CN115605220A - 线粒体富集的基因工程细胞及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明基于富集有线粒体的细胞可用于治疗疾病和病症的发现。公开了线粒体富集的基因工程T细胞的药物组合物和使用线粒体富集的基因工程T细胞的治疗方法。

Description

线粒体富集的基因工程细胞及其用途

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(E)要求于2020年3月31日提交的美国专利申请序列号63/003,184的优先权的权益，其全部内容以引用的方式并入本文。

技术领域

本发明一般涉及药物组合物和使用基因工程细胞的治疗方法，并且更具体地涉及富集有线粒体的基因工程淋巴细胞。

背景信息

尽管在医学和治疗方法方面取得了巨大进展，但在工业化国家，癌症仍然是最危及生命的疾病之一。尽管标准治疗策略例如手术、化疗和放疗的组合在大多数情况下可有效治疗原发性肿瘤，但这些策略往往不能成功治疗转移性肿瘤，也不能通过播散性肿瘤细胞预防疾病的进展。最近，基于细胞的免疫疗法，特别是T淋巴细胞的过继转移，已经成为癌症治疗的非常有潜力的替代方式，其目的是防止疾病的转移性扩散和改善患有晚期疾病的受试者的生活质量，包括那些对标准疗法难以治疗的受试者。基于T细胞的免疫疗法利用了T细胞穿透组织、活化并消除靶细胞的天然能力。特异性识别在癌细胞上表达的抗原靶标的基因工程T细胞(例如，T细胞受体(TCR)和嵌合抗原受体(CAR)转导的T细胞)已经用于临床试验并且取得了可喜的成果。

基于T细胞的疗法范围进一步扩展到包括自身免疫性疾病。临床前和临床研究的初步结果支持CAR T疗法在自身免疫中的应用，特别是在调节不良自身免疫应答中的应用。

T细胞受体(TCR)是在T细胞或T淋巴细胞表面发现的分子，其负责将抗原片段识别为与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的肽。TCR与抗原肽之间的结合具有相对低的亲和力并且是退化的：也就是说，许多TCR识别相同的抗原肽，并且许多抗原肽被同一TCR识别。

TCR由两条不同的蛋白链组成。在人类中，在95％的T细胞中，TCR由α链和β链(分别由TRA和TRB编码)组成，而在5％的T细胞中，TCR由γ和δ链(分别由TRG和TRD编码)组成。该比率在个体发育期间和疾病状态(例如白血病)下发生变化。它在物种之间也不同。4个基因座的直系同源物已经在各种物种中绘制。

线粒体是直径为0.5μm至1.0μm范围内的膜结合细胞器，其提供细胞能量并在细胞的代谢功能中起重要作用。在几乎所有真核细胞中都发现线粒体，并且线粒体的数目和位置因细胞类型而异。线粒体含有自己的DNA(mtDNA)和自己合成RNA和蛋白质的机器。mtDNA仅含有37个基因，因此哺乳动物体内的大多数基因产物都由核DNA编码。

线粒体的主要功能是通过电子传递链和氧化磷酸化系统(“呼吸链”)生成作为三磷酸腺苷(ATP)的能量。此外，线粒体在真核细胞中执行许多基本任务，例如丙酮酸氧化、克雷布斯循环和氨基酸、脂肪酸和类固醇的代谢。线粒体参与的其它过程包括产热、钙离子储存、钙信号传导、程序性细胞死亡(细胞凋亡)和细胞增殖。

细胞内的ATP浓度通常为1-10mM。ATP可以使用单糖和复合糖(碳水化合物)或脂类作为能源通过氧化还原反应产生。对于要合成为ATP的复杂燃料，它们首先需要分解成更小、更简单的分子。复合碳水化合物被水解成单糖，如葡萄糖和果糖。脂肪(甘油三酯)被代谢产生脂肪酸和甘油。

将葡萄糖氧化成二氧化碳的整个过程被称为细胞呼吸，并且可以从单个葡萄糖分子产生约30个ATP分子。ATP可以通过许多不同的细胞过程产生。用于在真核生物中生成能量的三种主要途径是糖酵解和柠檬酸循环/氧化磷酸化(两者均为细胞呼吸的组分)以及β-氧化。非光合真核生物的这种ATP产生大部分发生在线粒体中，所述线粒体可以构成典型细胞总体积的将近25％。

已经报道了诱导线粒体转移到宿主细胞或组织中的尝试。大多数方法需要通过注射主动转移线粒体。在如脂质体之类的载体内吞噬的线粒体的转移也是已知的。已经进一步显示，线粒体转移可以在体外在细胞之间自发地发生，尽管仅证实转移了mtDNA而不是完整的整个线粒体。还证实了通过胞吞作用或内化进行的体外线粒体转移。

发明内容

本发明基于以下基本发现：富集有线粒体的细胞可用于治疗疾病和病症。本发明提供了线粒体富集的基因工程T细胞的药物组合物。本发明还提供了使用线粒体富集的基因工程T细胞的治疗方法。

在一个实施例中，本发明提供了一种药物组合物，其包括线粒体富集的基因工程T细胞和药学上可接受的载体，其中所述线粒体富集的基因工程T细胞富集有外源线粒体。

在一个方面，所述线粒体富集的基因工程T细胞通过包括以下步骤的方法产生：从患有疾病或病症的受试者或供体获得T细胞；获得外源线粒体；通过在允许所述外源线粒体进入所述T细胞的条件下使所述T细胞与所述外源线粒体接触来产生线粒体富集的T细胞；以及通过将编码嵌合T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的核酸引入所述线粒体富集的T细胞来产生线粒体富集的基因工程T细胞，其中所述线粒体富集的基因工程T细胞的线粒体含量可检测地高于所述T细胞的线粒体含量。在一个实施例中，允许所述外源线粒体进入所述T细胞的所述条件包括以约0.088mU至176mU柠檬酸合酶(CS)活性/10⁶个T细胞的比率将所述T细胞与所述外源线粒体温育。

在另外的方面，所述线粒体富集的基因工程T细胞通过包括以下步骤的方法产生：从患有疾病或病症的受试者或供体获得T细胞；通过将编码嵌合T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的核酸引入所述T细胞来产生基因工程T细胞；获得外源线粒体；以及通过在允许所述外源线粒体进入所述基因工程T细胞的条件下使所述基因工程T细胞与所述外源线粒体接触来产生线粒体富集的基因工程T细胞；其中所述线粒体富集的基因工程T细胞的所述线粒体含量可检测地高于所述基因工程T细胞的线粒体含量。在一个方面，允许外源线粒体进入所述基因工程T细胞的所述条件包括以约0.088mU至176mU柠檬酸合酶(CS)活性/10⁶个T细胞的比率将基因工程T细胞与所述外源线粒体温育。

在某些方面，所述基因工程T细胞和线粒体富集的基因工程T细胞是CAR-T细胞。另一方面，所述基因工程T细胞和线粒体富集的T细胞是TCR-T细胞。在各个方面，所述外源线粒体来源于人细胞。在一些实施例中，所述人细胞来自人胎盘、人血细胞、人干细胞或人体细胞。在一些实施例中，所述人细胞是在培养物中生长的细胞。在某些方面，所述干细胞是诱导的多能干细胞、胚胎干细胞或多能细胞。在另一方面，外源人线粒体是同系或同种异体的。在另一方面，所述外源线粒体是自体的。

在一个方面，药物组合物具有每Kg需要其的受试者体重至少1×10⁵至5×10¹⁰个线粒体富集的T细胞或线粒体富集的基因工程T细胞。在一些实施例中，进行剂量递增。

在某些方面，所述线粒体富集的基因工程T细胞具有以下各者中的至少一者：相对于线粒体富集之前的所述T细胞中的对应水平，增加的线粒体DNA含量；增加的柠檬酸合酶(CS)活性水平；选自SDHA和COX1的至少一种线粒体蛋白的增加的含量；增加的O₂消耗速率；增加的ATP产生速率；或其任何组合。

在各个方面，允许所述外源线粒体进入所述T细胞或基因工程T细胞的所述条件包含将所述T细胞或基因工程T细胞与所述外源线粒体在约16℃至37℃范围内的温度下温育约0.5小时至30小时范围内的时间。在另一方面，所述外源线粒体构成所述线粒体富集的T细胞或线粒体富集的基因工程T细胞中总线粒体含量的至少1％。

在一个方面，所述疾病或病症是癌症。在具体方面，所述癌症是血液癌症。在另一方面，所述T细胞是自体的或同种异体的。

在另一实施例中，本发明提供了一种治疗有需要的受试者中的疾病或病症的方法，其包括向所述受试者施用线粒体富集的基因工程T细胞，其中所述线粒体富集的基因工程T细胞富集有外源线粒体。

在一个方面，所述线粒体富集的基因工程T细胞通过包括以下步骤的方法产生：从患有疾病或病症的受试者或供体获得T细胞；获得外源线粒体；通过在允许所述外源线粒体进入所述T细胞的条件下使所述T细胞与所述外源线粒体接触来产生线粒体富集的T细胞；以及通过将编码嵌合T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的核酸引入所述线粒体富集的T细胞来产生线粒体富集的基因工程T细胞，其中所述线粒体富集的基因工程T细胞的线粒体含量可检测地高于所述T细胞的线粒体含量。在一些实施例中，所述线粒体富集的基因工程T细胞的线粒体含量可检测地高于所述T细胞的线粒体含量。在一个方面，允许外源线粒体进入所述T细胞的所述条件包括以约0.088mU至176mU柠檬酸合酶(CS)活性/10⁶个T细胞的比率将所述T细胞与所述外源线粒体温育。

在另外的方面，所述线粒体富集的基因工程T细胞通过包括以下步骤的方法产生：从患有疾病或病症的受试者或供体获得T细胞；通过将编码嵌合T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的核酸引入所述T细胞来产生基因工程T细胞；从供体获得外源线粒体；以及通过在允许所述外源线粒体进入所述基因工程T细胞的条件下使所述基因工程T细胞与所述外源线粒体接触来产生线粒体富集的基因工程T细胞；其中所述线粒体富集的基因工程T细胞的所述线粒体含量可检测地高于所述基因工程T细胞的线粒体含量。在一个方面，允许外源线粒体进入所述基因工程T细胞的所述条件包括以约0.088mU至176mU柠檬酸合酶(CS)活性/10⁶个T细胞的比率将基因工程T细胞与所述外源线粒体温育。

在一个方面，所述受试者是人类受试者。在另一方面，所述疾病或病症是癌症。在具体方面，所述癌症是血液癌症。在某些方面，施用是通过静脉内、腹膜内、动脉内、鞘内和肌内施用。在一个方面，所述施用是通过静脉内施用。

在另外的方面，治疗方法还包括向所述受试者施用化学治疗剂、放射疗法或其它抗癌疗法。在另一方面，所述药物组合物与所述化学治疗剂、放射疗法或其它抗癌疗法的施用同时、并行或在其之后施用。在某些方面，所述外源线粒体来源于人细胞。在一些实施例中，所述人细胞来自人胎盘、人血细胞、干细胞或体细胞。在一些实施例中，所述人细胞是在培养物中生长的细胞。在某些方面，所述干细胞是诱导的多能干细胞、胚胎干细胞或多能细胞。在某些方面，所述外源线粒体是同种异体的或自体的。在一个方面，在通过所述外源线粒体富集后，所述线粒体富集的T细胞或线粒体富集的基因工程T细胞中的总线粒体含量的至少1％包含外源线粒体。在各个方面，允许所述外源线粒体进入所述T细胞或基因工程T细胞的所述条件包含将所述T细胞或基因工程T细胞与所述外源线粒体在约16℃至37℃范围内的温度下温育约0.5小时至30小时范围内的时间。

附图说明

图1A-C示出了线粒体富集的CAR-T细胞。图1A：示出了细胞活化后5天富集有线粒体的CAR-T细胞的ATP水平和柠檬酸合酶活性。图1B示出了细胞活化后10天富集有线粒体的CAR-T细胞的ATP水平和柠檬酸合酶活性。图1C示出了在细胞活化的第5天和第10天在富集有4.4mU线粒体的CAR-T细胞中测量的外源mtDNA的百分比。

图2示出了活化的T细胞和未活化的T细胞的增殖和活化后的％CAR-T。A1：在7000g下富集有4.4mU胎盘线粒体的CAR-T细胞；A2：在400g下富集有4.4mU胎盘线粒体的CAR-T细胞；UnT：非转导的非富集细胞；Tr：未经历线粒体富集条件的转导细胞；Ctrl：在未将外源线粒体引入富集过程的情况下经受线粒体富集条件的转导细胞。

具体实施方式

本发明基于以下基本发现：富集有线粒体的细胞可用于治疗疾病和病症。本发明提供了线粒体富集的基因工程T细胞的药物组合物。本发明还提供了使用线粒体富集的基因工程T细胞的治疗方法。

在描述本发明的组合物和方法之前，应理解本发明不限于所描述的特定组合物、方法和实验条件，因为此类组合物、方法和条件可能有所不同。还应当理解，本文所用的术语仅出于描述特定实施例的目的，并且不旨在是限制性的，因为本发明的范围将仅在所附权利要求中限定。

如在本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一(a/an)”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另外清楚地指明。因此，例如，对“所述方法”的引用包括本文所述类型的一种或多种方法和/或步骤，其对于本领域技术人员在阅读本公开等时将变得显而易见。

本说明书中所提及的所有公开、专利和专利申请都在本文中通过引用并入，程度如同每一单独的公开、专利或专利申请被专门并且单独地指示以引用的方式并入一般。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可使用与本文所述的那些类似或等效的任何方法和材料，但应理解，修改和变化涵盖在本公开的精神和范围内。现在描述优选的方法和材料。

本发明提供了用于癌症免疫治疗的药物组合物及其用途，所述药物组合物包含人类成熟淋巴细胞，包括非基因修饰的淋巴细胞和基因修饰的淋巴细胞(例如CAR T细胞)，所述淋巴细胞已经用外源线粒体离体富集。

本文所用的术语“淋巴细胞”是指在防御机体抵抗疾病中起主要作用的白细胞，包括T细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、B细胞及其混合物。本领域技术人员将理解，上面列出的免疫细胞类型可以分成更多的亚群。在一些实施例中，淋巴细胞是成熟淋巴细胞。在一些实施例中，淋巴细胞是非基因修饰的淋巴细胞。在其它实施例中，淋巴细胞是基因修饰的淋巴细胞。

本文所用的术语“成熟淋巴细胞”是指经历了导致中心淋巴组织中的选择和成熟的发育的完全分化或终末分化的淋巴细胞。成熟后，淋巴细胞进入循环和外周淋巴器官(例如脾和淋巴结)。根据一些实施例，术语“成熟淋巴细胞”不包括淋巴祖细胞或淋巴细胞前体细胞。根据其它实施例，术语“成熟淋巴细胞”也包括淋巴细胞前体细胞。如本文所用的术语“淋巴细胞前体细胞”是指部分分化的单能细胞，其通常在分化为淋巴细胞之前构成中间细胞。本文所用的术语“单能”是指具有分化成仅一种细胞类型的能力的细胞。与前体细胞相反，祖细胞是多能的，具有分化成离散细胞类型的潜力。

细胞的成熟度可以基于如标记表达、功能、整合和非分裂的测定来评估。例如，就T细胞而言，成熟T细胞的特征在于表达CD4或CD8，但不同时表达(即，它们是单阳性的)，以及表达CD3。此类标记的表达可以通过本领域已知的方法确定，例如通过FACS分析或免疫组织学染色技术。

T细胞受体(TCR)是在T细胞或T淋巴细胞表面发现的蛋白质复合物，其负责将抗原片段识别为与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的肽。TCR和抗原肽之间的结合具有相对低的亲和力并且是退化的。TCR由两条不同的蛋白链组成。在人类中，在95％的T细胞中，TCR由α链和β链(分别由TRA和TRB编码)组成，而在5％的T细胞中，TCR由γ和δ链(分别由TRG和TRD编码)组成。该比率在个体发育期间和疾病状态(例如白血病)下发生变化。使γδT细胞活化的抗原分子仍然大多是未知的。然而，γδT细胞不受MHC限制，并且似乎能够识别完整蛋白质而不是需要肽由APC上的MHC分子呈递。使用Vγ9和Vδ2基因片段的人γδT细胞构成外周血中主要的γδT细胞群体。

本发明部分地基于以下发现：T-淋巴细胞可接受富集有外源线粒体，并且用外源线粒体富集淋巴细胞可增加线粒体含量、细胞存活、脂肪酸氧化(FAO)和ATP产生。不受任何理论或机制的束缚，假定淋巴细胞与外源线粒体的共温育会促进完整的线粒体向淋巴细胞的转化。进一步假设通过线粒体富集改善淋巴细胞的线粒体功能可以改善淋巴细胞移植后的体内功能，从而增强基于细胞的免疫治疗。

本文所用的术语“基于细胞的免疫疗法”涉及一种疗法，包含向受试者施用基因修饰或非基因修饰的免疫细胞，例如T细胞。该治疗方法可用于治疗多种癌症疾病，以及感染性疾病和自身免疫病症。

本发明提供了一种药物组合物，其包括基因工程T细胞和药学上可接受的载体，其中所述线粒体富集的基因工程T细胞富集有外源线粒体。本发明还提供了一种治疗有需要的受试者的方法，其包括向所述受试者施用线粒体富集的基因工程T细胞，其中所述线粒体富集的基因工程T细胞富集有外源线粒体。

如本文所用的，“药物组合物”是指包含活性成分和任选的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的制剂。术语“活性成分”可互换地指“有效成分”，并且是指在施用后能够诱导所需效果的任何药剂。活性成分的实例包括但不限于化合物、药物、治疗剂、小分子等。

“药学上可接受的”是指载体、稀释剂或赋形剂必须与制剂的其它成分相容并且对其接受者或对制剂的活性成分的活性无害。药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂是本领域熟知的，例如《雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》，第16版，Osol,A.编辑(1980)。药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且可以包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和包括葡萄糖、甘露糖或糊精的其它碳水化合物；螯合剂，如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；金属复合物(例如，锌-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。载体的实例包括但不限于脂质体、纳米颗粒、软膏、胶束、微球、微粒、乳膏、乳液和凝胶。赋形剂的实例包括但不限于抗粘附剂如硬脂酸镁，粘合剂如糖类及其衍生物(蔗糖、乳糖、淀粉、纤维素、糖醇等)，蛋白质如明胶和合成聚合物，润滑剂如滑石和二氧化硅，和防腐剂如抗氧化剂、维生素A、维生素E、维生素C、棕榈酸视黄酯、硒、半胱氨酸、甲硫氨酸、柠檬酸、硫酸钠和对羟基苯甲酸酯。稀释剂的实例包括但不限于水、醇、盐水溶液、二醇、矿物油和二甲亚砜(DMSO)。

术语“治疗”在本文中可与术语“治疗方法”互换使用，并且是指1)治愈、减缓、减轻所诊断的病理学病状或病症的症状和/或停止所诊断的病理学病状或病症的进展的治疗性处理或措施，以及2)预防/预防措施。需要治疗的个体可包括已经患有特定医学病症的个体以及可最终获得所述病症的个体(即，需要预防措施的个体)。

术语“治疗有效量”、“有效剂量”、“治疗有效剂量”、“有效量”等是指将研究人员、兽医、医生或其他临床医生所寻求的将引起组织、系统、动物或人的生物学或医学反应的主题化合物的量。有效量可以如本文所述确定。

术语“施用(administration of/administering)”应理解为意指向需要治疗的受试者提供治疗有效量的药物组合物。施用途径可以是肠内的、局部的或肠胃外的。因此，施用途径包括但不限于静脉内、腹膜内、动脉内、鞘内和肌内施用。本文所用的短语“肠胃外施用(parenteral administration/administered parenterally)”是指除肠内和局部施用之外的施用方式。根据施用方法，药物组合物可以以各种单位剂型施用。合适的单位剂型包括但不限于胶囊剂、注射剂、可植入缓释制剂和脂质复合物。

在某些方面，所述线粒体富集的基因工程T细胞通过以下方法产生：从患有疾病或病症的受试者或供体获得T细胞；获得外源线粒体；通过在允许所述外源线粒体进入所述T细胞的条件下使所述T细胞与所述外源线粒体接触来产生线粒体富集的T细胞；以及通过将编码嵌合T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的核酸引入所述线粒体富集的T细胞来产生线粒体富集的基因工程T细胞，其中所述线粒体富集的基因工程T细胞的线粒体含量可检测地高于所述T细胞的线粒体含量。在某些方面，允许外源线粒体进入T细胞的条件包括以约0.088mU至176mU柠檬酸合酶(CS)活性/10⁶个T细胞的比率使T细胞与外源线粒体接触。

在另一个实施例中，线粒体富集的基因工程T细胞是通过以下方法产生的：从患有疾病或病症的受试者或供体获得造血干细胞；从供体获得外源线粒体；在允许外源线粒体进入造血干细胞的条件下产生线粒体富集的造血干细胞；将所述线粒体富集的造血干细胞分化为线粒体富集的T细胞；以及通过将编码嵌合T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的核酸引入线粒体富集的T细胞中来产生线粒体富集的基因工程T细胞，其中线粒体富集的基因工程T细胞的外源线粒体含量可检测地高于造血干细胞的线粒体含量。在某些实施例中，允许外源线粒体进入造血干细胞的条件是通过以约0.088mU至176mU柠檬酸合酶(CS)活性/10⁶个造血干细胞的比率使造血干细胞与外源线粒体接触。

在另一个实施例中，线粒体富集的基因工程T细胞通过以下方法产生：从患有疾病或病症的受试者或供体获得T细胞；通过将编码嵌合T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的核酸引入T细胞，获得外源线粒体，从而产生基因工程化的T细胞；在允许外源线粒体进入基因工程T细胞的条件下产生线粒体富集的基因工程T细胞；其中所述线粒体富集的基因工程T细胞的线粒体含量可检测地高于所述T细胞的线粒体含量。在某些方面，允许外源线粒体进入T细胞的条件包括以约0.088mU至176mU柠檬酸合酶(CS)活性/10⁶个T细胞的比率使T细胞与外源线粒体接触。

根据一些实施例，术语“线粒体含量”是指功能性线粒体含量和非功能性线粒体含量。根据一些实施例，术语“线粒体含量”是指功能性线粒体含量。

术语“T细胞”和“T淋巴细胞”在本文中可互换使用。T细胞是特定类型的淋巴细胞，其通过提供多种免疫相关功能而在控制和形成免疫应答中具有重要作用。T细胞可通过T细胞受体(TCR)在细胞表面上的存在而与其它淋巴细胞区分开来。本文所用的术语“T细胞”包括细胞毒性T细胞、T辅助细胞、调节性T细胞和天然杀伤T细胞(NKT)。根据一些实施例，所述T细胞是T细胞前体。根据其它实施例，所述T细胞是成熟T细胞。根据一些实施例，所述T细胞是完全分化的T细胞。在本发明的方法中，从患有疾病或病症的受试者或供体获得的T细胞在用外源线粒体富集之前未被主动改变或修饰(例如，mtDNA或线粒体功能的降低)。更具体地，T细胞中的线粒体功能和/或线粒体DNA在与外源线粒体接触之前未被主动改变或修饰。

根据一些实施例，所述T细胞是基因工程T细胞。根据另外的实施例，所述基因工程T细胞选自T细胞受体(TCR)转导的T细胞和嵌合抗原受体(CAR)转导的T细胞。每种可能性代表本发明的单独实施例。根据具体的实施例，所述基因工程T细胞是CAR-T细胞。

在一些实施例中，基因工程T细胞对受试者是自体的。在一些实施例中，基因工程T细胞对受试者是同种异体的。在具体的实施例中，同种异体T细胞从至少部分与受试者HLA匹配的供体获得。在某些实施例中，当基因工程T细胞对于受试者是同种异体的时，上述方法进一步包含向受试者施用预防、延迟、最小化或消除受试者与线粒体富集的人干细胞之间的不良免疫原性反应的试剂的步骤。每种可能性代表本发明的单独实施例。在某些实施例中，不良免疫原性反应是移植物抗宿主病(GvHD)。

本文所用的术语“T细胞对受试者是自体的”是指受试者自身的细胞。本文所用的术语“T细胞对受试者是同种异体的”是指来自不同供体个体的细胞。

术语“CAR转导的T细胞”和术语“CAR-T细胞”在本文中可互换使用，并且是指已经被基因修饰以表达靶向特定抗原的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。根据具体的实施例，抗原存在于癌细胞的表面上。根据一些实施例，所述癌细胞是血液癌症细胞。根据一些实施例，CAR-T细胞表达靶向选自但不限于CD19、CD30、CD33、CD123、FLT3和BCMA的抗原的CAR。

如本领域技术人员已知的，CAR-T细胞分离自受试者并使用慢病毒或逆转录病毒载体或非病毒基因转移系统进行离体遗传操作，以表达对特定肿瘤靶标特异性的工程化CAR。然后扩增这些重编程的CAR-T细胞，必要时进行选择，并在它们接受免疫抑制制备方案后输注到受试者中。根据本发明的原理，分离的T细胞的离体遗传操作可以在线粒体富集过程之前或之后进行。

移植后，CAR-T细胞经历抗原结合并在外周血中扩增，它们从外周血到达肿瘤部位并识别和杀死表达对应抗原的肿瘤细胞。这可以触发CAR-T细胞的广泛扩增和肿瘤抗原的释放，其激活受试者的免疫系统以募集非CAR-T免疫细胞，因此在被称为来自表位扩展的交叉激活的过程中引起进一步的抗肿瘤应答。

当移植后CAR-T细胞的数目下降到不可检测的水平时，经常观察到疾病复发。现在提出，用外源线粒体富集CAR-T细胞可以提高CAR-T细胞的存活和体内活性，从而延长和放大细胞的治疗效果。

术语“TCR转导的T细胞”和术语“TCR-T细胞”在本文中可互换使用，并且是指已经被基因修饰以表达T细胞受体(TCR)的T细胞。与识别表面表达的蛋白质的CAR-T细胞不同，T细胞受体(TCR)可以识别细胞内部的肿瘤特异性蛋白质。当肿瘤特异性蛋白质断裂成片段时，它们与另一种被称为主要组织相容性复合物或MHC的蛋白质一起出现在细胞表面。TCR被改造以识别肿瘤特异性蛋白质片段/MHC组合。

根据一些实施例，基因工程T细胞来源于哺乳动物受试者，优选人类受试者。

根据一些实施例，本发明的T细胞是与对应的T细胞相比具有较低线粒体膜电位的T细胞。

如本文所用的，术语“线粒体富集的基因工程T细胞”是指已经被基因改造(即编码TCR或CAR的核酸被引入细胞)并插入了外源线粒体的T细胞。

本文所用的术语“线粒体富集的T细胞”是指插入了外源线粒体的T细胞。

本文所用的术语“基因工程T细胞”是已经基因改造的T细胞(即，将编码TCR或CAR的核酸引入细胞)。

本文所用的术语“线粒体富集的造血干细胞”是插入了外源线粒体的造血干细胞。

如本文所用的，术语“干细胞”通常是指任何哺乳动物干细胞。干细胞是未分化的细胞，其可以分化成其它类型的细胞并且可以分裂以产生更多相同类型的干细胞。干细胞可以是全能的或多能的。

如本文所用的，术语“人干细胞”通常是指在人类中天然发现的所有干细胞，以及离体产生或衍生的并且与人类相容的所有干细胞。象干细胞一样，“祖细胞”具有分化成特定类型细胞的倾向，但是已经比干细胞更有针对性，并且被推动分化成其“靶”细胞。干细胞与祖细胞之间最重要的区别是干细胞可以无限地复制，而祖细胞只能分裂有限的次数。如本文所用的术语“人干细胞”进一步包括“祖细胞”和“非完全分化的干细胞”。

在某些实施例中，干细胞是多能干细胞(PSC)。在其它实施例中，PSC是非胚胎干细胞。根据一些实施例，胚胎干细胞明确地排除在本发明的范围之外。在一些实施例中，干细胞是诱导PSC(iPSC)。在某些实施例中，干细胞是胚胎干细胞。在某些实施例中，干细胞来源于骨髓细胞。在特定的实施例中，干细胞是CD34+细胞。在特定的实施例中，干细胞是间充质干细胞。在其它实施例中，干细胞来源于脂肪组织。在其它实施例中，干细胞来源于血液。在进一步的实施例中，干细胞来源于脐带血。在进一步的实施例中，干细胞来源于口腔粘膜。在具体的实施例中，从患有疾病或病症的受试者或从健康受试者获得的干细胞是骨髓细胞或骨髓源性干细胞。

如本文所用的，术语“多能干细胞(PSC)”是指可无限繁殖以及在体内产生多种细胞类型的细胞。全能干细胞是能够在体内产生所有其它细胞类型的细胞。胚胎干细胞(ESC)是全能干细胞，而诱导多能干细胞(iPSC)是多能干细胞。

如本文所用的，术语“诱导多能干细胞(iPSC)”是指可由成人体细胞产生的多能干细胞类型。本文中可以生成iPSC的体细胞的一些非限制性实例包括成纤维细胞、内皮细胞、毛细血管血细胞、角质细胞、骨髓细胞上皮细胞。

本文所用的术语“胚胎干细胞(ESC)”是指来源于胚泡内细胞团的全能干细胞类型。

本文所用的术语“骨髓细胞”通常是指天然存在于人骨髓中的所有人细胞，以及天然存在于人骨髓中的所有细胞群体。术语“骨髓干细胞”和“骨髓源性干细胞”是指来源于骨髓的干细胞群体。

在一些实施例中，自体或同种异体人干细胞是多能干细胞(PSC)或诱导多能干细胞(iPSC)。在进一步的实施例中，自体或同种异体人干细胞是间充质干细胞。

根据几个实施例，人干细胞来源于脂肪组织、口腔粘膜、血液、脐带血或骨髓。每种可能性代表本发明的单独实施例。在具体的实施例中，人干细胞来源于骨髓。

在某些实施例中，骨髓源性干细胞包括骨髓生成细胞。本文所用的术语“骨髓生成细胞”是指参与骨髓生成的细胞，例如参与骨髓的产生的细胞和由骨髓产生的所有细胞，即所有血细胞。

在某些实施例中，骨髓源性干细胞包括红细胞生成细胞。本文所用的术语“红细胞生成细胞”是指参与红细胞生成的细胞，例如红细胞(红血球)的产生。

在某些实施例中，骨髓源性干细胞包括多潜能造血干细胞(HSC)。本文所用的术语“多潜能造血干细胞”或“成血细胞”是指通过造血过程产生所有其它血细胞的干细胞。

在某些实施例中，骨髓源性干细胞包含普通骨髓祖细胞、普通淋巴祖细胞或其任何组合。在某些实施例中，骨髓源性干细胞包含间充质干细胞。本文所用的术语“共同骨髓祖细胞”是指生成骨髓细胞的细胞。本文所用的术语“共同淋巴祖细胞”是指生成淋巴细胞的细胞。

在某些实施例中，骨髓源性干细胞进一步包含巨核细胞、红细胞、肥大细胞、成肌细胞，嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、天然杀伤(NK)细胞、小淋巴细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、浆细胞、网状细胞或其任何组合。每种可能性代表本发明的单独实施例。

在某些实施例中，骨髓源性干细胞包括间充质干细胞。本文所用的术语“间充质干细胞”指能分化成多种细胞类型的多能基质细胞，包括成骨细胞、软骨细胞、肌细胞和脂肪细胞。

在某些实施例中，骨髓源性干细胞包括骨髓生成细胞。在某些实施例中，骨髓源性干细胞由红细胞生成细胞组成。在某些实施例中，骨髓源性干细胞包括多潜能造血干细胞(HSC)。在某些实施例中，骨髓源性干细胞包括普通骨髓祖细胞、普通淋巴祖细胞或其任何组合。在某些实施例中，骨髓源性干细胞包括巨核细胞、红细胞、肥大细胞、成肌细胞，嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、天然杀伤(NK)细胞、小淋巴细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、浆细胞、网状细胞或其任何组合。在某些实施例中，骨髓源性干细胞由间充质干细胞组成。在某些实施例中，干细胞包括从外周血获得的多种人骨髓干细胞。

造血干细胞(HSC)是产生其它血细胞的干细胞。该过程称为血细胞生成。造血干细胞在被称为骨髓和淋巴的细胞系中产生不同类型的血细胞。骨髓和淋巴谱系均参与树突细胞形成。骨髓细胞包括单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞和巨核细胞至血小板。淋巴样细胞包括T细胞、B细胞和天然杀伤细胞。

造血祖细胞抗原CD34，也称为CD34抗原，是人类中由CD34基因编码的蛋白质。CD34是细胞表面糖蛋白中的分化簇，并且起细胞间粘附因子的作用。在某些实施例中，骨髓干细胞表达骨髓祖细胞抗原CD34(即CD34+)。在某些实施例中，骨髓干细胞不表达CD34。在某些实施例中，骨髓干细胞在其外膜上呈现骨髓祖细胞抗原CD34。在某些实施例中，CD34+细胞来自脐带血。如本文所用的，术语“CD34+细胞”是指表征为CD34阳性的造血干细胞，无论其来源如何。在某些实施例中，CD34+细胞获自骨髓、获自被动员至血液的骨髓细胞或获自脐带血。

在某些实施例中，包括造血干细胞的干细胞从患有疾病或病症的受试者的外周血获得。在某些实施例中，干细胞从健康人的外周血获得。本文所用的术语“外周血”是指在血液系统中循环的血液。

如本文所用的，术语“自体细胞”或“细胞是自体的”是指受试者自身的细胞。术语“自体线粒体”是指从受试者自身细胞或从母系相关细胞获得的线粒体。术语“同种异体细胞”或“同种异体线粒体”是指来自不同供体个体的细胞或线粒体。

本文和权利要求中使用的术语“同系的”是指足以允许在个体中移植而不排斥的遗传同一性或遗传近同一性。在线粒体的上下文中，术语“同系的”可以与术语“自体线粒体”互换使用，“自体线粒体”是指相同的母体血统。同种异体线粒体富集的细胞是指外源线粒体和内源线粒体基本上是遗传上不同的，而同系线粒体富集的细胞是指外源线粒体和内源线粒体是遗传上相同或近似相同的，因为外源线粒体来源于母系遗传相关细胞。

术语“疾病”和“病症”是指任何被认为是不正常的或不同于生理状态的痛苦。疾病和病症实际上可影响身体的任何器官、组织或功能。疾病和病症的非限制性实例包括癌症、肌肉疾病和病症、糖原贮积疾病和病症、血管内皮病症或疾病、脑部病症或脑部疾病、胎盘病症或胎盘疾病、胸腺病症或胸腺疾病、自身免疫疾病、肾脏疾病或病症、胰腺病症或胰腺疾病、前列腺病症或前列腺疾病、肾脏病症或肾脏疾病、血液病症或血液疾病、心脏疾病或心脏病症、皮肤病症或皮肤疾病、免疫和炎性疾病和病症、骨疾病或骨病症、胃肠疾病或胃肠病症以及眼部疾病或眼部病症。

如本文所用的，术语“患有疾病或病症的受试者”或“有疾病或病症的受试者”是指经历由某些病症引起的衰弱影响的人类受试者。所述病症可指癌症、年龄相关性病症、肾病、胰腺疾病、肝病、肌肉病症、脑部疾病、原发性线粒体疾病或继发性线粒体疾病以及其它疾病或病症。

本文所用的术语“供体”是指提供外源细胞或线粒体的供体。在一些实施例中，供体未患有疾病或病症或未患有受试者所患的相同疾病或病症。在某些实施例中，供体是受试者并且细胞和/或线粒体是自体的。

关于线粒体的术语“外源”或“分离的外源”是指来自接受者细胞外部来源的线粒体。例如，在一些实施例中，外源线粒体来源于或分离自不同于接受者细胞供体的供体细胞。在一些实施例中，外源线粒体来源于或分离自与接受者细胞相同的受试者的供体细胞。例如，可以从供体细胞纯化、分离或获得外源线粒体，然后将其引入来自与供体细胞相同的受试者或不同的供体的接受者细胞中，从而使外源线粒体分别为自体的和同种异体的。在某些实施例中，外源线粒体是完整线粒体。

如本文所用的，在线粒体的上下文中的术语“分离的”和“部分纯化的”包括从其它细胞组分纯化或至少部分纯化的外源线粒体。外源分离或部分纯化的线粒体中线粒体蛋白的总量为样品内细胞蛋白总量的10％至90％。

在某些实施例中，外源线粒体构成线粒体富集的细胞中总线粒体含量的至少1％。在某些实施例中，外源线粒体构成线粒体富集的细胞中总线粒体含量的至少3％。在某些实施例中，外源线粒体构成线粒体富集的T细胞中总线粒体含量的至少10％。在一些实施例中，外源线粒体构成线粒体富集的T细胞中总线粒体含量的至少约1％、3％、5％、10％、15％、20％、25％或30％。在某些实施例中，外源线粒体中线粒体蛋白的总量为细胞蛋白总量的10％至80％、20至80％、40至70％、20至40％或20至30％。每种可能性代表本发明的单独实施例。在某些实施例中，外源线粒体中线粒体蛋白的总量为样品中细胞蛋白总量的10％至80％。在某些实施例中，外源线粒体中线粒体蛋白的总量为线粒体和其它亚细胞部分的组合重量的10％至80％。在其它实施例中，外源线粒体中线粒体蛋白的总量高于线粒体和其它亚细胞部分的组合重量的80％。

在某些实施例中，外源线粒体获自人细胞或人组织。在某些实施例中，细胞选自由胎盘、在培养物中生长的胎盘细胞或血细胞组成的组。在一些实施例中，线粒体从人干细胞获得。在一些实施例中，人细胞是人体细胞。在一些实施例中，人细胞是在培养物中生长的细胞。

在某些实施例中，本发明提供的方法和药物组合物进一步包含向线粒体供体施用促进线粒体生物发生的试剂的步骤。本文所用的术语“线粒体生物发生”是指线粒体的生长和分裂。在某些实施例中，促进线粒体生物发生的试剂是促红细胞生成素(EPO)或其盐。在某些实施例中，所述试剂选自由重组人促红细胞生成素和分离的人促红细胞生成素组成的组。

关于线粒体的术语“内源”是指由细胞形成/表达/产生的并且不从外源引入细胞的线粒体。在一些实施例中，内源线粒体含有由细胞基因组编码的蛋白质和/或其它分子。在一些实施例中，术语“内源线粒体”等同于术语“宿主线粒体”。

根据本发明的原理，将外源人线粒体引入细胞，从而用外源线粒体富集这些细胞。应当理解，这种富集改变了细胞的线粒体含量：尽管原初人细胞基本上具有一个宿主/自体线粒体群体，但富集有不是自体线粒体的外源线粒体的细胞基本上具有两个线粒体群体，第一宿主/自体/内源线粒体群体和另一引入的线粒体群体(即，外源线粒体)。因此，术语“富集的”涉及接受/掺入外源线粒体后的细胞状态。在某些实施例中，外源线粒体是自体线粒体。当外源线粒体是自体线粒体时，只有一个线粒体群体并且富集是指总线粒体含量。确定两个线粒体群体的数目和/或比率是直接的，因为这两个群体可以在几个方面有所不同，例如在它们的线粒体DNA方面。例如，包含总线粒体含量的至少1％外源线粒体的人细胞被认为是包含比例为99:1的宿主/自体/内源线粒体和外源线粒体。例如，“总线粒体的3％”是指在富集后，原始(内源)线粒体含量是总线粒体含量的97％，而引入的(外源)线粒体是总线粒体含量的3％，这相当于(3/97＝)3.1％富集。另一个实例，即“总线粒体的33％”是指在富集后，原始(内源)线粒体含量是总线粒体含量的67％，而引入的(外源)线粒体是总线粒体含量的33％，这相当于(33/67＝)49.2％富集。

在一些实施例中，在已经将外源线粒体引入细胞之后，可以通过各种手段进行内源线粒体与外源线粒体的鉴定/区分，所述手段包括例如但不限于：鉴定内源线粒体与外源线粒体之间mtDNA序列的差异，例如不同的单倍型，鉴定源自外源线粒体来源组织的特定线粒体蛋白，例如来自胎盘的细胞色素p450胆固醇侧链裂解(P450SCC)、来自褐色脂肪组织的UCP1等，或其任何组合。

异质性是细胞或个体中存在多于一种类型的线粒体DNA。异质性水平是突变型mtDNA分子与野生型/功能性mtDNA分子的比例，并且是考虑线粒体疾病严重程度的重要因素。虽然较低水平的异质性(足够量的线粒体是功能性的)与健康表型相关，但较高水平的异质性(不足量的线粒体是功能性的)与病理相关。在某些实施例中，富集的细胞，如线粒体富集的基因工程T细胞的异质性水平比从受试者或供体获得或衍生的细胞的异质性水平低至少1％、3％、5％、15％、20％、25％或30％。

本文所用的术语“接触”是指将线粒体和细胞(例如，T细胞和基因工程T细胞)充分接近以促进外源线粒体进入细胞。术语将线粒体引入或插入细胞(例如T细胞和基因工程T细胞)可与术语接触互换使用。

本文所用的短语“允许外源线粒体进入T细胞的条件”和“允许外源线粒体进入基因工程T细胞的条件”通常是指如时间、温度、离心、培养基和线粒体与接受者细胞之间的接近度的参数。例如，将人细胞和人细胞系常规地在液体培养基中温育，并在37℃和5％CO₂气氛下保持在无菌环境中，如在组织培养箱中。根据本文公开和例举的替代实施例，细胞可在室温下在补充人血清白蛋白的盐水中温育。

在某些实施例中，将细胞与外源线粒体在约16℃至37℃范围内的温度下温育0.5小时至30小时范围内的时间。在某些实施例中，将细胞与外源线粒体温育约1小时至30小时或约5至25小时范围内的时间。在具体的实施例中，温育持续约20小时至30小时。在一些实施例中，温育持续至少约1小时、5小时、10小时、15小时、20小时、21小时、22小时、23小时或24小时。在其它实施例中，温育长达5小时、10小时、15小时、20小时或30小时。在具体的实施例中，温育持续24小时。在某些实施例中，温育直到细胞中的线粒体含量与其初始线粒体含量相比平均增加1％至45％。

在一些实施例中，温育是在室温下(16℃至30℃)。在其它实施例中，温育是在37℃。在一些实施例中，在5％CO₂气氛中温育。在其它实施例中，温育不包括添加超过空气中发现的水平的CO₂。

在其它实施例中，在补充了人血清白蛋白(HSA)的培养基中进行培养。在另外的实施例中，温育在补充有HSA的盐水中进行。根据某些示范性实施例，允许外源线粒体进入人干细胞从而用所述人外源线粒体富集所述人干细胞的条件包括在室温下在补充了4.5％人血清白蛋白的盐水中温育。

在某些实施例中，在37℃下进行温育。在某些实施例中，温育进行至少6小时。在某些实施例中，温育进行至少12小时。在某些实施例中，温育进行12小时至24小时。

如本文所用的，术语“富集”是指设计用于增加哺乳动物细胞的线粒体含量，例如完整线粒体的数目或线粒体的功能的任何行动。特别地，与富集前的相同T细胞相比，富集有外源线粒体的基因工程T细胞将显示增强的功能。

如本文所用的术语“富集(enriching/enrichment)”是指离体进行的任何行动，其增加人细胞的线粒体含量，例如完整的、功能性的或健康的线粒体的数目。根据本发明的原理，将外源线粒体引入人T细胞，从而用外源线粒体富集这些细胞。根据一些实施例，外源线粒体构成线粒体富集的T细胞和线粒体富集的基因工程T细胞中总线粒体的1％以上、2％以上、3％以上、4％以上、5％以上、10％以上、15％以上或20％以上。

柠檬酸合酶(CS)定位于线粒体基质中，但由核DNA编码。柠檬酸合酶参与克雷布斯循环的第一步，并且通常用作完整线粒体存在的定量酶标记(Larsen S.等人，《生理学杂志(J.Physiol.)》，2012，Vol.590(14)，第3349－3360页；Cook G.A.等人，《生物化学与生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta.)》，1983，Vol.763(4)，第356－367页)。

线粒体剂量可以用CS活性单位或线粒体量的其它可定量测量的mtDNA拷贝数表示，如本文所述。“CS活性单位”定义为在1mL反应体积中1分钟内能够转化一微摩尔底物的量。

在一些实施例中，用外源线粒体富集细胞(例如，T细胞和基因工程T细胞)包括向细胞中引入线粒体剂量为至少0.044毫单位(mU)至176mU的柠檬酸合酶(CS)活性/百万个细胞；至少0.088mU至高达176mU的CS活性/百万个细胞；至少0.2mU至150mU的CS活性/百万个细胞；至少0.4mU至100mU的CS活性/百万个细胞；至少0.6mU至80mU的CS活性/百万个细胞；至少0.7mU至50mU的CS活性/百万个细胞；至少0.8mU至20mU的CS活性/百万个细胞；至少0.88mU至17.6mU的CS活性/百万个细胞；或至少0.44mU至17.6mU的CS活性/百万个细胞。

如本文所用的术语“线粒体含量”是指细胞内线粒体的量，或指多个细胞内线粒体的平均量。如本文所用的术语“增加的线粒体含量”是指可检测地高于线粒体富集前细胞的线粒体含量的线粒体含量。

在某些实施例中，富集有外源线粒体的细胞的线粒体含量可检测地高于原初细胞的线粒体含量。根据各种实施例，线粒体富集的基因工程T细胞的线粒体含量比线粒体富集前细胞的线粒体含量高至少1％、至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少100％、至少200％或更多。在某些实施例中，T细胞或基因工程T细胞是新鲜使用的。在某些实施例中，将T细胞或基因工程T细胞冷冻和解冻。

在某些实施例中，细胞或线粒体富集的基因工程T细胞的线粒体含量通过确定柠檬酸合酶的含量来确定。在某些实施例中，原初细胞或富集细胞的线粒体含量通过确定柠檬酸合酶的活性水平来确定。在某些实施例中，原初细胞或富集细胞的线粒体含量与柠檬酸合酶的含量相关。在某些实施例中，原初细胞或富集细胞的线粒体含量与柠檬酸合酶的活性水平相关。CS活性可通过市售试剂盒测量，例如使用CS活性试剂盒CS0720(Sigma)。

线粒体DNA含量可以通过在线粒体富集之前和之后对线粒体基因进行定量PCR来测量，相对于核基因标准化。

在特定情况下，在线粒体富集之前，相同的细胞用作测量CS和ATP活性并确定富集水平的对照。

在某些实施例中，如本文所用的术语“可检测地高于”是指正常值与增加值之间统计学显著的增加。在某些实施例中，如本文所用的术语“可检测地高于”是指非病理学增加，即达到其中没有与显著更高值相关联的病理学症状变得明显的水平。在某些实施例中，如本文所用的术语“增加的”是指这样的值，该值是在健康受试者或多个健康受试者的对应细胞或对应线粒体中或在线粒体富集之前的细胞(例如，T细胞和基因工程T细胞)中发现的对应值的1.05倍、1.1倍、1.25倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍或更高。

如本文所用的术语“增加的线粒体DNA含量”是指可检测地高于线粒体富集前细胞中的线粒体DNA含量的线粒体DNA的含量。线粒体含量可以通过测量SDHA或COX1含量来确定。在说明书和权利要求书的上下文中，“正常线粒体DNA”是指不携带/具有已知与线粒体疾病相关联的突变或缺失的线粒体DNA。如本文所用的术语“正常氧(O₂)消耗速率”是指来自健康个体的细胞的平均O₂消耗。如本文所用的术语“柠檬酸合酶的正常活性水平”是指来自健康个体的细胞中柠檬酸合酶的平均活性水平。如本文所用的术语“三磷酸腺苷(ATP)产生的正常速率”是指来自健康个体的细胞中的平均ATP产生速率。

外源线粒体对细胞的富集程度可以通过功能和/或酶测定来确定，包括但不限于氧(O₂)消耗速率、柠檬酸合酶的含量或活性水平、三磷酸腺苷(ATP)产生速率。在替代方案中，外源线粒体对细胞的富集可以通过检测供体的线粒体DNA来确认。根据一些实施例，外源线粒体对细胞的富集程度可以通过异质性的变化水平和/或通过每个细胞mtDNA的拷贝数来确定。

TMRM(四甲基罗丹明甲酯)或相关的TMRE(四甲基罗丹明乙酯)是细胞渗透性荧光染料，通常用于通过鉴定线粒体膜电位的变化来评估活细胞中的线粒体功能。根据一些实施例，富集水平可以通过用TMRE或TMRM染色来确定。

根据一些实施例，线粒体包含完整的线粒体、破裂的线粒体和/或选自由线粒体蛋白、线粒体核酸、线粒体脂质和线粒体糖组成的组的线粒体成分。

根据一些实施例，线粒体膜的完整性可以通过本领域已知的任何方法确定。在非限制性实例中，使用四甲基罗丹明甲酯(TMRM)或四甲基罗丹明乙酯(TMRE)荧光探针测量线粒体膜的完整性。每种可能性代表本发明的单独实施例。在显微镜下观察并显示TMRM或TMRE染色的线粒体具有完整的线粒体外膜。如本文所用的术语“线粒体膜”是指选自由线粒体内膜、线粒体外膜和二者组成的组的线粒体膜。

在某些实施例中，线粒体富集的基因工程T细胞中线粒体富集的水平通过对细胞中总线粒体DNA的至少统计学上代表性的部分测序并确定宿主/内源线粒体DNA和外源线粒体DNA的相对水平来确定。在某些实施例中，通过单核苷酸多态性(SNP)分析确定线粒体富集的基因工程T细胞中线粒体富集的水平。在某些实施例中，最大线粒体群体和/或最大线粒体DNA群体是宿主/内源线粒体群体和/或宿主/内源线粒体DNA群体；和/或第二大线粒体群体和/或第二大线粒体DNA群体是外源线粒体群体和/或外源线粒体DNA群体。

根据某些实施例，外源线粒体对细胞的富集可以通过本领域公认的常规测定来确定。在某些实施例中，线粒体富集的人基因工程T细胞中线粒体富集的水平通过以下各者来确定：(i)宿主/内源线粒体DNA和外源线粒体DNA的水平；(ii)选自由柠檬酸合酶(CS)、细胞色素C氧化酶(COX1)、琥珀酸脱氢酶复合物黄素蛋白亚基A(SDHA)及其任何组合组成的组的线粒体蛋白的水平；(iii)CS活性的水平；或(iv)(i)、(ii)和(iii)的任何组合。用于确定这些各种参数的方法在本领域中是公知的。

在某些实施例中，线粒体富集的基因工程T细胞中线粒体富集的水平通过以下各者中的至少一者确定：(i)宿主线粒体DNA和外源线粒体DNA的水平；(ii)柠檬酸合酶活性的水平；(iii)琥珀酸脱氢酶复合物黄素蛋白亚基A(SDHA)或细胞色素C氧化酶(COX1)的水平；(iv)氧(O₂)消耗速率；(v)三磷酸腺苷(ATP)产生速率或(vi)其任何组合。每种可能性代表本发明的单独实施例。测量这些各种参数的方法是本领域公知的。

在一些实施例中，外源人线粒体对细胞的富集包含在将细胞与外源人线粒体温育后洗涤线粒体富集的细胞(例如线粒体富集的基因工程T细胞)。该步骤提供了基本上不含细胞碎片或线粒体膜残余物和未进入干细胞的线粒体的线粒体富集的细胞。在一些实施例中，洗涤包含在将人细胞与所述外源人线粒体温育后对线粒体富集的细胞进行离心。根据一些实施例，所述方法产生与游离线粒体分离的线粒体富集的细胞，即未进入细胞的线粒体或其它细胞碎片，并且所述药物组合物含有与游离线粒体分离的线粒体富集的细胞。根据一些实施例，所述方法产生并且药物组合物含有线粒体富集的基因工程T细胞，所述T细胞不包含可检测量的游离线粒体。

在某些实施例中，上述方法进一步包括在温育和/或接触之前或期间将T细胞或基因工程T细胞与外源线粒体浓缩。在某些实施例中，上述方法进一步包括在温育或接触之前、期间或之后将T细胞或基因工程T细胞与外源线粒体离心。在一些实施例中，上述各种实施例中的方法包括在细胞与外源线粒体温育之前、期间或之后的单个离心步骤。

在某些实施例中，所述离心速度为7,000g或8,000g。根据另外的实施例，该离心是在300g至8000g；500g至6000g；1000g至5000g；2000g至4000g；2500g至8500g；3000g至8000g；4000g至8000g；5,000至10,000g；7000g至8000g或超过2500g之间的速度下。在一些实施例中，离心进行2分钟至30分钟；3分钟至25分钟；5分钟至20分钟；或8分钟至15分钟范围内的时间。

在一些实施例中，离心在2℃至6℃；4℃至37℃；4℃至10℃或16℃至30℃范围内的温度下进行。在具体的实施例中，离心在4℃下进行。在一些实施例中，以上在其各种实施例中描述的方法包括在细胞与外源线粒体温育之前、期间或之后的单次离心，随后将细胞静置在低于30℃的温度下。在一些实施例中，允许外源线粒体进入人细胞的条件包括在细胞与外源线粒体温育之前、期间或之后的单次离心，随后将细胞静置在16℃至28℃范围内的温度下。

在一些实施例中，这些方法生成和/或这些药物组合物包含线粒体富集的基因工程T细胞，其浓度为每千克受试者体重至少10⁵至10¹⁰；5×10⁵至1.5×10⁷；或5×10⁵至4×10⁷个线粒体富集的基因工程T细胞。在一些实施例中，所述方法生成和/或药物组合物包含线粒体富集的基因工程T细胞，其浓度为每千克受试者体重至少10⁶至10⁷个线粒体富集的基因工程T细胞。在其它实施例中，所述方法生成和/或所述药物组合物包含线粒体富集的基因工程T细胞，其浓度为每千克受试者体重至少10⁵或至少10⁶个线粒体富集的基因工程T细胞。在一些实施例中，所述方法生成和/或所述药物组合物包含线粒体富集的基因工程T细胞，其总浓度为至少5×10⁵至5×10⁹个线粒体富集的基因工程T细胞。在一些实施例中，所述方法生成和/或所述药物组合物包含线粒体富集的基因工程T细胞，其总浓度为至少10⁶至10⁹个线粒体富集的基因工程T细胞。在其它实施例中，所述方法生成和/或所述药物组合物包含总计至少2×10⁶至5×10⁸个线粒体富集的基因工程T细胞。

在某些实施例中，T细胞是新鲜的。在某些实施例中，将T细胞冷冻，并且然后在温育前解冻。在某些实施例中，外源线粒体是新鲜的。在某些实施例中，将外源线粒体冷冻，并且然后在温育之前解冻。在某些实施例中，线粒体富集的基因工程T细胞是新鲜的。在某些实施例中，将线粒体富集的基因工程T细胞冷冻，并且然后在施用前解冻。

在某些实施例中，然后将T细胞储存并在解冻后使用。在进一步的实施例中，外源线粒体在使用前被冷冻，然后储存和解冻。在进一步的实施例中，使用线粒体富集的基因工程T细胞而无需冷冻和储存。在又进一步的实施例中，在冷冻、储存和解冻后使用线粒体富集的基因工程T细胞。适于冷冻和解冻细胞制剂以保存活力的方法是本领域公知的。

如本文所用的，术语“冻融循环”是指将外源线粒体冷冻至低于0℃的温度，将线粒体在低于0℃的温度下保持限定的时间段，并将外源线粒体解冻至室温或体温或能够用外源线粒体处理细胞的高于0℃的任何温度。如本文所用的，术语“室温”通常是指介于18℃与25℃之间的温度。如本文所用的术语“体温”是指35.5℃与37.5℃之间，优选37℃的温度。

在另一个实施例中，已经经历冻融循环的线粒体在－20℃或更低；－4℃或更低；或－70℃或更低的温度下冷冻。根据另一个实施例，线粒体的冷冻是逐渐的。根据某些实施例，线粒体的冷冻是通过闪冻。如本文所用的，术语“闪冻”是指通过使线粒体经受低温而快速冷冻线粒体。

在另一个实施例中，经历冻融循环的线粒体在解冻前被冷冻至少30分钟。根据另一个实施例，冻融循环包含在解冻前将外源线粒体冷冻至少30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、180分钟、210分钟。每种可能性代表本发明的单独实施例。在另一个实施例中，经历冻融循环的线粒体在解冻前被冷冻至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、24小时、48小时、72小时、96小时或120小时。在另一个实施例中，经历冻融循环的线粒体在解冻前被冷冻至少4天、5天、6天、7天、30天、60天、120天、365天。根据另一个实施例，冻融循环包含在解冻前将外源线粒体冷冻至少1周、2周、3周。根据另一个实施例，冻融循环包含在解冻前将外源线粒体冷冻至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月。每种可能性代表本发明的单独实施例。根据另一个实施例，冻融循环后的外源线粒体的氧消耗等于或高于冻融循环前的外源线粒体的氧消耗。

根据某些实施例，解冻是在室温下进行。在另一个实施例中，解冻是在体温下进行。根据另一个实施例，解冻是在能够根据本发明的方法施用线粒体的温度下进行。根据另一个实施例，逐渐执行解冻。

在某些实施例中，上述方法进一步包括向患有疾病或病症的受试者或供体施用诱导骨髓细胞动员至外周血的试剂的在前步骤。

在某些实施例中，诱导骨髓中产生的骨髓细胞/干细胞动员至外周血的试剂选自由粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、l,l'-[l,4-亚苯基双(亚甲基)]双[l,4,8,l l-四氮环十四烷](普乐沙福，CAS号155148-31-5)、CXCR4抑制剂、其盐及其任何组合组成的组。每种可能性代表本发明的单独实施例。

在某些实施例中，上述方法进一步包括从患有疾病或病症的受试者和/或供体的外周血分离细胞。如本文所用的术语“从外周血中分离”是指从血液的其它成分中分离T细胞或造血干细胞。

在单采血液成分术中，受试者或供体的血液通过分离出一种特定成分的设备，并将剩余部分返回到循环中。因此，这是在体外进行的医疗程序。在某些实施例中，通过单采血液成分术进行分离。

在某些实施例中，细胞从患有疾病或病症的受试者或供体获得，并且所述细胞具有(i)正常的氧(O₂)消耗速率；(ii)柠檬酸合酶的正常含量或活性水平；(iii)正常的三磷酸腺苷(ATP)产生速率；或(iv)(i)、(ii)和(iii)的任何组合。

在某些实施例中，细胞(其可以是T细胞)从患有疾病或病症的受试者或供体获得，并且与未患有疾病或病症的受试者相比，所述T细胞具有(i)降低的氧(O₂)消耗速率；(ii)降低的柠檬酸合酶含量或活性水平；(iii)降低的三磷酸腺苷(ATP)产生速率；或(iv)(i)、(ii)和(iii)的任何组合。

在某些实施例中，与未经历线粒体富集的对应T细胞相比，线粒体富集的基因工程T细胞具有(i)增加的氧(O₂)消耗速率；(ii)增加的柠檬酸合酶含量或活性水平；(iii)增加的三磷酸腺苷(ATP)产生速率；(iv)增加的线粒体DNA含量，或(v)(i)、(ii)、(iii)和(iv)的任何组合。

如本文所用的术语“增加的氧(O₂)消耗速率”是指可检测地高于线粒体富集前氧(O₂)消耗速率的氧(O₂)消耗速率。

如本文所用的术语“至少一种线粒体蛋白的增加的含量”是指可检测地高于线粒体富集前细胞中所述线粒体蛋白的含量的核编码的或线粒体编码的线粒体蛋白例如CS、COX1和SDHA的含量。

如本文所用的术语“增加的柠檬酸合酶含量或活性水平”是指可检测地高于线粒体富集前细胞中柠檬酸合酶含量值或活性水平的柠檬酸合酶含量或活性水平。

如本文所用的术语“三磷酸腺苷(ATP)产生速率增加”是指可检测地高于线粒体富集前三磷酸腺苷(ATP)产生速率的三磷酸腺苷(ATP)产生速率。

根据又一方面，本发明提供了一种用于治疗选自由以下组成的组的疾病的方法：癌症、感染性疾病或自身免疫性疾病，所述方法包含向有需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含多种线粒体富集的基因工程T细胞。

根据一些实施例，所述疾病是癌症。术语“癌症”是指以异常和不受控制的细胞增殖为特征的一组疾病，所述细胞增殖在一个部位(原发部位)开始，具有侵入和扩散到其它部位(继发部位、转移)的潜力，这使癌症(恶性肿瘤)与良性肿瘤有所区别。几乎所有的器官都可能受到影响，从而导致100多种可能影响人类的癌症。癌症可以由许多原因引起，包括遗传易感性、病毒感染、暴露于电离辐射、暴露于环境污染物、烟草和/或酒精使用、肥胖、不良饮食、缺乏体育活动或任何组合。如本文所用，“瘤”或“肿瘤”(包括其语法变化)意指组织的新的和异常的生长，其可能是良性的或癌性的。在相关方面，瘤指示瘤性疾病或病症，包括但不限于各种癌症。例如，此类癌症可以包括前列腺癌、胰腺癌、胆管癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、肾癌、肺癌、睾丸癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、脑癌和头颈癌、黑色素瘤、肉瘤、多发性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤等。

始于血液形成组织如骨髓或在免疫系统的细胞中的癌症被称为血液癌症或血癌。血液癌症影响血细胞的产生和功能，主要分为三种类型：白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。

如本文所用的，“白血病”是指由异常白细胞的快速产生引起的血液。白血病的实例包括急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)和毛细胞白血病。

如本文所用的，“淋巴瘤”是指影响淋巴系统的血癌类型。淋巴瘤的实例包括艾滋病相关的淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、蕈样肉芽肿病、非霍奇金淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、塞扎里综合征、皮肤T细胞淋巴瘤和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。

如本文所用的“骨髓瘤”是浆细胞的癌症。骨髓瘤的实例包括慢性骨髓增生性肿瘤、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、多发性骨髓瘤、浆细胞肿瘤、骨髓增生异常综合征和骨髓增生异常/骨髓增生性肿瘤。

在一些实施例中，所述癌症是血液癌症。在某些实施例中，所述癌症包括急性成淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、毛细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或多发性骨髓瘤。

在一些方面，施用可以与一种或多种另外的治疗剂组合。短语“联合疗法”、“与...组合”等是指同时使用多于一种药物或治疗以增加反应。本发明的组合物可以例如与用于治疗癌症的其它药物或治疗组合使用。具体地，本发明的组合物对受试者的施用可以与任何抗癌疗法组合。此类疗法可以在施用本发明的组合物之前、同时或之后施用。

如本文所用的术语“抗癌疗法”或“抗癌治疗”意指可用于治疗癌症的任何治疗，如手术、放射疗法、化学疗法、免疫疗法和检查点抑制剂疗法。

提供以下实例以进一步说明本发明的实施例，但不意图限制本发明的范围。虽然它们是可以使用的那些的典型实例，但是可以替代地使用本领域技术人员已知的其它程序、方法或技术。

实例

实例1

在一个方面，本发明提供用于治疗如本文所述的受试者的以下方法：

用本文所述的线粒体富集分离的T细胞，其中使用冻/融循环冻/融所述线粒体。

将编码嵌合T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)的核酸聚合物引入细胞。

向所述受试者施用所述线粒体富集的细胞。

实例2

在一个方面，本发明提供用于治疗如本文所述的受试者的以下方法：

将编码嵌合T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)的核酸聚合物引入分离的T细胞。

用线粒体富集细胞。

向受试者施用富集的细胞。

实例3

将来自健康人供体的外周血单核细胞(PBMC)解冻并用白介素2培养。恢复两天后，使用OKT3(50ng/ml)使细胞活化(即方案的第0天)。

为了用编码具有CD28共刺激结构域的CD19-CAR的逆转录病毒转导，在第2天用重组人纤维连接蛋白在室温过夜包被非组织培养板。在第3天，将病毒解冻，加入到重组人纤维连接蛋白包被的板中，并在32℃旋转2小时。然后从平板上除去病毒，并且将活化的供体细胞铺板(0.5×10⁶/ml)，并置于培养箱中。作为对照，将未转导的细胞铺板在不含病毒的平板上。使细胞在补充了10％胎牛血清(FBS)和IL-2(100IU/ml)的RPMI培养基中生长，并且每2至3天更换培养基。

对于线粒体富集，将从健康个体(MNV-PLC)的胎盘分离的冷冻保存的线粒体解冻，并在细胞活化的第5天或第10天以0.88mU或4.4mU CS活性/1×10⁶个细胞加入到细胞中。将线粒体富集的细胞以及非富集的细胞在4℃下以7000g(A1)或400g(A2)离心5分钟。离心后，将细胞悬浮于相同培养基(补充了100U/ml IL-2的RPMI-10％FCS)中并在37℃下温育22小时。22小时后，收集细胞、洗涤并重悬于RPMI中。通过测序分析鉴定细胞中外源胎盘线粒体的存在来验证线粒体富集。进行相同程序并在37℃下温育22小时而无外源线粒体的CAR-T细胞用作对照。

如序列分析所证实的，用4.4mU或0.88mU的MNV-PLC处理CAR-T细胞导致线粒体富集。CAR-T细胞的线粒体富集在细胞活化的第5天或第10天是可行的。在第5天进行的线粒体富集导致90.3％至95.5％的活力，与对照细胞相比ATP含量增加1.05至1.21倍，并且与对照细胞相比标准化的CS活性增加1.7至2.6倍。在第10天进行的线粒体富集导致88.5％至92.7％活力，与对照细胞相比ATP含量增加1.02至1.53倍，并且与tp对照细胞相比标准化CS活性增加1.7至2.13倍。对照细胞是经受扩增条件而不将外源线粒体引入该过程的转导细胞(图1B)。与在第5天进行的线粒体富集相比，在第10天进行的线粒体富集的外源性线粒体掺入增加了2倍或3倍(在A1中为8.14％对4.03％，而在A2中为6.34％对2.7％)(图1C)。线粒体富集不损害T细胞增殖能力和转导效率(图2)。

尽管已经参考上述实例描述了本发明，但是应当理解，在本发明的精神和范围内包括修改和变化。因此，本发明仅由所附权利要求限制。

Claims (35)

1.一种药物组合物，其包含线粒体富集的基因工程T细胞和药学上可接受的载体，其中所述线粒体富集的基因工程T细胞富集有外源线粒体。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述线粒体富集的基因工程T细胞通过包含以下步骤的方法产生：

a)从患有疾病或病症的受试者或供体获得T细胞；

b)获得外源线粒体；

c)通过在允许所述外源线粒体进入所述T细胞的条件下使所述T细胞与所述外源线粒体接触来产生线粒体富集的T细胞；以及

d)通过将编码嵌合T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的核酸引入所述线粒体富集的T细胞来产生线粒体富集的基因工程T细胞，

其中所述线粒体富集的基因工程T细胞的线粒体含量可检测地高于所述T细胞的线粒体含量。

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述线粒体富集的基因工程T细胞通过包含以下步骤的所述方法产生：

a)从患有疾病或病症的受试者或供体获得T细胞；

b)通过将编码嵌合T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的核酸引入所述T细胞来产生基因工程T细胞，

c)获得外源线粒体；

d)通过在允许所述外源线粒体进入所述基因工程T细胞的条件下使所述基因工程T细胞与所述外源线粒体接触来产生线粒体富集的基因工程T细胞；

其中所述线粒体富集的基因工程T细胞的所述线粒体含量可检测地高于所述基因工程T细胞的线粒体含量。

4.根据权利要求2至3中任一项所述的药物组合物，其中所述基因工程T细胞和线粒体富集的基因工程T细胞是CAR-T细胞。

5.根据权利要求2至3中任一项所述的药物组合物，其中所述基因工程T细胞和线粒体富集的基因工程T细胞是TCR-T细胞。

6.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述外源线粒体来源于人细胞。

7.根据权利要求6所述的药物组合物，其中所述人细胞选自人胎盘、在培养物中生长的人胎盘细胞、人血细胞、干细胞和体细胞。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中所述干细胞选自由诱导的多能干细胞、胚胎干细胞和多能干细胞组成的组。

9.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述外源线粒体是同系或同种异体的。

10.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述外源线粒体是自体的。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含每Kg所述受试者体重至少5×10⁵至至少5×10¹⁰个线粒体富集的基因工程T细胞。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的药物组合物，其中所述线粒体富集的基因工程T细胞具有以下各者中的至少一者：

相对于线粒体富集之前的所述T细胞中的对应水平，

(a)增加的线粒体DNA含量；

(b)增加的柠檬酸合酶(CS)活性水平；

(c)选自SDHA和COX1的至少一种线粒体蛋白的增加的含量；

(d)增加的O₂消耗速率；

(e)增加的ATP产生速率；或

(f)其任何组合。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的药物组合物，其中允许所述外源线粒体进入所述T细胞或基因工程T细胞的所述条件包含将所述T细胞或基因工程T细胞与所述外源线粒体在约16℃至37℃范围内的温度下温育0.5小时至30小时范围内的时间。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的药物组合物，其中所述外源线粒体构成所述线粒体富集的T细胞或线粒体富集的基因工程T细胞中总线粒体的至少1％。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的药物组合物，其中所述疾病或病症是癌症。

16.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述癌症是血液癌症。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的药物组合物，其中所述T细胞是自体的或同种异体的。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的药物组合物，其中允许所述外源线粒体进入所述基因工程T细胞的所述条件包含约0.088mU至176mU柠檬酸合酶(CS)活性/10⁶个T细胞的比率。

19.一种治疗有需要的受试者中的疾病或病症的方法，其包含向所述受试者施用线粒体富集的基因工程T细胞，其中所述线粒体富集的基因工程T细胞富集有外源线粒体，从而治疗所述受试者。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述线粒体富集的基因工程T细胞通过包含以下步骤的方法产生：

a)从患有疾病或病症的受试者或供体获得T细胞；

b)获得外源线粒体；

c)通过在允许所述外源线粒体进入所述T细胞的条件下使所述T细胞与所述外源线粒体接触来产生线粒体富集的T细胞；以及

d)通过将编码嵌合T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的核酸引入所述线粒体富集的T细胞来产生线粒体富集的基因工程T细胞，

其中所述线粒体富集的基因工程T细胞的线粒体含量可检测地高于所述T细胞的线粒体含量。

21.根据权利要求19至20所述的方法，其中所述线粒体富集的基因工程T细胞通过包含以下步骤的方法产生：

a)通过将编码嵌合T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的核酸引入从患有疾病或病症的受试者或供体获得的T细胞来产生基因工程T细胞；

b)获得外源线粒体；以及

c)通过在允许所述外源线粒体进入所述基因工程T细胞的条件下使所述基因工程T细胞与所述外源线粒体接触来产生线粒体富集的基因工程T细胞；

其中所述线粒体富集的基因工程T细胞的线粒体含量可检测地高于所述T细胞的线粒体含量。

22.根据权利要求19至21中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类受试者。

23.根据权利要求19至22中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述癌症是血液癌症。

25.根据权利要求19至24中任一项所述的方法，其中施用是通过静脉内、腹膜内、动脉内、鞘内和肌内施用。

26.根据权利要求19至25中任一项所述的方法，其中所述施用是通过静脉内施用。

27.根据权利要求19至26中任一项所述的方法，其进一步包含向所述受试者施用化学治疗剂、放射疗法或其它抗癌疗法。

28.根据权利要求19至27中任一项所述的方法，其中所述药物组合物与所述化学治疗剂、放射疗法或其它抗癌疗法的施用同时、并行或在其之后施用。

29.根据权利要求19至28中任一项所述的方法，其中所述外源线粒体来源于人细胞或组织。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述人细胞选自由胎盘、在培养物中生长的胎盘细胞、血细胞和干细胞组成的组。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述干细胞选自由诱导的多能干细胞、胚胎干细胞和多能干细胞组成的组。

32.根据权利要求1至31中任一项所述的方法，其中所述外源线粒体是同种异体的或自体的。

33.根据权利要求19至32中任一项所述的方法，其中在通过所述外源线粒体富集后，所述线粒体富集的T细胞或线粒体富集的基因工程T细胞中的总线粒体的至少1％包含外源线粒体。

34.根据权利要求19至33中任一项所述的方法，其中允许所述外源线粒体进入所述T细胞或基因工程T细胞的所述条件包含将所述T细胞或基因工程T细胞与所述外源线粒体在约16℃至37℃范围内的温度下温育0.5小时至30小时范围内的时间。

35.根据权利要求19至34中任一项所述的方法，其中允许所述外源线粒体进入所述细胞的所述条件包含约0.088mU至176mU柠檬酸合酶(CS)活性/10⁶个细胞的比率。

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