优越性。中药单体及有效成分治疗老年痴呆的研究进展较快，且这种研究为中药现代化和国际化提供了很好的思路和方法中药在治疗老年痴呆病方面体现出了优势。
中国专利ZL200510002971.0公开了一种治疗老年痴呆症的中药制剂及其制备方法，该中药制剂由活性原料制何何首乌20-40份、荷叶20-30份、肉苁蓉10-25份、地龙10-25份和漏芦5-20份制得，其制备方法步骤如下：a)制何何首乌经粉碎、乙醇加热回流提取而得到清膏；b)荷叶、肉苁蓉、漏芦加水煎煮提取，得到清膏；c)将制何何首乌清膏和荷叶、肉苁蓉、漏芦清膏合并，真空干燥成干膏；d)地龙匀浆、乙醇提取，制成干膏；e)将步骤c)、步骤d)制得的干膏合并，粉碎，过筛，加入辅料制得适应剂型。本发明人对上述制备方法进行持续的研究和改进，对于制何何首乌、荷叶、肉苁蓉、地龙和漏芦活性成分的提取工艺进行了大量的实验和探索，以寻找更加有效地提取这些原料中的活性成分的工艺，从而更加有效地利用药物原料而不浪费。
灵芝是中草药的瑰宝，并已为人所熟知，而灵芝类产品所具有的显著保健功能也被人们所认可，近年来以灵芝为原料制成的产品层出不穷，产品众多，但大多使用单一灵芝原料或者是几种组分简单组合，不能完全体现灵芝功效。往往需要大剂量服用才能起到预期功效。
随着生物技术的发展，发现肠道微生物与神经系统之间存在相互关联。一种脑部与肠道之间双向体液神经交流的系统，即“脑肠轴”被逐步确立。20世纪六七十年代，随着生物化学技术的发展，科学家们陆续发现更多脑肠肽物质，如脑啡肽、胆囊收缩素等。脑肠肽无论在胃黏膜内分泌细胞中发现，还是在肠道自主神经系统中发现，都进一步为脑部与肠道之间的联系提供了证据支撑，同时伴随着“脑肠轴”这一概念的首次提出。目前研究发现，脑肠轴-肠道微生物群在脑部与肠道之间构建双向交流传输系统。一方面，中枢神经系统通过改变胃肠道蠕动、分泌和肠道渗透性等功能，从而能间接引起肠道微生物的组成变化；另一方面，肠道微生物及其代谢产物可以通过作用于脑肠轴通路中的神经系统、内分泌系统和免疫系统进而影响中枢神经系统，从而影响大脑的功能。随着肠道微生物对大脑功能的研究深入，发现肠道微生物的失调与神经退行性疾病有关。肠道微生物能够调节神经系统、内分泌系统、免疫系统等，进而影响神经退行性疾病的发生发展。
目前，很少有将益生菌和中药组合物联合制剂，从而制得一种效果更好的预防及延缓老年痴呆症的发生、发展的产品，该产品将具有显著的现实意义。
发明内容
本发明的目的在于提出一种灵芝复方制剂及其制备方法和应用，各中药组分配伍合理，能睡眠改善、镇静、增强记忆力、影响神经递质的传导，导致皮层诱导电位的变化，对脑神经有良好保健作用，具有很好的抗衰老作用，其添加的益生菌通过“脑肠轴”的作用，提高脑内GABA的含量，减少炎症因子的分泌，降低β-淀粉样蛋白的含量，与益生元、活性组合物的协同作用下，起到很好的预防和缓解老年痴呆症的发生、发展的效果。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种灵芝复方制剂，由以下原料按重量份制备而成：灵芝70-110份，枸杞子50-90份，核桃仁35-55份，薏苡仁35-55份，黑芝麻15-25份。
作为本发明的进一步改进，还包括何首乌70-110份，杜仲叶35-55份。
本发明进一步保护一种上述灵芝复方制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)按比例称取各药材，经挑选，剔除虫害、杂物等杂质；灵芝经粗碎，其他药材经水洗，干燥至水分10％以下；
(2)将步骤(1)得到的药材加入等重量的50％-95％乙醇溶液中浸泡12-48h，渗漉提取，收集漉液；
(3)将步骤(2)得到的药渣先浸泡10-50min，分别回流提取两次，第一次加入6-10倍质量的水，第二次加入4-8倍质量的水；回流时间1.5-3.5h，温度85-100℃；合并两次药液，加入步骤(2)中得到的漉液，陶瓷膜过滤，滤膜孔径为2-8μm，滤液减压回收乙醇；剩余药液进行浓缩，至原体积的1/7-1/10，板框过滤，得到药液；
(4)将步骤(3)得到的药液制备成胶囊剂、颗粒剂、片剂或口服液；
其中，胶囊剂的制备方法如下：
将药液浓缩至相对密度为1.20-1.30，喷雾干燥得到干粉，干粉装硬胶囊即得；
颗粒剂的制备方法如下：
将药液浓缩至相对密度为1.20-1.30，喷雾制粒，干燥、整粒得到颗粒；
片剂的制备方法如下：
将药液浓缩至相对密度为1.20-1.30，喷雾制粒，干燥、整粒得到颗粒，控制水分在4-5％，添加硬脂酸镁，压片即得；
口服液的制备方法如下：
将药液浓缩至相对密度为1.20-1.30，得到浓缩液；另称量羧甲基纤维素钠和海藻酸钠加入水中，使物料均匀润湿混合，搅拌10-15min，转速50-100r/min，使之完全溶解，无块状不溶物，液体呈现无色透明，然后加入步骤(3)得到的药液，加完后搅拌10-30min，转速20-60r/min；继续加入赤藓糖醇、木糖醇、山梨酸钾，搅拌使完全溶解，另将溶解了柠檬酸和苹果酸的溶液，滴加入上述料液中，边加边搅拌，搅拌10-15min，降温至20-30℃，然后板框过滤，使溶液澄清透明，灌装即得口服液。
作为本发明的进一步改进，所述羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、赤藓糖醇、木糖醇、山梨酸钾、柠檬酸和苹果酸的质量比为0.1-0.3:0.1-0.3:20-60:20-40:0.5-1.5:0.2-1:0.2-1。
本发明进一步保护一种上述灵芝复方制剂的制备方法，包括以下步骤：
S1.中药材的预处理：按比例称取各药材，经挑选，剔除虫害、杂物等杂质；灵芝经粗碎，其他药材经水洗，干燥至水分10％以下；
S2.渗漉提取：将步骤S1得到的药材加入等重量的50％-95％乙醇溶液中浸泡12-48h，渗漉提取，收集漉液；
S3.将步骤S2得到的药渣先浸泡10-50min，分别回流提取两次，第一次加入6-10倍质量的水，第二次加入4-8倍质量的水；回流时间1.5-3.5h，温度85-100℃；合并两次药液，醇沉，离心，得到多糖组合物和上清液，将上清液与步骤S2中得到的漉液混合，陶瓷膜过滤，滤膜孔径为2-8μm，滤液减压回收乙醇；剩余药液进行浓缩，至原体积的1/7-1/10，板框过滤，得到中药液；
S4.菌种的活化：将枯草芽孢杆菌、青春双歧杆菌、保加利亚乳杆菌在高氏培养基中划线，活化培养，得到菌种种子液；
S5.发酵：将步骤S3得到的多糖组合物、碳源、氮源、维生素、无机盐加入水中，用磷酸盐缓冲液调节pH值，灭菌，得到发酵培养基；将步骤S4制得的菌种种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵组合物；
S6.益生元组合物的制备：将羧甲基茯苓多糖、木寡糖混合均匀，得到益生元组合物；
S7.活性组合物的制备：将大豆异黄酮、三七总皂苷、白藜芦醇混合均匀，得到活性组合物；
S8.内核的制备：将步骤S5制得的发酵组合物、大豆分离蛋白和亲水乳化剂混合均匀，得到水相；将磷脂酰胆碱和亲油乳化剂混合均匀，得到油相；搅拌下将水相加入油相，均质，喷雾干燥，得到内核；
S9.中层核的制备：将壳聚糖溶于酸液中，加入ɑ-酮二酸，搅拌反应12-15h后，加入硼氢化钠，继续搅拌2-4h，醇沉，离心，得到酸化壳聚糖，然后将酸化壳聚糖、步骤S8制得的内核、益生元组合物和活性组合物加入水中，混合均匀，用第一SPG快速膜乳化，滴加第一金属离子溶液，固化，过滤，干燥，得到中层核；
S10.灵芝复方制剂的制备：将步骤S9制得的中层核、海藻酸钠、步骤S3制得的中药液加入水中，混合均匀，用第二SPG快速膜乳化，滴加第二金属离子溶液，固化，过滤，干燥，得到灵芝复方制剂。
作为本发明的进一步改进，步骤S4中所述活化培养的条件为微缺氧条件下，35-40℃，50-70r/min，活化培养18-24h；所述菌种种子液的含菌量为108-109cfu/mL；步骤S5中所述多糖组合物、碳源、氮源、维生素、无机盐和水的质量比为5-7:7-12:5-10:0.5-1:1-2:100；所述pH值调节至6.8-7.2，所述灭菌方法为紫外线灭菌；所述枯草芽孢杆菌、青春双歧杆菌、保加利亚乳杆菌的接种量分别为0.5-1.5％、2-4％、1.5-3％；所述发酵培养的条件为在微缺氧条件下，温度为36-38℃，转速为50-70r/min，发酵培养24-36h。
优选地，所述碳源选自葡萄糖、麦芽糖、异麦芽糖、果糖、蔗糖、琼脂、可溶性淀粉中的至少一种；所述氮源选自氯化铵、硝酸铵、硫酸铵、硝酸钾、硝酸钠、氨基酸、蛋白胨、尿素中的至少一种；所述氨基酸选自甲硫氨酸、缬氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、牛磺酸、丙氨酸中的至少一种；所述维生素选自维生素C、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素K、维生素E、维生素D、叶酸中的至少一种；所述无机盐选自氯化钠、硫酸钠、氯化钾、硫酸钾、氯化镁、氯化铜、氯化铁、氯化锌、氯化锰、硫酸锰、硫酸铜、硫酸锌、硫酸铁、硫酸镁中的至少一种。
作为本发明的进一步改进，步骤S6中所述羧甲基茯苓多糖、木寡糖的质量比为2-4:1-3；步骤S7中所述大豆异黄酮、三七总皂苷、白藜芦醇的质量比为10:3-5:1-2；步骤S8中所述发酵组合物、大豆分离蛋白和亲水乳化剂的质量比为10：12-17:0.1-0.5；所述磷脂酰胆碱和亲油乳化剂的质量比4-5:0.1-0.3；所述水相和油相的质量比为2-5:7；所述均质的转速为12000-15000r/min，时间为10-15min。
优选地，所述亲油乳化剂选自司盘-20、司盘-40、司盘-60、司盘-80中的至少一种；所述亲水乳化剂选自吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80中的至少一种。
作为本发明的进一步改进，步骤S9中所述酸液为2-4wt％的醋酸溶液，所述壳聚糖、ɑ-酮二酸、硼氢化钠的质量比为1:2.2-2.7:0.23-0.38；所述醇沉为加入乙醇至体系中乙醇含量为60-80wt％，所述酸化壳聚糖、内核、益生元组合物和活性组合物的质量比为10:3-5:0.5-1:1-3；所述第一SPG快速膜的孔隙为3-5μm，所述第一金属离子溶液为浓度为3-5wt％的含有钙离子、镁离子、铝离子、锌离子、铁离子、铜离子中至少一种的金属离子溶液；步骤S10中所述中层核、海藻酸钠、中药液的质量比为3-5:15-20:7-12；所述第二SPG快速膜的孔隙为7-12μm，所述第二金属离子溶液为浓度为3-5wt％的含有钙离子、镁离子、铝离子、锌离子、铁离子、铜离子中至少一种的金属离子溶液。
优选地，所述ɑ-酮二酸选自ɑ-酮戊二酸、ɑ-酮己二酸、ɑ-酮庚二酸中的至少一种。
作为本发明的进一步改进，具体包括以下步骤：
S1.中药材的预处理：按比例称取各药材，经挑选，剔除虫害、杂物等杂质；灵芝经粗碎，其他药材经水洗，干燥至水分10％以下；
S2.渗漉提取：将步骤S1得到的药材加入等重量的50％-95％乙醇溶液中浸泡12-48h，渗漉提取，收集漉液；
S3.将步骤S2得到的药渣先浸泡10-50min，分别回流提取两次，第一次加入6-10倍质量的水，第二次加入4-8倍质量的水；回流时间1.5-3.5h，温度85-100℃；合并两次药液，加入乙醇至体系中乙醇含量为60-80wt％，静置沉淀12-24h，离心，得到多糖组合物和上清液，将上清液与步骤S2中得到的漉液混合，陶瓷膜过滤，滤膜孔径为2-8μm，滤液减压回收乙醇；剩余药液进行浓缩，至原体积的1/7-1/10，板框过滤，得到中药液；
S4.菌种的活化：将枯草芽孢杆菌、青春双歧杆菌、保加利亚乳杆菌在高氏培养基中划线，微缺氧条件下，35-40℃，50-70r/min，活化培养18-24h，得到菌种种子液，含菌量为108-109cfu/mL；
S5.发酵：将5-7重量份步骤S3得到的多糖组合物、7-12重量份碳源、5-10重量份氮源、0.5-1重量份维生素、1-2重量份无机盐加入100重量份水中，用磷酸盐缓冲液调节pH值至6.8-7.2，紫外线灭菌，得到发酵培养基；将步骤S4制得的菌种种子液接种至发酵培养基中，所述枯草芽孢杆菌、青春双歧杆菌、保加利亚乳杆菌的接种量分别为0.5-1.5％、2-4％、1.5-3％，在微缺氧条件下，温度为36-38℃，转速为50-70r/min，发酵培养24-36h，得到发酵组合物；
S6.益生元组合物的制备：将2-4重量份羧甲基茯苓多糖、1-3重量份木寡糖混合，搅拌10-20min，得到益生元组合物；
S7.活性组合物的制备：将10重量份大豆异黄酮、3-5重量份三七总皂苷、1-2重量份白藜芦醇混合，搅拌10-20min，得到活性组合物；
S8.内核的制备：将10重量份步骤S5制得的发酵组合物、12-17重量份大豆分离蛋白和0.1-0.5重量份亲水乳化剂混合均匀，得到水相；将4-5重量份磷脂酰胆碱和0.1-0.3重量份亲油乳化剂混合均匀，得到油相；搅拌下将20-50重量份水相加入70重量份油相，12000-15000r/min均质10-15min，喷雾干燥，得到内核；
S9.中层核的制备：将10重量份壳聚糖溶于2-4wt％的醋酸溶液中，加入22-27重量份ɑ-酮二酸，加热至40-50℃，搅拌反应12-15h后，加入2.3-3.8重量份硼氢化钠，继续搅拌2-4h，加入乙醇至体系中乙醇含量为60-80wt％，离心，得到酸化壳聚糖，然后将10重量份酸化壳聚糖、3-5重量份步骤S8制得的内核、0.5-1重量份益生元组合物和1-3重量份活性组合物加入100重量份水中，搅拌混合15-20min，用孔隙为3-5μm的SPG快速膜乳化，滴加3-5wt％的含有钙离子、镁离子、铝离子、锌离子、铁离子、铜离子中至少一种的金属离子溶液，常温固化30-60min，过滤，干燥，得到中层核；
S10.灵芝复方制剂的制备：将3-5重量份步骤S9制得的中层核、15-20重量份海藻酸钠、7-12重量份步骤S3制得的中药液加入100重量份水中，混合均匀，用孔隙为7-12μm的SPG快速膜乳化，滴加3-5wt％的含有钙离子、镁离子、铝离子、锌离子、铁离子、铜离子中至少一种的金属离子溶液，常温固化30-60min，过滤，干燥，得到灵芝复方制剂。
优选地，所述微缺氧条件为二氧化碳含量为2-3％，氧气含量为5-10％，余量为氮气，其中，％为体积百分比。
本发明进一步保护一种上述灵芝复方制剂在制备预防或延缓老年痴呆症的发生、发展的产品中的应用。
本发明具有如下有益效果：灵芝，味甘，性平；归心、肺、肝、肾经，主治心神不宁，失眠，惊悸，咳喘痰多，虚劳证等，含多糖、核苷类、呋喃类、甾醇类、生物碱、三萜类、油脂类、多种氨基酸及蛋白质类、酶类、有机锗及多种微量元素等，灵芝多种制剂分别具有镇静、抗惊厥、强心、抗心律失常、降压、镇咳平喘、睡眠改善，食欲、体重增加，心悸、头痛、头晕减轻或消失，精神振奋，记忆力增强的作用；灵芝可用于神经衰弱症与失眠，对中枢起到良好的作用。灵芝提取物能激发运动性抑制，使运动性降低，使协调运动失调、呈现用量依赖性镇病效果，对环已巴比妥睡眠作用能缩短睡眠时间，能延长中枢兴奋药咖啡因致痉挛及死亡的时间，可见，灵芝对中枢呈抑制性作用。枸杞子，味甘，性平，归肝、肾经，滋补肝肾，益精明目，改善血液循环，含有枸杞多糖、单糖、甜菜碱、脂肪酸、蛋白质和多肽、维生素B1、维生素B2、维生素C、18种氨基酸(含8种必需氨基酸)、微量元素(钙、锌、镁、铁、锰、磷等)，而且能直接作用于大脑神经细胞，影响神经递质的传导，导致皮层诱导电位的变化。核桃仁，性温，味甘。肺，肾，大肠，具有温补肺肾，定喘润肠。用于肾虚腰痛、脚软、虚寒喘咳、大便燥结的效果；核桃仁中含有多种维生素、糖分以及各种矿物质。此外，核桃仁中植物脂肪和蛋白质的含量非常高，其中脂肪含量高达70％，蛋白质占17％-27％。在核桃仁中不仅含有钙、铁、磷等元素，还含有锌、锰、铬等人体不可缺乏的矿物质。多种维生素及蛋白质、矿物质，都是有利于容貌健美的营养物质。核桃中的磷脂，对脑神经有良好保健作用，具有很好的抗衰老作用，核桃的益智作用很好，有助于提高记忆力，延缓老年痴呆。薏苡仁，味甘、淡，性凉，归脾、胃、肺经。有利水渗湿，健脾止泻，除痹，排脓，解毒散结的作用。薏苡仁含薏苡仁油、薏苡仁酯、氨基酸、脂肪油等。薏苡仁油及薏苡素有抑制肌肉收缩的作用，薏苡素还对中枢神经系统有镇静、解热、降温和镇痛作用。黑芝麻，性平，味甘，补肝肾，益精血，润肠燥。用于头晕眼花、耳鸣耳聋、须发早白、病后脱发、肠燥便秘。黑芝麻含有的多种人体必需氨基酸在维生素E、维生素B1的作用参与下，能加速人体的代谢功能；黑芝麻-含有的铁和维生素E是预防贫血、活化脑细胞、消除血管胆固醇的重要成分；黑芝麻含有的脂肪大多为不饱和脂肪酸，有延年益寿的作用；中医中药理论认为，黑芝麻具有补肝肾、润五脏、益气力、长肌肉、填脑髓的作用，可用于治疗肝肾精血不足所致的眩晕、须发早白、脱发、腰膝酸软、四肢乏力、步履艰难、五脏虚损、皮燥发枯、肠燥便秘等病症。还具有健脑益智、延年益寿的作用。何首乌苦甘涩之，非寒非燥，既先天之真阴补之，又后天之营血调补，益精髓，乌须发，驻颜延年，久养精神，能加强滋阴、生精、填髓、健脑之效。内含酚类化合物，根部含大黄酚、大黄素、大黄酸，此外，含淀粉45.2％、粗脂肪3.1％、卵磷脂3.7％等。具有改善老年人多巴胺能神经系统的功能。杜仲叶，微辛，温。归肝、肾经，补肝肾，强筋骨。用于肝肾不足，头晕目眩，腰膝酸痛，筋骨痿软。有很好的镇静、镇痛作用，抗炎作用等效果，能协助各药起到很好的增效作用。
经过研究发现，老年痴呆症患者的厚壁菌门减少，益生菌双歧杆菌减少，拟杆菌增多，明肠道微生物与老年痴呆症密切相关。本发明中添加的枯草芽孢杆菌等可以抑制产生细胞外β-淀粉样蛋白，并抑制肠道微生物紊乱后引起的炎症，影响肠道通透性，从而避免细胞外β-淀粉样蛋白透过肠道细胞进入循环系统进入脑部，从而起到减少β-淀粉样蛋白对神经的负面影响，延缓老年痴呆的发生。青春双歧杆菌、保加利亚乳杆菌能产生短链脂肪酸，包括乳酸、丙酸盐、丁酸盐等，丙酸盐可以激发肠道糖异生途径从而激活迷走神经环路，而迷走神经背侧运动核接受该环路调节，从而影响老年痴呆症神经变性早期过程。通过添加青春双歧杆菌、保加利亚乳杆菌，还能提高肠道GABA水平，进而提高中枢系统GABA水平，从而起到改善患者的认知功能的效果。本发明枯草芽孢杆菌、青春双歧杆菌、保加利亚乳杆菌组合后，还可以通过分泌抑制炎症反应的物质，降低肠道的通透性，从而减少引发老年痴呆症的物质通过脑肠轴进入大脑，从而预防和延缓老年痴呆症的发生发展。
普通的益生菌制剂进入人体后，经过胃部的pH值和氧化还原电位很低，大多数的益生菌不能存活。到了小肠又遇到较高浓度胆汁的影响，益生菌的活性几乎丧失殆尽。本发明微胶囊结构是在最外层包覆一层生物相容性较好的海藻酸钠壳层，且此海藻酸钠壳层能保护内容物不易被微生物接触，不易吸湿，不易被氧化，进入人体后，在强酸性的胃液中发生降解，将第三层内的中药药液溶出，以及中层核暴露，此步骤可以保护益生菌在低pH条件下顺利通过胃部而不失活，同时，中药醇提液经过胃液分解后，部分吸收，其他营养物质与中层核一同进入较高pH值十二指肠。
进入十二指肠后，不耐碱的中层壳材(酸化壳聚糖层)发生降解，第二层内的活性组合物、益生元以及内层核暴露，活性组合物包括大豆异黄酮、三七总皂苷、白藜芦醇等，容易被肠道直接吸收，发挥出抗炎、抗氧化、增强免疫、抗β-淀粉样蛋白的作用、抗应激等作用；另外，益生元进入肠道后，在肠道内富集，为后期益生菌定植后，提高丰富的营养温床，从而促进益生菌的增殖和生长，通过“脑肠轴”起到很好的调节中枢系统功能的作用；
壳聚糖的高分子链段中含有丰富的-NH2和-OH活性基团，来源广泛，无毒无害，易生物降解，但壳聚糖在酸性介质中不稳定，酸性强时容易溶解，因此，本发明通过将ɑ-酮二酸与壳聚糖的氨基反应，将羧酸结构连接到壳聚糖上，使得酸化壳聚糖与金属离子交联形成网络结构的壳层，不易于在胃部被人体分解，从而能在进入十二指肠中后被降解释放出来，同时，降解的壳聚糖也能够作为益生元被益生菌分解吸收，促进益生菌的增殖。
进一步地，由于内层壳材中含有抗胆汁的脂类物质(大豆分离蛋白和磷脂酰胆碱形成的壳层)，因此，包裹了内层壳材的益生菌不会直接与胆碱盐类物质接触，益生菌在空肠的初期不被胆汁灭活。随着消化酶作用的进行，内层壳材开始崩解，促进益生菌(包括枯草芽孢杆菌、青春双歧杆菌和保加利亚乳杆菌)在肠壁绒毛上的附着，随着消化作用的继续推进，失去所有壳材保护的益生菌在各自适宜和营养丰富的肠道中最终靶向定植下来，并开始大量繁殖，发挥出调节的作用。本发明通过多层保护的策略，避免益生菌在经过胃部、肠道、十二指肠过程中失活，使其安全到达小肠、大肠后靶向定殖，提高了益生菌的抗逆性，延长了益生菌保存期的活性，使其能正常发挥益生菌的双向调节的功效，提高肠道GABA水平以及中枢系统GABA水平，起到改善患者的认知功能的效果，减少引发老年痴呆症的物质通过脑肠轴进入大脑，从而预防和延缓老年痴呆症的发生发展。
本发明通过添加益生元刺激有益菌群的生长，而不刺激有潜在致病性或腐败活性的有害细菌。益生元不能被人体分解、吸收和利用，通过消化道到达结肠后，被结肠益生菌菌群分解和利用，从而促进结肠菌群的生长，能明显改善肠道微生态、促进脂质、蛋白质与矿物类代谢，调节益生菌代谢产物，产生大量GABA活性物质，抑制β-淀粉样蛋白的生成，从而起到辅助改善大脑中枢神经的功能，起到预防和延缓老年痴呆症的发生发展的效果。羧甲基茯苓多糖是一种具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、免疫调节作用的活性多糖，其还可以明显促进肠道益生菌的增殖，起到很好的调节作用；木寡糖对pH及热的稳定性较好，即使是在酸性条件(pH2.5-7)加热也不会大量分解，极难被动物消化吸收，肠道内残存率高，能够有效推动双歧杆菌增殖。
大豆异黄酮、三七总皂苷、白藜芦醇均具有较好的改善认知的效果，大豆异黄酮和三七总皂苷在抗应激、抗氧化、增强胆碱功能、增强免疫力、抗β-淀粉样蛋白以及改善体内微循环等方面有明显的促进作用。白藜芦醇具有较好的抗炎、抗氧化、增强免疫、抗β-淀粉样蛋白的作用，三者协同作用下，能明显起到较好的改善认知、减少炎症因子的分泌，减少β-淀粉样蛋白的生成，从而预防以及延缓老年痴呆症的发生和发展。
本发明制得的灵芝复方制剂，各中药组分配伍合理，能睡眠改善、镇静、增强记忆力、影响神经递质的传导，导致皮层诱导电位的变化，对脑神经有良好保健作用，具有很好的抗衰老作用，其添加的益生菌通过“脑肠轴”的作用，提高脑内GABA的含量，减少炎症因子的分泌，降低β-淀粉样蛋白的含量，与益生元、活性组合物的协同作用下，起到很好的预防和缓解老年痴呆症的发生、发展的效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明测试例1中各组在人工唾液中存活率随时间关系图；
图2为本发明测试例1中各组在人工胃液和人工肠液中存活率随时间关系图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
枯草芽孢杆菌，100亿cfu/g，购于山东和众康源生物科技有限公司；青春双歧杆菌，50亿cfu/g，购于上海信裕生物科技有限公司；保加利亚乳杆菌，菌株编号为保加利亚乳杆菌LB-Z16，购于山东中科嘉亿生物工程有限公司；羧甲基茯苓多糖，纯度>80％，购于湖北威德利化学科技有限公司；木寡糖，纯度>99％，购于山东萍聚生物科技有限公司；大豆异黄酮，纯度>90％，购于西安芳草生物科技有限公司；三七总皂苷，纯度>80％，购于西安艾诺医药科技有限责任公司；白藜芦醇，纯度>98％，购于三原天域生物制品有限公司；壳聚糖，食品级，纯度>98％，购于广州益民药业有限公司。
实施例1
本实施例提供一种灵芝复方制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)称取灵芝70g，枸杞子50g，核桃仁35g，薏苡仁35g，黑芝麻15g，上述药材经挑选，剔除虫害、杂物等杂质；灵芝经粗碎，其他药材经水洗，干燥至水分10％以下；
(2)将步骤(1)得到的药材加入等重量的50％乙醇溶液中浸泡12h，渗漉提取，收集漉液；
(3)将步骤(2)得到的药渣先浸泡10min，分别回流提取两次，第一次加入6倍质量的水，第二次加入4倍质量的水；回流时间1.5h，温度85℃；合并两次药液，加入步骤(2)中得到的漉液，陶瓷膜过滤，滤膜孔径为2μm，滤液减压回收乙醇；剩余药液进行浓缩，至原体积的1/7，板框过滤，得到药液；
(4)将步骤(3)得到的药液制备成胶囊剂；
其中，胶囊剂的制备方法如下：
将药液浓缩至相对密度为1.20，喷雾干燥得到干粉，干粉装硬胶囊即得。
实施例2
本实施例提供一种灵芝复方制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)称取灵芝110g，枸杞子90g，核桃仁55g，薏苡仁55g，黑芝麻25g，上述药材经挑选，剔除虫害、杂物等杂质；灵芝经粗碎，其他药材经水洗，干燥至水分10％以下；
(2)将步骤(1)得到的药材加入等重量的95％乙醇溶液中浸泡48h，渗漉提取，收集漉液；
(3)将步骤(2)得到的药渣先浸泡50min，分别回流提取两次，第一次加入10倍质量的水，第二次加入8倍质量的水；回流时间3.5h，温度100℃；合并两次药液，加入步骤(2)中得到的漉液，陶瓷膜过滤，滤膜孔径为8μm，滤液减压回收乙醇；剩余药液进行浓缩，至原体积的1/10，板框过滤，得到药液；
(4)将步骤(3)得到的药液制备成颗粒剂；
颗粒剂的制备方法如下：
将药液浓缩至相对密度为1.30，喷雾制粒，干燥、整粒得到颗粒。
实施例3
本实施例提供一种灵芝复方制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)称取灵芝85g，枸杞子70g，核桃仁45g，薏苡仁45g，黑芝麻20g，上述药材经挑选，剔除虫害、杂物等杂质；灵芝经粗碎，其他药材经水洗，干燥至水分10％以下；
(2)将步骤(1)得到的药材加入等重量的75％乙醇溶液中浸泡28h，渗漉提取，收集漉液；
(3)将步骤(2)得到的药渣先浸泡35min，分别回流提取两次，第一次加入8倍质量的水，第二次加入6倍质量的水；回流时间2h，温度90℃；合并两次药液，加入步骤(2)中得到的漉液，陶瓷膜过滤，滤膜孔径为6μm，滤液减压回收乙醇；剩余药液进行浓缩，至原体积的1/8，板框过滤，得到药液；
(4)将步骤(3)得到的药液制备成片剂；
片剂的制备方法如下：
将药液浓缩至相对密度为1.25，喷雾制粒，干燥、整粒得到颗粒，控制水分在4.5％，添加总质量的2wt％的硬脂酸镁，压片即得。
实施例4
本实施例提供一种灵芝复方制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)称取灵芝80g，枸杞子60g，核桃仁40g，薏苡仁40g，黑芝麻17g，何首乌70g，杜仲叶35g，上述药材经挑选，剔除虫害、杂物等杂质；灵芝经粗碎，其他药材经水洗，干燥至水分10％以下；
(2)将步骤(1)得到的药材加入等重量的60％乙醇溶液中浸泡20h，渗漉提取，收集漉液；
(3)将步骤(2)得到的药渣先浸泡20min，分别回流提取两次，第一次加入7倍质量的水，第二次加入5倍质量的水；回流时间2h，温度95℃；合并两次药液，加入步骤(2)中得到的漉液，陶瓷膜过滤，滤膜孔径为4μm，滤液减压回收乙醇；剩余药液进行浓缩，至原体积的1/7，板框过滤，得到药液；
(4)将步骤(3)得到的药液制备成口服液；
口服液的制备方法如下：
将药液浓缩至相对密度为1.20，得到浓缩液；另称量0.1g羧甲基纤维素钠和0.1g海藻酸钠加入200mL水中，使物料均匀润湿混合，搅拌10min，转速50r/min，使之完全溶解，无块状不溶物，液体呈现无色透明，然后加入步骤(3)得到的药液，加完后搅拌10min，转速20r/min；继续加入20g赤藓糖醇、20g木糖醇、0.5g山梨酸钾，搅拌使完全溶解，另将溶解了0.2g柠檬酸和0.2g苹果酸的溶液20mL，滴加入上述料液中，边加边搅拌，搅拌10min，降温至20℃，然后板框过滤，使溶液澄清透明，灌装即得口服液。
实施例5
本实施例提供一种灵芝复方制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)称取灵芝100g，枸杞子80g，核桃仁50g，薏苡仁50g，黑芝麻22g，何首乌110g，杜仲叶55g，上述药材经挑选，剔除虫害、杂物等杂质；灵芝经粗碎，其他药材经水洗，干燥至水分10％以下；
(2)将步骤(1)得到的药材加入等重量的90％乙醇溶液中浸泡40h，渗漉提取，收集漉液；
(3)将步骤(2)得到的药渣先浸泡45min，分别回流提取两次，第一次加入9倍质量的水，第二次加入7倍质量的水；回流时间3h，温度95℃；合并两次药液，加入步骤(2)中得到的漉液，陶瓷膜过滤，滤膜孔径为7μm，滤液减压回收乙醇；剩余药液进行浓缩，至原体积的1/8，板框过滤，得到药液；
(4)将步骤(3)得到的药液制备成口服液；
其中，胶囊剂的制备方法如下：
口服液的制备方法如下：
将药液浓缩至相对密度为1.30，得到浓缩液；另称量0.3g羧甲基纤维素钠和0.3g海藻酸钠加入200mL水中，使物料均匀润湿混合，搅拌15min，转速100r/min，使之完全溶解，无块状不溶物，液体呈现无色透明，然后加入步骤(3)得到的药液，加完后搅拌30min，转速60r/min；继续加入60g赤藓糖醇、40g木糖醇、1.5g山梨酸钾，搅拌使完全溶解，另将溶解了1g柠檬酸和1g苹果酸的溶液20mL，滴加入上述料液中，边加边搅拌，搅拌15min，降温至30℃，然后板框过滤，使溶液澄清透明，灌装即得口服液。
实施例6
本实施例提供一种灵芝复方制剂的制备方法，包括以下步骤：
S1.中药材的预处理：称取灵芝70g，枸杞子50g，核桃仁35g，薏苡仁35g，黑芝麻15g，何首乌70g，杜仲叶35g，将上述药材经挑选，剔除虫害、杂物等杂质；灵芝经粗碎，其他药材经水洗，干燥至水分10％以下；
S2.渗漉提取：将步骤S1得到的药材加入等重量的50％乙醇溶液中浸泡12h，渗漉提取，收集漉液；
S3.将步骤S2得到的药渣先浸泡10min，分别回流提取两次，第一次加入6倍质量的水，第二次加入4倍质量的水；回流时间1.5h，温度85℃；合并两次药液，加入乙醇至体系中乙醇含量为60wt％，静置沉淀12h，3000r/min离心15min，得到多糖组合物和上清液，将上清液与步骤S2中得到的漉液混合，陶瓷膜过滤，滤膜孔径为2μm，滤液减压回收乙醇；剩余药液进行浓缩，至原体积的1/7，板框过滤，得到中药液；
S4.菌种的活化：将枯草芽孢杆菌、青春双歧杆菌、保加利亚乳杆菌在高氏培养基中划线，微缺氧条件下，35℃，50r/min，活化培养18h，得到菌种种子液，含菌量为108cfu/mL；
S5.发酵：将5g步骤S3得到的多糖组合物、7g葡萄糖、4g蛋白胨、1g尿素、0.3g维生素C、0.1g维生素B1、0.1g维生素B2、0.4g硫酸钾、0.2g氯化镁、0.2g氯化铜、0.2g氯化铁加入100g水中，用磷酸盐缓冲液调节pH值至6.8，紫外线灭菌，得到发酵培养基；将步骤S4制得的菌种种子液接种至发酵培养基中，所述枯草芽孢杆菌、青春双歧杆菌、保加利亚乳杆菌的接种量分别为0.5％、2％、1.5％，在微缺氧条件下，温度为36℃，转速为50r/min，发酵培养24h，得到发酵组合物；
S6.益生元组合物的制备：将2g羧甲基茯苓多糖、1g木寡糖混合，搅拌10min，得到益生元组合物；
S7.活性组合物的制备：将10g大豆异黄酮、3g三七总皂苷、1g白藜芦醇混合，搅拌10min，得到活性组合物；
S8.内核的制备：将10g步骤S5制得的发酵组合物、12g大豆分离蛋白和0.1g吐温-20，搅拌混合15min，得到水相；将4g磷脂酰胆碱和0.1g司盘-20，搅拌混合15min，得到油相；搅拌下将20g水相加入70g油相，12000r/min均质10min，喷雾干燥，得到内核；
S9.中层核的制备：将10g壳聚糖溶于100mL 2wt％的醋酸溶液中，加入22gɑ-酮戊二酸，加热至40℃，搅拌反应12h后，加入2.3g硼氢化钠，继续搅拌2h，加入乙醇至体系中乙醇含量为60wt％，3000r/min离心15min，得到酸化壳聚糖，然后将10g酸化壳聚糖、3g步骤S8制得的内核、0.5g益生元组合物和1g活性组合物加入100mL水中，搅拌混合15min，用孔隙为3μm的SPG快速膜乳化，滴加20mL 3wt％的钙离子溶液，常温固化30min，过滤，干燥，得到中层核；
S10.灵芝复方制剂的制备：将3g步骤S9制得的中层核、15g海藻酸钠、7g步骤S3制得的中药液加入100mL水中，混合均匀，用孔隙为7μm的SPG快速膜乳化，滴加20mL 3wt％的钙离子溶液，常温固化30min，过滤，干燥，得到灵芝复方制剂。
所述微缺氧条件为二氧化碳含量为2％，氧气含量为5％，余量为氮气，其中，％为体积百分比。
实施例7
本实施例提供一种灵芝复方制剂的制备方法，包括以下步骤：
S1.中药材的预处理：称取灵芝110g，枸杞子90g，核桃仁55g，薏苡仁55g，黑芝麻25g，何首乌110g，杜仲叶55g，将上述药材经挑选，剔除虫害、杂物等杂质；灵芝经粗碎，其他药材经水洗，干燥至水分10％以下；
S2.渗漉提取：将步骤S1得到的药材加入等重量的95％乙醇溶液中浸泡48h，渗漉提取，收集漉液；
S3.将步骤S2得到的药渣先浸泡50min，分别回流提取两次，第一次加入10倍质量的水，第二次加入8倍质量的水；回流时间3.5h，温度100℃；合并两次药液，加入乙醇至体系中乙醇含量为80wt％，静置沉淀24h，3000r/min离心15min，得到多糖组合物和上清液，将上清液与步骤S2中得到的漉液混合，陶瓷膜过滤，滤膜孔径为8μm，滤液减压回收乙醇；剩余药液进行浓缩，至原体积的1/10，板框过滤，得到中药液；
S4.菌种的活化：将枯草芽孢杆菌、青春双歧杆菌、保加利亚乳杆菌在高氏培养基中划线，微缺氧条件下，40℃，70r/min，活化培养24h，得到菌种种子液，含菌量为109cfu/mL；
S5.发酵：将7g步骤S3得到的多糖组合物、10g葡萄糖、2g麦芽糖、8g蛋白胨、2g硝酸铵、0.5g维生素C、0.3g维生素D、0.2g叶酸、1g氯化钠、0.2g硫酸锰、0.2g硫酸铜、0.2g硫酸锌、0.2g硫酸铁、0.2g硫酸镁加入100g水中，用磷酸盐缓冲液调节pH值至7.2，紫外线灭菌，得到发酵培养基；将步骤S4制得的菌种种子液接种至发酵培养基中，所述枯草芽孢杆菌、青春双歧杆菌、保加利亚乳杆菌的接种量分别为1.5％、4％、3％，在微缺氧条件下，温度为38℃，转速为70r/min，发酵培养36h，得到发酵组合物；
S6.益生元组合物的制备：将4g羧甲基茯苓多糖、3g木寡糖混合，搅拌20min，得到益生元组合物；
S7.活性组合物的制备：将10g大豆异黄酮、5g三七总皂苷、2g白藜芦醇混合，搅拌20min，得到活性组合物；
S8.内核的制备：将10g步骤S5制得的发酵组合物、17g大豆分离蛋白和0.5g吐温-40，搅拌混合15min，得到水相；将5g磷脂酰胆碱和0.3g司盘-40，搅拌混合15min，得到油相；搅拌下将50g水相加入70g油相，15000r/min均质15min，喷雾干燥，得到内核；
S9.中层核的制备：将10g壳聚糖溶于100mL 4wt％的醋酸溶液中，加入27gɑ-酮庚二酸，加热至50℃，搅拌反应15h后，加入3.8g硼氢化钠，继续搅拌4h，加入乙醇至体系中乙醇含量为80wt％，3000r/min离心15min，得到酸化壳聚糖，然后将10g酸化壳聚糖、5g步骤S8制得的内核、1g益生元组合物和3g活性组合物加入100mL水中，搅拌混合20min，用孔隙为5μm的SPG快速膜乳化，滴加20mL 5wt％的铝离子溶液，常温固化60min，过滤，干燥，得到中层核；
S10.灵芝复方制剂的制备：将5g步骤S9制得的中层核、20g海藻酸钠、12g步骤S3制得的中药液加入100mL水中，混合均匀，用孔隙为12μm的SPG快速膜乳化，滴加20mL 5wt％的铝离子溶液，常温固化60min，过滤，干燥，得到灵芝复方制剂。
所述微缺氧条件为二氧化碳含量为3％，氧气含量为10％，余量为氮气，其中，％为体积百分比。
实施例8
本实施例提供一种灵芝复方制剂的制备方法，包括以下步骤：
S1.中药材的预处理：称取灵芝85g，枸杞子70g，核桃仁45g，薏苡仁45g，黑芝麻20g，何首乌85g，杜仲叶45g，将上述药材经挑选，剔除虫害、杂物等杂质；灵芝经粗碎，其他药材经水洗，干燥至水分10％以下；
S2.渗漉提取：将步骤S1得到的药材加入等重量的75％乙醇溶液中浸泡36h，渗漉提取，收集漉液；
S3.将步骤S2得到的药渣先浸泡30min，分别回流提取两次，第一次加入8倍质量的水，第二次加入6倍质量的水；回流时间2.5h，温度90℃；合并两次药液，加入乙醇至体系中乙醇含量为70wt％，静置沉淀18h，3000r/min离心15min，得到多糖组合物和上清液，将上清液与步骤S2中得到的漉液混合，陶瓷膜过滤，滤膜孔径为6μm，滤液减压回收乙醇；剩余药液进行浓缩，至原体积的1/8，板框过滤，得到中药液；
S4.菌种的活化：将枯草芽孢杆菌、青春双歧杆菌、保加利亚乳杆菌在高氏培养基中划线，微缺氧条件下，37℃，60r/min，活化培养21h，得到菌种种子液，含菌量为109cfu/mL；
S5.发酵：将6g步骤S3得到的多糖组合物、8g葡萄糖、1.5g蔗糖、0.5g琼脂、4g蛋白胨、1g尿素、0.5g亮氨酸、0.5g色氨酸、1g硝酸铵、0.4g维生素C、0.1g维生素B1、0.1g维生素B2、0.1g维生素B6、1g氯化钠、0.1g氯化镁、0.1g氯化铜、0.1g氯化铁、0.1g氯化锌、0.1g氯化锰加入100g水中，用磷酸盐缓冲液调节pH值至7，紫外线灭菌，得到发酵培养基；将步骤S4制得的菌种种子液接种至发酵培养基中，所述枯草芽孢杆菌、青春双歧杆菌、保加利亚乳杆菌的接种量分别为1％、3％、2％，在微缺氧条件下，温度为37℃，转速为60r/min，发酵培养30h，得到发酵组合物；
S6.益生元组合物的制备：将3g羧甲基茯苓多糖、2g木寡糖混合，搅拌15min，得到益生元组合物；
S7.活性组合物的制备：将10g大豆异黄酮、4g三七总皂苷、1.5g白藜芦醇混合，搅拌15min，得到活性组合物；
S8.内核的制备：将10g步骤S5制得的发酵组合物、15g大豆分离蛋白和0.3g吐温-80，搅拌混合15min，得到水相；将4.5g磷脂酰胆碱和0.2g司盘-80，搅拌混合15min，得到油相；搅拌下将35g水相加入70g油相，13500r/min均质12min，喷雾干燥，得到内核；
S9.中层核的制备：将10g壳聚糖溶于100mL 3wt％的醋酸溶液中，加入25gɑ-酮己二酸，加热至45℃，搅拌反应13h后，加入2.5g硼氢化钠，继续搅拌3h，加入乙醇至体系中乙醇含量为70wt％，3000r/min离心15min，得到酸化壳聚糖，然后将10g酸化壳聚糖、4g步骤S8制得的内核、0.7g益生元组合物和2g活性组合物加入100mL水中，搅拌混合17min，用孔隙为4μm的SPG快速膜乳化，滴加20mL 4wt％的含有钙离子和铁离子的金属离子溶液，钙离子和铁离子的质量比为1:1，常温固化45min，过滤，干燥，得到中层核；
S10.灵芝复方制剂的制备：将4g步骤S9制得的中层核、17g海藻酸钠、10g步骤S3制得的中药液加入100mL水中，混合均匀，用孔隙为10μm的SPG快速膜乳化，滴加20mL 4wt％的含有钙离子和铁离子的金属离子溶液，钙离子和铁离子的质量比为1:1，常温固化45min，过滤，干燥，得到灵芝复方制剂。
所述微缺氧条件为二氧化碳含量为2.5％，氧气含量为7％，余量为氮气，其中，％为体积百分比。
对比例1
与实施例8相比，未进行步骤S1至S3，其他条件均不改变。
包括以下步骤：
S1.菌种的活化：将枯草芽孢杆菌、青春双歧杆菌、保加利亚乳杆菌在高氏培养基中划线，微缺氧条件下，37℃，60r/min，活化培养21h，得到菌种种子液，含菌量为109cfu/mL；
S2.发酵：将14g葡萄糖、1.5g蔗糖、0.5g琼脂、4g蛋白胨、1g尿素、0.5g亮氨酸、0.5g色氨酸、1g硝酸铵、0.4g维生素C、0.1g维生素B1、0.1g维生素B2、0.1g维生素B6、1g氯化钠、0.1g氯化镁、0.1g氯化铜、0.1g氯化铁、0.1g氯化锌、0.1g氯化锰加入100g水中，用磷酸盐缓冲液调节pH值至7，紫外线灭菌，得到发酵培养基；将步骤S1制得的菌种种子液接种至发酵培养基中，所述枯草芽孢杆菌、青春双歧杆菌、保加利亚乳杆菌的接种量分别为1％、3％、2％，在微缺氧条件下，温度为37℃，转速为60r/min，发酵培养30h，得到发酵组合物；
S3.益生元组合物的制备：将3g羧甲基茯苓多糖、2g木寡糖混合，搅拌15min，得到益生元组合物；
S4.活性组合物的制备：将10g大豆异黄酮、4g三七总皂苷、1.5g白藜芦醇混合，搅拌15min，得到活性组合物；
S5.内核的制备：将10g步骤S2制得的发酵组合物、15g大豆分离蛋白和0.3g吐温-80，搅拌混合15min，得到水相；将4.5g磷脂酰胆碱和0.2g司盘-80，搅拌混合15min，得到油相；搅拌下将35g水相加入70g油相，13500r/min均质12min，喷雾干燥，得到内核；
S6.中层核的制备：将10g壳聚糖溶于100mL 3wt％的醋酸溶液中，加入25gɑ-酮己二酸，加热至45℃，搅拌反应13h后，加入2.5g硼氢化钠，继续搅拌3h，加入乙醇至体系中乙醇含量为70wt％，3000r/min离心15min，得到酸化壳聚糖，然后将10g酸化壳聚糖、4g步骤S5制得的内核、0.7g益生元组合物和2g活性组合物加入100mL水中，搅拌混合17min，用孔隙为4μm的SPG快速膜乳化，滴加20mL 4wt％的含有钙离子和铁离子的金属离子溶液，钙离子和铁离子的质量比为1:1，常温固化45min，过滤，干燥，得到中层核；
S8.灵芝复方制剂的制备：将4g步骤S6制得的中层核、17g海藻酸钠加入100mL水中，混合均匀，用孔隙为10μm的SPG快速膜乳化，滴加20mL 4wt％的含有钙离子和铁离子的金属离子溶液，钙离子和铁离子的质量比为1:1，常温固化45min，过滤，干燥，得到灵芝复方制剂。
所述微缺氧条件为二氧化碳含量为2.5％，氧气含量为7％，余量为氮气，其中，％为体积百分比。
对比例2
与实施例8相比，步骤S5中发酵时未接种枯草芽孢杆菌，其他条件均不改变。
对比例3
与实施例8相比，步骤S5中发酵时未接种青春双歧杆菌，其他条件均不改变。
对比例4
与实施例8相比，步骤S5中发酵时未接种保加利亚乳杆菌，其他条件均不改变。
对比例5
与实施例8相比，未进行步骤S5发酵步骤，其他条件均不改变。
包括以下步骤：
S1.中药材的预处理：称取灵芝85g，枸杞子70g，核桃仁45g，薏苡仁45g，黑芝麻20g，何首乌85g，杜仲叶45g，将上述药材经挑选，剔除虫害、杂物等杂质；灵芝经粗碎，其他药材经水洗，干燥至水分10％以下；
S2.渗漉提取：将步骤S1得到的药材加入等重量的75％乙醇溶液中浸泡36h，渗漉提取，收集漉液；
S3.将步骤S2得到的药渣先浸泡30min，分别回流提取两次，第一次加入8倍质量的水，第二次加入6倍质量的水；回流时间2.5h，温度90℃；合并两次药液，加入乙醇至体系中乙醇含量为70wt％，静置沉淀18h，3000r/min离心15min，得到多糖组合物和上清液，将上清液与步骤S2中得到的漉液混合，陶瓷膜过滤，滤膜孔径为6μm，滤液减压回收乙醇；剩余药液进行浓缩，至原体积的1/8，板框过滤，得到中药液；
S4.益生元组合物的制备：将3g羧甲基茯苓多糖、2g木寡糖混合，搅拌15min，得到益生元组合物；
S5.活性组合物的制备：将10g大豆异黄酮、4g三七总皂苷、1.5g白藜芦醇混合，搅拌15min，得到活性组合物；
S6.内核的制备：将10g步骤S3制得的多糖组合物、15g大豆分离蛋白和0.3g吐温-80，搅拌混合15min，得到水相；将4.5g磷脂酰胆碱和0.2g司盘-80，搅拌混合15min，得到油相；搅拌下将35g水相加入70g油相，13500r/min均质12min，喷雾干燥，得到内核；
S7.中层核的制备：将10g壳聚糖溶于100mL 3wt％的醋酸溶液中，加入25gɑ-酮己二酸，加热至45℃，搅拌反应13h后，加入2.5g硼氢化钠，继续搅拌3h，加入乙醇至体系中乙醇含量为70wt％，3000r/min离心15min，得到酸化壳聚糖，然后将10g酸化壳聚糖、4g步骤S6制得的内核、0.7g益生元组合物和2g活性组合物加入100mL水中，搅拌混合17min，用孔隙为4μm的SPG快速膜乳化，滴加20mL 4wt％的含有钙离子和铁离子的金属离子溶液，钙离子和铁离子的质量比为1:1，常温固化45min，过滤，干燥，得到中层核；
S8.灵芝复方制剂的制备：将4g步骤S7制得的中层核、17g海藻酸钠、10g步骤S3制得的中药液加入100mL水中，混合均匀，用孔隙为10μm的SPG快速膜乳化，滴加20mL 4wt％的含有钙离子和铁离子的金属离子溶液，钙离子和铁离子的质量比为1:1，常温固化45min，过滤，干燥，得到灵芝复方制剂。
所述微缺氧条件为二氧化碳含量为2.5％，氧气含量为7％，余量为氮气，其中，％为体积百分比。
对比例6
与实施例8相比，未添加益生元组合物，其他条件均不改变。
包括以下步骤：
S1.中药材的预处理：称取灵芝85g，枸杞子70g，核桃仁45g，薏苡仁45g，黑芝麻20g，何首乌85g，杜仲叶45g，将上述药材经挑选，剔除虫害、杂物等杂质；灵芝经粗碎，其他药材经水洗，干燥至水分10％以下；
S2.渗漉提取：将步骤S1得到的药材加入等重量的75％乙醇溶液中浸泡36h，渗漉提取，收集漉液；
S3.将步骤S2得到的药渣先浸泡30min，分别回流提取两次，第一次加入8倍质量的水，第二次加入6倍质量的水；回流时间2.5h，温度90℃；合并两次药液，加入乙醇至体系中乙醇含量为70wt％，静置沉淀18h，3000r/min离心15min，得到多糖组合物和上清液，将上清液与步骤S2中得到的漉液混合，陶瓷膜过滤，滤膜孔径为6μm，滤液减压回收乙醇；剩余药液进行浓缩，至原体积的1/8，板框过滤，得到中药液；
S4.菌种的活化：将枯草芽孢杆菌、青春双歧杆菌、保加利亚乳杆菌在高氏培养基中划线，微缺氧条件下，37℃，60r/min，活化培养21h，得到菌种种子液，含菌量为109cfu/mL；
S5.发酵：将6g步骤S3得到的多糖组合物、8g葡萄糖、1.5g蔗糖、0.5g琼脂、4g蛋白胨、1g尿素、0.5g亮氨酸、0.5g色氨酸、1g硝酸铵、0.4g维生素C、0.1g维生素B1、0.1g维生素B2、0.1g维生素B6、1g氯化钠、0.1g氯化镁、0.1g氯化铜、0.1g氯化铁、0.1g氯化锌、0.1g氯化锰加入100g水中，用磷酸盐缓冲液调节pH值至7，紫外线灭菌，得到发酵培养基；将步骤S4制得的菌种种子液接种至发酵培养基中，所述枯草芽孢杆菌、青春双歧杆菌、保加利亚乳杆菌的接种量分别为1％、3％、2％，在微缺氧条件下，温度为37℃，转速为60r/min，发酵培养30h，得到发酵组合物；
S6.活性组合物的制备：将10g大豆异黄酮、4g三七总皂苷、1.5g白藜芦醇混合，搅拌15min，得到活性组合物；
S7.内核的制备：将10g步骤S5制得的发酵组合物、15g大豆分离蛋白和0.3g吐温-80，搅拌混合15min，得到水相；将4.5g磷脂酰胆碱和0.2g司盘-80，搅拌混合15min，得到油相；搅拌下将35g水相加入70g油相，13500r/min均质12min，喷雾干燥，得到内核；
S8.中层核的制备：将10g壳聚糖溶于100mL 3wt％的醋酸溶液中，加入25gɑ-酮己二酸，加热至45℃，搅拌反应13h后，加入2.5g硼氢化钠，继续搅拌3h，加入乙醇至体系中乙醇含量为70wt％，3000r/min离心15min，得到酸化壳聚糖，然后将10g酸化壳聚糖、4g步骤S8制得的内核和2g活性组合物加入100mL水中，搅拌混合17min，用孔隙为4μm的SPG快速膜乳化，滴加20mL 4wt％的含有钙离子和铁离子的金属离子溶液，钙离子和铁离子的质量比为1:1，常温固化45min，过滤，干燥，得到中层核；
S9.灵芝复方制剂的制备：将4g步骤S8制得的中层核、17g海藻酸钠、10g步骤S3制得的中药液加入100mL水中，混合均匀，用孔隙为10μm的SPG快速膜乳化，滴加20mL 4wt％的含有钙离子和铁离子的金属离子溶液，钙离子和铁离子的质量比为1:1，常温固化45min，过滤，干燥，得到灵芝复方制剂。
所述微缺氧条件为二氧化碳含量为2.5％，氧气含量为7％，余量为氮气，其中，％为体积百分比。
对比例7
与实施例8相比，步骤S7中未添加大豆异黄酮，其他条件均不改变。
具体如下：
S7.活性组合物的制备：将4g三七总皂苷、1.5g白藜芦醇混合，搅拌15min，得到活性组合物。
对比例8
与实施例8相比，步骤S7中未添加三七总皂苷，其他条件均不改变。
具体如下：
S7.活性组合物的制备：将10g大豆异黄酮、1.5g白藜芦醇混合，搅拌15min，得到活性组合物。
对比例9
与实施例8相比，步骤S7中未添加白藜芦醇，其他条件均不改变。
具体如下：
S7.活性组合物的制备：将10g大豆异黄酮、4g三七总皂苷混合，搅拌15min，得到活性组合物。
对比例10
与实施例8相比，未添加活性组合物，其他条件均不改变。
包括以下步骤：
S1.中药材的预处理：称取灵芝85g，枸杞子70g，核桃仁45g，薏苡仁45g，黑芝麻20g，何首乌85g，杜仲叶45g，将上述药材经挑选，剔除虫害、杂物等杂质；灵芝经粗碎，其他药材经水洗，干燥至水分10％以下；
S2.渗漉提取：将步骤S1得到的药材加入等重量的75％乙醇溶液中浸泡36h，渗漉提取，收集漉液；
S3.将步骤S2得到的药渣先浸泡30min，分别回流提取两次，第一次加入8倍质量的水，第二次加入6倍质量的水；回流时间2.5h，温度90℃；合并两次药液，加入乙醇至体系中乙醇含量为70wt％，静置沉淀18h，3000r/min离心15min，得到多糖组合物和上清液，将上清液与步骤S2中得到的漉液混合，陶瓷膜过滤，滤膜孔径为6μm，滤液减压回收乙醇；剩余药液进行浓缩，至原体积的1/8，板框过滤，得到中药液；
S4.菌种的活化：将枯草芽孢杆菌、青春双歧杆菌、保加利亚乳杆菌在高氏培养基中划线，微缺氧条件下，37℃，60r/min，活化培养21h，得到菌种种子液，含菌量为109cfu/mL；
S5.发酵：将6g步骤S3得到的多糖组合物、8g葡萄糖、1.5g蔗糖、0.5g琼脂、4g蛋白胨、1g尿素、0.5g亮氨酸、0.5g色氨酸、1g硝酸铵、0.4g维生素C、0.1g维生素B1、0.1g维生素B2、0.1g维生素B6、1g氯化钠、0.1g氯化镁、0.1g氯化铜、0.1g氯化铁、0.1g氯化锌、0.1g氯化锰加入100g水中，用磷酸盐缓冲液调节pH值至7，紫外线灭菌，得到发酵培养基；将步骤S4制得的菌种种子液接种至发酵培养基中，所述枯草芽孢杆菌、青春双歧杆菌、保加利亚乳杆菌的接种量分别为1％、3％、2％，在微缺氧条件下，温度为37℃，转速为60r/min，发酵培养30h，得到发酵组合物；
S6.益生元组合物的制备：将3g羧甲基茯苓多糖、2g木寡糖混合，搅拌15min，得到益生元组合物；
S7.内核的制备：将10g步骤S5制得的发酵组合物、15g大豆分离蛋白和0.3g吐温-80，搅拌混合15min，得到水相；将4.5g磷脂酰胆碱和0.2g司盘-80，搅拌混合15min，得到油相；搅拌下将35g水相加入70g油相，13500r/min均质12min，喷雾干燥，得到内核；
S8.中层核的制备：将10g壳聚糖溶于100mL 3wt％的醋酸溶液中，加入25gɑ-酮己二酸，加热至45℃，搅拌反应13h后，加入2.5g硼氢化钠，继续搅拌3h，加入乙醇至体系中乙醇含量为70wt％，3000r/min离心15min，得到酸化壳聚糖，然后将10g酸化壳聚糖、4g步骤S7制得的内核、0.7g益生元组合物加入100mL水中，搅拌混合17min，用孔隙为4μm的SPG快速膜乳化，滴加20mL 4wt％的含有钙离子和铁离子的金属离子溶液，钙离子和铁离子的质量比为1:1，常温固化45min，过滤，干燥，得到中层核；
S9.灵芝复方制剂的制备：将4g步骤S8制得的中层核、17g海藻酸钠、10g步骤S3制得的中药液加入100mL水中，混合均匀，用孔隙为10μm的SPG快速膜乳化，滴加20mL 4wt％的含有钙离子和铁离子的金属离子溶液，钙离子和铁离子的质量比为1:1，常温固化45min，过滤，干燥，得到灵芝复方制剂。
所述微缺氧条件为二氧化碳含量为2.5％，氧气含量为7％，余量为氮气，其中，％为体积百分比。
对比例11
与实施例8相比，未进行三层包埋，仅进行一层包埋，其他条件均不改变。
包括以下步骤：
S1.中药材的预处理：称取灵芝85g，枸杞子70g，核桃仁45g，薏苡仁45g，黑芝麻20g，何首乌85g，杜仲叶45g，将上述药材经挑选，剔除虫害、杂物等杂质；灵芝经粗碎，其他药材经水洗，干燥至水分10％以下；
S2.渗漉提取：将步骤S1得到的药材加入等重量的75％乙醇溶液中浸泡36h，渗漉提取，收集漉液；
S3.将步骤S2得到的药渣先浸泡30min，分别回流提取两次，第一次加入8倍质量的水，第二次加入6倍质量的水；回流时间2.5h，温度90℃；合并两次药液，加入乙醇至体系中乙醇含量为70wt％，静置沉淀18h，3000r/min离心15min，得到多糖组合物和上清液，将上清液与步骤S2中得到的漉液混合，陶瓷膜过滤，滤膜孔径为6μm，滤液减压回收乙醇；剩余药液进行浓缩，至原体积的1/8，板框过滤，得到中药液；
S4.菌种的活化：将枯草芽孢杆菌、青春双歧杆菌、保加利亚乳杆菌在高氏培养基中划线，微缺氧条件下，37℃，60r/min，活化培养21h，得到菌种种子液，含菌量为109cfu/mL；
S5.发酵：将6g步骤S3得到的多糖组合物、8g葡萄糖、1.5g蔗糖、0.5g琼脂、4g蛋白胨、1g尿素、0.5g亮氨酸、0.5g色氨酸、1g硝酸铵、0.4g维生素C、0.1g维生素B1、0.1g维生素B2、0.1g维生素B6、1g氯化钠、0.1g氯化镁、0.1g氯化铜、0.1g氯化铁、0.1g氯化锌、0.1g氯化锰加入100g水中，用磷酸盐缓冲液调节pH值至7，紫外线灭菌，得到发酵培养基；将步骤S4制得的菌种种子液接种至发酵培养基中，所述枯草芽孢杆菌、青春双歧杆菌、保加利亚乳杆菌的接种量分别为1％、3％、2％，在微缺氧条件下，温度为37℃，转速为60r/min，发酵培养30h，得到发酵组合物；
S6.益生元组合物的制备：将3g羧甲基茯苓多糖、2g木寡糖混合，搅拌15min，得到益生元组合物；
S7.活性组合物的制备：将10g大豆异黄酮、4g三七总皂苷、1.5g白藜芦醇混合，搅拌15min，得到活性组合物；
S8.灵芝复方制剂的制备：将4g步骤S5制得的发酵组合物、0.7g益生元组合物、2g活性组合物、17g海藻酸钠、10g步骤S3制得的中药液加入100mL水中，混合均匀，用孔隙为10μm的SPG快速膜乳化，滴加20mL 4wt％的含有钙离子和铁离子的金属离子溶液，钙离子和铁离子的质量比为1:1，常温固化45min，过滤，干燥，得到灵芝复方制剂。
所述微缺氧条件为二氧化碳含量为2.5％，氧气含量为7％，余量为氮气，其中，％为体积百分比。
对比例12
与实施例8相比，未进行包埋处理，其他条件均不改变。
包括以下步骤：
S1.中药材的预处理：称取灵芝85g，枸杞子70g，核桃仁45g，薏苡仁45g，黑芝麻20g，何首乌85g，杜仲叶45g，将上述药材经挑选，剔除虫害、杂物等杂质；灵芝经粗碎，其他药材经水洗，干燥至水分10％以下；
S2.渗漉提取：将步骤S1得到的药材加入等重量的75％乙醇溶液中浸泡36h，渗漉提取，收集漉液；
S3.将步骤S2得到的药渣先浸泡30min，分别回流提取两次，第一次加入8倍质量的水，第二次加入6倍质量的水；回流时间2.5h，温度90℃；合并两次药液，加入乙醇至体系中乙醇含量为70wt％，静置沉淀18h，3000r/min离心15min，得到多糖组合物和上清液，将上清液与步骤S2中得到的漉液混合，陶瓷膜过滤，滤膜孔径为6μm，滤液减压回收乙醇；剩余药液进行浓缩，至原体积的1/8，板框过滤，得到中药液；
S4.菌种的活化：将枯草芽孢杆菌、青春双歧杆菌、保加利亚乳杆菌在高氏培养基中划线，微缺氧条件下，37℃，60r/min，活化培养21h，得到菌种种子液，含菌量为109cfu/mL；
S5.发酵：将6g步骤S3得到的多糖组合物、8g葡萄糖、1.5g蔗糖、0.5g琼脂、4g蛋白胨、1g尿素、0.5g亮氨酸、0.5g色氨酸、1g硝酸铵、0.4g维生素C、0.1g维生素B1、0.1g维生素B2、0.1g维生素B6、1g氯化钠、0.1g氯化镁、0.1g氯化铜、0.1g氯化铁、0.1g氯化锌、0.1g氯化锰加入100g水中，用磷酸盐缓冲液调节pH值至7，紫外线灭菌，得到发酵培养基；将步骤S4制得的菌种种子液接种至发酵培养基中，所述枯草芽孢杆菌、青春双歧杆菌、保加利亚乳杆菌的接种量分别为1％、3％、2％，在微缺氧条件下，温度为37℃，转速为60r/min，发酵培养30h，得到发酵组合物；
S6.益生元组合物的制备：将3g羧甲基茯苓多糖、2g木寡糖混合，搅拌15min，得到益生元组合物；
S7.活性组合物的制备：将10g大豆异黄酮、4g三七总皂苷、1.5g白藜芦醇混合，搅拌15min，得到活性组合物；
S8.灵芝复方制剂的制备：将4g步骤S5制得的发酵组合物、0.7g益生元组合物、2g活性组合物、10g步骤S3制得的中药液混合均匀，干燥，得到灵芝复方制剂。
所述微缺氧条件为二氧化碳含量为2.5％，氧气含量为7％，余量为氮气，其中，％为体积百分比。
测试例1缓释效果测试
将实施例8和对比例11、对比例12制得的灵芝复方制剂进行体外消化道中缓释效果测试，结果见图1和图2。
方法如下：
人工唾液的配制：将0.75g氯化钾、0.15g磷酸氢二钾、0.99g碳酸氢钠、0.03g六水合氯化镁和0.01g碳酸铵溶于500mL无菌水中混合均匀，并用盐酸或氢氧化钠调节pH至7.00，备用。
人工胃液的配制：将0.26g氯化钾、0.02g磷酸二氢钾、1.05g碳酸氢钠、1.40g氯化钠、0.04g碳酸铵、0.01g二水合氯化镁和0.01g二水合氯化钙于500mL无菌水中混合均匀，并用盐酸或氢氧化钠调节pH至2.00，添加胃蛋白酶，并保持在3.20g/L，备用。
人工肠液的配制：将0.01g磷酸二氢钾、0.25g氯化钾、1.12g氯化钠、3.27g碳酸氢钠、6.13g六水合氯化镁和0.03g二水合氯化钙于500mL无菌水中混合均匀，并用盐酸或氢氧化钠调节pH至7.40，添加胰酶和胆盐，胰酶保持在10.00g/L，胆盐保持在3.00g/L，备用。
人工唾液中益生菌存活率测定
将实施例8、对比例11、12制得的灵芝复方制剂加入20mL人工唾液中，37℃、150r/min匀速摇动10min，每隔2min进行活菌计数，计算存活率。
人工胃液与肠液中益生菌存活率测定
将上述已通过人工唾液的灵芝复方制剂加入20mL人工胃液中，37℃、150r/min匀速摇动120min，通过人工胃液的微胶囊加入20mL人工肠液中匀速摇动120min，每隔30min进行活菌计数，计算存活率。
活菌计数的方法参考：GB4789.35-2016的涂布平板法。
存活率的测定：将灵芝复方制剂用球磨的方法进行充分破碎处理，然后进行活菌计数。
存活率的计算公式如下：
存活率(％)＝S/S0×100％
式中：S表示处理后的益生菌活菌数，logCFU/g；S0表示处理前的益生菌活菌数，logCFU/g。
由图1可知，尽管人体唾液中含有唾液淀粉酶和大量的无机盐，但食物通过人体口腔和食管的时间只需30-120s，包埋处理的实施例8、对比例11中益生菌的存活率无显著变化，而未经包埋处理的对比例12则益生菌存活率大大下降。
由图2可知，仅进行单层包埋的对比例11在模拟胃液环境中益生菌的存活率大大下降，在刚进入模拟肠液中时，存活率几乎接近为40-50％，且进入模拟肠液后，存活率迅速下降，可能是因为海藻酸钠微胶囊存在较大孔隙，使得胃酸快速进入微胶囊内部，降低益生菌的存活率。而经过本发明三层包埋后，刚进入模拟肠液中时，存活率几乎变化不大，在模拟肠液中实现了存活率仍然保持较高的范围。
测试例2
试验分组和给药：将138只2月龄的SPF级昆明种小鼠根据体重随机分为23组：空白组、模型组、脑复康组、实施例1-8组、对比例1-12组，每组6只。除空白组外其余各组老鼠腹腔注射D-半乳糖60mg/(kg·d)(生理盐水配制)和灌胃AlCl3 5mg/(kg·d)(清水配置)，每天上午8点给药1次，连续60d。空白组腹腔注射等量的生理盐水和灌胃等量的清水。脑复康组和实施例1-8组、对比例1-12组自造模起上午给予D-半乳糖和AlCl3外，每日下午2点给予相应的药物，每日1次，连续60d，灌胃量是脑复康组给予脑复康0.2g/10g，实施例1-8、对比例1-12组给予实施例1-8、对比例1-12制得的灵芝复方制剂1g/10g。空白组和模型组给予等量的生理盐水。
小鼠跳台试验：
学习障碍实验：末次给药1h后开始进行训练。将各组小鼠放入反应箱内(包括平台、铜栅)适应环境3min，然后将小鼠放置反应箱内的铜栅上，通以36V的交流电。小鼠因为感受到电击，正常反应是跳回平台。训练一次后，将小鼠放在反应箱内的平台上，记录5min内各组小鼠跳下平台的平均错误次数和第一次跳下平台的潜伏期。
巩固障碍实验：24h后进行重复测验，将小鼠放在平台上，记录5min内各组小鼠跳下平台的平均错误次数和第一次跳下平台的潜伏期。
记忆再现障碍实验：停止训练5d后(包括第5天)，各组小鼠在相同时间进行一次试验，将小鼠放在平台上，记录5min内各组小鼠跳下平台的平均错误次数和第一次跳下平台的潜伏期。
结果见表1。
表1
注释：#为与正常组相比，P<0.05；*为与模型组相比，P<0.05，**为与模型组相比，P<0.01。
由上表可知，本发明实施例1-8制得的灵芝复方制剂能明显改善小鼠的学习、记忆能力，实施例6-8则具有更好的效果。
脑内代谢指标的测定：
小鼠跳台试验试验结束后，处死动物，取大脑，洗去血液并吸干水分，匀浆，离心，取上清液，采用试剂盒法测定脑中过氧化脂质(MDA)含量、超氧化岐化酶(SOD)活性。
结果见表2。
表2
组别 SOD(U/mg) MDA(nmol/mg)
正常组 167.4±29.3 2.49±0.62
模型组 98.5±21.3# 3.02±1.01#
脑复康组 137.5±24.5* 2.67±0.43*
实施例1 140.2±22.3* 2.65±0.39*
实施例2 139.7±21.7* 2.64±0.45*
实施例3 141.1±23.6** 2.66±0.34*
实施例4 141.5±25.1* 2.63±0.47*
实施例5 141.7±24.8* 2.62±0.29*
实施例6 153.5±23.2** 2.56±0.33**
实施例7 154.2±21.4** 2.54±0.26**
实施例8 155.7±22.7** 2.52±0.31**
对比例1 110.2±19.5 2.94±0.36
对比例2 124.5±17.3 2.78±0.44
对比例3 121.3±20.3 2.87±0.42
对比例4 122.7±21.1 2.83±0.54
对比例5 114.2±15.7 2.92±0.48
对比例6 135.7±14.2 2.72±0.51
对比例7 131.2±16.7 2.75±0.57
对比例8 127.8±17.2 2.79±0.45
对比例9 128.7±18.8 2.78±0.41
对比例10 122.5±19.4 2.84±0.55
对比例11 118.7±16.5 2.89±0.40
对比例12 112.2±16.9 2.93±0.52
注释：#为与正常组相比，P<0.05；*为与模型组相比，P<0.05，**为与模型组相比，P<0.01。
由上表可知，本发明实施例1-8制得的灵芝复方制剂能明显减少MDA含量，提高SOD含量，自由基减少，抗氧化作用增强，实施例6-8则具有更好的效果。
对比例1与实施例8相比，未进行步骤S1至S3，小鼠学习、记忆指标明显下降，自由基增多，抗氧化作用减弱。灵芝，味甘，性平；归心、肺、肝、肾经，主治心神不宁，失眠，惊悸，咳喘痰多，虚劳证等，含多糖、核苷类、呋喃类、甾醇类、生物碱、三萜类、油脂类、多种氨基酸及蛋白质类、酶类、有机锗及多种微量元素等，灵芝多种制剂分别具有镇静、抗惊厥、强心、抗心律失常、降压、镇咳平喘、睡眠改善，食欲、体重增加，心悸、头痛、头晕减轻或消失，精神振奋，记忆力增强的作用；灵芝可用于神经衰弱症与失眠，对中枢起到良好的作用。灵芝提取物能激发运动性抑制，使运动性降低，使协调运动失调、呈现用量依赖性镇病效果，对环已巴比妥睡眠作用能缩短睡眠时间，能延长中枢兴奋药咖啡因致痉挛及死亡的时间，可见，灵芝对中枢呈抑制性作用。枸杞子，味甘，性平，归肝、肾经，滋补肝肾，益精明目，改善血液循环，含有枸杞多糖、单糖、甜菜碱、脂肪酸、蛋白质和多肽、维生素B1、维生素B2、维生素C、18种氨基酸(含8种必需氨基酸)、微量元素(钙、锌、镁、铁、锰、磷等)，而且能直接作用于大脑神经细胞，影响神经递质的传导，导致皮层诱导电位的变化。核桃仁，性温，味甘。肺，肾，大肠，具有温补肺肾，定喘润肠。用于肾虚腰痛、脚软、虚寒喘咳、大便燥结的效果；核桃仁中含有多种维生素、糖分以及各种矿物质。此外，核桃仁中植物脂肪和蛋白质的含量非常高，其中脂肪含量高达70％，蛋白质占17％-27％。在核桃仁中不仅含有钙、铁、磷等元素，还含有锌、锰、铬等人体不可缺乏的矿物质。多种维生素及蛋白质、矿物质，都是有利于容貌健美的营养物质。核桃中的磷脂，对脑神经有良好保健作用，具有很好的抗衰老作用，核桃的益智作用很好，有助于提高记忆力，延缓老年痴呆。薏苡仁，味甘、淡，性凉，归脾、胃、肺经。有利水渗湿，健脾止泻，除痹，排脓，解毒散结的作用。薏苡仁含薏苡仁油、薏苡仁酯、氨基酸、脂肪油等。薏苡仁油及薏苡素有抑制肌肉收缩的作用，薏苡素还对中枢神经系统有镇静、解热、降温和镇痛作用。黑芝麻，性平，味甘，补肝肾，益精血，润肠燥。用于头晕眼花、耳鸣耳聋、须发早白、病后脱发、肠燥便秘。黑芝麻含有的多种人体必需氨基酸在维生素E、维生素B1的作用参与下，能加速人体的代谢功能；黑芝麻-含有的铁和维生素E是预防贫血、活化脑细胞、消除血管胆固醇的重要成分；黑芝麻含有的脂肪大多为不饱和脂肪酸，有延年益寿的作用；中医中药理论认为，黑芝麻具有补肝肾、润五脏、益气力、长肌肉、填脑髓的作用，可用于治疗肝肾精血不足所致的眩晕、须发早白、脱发、腰膝酸软、四肢乏力、步履艰难、五脏虚损、皮燥发枯、肠燥便秘等病症。还具有健脑益智、延年益寿的作用。何首乌苦甘涩之，非寒非燥，既先天之真阴补之，又后天之营血调补，益精髓，乌须发，驻颜延年，久养精神，能加强滋阴、生精、填髓、健脑之效。内含酚类化合物，根部含大黄酚、大黄素、大黄酸，此外，含淀粉45.2％、粗脂肪3.1％、卵磷脂3.7％等。具有改善老年人多巴胺能神经系统的功能。杜仲叶，微辛，温。归肝、肾经，补肝肾，强筋骨。用于肝肾不足，头晕目眩，腰膝酸痛，筋骨痿软。有很好的镇静、镇痛作用，抗炎作用等效果，能协助各药起到很好的增效作用。本发明制得的灵芝复方制剂，各中药组分配伍合理，能睡眠改善、镇静、增强记忆力、影响神经递质的传导，导致皮层诱导电位的变化，对脑神经有良好保健作用，具有很好的抗衰老作用，其添加的益生菌通过“脑肠轴”的作用，提高脑内GABA的含量，减少炎症因子的分泌，降低β-淀粉样蛋白的含量，与益生元、活性组合物的协同作用下，起到很好的预防和缓解老年痴呆症的发生、发展的效果。
对比例2、3、4与实施例8相比，步骤S5中发酵时未接种枯草芽孢杆菌、青春双歧杆菌或保加利亚乳杆菌，小鼠学习、记忆指标下降，自由基增多，抗氧化作用减弱。对比例5与实施例8相比，未进行步骤S5发酵步骤，小鼠学习、记忆指标明显下降，自由基增多，抗氧化作用明显减弱。本发明中添加的枯草芽孢杆菌等可以抑制产生细胞外β-淀粉样蛋白，并抑制肠道微生物紊乱后引起的炎症，影响肠道通透性，从而避免细胞外β-淀粉样蛋白透过肠道细胞进入循环系统进入脑部，从而起到减少β-淀粉样蛋白对神经的负面影响，延缓老年痴呆的发生。青春双歧杆菌、保加利亚乳杆菌能产生短链脂肪酸，包括乳酸、丙酸盐、丁酸盐等，丙酸盐可以激发肠道糖异生途径从而激活迷走神经环路，而迷走神经背侧运动核接受该环路调节，从而影响老年痴呆症神经变性早期过程。通过添加青春双歧杆菌、保加利亚乳杆菌，还能提高肠道GABA水平，进而提高中枢系统GABA水平，从而起到改善患者的认知功能的效果。本发明枯草芽孢杆菌、青春双歧杆菌、保加利亚乳杆菌组合后，还可以通过分泌抑制炎症反应的物质，降低肠道的通透性，从而减少引发老年痴呆症的物质通过脑肠轴进入大脑，从而预防和延缓老年痴呆症的发生发展。
对比例6与实施例8相比，未添加益生元组合物，自由基增多，抗氧化作用减弱。本发明通过添加益生元刺激有益菌群的生长，而不刺激有潜在致病性或腐败活性的有害细菌。益生元不能被人体分解、吸收和利用，通过消化道到达结肠后，被结肠益生菌菌群分解和利用，从而促进结肠菌群的生长，能明显改善肠道微生态、促进脂质、蛋白质与矿物类代谢，调节益生菌代谢产物，产生大量GABA活性物质，抑制β-淀粉样蛋白的生成，从而起到辅助改善大脑中枢神经的功能，起到预防和延缓老年痴呆症的发生发展的效果。羧甲基茯苓多糖是一种具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、免疫调节作用的活性多糖，其还可以明显促进肠道益生菌的增殖，起到很好的调节作用；木寡糖对pH及热的稳定性较好，即使是在酸性条件(pH2.5-7)加热也不会大量分解，极难被动物消化吸收，肠道内残存率高，能够有效推动双歧杆菌增殖。
对比例7、8、9与实施例8相比，步骤S7中未添加大豆异黄酮、三七总皂苷或白藜芦醇，自由基增多，抗氧化作用减弱。对比例10与实施例8相比，未添加活性组合物，小鼠学习、记忆指标明显下降，自由基增多，抗氧化作用减弱。大豆异黄酮、三七总皂苷、白藜芦醇均具有较好的改善认知的效果，大豆异黄酮和三七总皂苷在抗应激、抗氧化、增强胆碱功能、增强免疫力、抗β-淀粉样蛋白以及改善体内微循环等方面有明显的促进作用。白藜芦醇具有较好的抗炎、抗氧化、增强免疫、抗β-淀粉样蛋白的作用，三者协同作用下，能明显起到较好的改善认知、减少炎症因子的分泌，减少β-淀粉样蛋白的生成，从而预防以及延缓老年痴呆症的发生和发展。
对比例11与实施例8相比，未进行三层包埋，小鼠学习、记忆指标下降，自由基增多，抗氧化作用减弱。对比例12与实施例8相比，未进行包埋处理，小鼠学习、记忆指标明显下降，自由基明显增多，抗氧化作用明显减弱。普通的益生菌制剂进入人体后，经过胃部的pH值和氧化还原电位很低，大多数的益生菌不能存活。到了小肠又遇到较高浓度胆汁的影响，益生菌的活性几乎丧失殆尽。本发明微胶囊结构是在最外层包覆一层生物相容性较好的海藻酸钠壳层，且此海藻酸钠壳层能保护内容物不易被微生物接触，不易吸湿，不易被氧化，进入人体后，在强酸性的胃液中发生降解，将第三层内的中药药液溶出，以及中层核暴露，此步骤可以保护益生菌在低pH条件下顺利通过胃部而不失活，同时，中药醇提液经过胃液分解后，部分吸收，其他营养物质与中层核一同进入较高pH值十二指肠。进入十二指肠后，不耐碱的中层壳材(酸化壳聚糖层)发生降解，第二层内的活性组合物、益生元以及内层核暴露，活性组合物包括大豆异黄酮、三七总皂苷、白藜芦醇等，容易被肠道直接吸收，发挥出抗炎、抗氧化、增强免疫、抗β-淀粉样蛋白的作用、抗应激等作用；另外，益生元进入肠道后，在肠道内富集，为后期益生菌定植后，提高丰富的营养温床，从而促进益生菌的增殖和生长，通过“脑肠轴”起到很好的调节中枢系统功能的作用；壳聚糖的高分子链段中含有丰富的-NH2和-OH活性基团，来源广泛，无毒无害，易生物降解，但壳聚糖在酸性介质中不稳定，酸性强时容易溶解，因此，本发明通过将ɑ-酮二酸与壳聚糖的氨基反应，将羧酸结构连接到壳聚糖上，使得酸化壳聚糖与金属离子交联形成网络结构的壳层，不易于在胃部被人体分解，从而能在进入十二指肠中后被降解释放出来，同时，降解的壳聚糖也能够作为益生元被益生菌分解吸收，促进益生菌的增殖。进一步地，由于内层壳材中含有抗胆汁的脂类物质(大豆分离蛋白和磷脂酰胆碱形成的壳层)，因此，包裹了内层壳材的益生菌不会直接与胆碱盐类物质接触，益生菌在空肠的初期不被胆汁灭活。随着消化酶作用的进行，内层壳材开始崩解，促进益生菌(包括枯草芽孢杆菌、青春双歧杆菌和保加利亚乳杆菌)在肠壁绒毛上的附着，随着消化作用的继续推进，失去所有壳材保护的益生菌在各自适宜和营养丰富的肠道中最终靶向定植下来，并开始大量繁殖，发挥出调节的作用。本发明通过多层保护的策略，避免益生菌在经过肠道、十二指肠过程中失活，使其安全到达小肠、大肠后靶向定殖，提高了益生菌的抗逆性，延长了益生菌保存期的活性，使其能正常发挥益生菌的双向调节的功效，提高肠道GABA水平以及中枢系统GABA水平，起到改善患者的认知功能的效果，减少引发老年痴呆症的物质通过脑肠轴进入大脑，从而预防和延缓老年痴呆症的发生发展。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种具有预防或延缓老年痴呆症的发生、发展的灵芝复方制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.中药材的预处理：按比例称取各药材，经挑选，剔除虫害、杂物；灵芝经粗碎，其他药材经水洗，干燥至水分10%以下；
所述中药材包括按重量份的以下原料：灵芝70-110份，枸杞子50-90份，核桃仁35-55份，薏苡仁35-55份，黑芝麻15-25份；
S2.渗漉提取：将步骤S1得到的药材加入等重量的50%-95%乙醇溶液中浸泡12-48h，渗漉提取，收集漉液；
S3.将步骤S2得到的药渣先浸泡10-50min，分别回流提取两次，第一次加入6-10倍质量的水，第二次加入4-8倍质量的水；回流时间1.5-3.5h，温度85-100℃；合并两次药液，醇沉，离心，得到多糖组合物和上清液，将上清液与步骤S2中得到的漉液混合，陶瓷膜过滤，滤膜孔径为2-8μm，滤液减压回收乙醇；药液进行浓缩，至原体积的1/7-1/10，板框过滤，得到中药液；
S4.菌种的活化：将枯草芽孢杆菌、青春双歧杆菌、保加利亚乳杆菌在高氏培养基中划线，活化培养，得到菌种种子液；
S5.发酵：将步骤S3得到的多糖组合物、碳源、氮源、维生素、无机盐加入水中，用磷酸盐缓冲液调节pH值，灭菌，得到发酵培养基；将步骤S4制得的菌种种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵组合物；所述多糖组合物、碳源、氮源、维生素、无机盐和水的质量比为5-7:7-12:5-10:0.5-1:1-2:100；所述枯草芽孢杆菌、青春双歧杆菌、保加利亚乳杆菌的接种量分别为0.5-1.5%、2-4%、1.5-3%；所述发酵培养的条件为在微缺氧条件下，温度为36-38℃，转速为50-70r/min，发酵培养24-36h；
S6.益生元组合物的制备：将羧甲基茯苓多糖、木寡糖混合均匀，得到益生元组合物；所述羧甲基茯苓多糖、木寡糖的质量比为2-4:1-3；
S7.活性组合物的制备：将大豆异黄酮、三七总皂苷、白藜芦醇混合均匀，得到活性组合物；所述大豆异黄酮、三七总皂苷、白藜芦醇的质量比为10:3-5:1-2；
S8.内核的制备：将步骤S5制得的发酵组合物、大豆分离蛋白和亲水乳化剂混合均匀，得到水相；将磷脂酰胆碱和亲油乳化剂混合均匀，得到油相；搅拌下将水相加入油相，均质，喷雾干燥，得到内核；所述发酵组合物、大豆分离蛋白和亲水乳化剂的质量比为10：12-17:0.1-0.5；所述磷脂酰胆碱和亲油乳化剂的质量比4-5:0.1-0.3；所述水相和油相的质量比为2-5:7；
S9.中层核的制备：将壳聚糖溶于酸液中，加入ɑ-酮二酸，搅拌反应12-15h后，加入硼氢化钠，继续搅拌2-4h，醇沉，离心，得到酸化壳聚糖，然后将酸化壳聚糖、步骤S8制得的内核、益生元组合物和活性组合物加入水中，混合均匀，用第一SPG快速膜乳化，滴加第一金属离子溶液，固化，过滤，干燥，得到中层核；所述壳聚糖、ɑ-酮二酸、硼氢化钠的质量比为1:2.2-2.7:0.23-0.38；所述酸化壳聚糖、内核、益生元组合物和活性组合物的质量比为10:3-5:0.5-1:1-3；所述酸液为2-4wt%的醋酸溶液，所述醇沉为加入乙醇至体系中乙醇含量为60-80wt%，所述第一SPG快速膜的孔隙为3-5μm，所述第一金属离子溶液为浓度为3-5wt%的含有钙离子、镁离子、铝离子、锌离子、铁离子、铜离子中至少一种的金属离子溶液；
S10.灵芝复方制剂的制备：将步骤S9制得的中层核、海藻酸钠、步骤S3制得的中药液加入水中，混合均匀，用第二SPG快速膜乳化，滴加第二金属离子溶液，固化，过滤，干燥，得到灵芝复方制剂；所述中层核、海藻酸钠、中药液的质量比为3-5:15-20:7-12；所述第二SPG快速膜的孔隙为7-12μm，所述第二金属离子溶液为浓度为3-5wt%的含有钙离子、镁离子、铝离子、锌离子、铁离子、铜离子中至少一种的金属离子溶液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，还包括何首乌70-110份，杜仲叶35-55份。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中所述活化培养的条件为微缺氧条件下，35-40℃，50-70r/min，活化培养18-24h；所述菌种种子液的含菌量为108-109cfu/mL；步骤S5中所述pH值调节至6.8-7.2，所述灭菌方法为紫外线灭菌。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S8中所述均质的转速为12000-15000r/min，时间为10-15min。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1.中药材的预处理：按比例称取各药材，经挑选，剔除虫害、杂物；灵芝经粗碎，其他药材经水洗，干燥至水分10%以下；
S2.渗漉提取：将步骤S1得到的药材加入等重量的50%-95%乙醇溶液中浸泡12-48h，渗漉提取，收集漉液；
S3.将步骤S2得到的药渣先浸泡10-50min，分别回流提取两次，第一次加入6-10倍质量的水，第二次加入4-8倍质量的水；回流时间1.5-3.5h，温度85-100℃；合并两次药液，加入乙醇至体系中乙醇含量为60-80wt%，静置沉淀12-24h，离心，得到多糖组合物和上清液，将上清液与步骤S2中得到的漉液混合，陶瓷膜过滤，滤膜孔径为2-8μm，滤液减压回收乙醇；药液进行浓缩，至原体积的1/7-1/10，板框过滤，得到中药液；
S4.菌种的活化：将枯草芽孢杆菌、青春双歧杆菌、保加利亚乳杆菌在高氏培养基中划线，微缺氧条件下，35-40℃，50-70r/min，活化培养18-24h，得到菌种种子液，含菌量为108-109cfu/mL；
S5.发酵：将5-7重量份步骤S3得到的多糖组合物、7-12重量份碳源、5-10重量份氮源、0.5-1重量份维生素、1-2重量份无机盐加入100重量份水中，用磷酸盐缓冲液调节pH值至6.8-7.2，紫外线灭菌，得到发酵培养基；将步骤S4制得的菌种种子液接种至发酵培养基中，所述枯草芽孢杆菌、青春双歧杆菌、保加利亚乳杆菌的接种量分别为0.5-1.5%、2-4%、1.5-3%，在微缺氧条件下，温度为36-38℃，转速为50-70r/min，发酵培养24-36h，得到发酵组合物；
S6.益生元组合物的制备：将2-4重量份羧甲基茯苓多糖、1-3重量份木寡糖混合，搅拌10-20min，得到益生元组合物；
S7.活性组合物的制备：将10重量份大豆异黄酮、3-5重量份三七总皂苷、1-2重量份白藜芦醇混合，搅拌10-20min，得到活性组合物；
S8.内核的制备：将10重量份步骤S5制得的发酵组合物、12-17重量份大豆分离蛋白和0.1-0.5重量份亲水乳化剂混合均匀，得到水相；将4-5重量份磷脂酰胆碱和0.1-0.3重量份亲油乳化剂混合均匀，得到油相；搅拌下将20-50重量份水相加入70重量份油相，12000-15000r/min均质10-15min，喷雾干燥，得到内核；
S9.中层核的制备：将10重量份壳聚糖溶于2-4wt%的醋酸溶液中，加入22-27重量份ɑ-酮二酸，加热至40-50℃，搅拌反应12-15h后，加入2.3-3.8重量份硼氢化钠，继续搅拌2-4h，加入乙醇至体系中乙醇含量为60-80wt%，离心，得到酸化壳聚糖，然后将10重量份酸化壳聚糖、3-5重量份步骤S8制得的内核、0.5-1重量份益生元组合物和1-3重量份活性组合物加入100重量份水中，搅拌混合15-20min，用孔隙为3-5μm的SPG快速膜乳化，滴加3-5wt%的含有钙离子、镁离子、铝离子、锌离子、铁离子、铜离子中至少一种的金属离子溶液，常温固化30-60min，过滤，干燥，得到中层核；
S10.灵芝复方制剂的制备：将3-5重量份步骤S9制得的中层核、15-20重量份海藻酸钠、7-12重量份步骤S3制得的中药液加入100重量份水中，混合均匀，用孔隙为7-12μm的SPG快速膜乳化，滴加3-5wt%的含有钙离子、镁离子、铝离子、锌离子、铁离子、铜离子中至少一种的金属离子溶液，常温固化30-60min，过滤，干燥，得到灵芝复方制剂。
6.一种如权利要求1-5任一项所述的制备方法制得的的具有预防或延缓老年痴呆症的发生、发展的灵芝复方制剂。
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