CN115595347B - 一种壳多糖衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种壳多糖衍生物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种壳多糖衍生物及其制备方法和应用，涉及抗菌材料领域。包括以下步骤：(1)甲壳素的预处理；(2)甲壳素的酶法降解；(3)壳多糖衍生物的分离；(4)壳多糖衍生物的精制。本申请设计中高分子量壳多糖衍生物更加适用于淋洗类产品，兼顾了高效保湿、成膜、抗菌、舒缓的效果，在表面活性剂配方体系中，能够显著降低表面活性剂的刺激性，在护肤品中，具有舒缓、抑制炎症因子的功能；其适当的脱乙酰度，能够与微生物有更好的亲和力，且具有更好的抑菌能力，同时对引起头屑的马拉色菌和引起痤疮的痤疮丙酸杆菌具有一定的抑制能力，抗菌性较单一壳聚糖好，可实现商品化。

Description

一种壳多糖衍生物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及抗菌材料领域，尤其涉及一种壳多糖衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
壳多糖(Chitin)又称几丁质、甲壳质、甲壳素，为N-乙酰葡糖胺通过β连接聚合而成的结构同多糖，如图1所示，化学式为(C8H13O5N)n，化学名称：β-(1,4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖。广泛存在于甲壳类动物的外壳、昆虫的甲壳和真菌的胞壁中，也存在于一些绿藻中。壳多糖是广泛存在于自然界的一种含氮多糖类生物性高分子，其蕴藏量在地球上的天然高分子中占第二位，估计每年自然界生物的合成量可达1×1011吨，仅次于纤维素。壳多糖有α，β，γ三种晶型，其中α晶型最丰富，也最稳定，由于大分子之间极强的氢键作用，导致其一般不溶于水，化学性质非常稳定，因而应用有限。自然界中壳多糖大多是与各不溶于水的无机盐及蛋白质紧密结合在一起，为了获取壳多糖，往往将甲壳动物的外壳通过酸碱处理，脱去钙盐和蛋白质，得到上述壳多糖后，再用强碱在加热条件下脱去分子中的乙酰基就可以转化为可溶性的壳聚糖，反应化学式如图2所示。
壳多糖作为天然来源抗菌物质，尽管已经有较多的研究来进一步提升抗菌活性，但是商品化的壳多糖衍生物抗菌剂却凤毛麟角，更多是突出在保湿、成膜保护等功能上。究其原因，仍旧是如同其他天然来源抗菌一样，抗菌性能达不到实际的商品化应用，不足以单独作为抑菌剂来使用，尤其是对真菌的抑制能力上。
发明内容
本发明提供了一种壳多糖衍生物及其制备方法和应用，提供一种壳多糖衍生物，其安全性高，可生物降解，对马拉色菌、痤疮丙酸杆菌等具有优异的抑制能力，同时具有良好的保湿功能，可以实现其在抗菌领域的商品化应用。
为了解决上述技术问题，本发明目的之一提供了一种壳多糖衍生物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将甲壳素粉碎后加入第一份水、试剂A，搅拌6-12h，过滤并水洗至pH为6.8-7.2，加入第二份水、试剂B、碱性盐和试剂C，搅拌2-4h，冷冻后水洗至pH为6.8-7.2，烘干后制得预处理后的甲壳素，所述试剂A为甲酸、乙酸、丙酸中的一种或多种，所述试剂B为异丙醇、甲醇、乙醇、正丙醇、丙酮、石油醚中的一种或多种，所述碱性盐为氢氧化钠和/或氢氧化钾，所述试剂C为脂肪醇聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚、十二烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠、脂肪醇聚醚磷酸酯盐中的一种或多种；
(2)在所述预处理后的甲壳素加入水和甲壳素酶，酶解反应后获得甲壳素酶解液，所述甲壳素酶来源于类芽孢杆菌CS0611生产的甲壳素酶，类芽孢杆菌CS0611的保藏编号为CCTCC NO:M2014458；
(3)在所述甲壳素酶解液中加入酸，过滤收集滤液，获得粗壳多糖衍生物；
(4)在粗壳多糖衍生物中加入酒精溶液，调节pH为8.5-9.5，过滤后滤渣分别用水、15-25vt％的酒精溶液、45-55vt％的酒精溶液、70-80vt％的酒精溶液和95vt％的酒精溶液依次洗涤，滤渣真空干燥后获得壳多糖衍生物。
作为优选方案，在步骤(1)中，所述预处理后的甲壳素水分含量<1.5％；其灰分含量<0.5％。
作为优选方案，在步骤(4)中，所述壳多糖衍生物的脱乙酰度为45-75％，粘均分子量为3.77-10.64×104g/mol，灰分含量<0.05％，溶解度＞98g/L。
作为优选方案，在步骤(1)中，所述甲壳素来源于虾壳和/或蟹壳，所述甲壳素的制备方法为：将虾壳和/或蟹壳水洗除杂后，加盐酸浸酸脱钙，水洗后加稀碱，煮碱脱脂脱蛋白，随后水洗再加酸二次浸酸脱钙，再水洗后加稀碱，二次煮碱脱脂脱蛋白，水洗后获得所述甲壳素。
作为优选方案，在步骤(3)中，酸为醋酸、甲酸、盐酸、硫酸、磷酸、多聚磷酸、草酸、乳酸、柠檬酸中的一种或多种。
作为优选方案，在步骤(1)中，将甲壳素粉碎至100-200目，加入第一份水、试剂A，在200-400rpm转速下搅拌6-12h，过滤并水洗至pH为6.8-7.2，加入第二份水、试剂B、碱性盐、试剂C，在200-400rpm转速下搅拌2-4h，在-10～-20℃温度下冷冻24-48h，水洗至pH为6.8-7.2，在75-90℃温度下水浴烘干，得到预处理后的甲壳素；所述甲壳素粉、第一份水、第二份水、试剂A、试剂B、试剂C的质量比为(12-14)：(50-60):(3-5):(24-36):(6-12):(3-5):(1-3)。
作为优选方案，在步骤(2)中，在预处理的甲壳素中加入水，搅拌均匀，加入甲壳素酶，升温至30-45℃，搅拌酶解8-16h；酶解结束后，升温至95-100℃，搅拌15-30min，降至室温获得甲壳素酶解液，所述甲壳素、水与甲壳素酶的质量比为10:(50-100):(1-5)。
作为优选方案，在步骤(3)中，在所述甲壳素酶解液加入预处理的甲壳素质量50％-80％的酸，过滤收集滤液，即为粗壳多糖衍生物；
在步骤(4)中，在粗壳多糖衍生物溶液中加入所述预处理的甲壳素质量100-200％的55-65vt％浓度酒精，加碱调节pH至8.5-9.5；过滤后滤渣分别用水、15-25vt％的酒精溶液、45-55vt％的酒精溶液、70-80vt％的酒精溶液和95vt％的酒精溶液依次洗涤，滤渣真空干燥后获得壳多糖衍生物。
作为优选方案，在步骤(4)中，过滤采用板框过滤机、蝶式离心机或管式离心机。
作为优选方案，在步骤(4)中，真空干燥采用立式真空干燥箱、工业级真空盘式连续干燥机、双锥回转真空干燥机或真空耙式干燥机；干燥温度为35-45℃，压力为-0.09～-0.1MPa。
为了解决上述技术问题，本发明目的之二提供了一种采用上述制备方法获得的壳多糖衍生物。
为了解决上述技术问题，本发明目的之三提供了一种壳多糖衍生物在头发洗护产品中的应用。
作为优选方案，所述壳多糖衍生物的添加量为0.03-0.5wt％。
作为优选方案，所述头发洗护产品为洗发水、护发素、护发精华、发膜或发膏。
相比于现有技术，本发明实施例具有如下有益效果：
(1)本申请采用酶法水解甲壳素，获得壳多糖衍生物，避免了传统碱法产生大量污染的问题，该甲壳素酶可以显著提高壳多糖衍生物的溶解度，同时产品的灰分较低，纯度较高，该方法简单，设备要求较低，且后处理简单易行，适宜工业化生产；
(2)本申请对甲壳素的预处理步骤可以破坏甲壳素致密的晶型，有助于降低甲壳素的灰分，从而利于后续酶解反应的进行，有助于最终壳多糖衍生物的灰分降低，溶解度提高；以梯度洗涤对粗壳多糖衍生物进行精制，可以溶解更多的可溶性成分，同时去掉了更低分子量的衍生物，最终所获得的壳多糖衍生物灰分含量低、纯度高，分子量分布均匀；
(3)本申请获得的壳多糖衍生物具有良好的抑菌、保湿、舒缓性能，在表面活性剂配方体系中，能够显著降低表面活性剂的刺激性，在护肤品中，具有舒缓、抑制炎症因子的功能；同时对引起头屑的马拉色菌和引起痤疮的痤疮丙酸杆菌具有一定的抑制能力，抗菌性较单一壳聚糖好，可实现商品化；
(4)壳聚糖的许多独特功能只有在特定分子量、特定脱乙酰度下才表现出来，本申请所制备的壳多糖衍生物其脱乙酰度为45-75％，粘均分子量属于中高分子量为3.77-10.64×104g/mol，随着壳聚糖分子量的降低，壳聚糖的抑菌、抗菌、保湿效果得到提升，在3000左右达到最佳，这是由于低分子量壳聚糖分子中有大量的-NH2和-OH强极性基团，平均分子量的降低使得分子内的氧键作用也随之消弱，分子链长度的缩短增加其在水溶液中的无序程度，提高了保湿功能，本申请设计中高分子量壳多糖衍生物更加适用于淋洗类产品，兼顾了高效保湿、成膜、抗菌的效果；另外，微生物的细胞膜是疏水结构，壳多糖衍生物的脱乙酰度越高亲水能力越强，与微生物的亲和力越差，本申请制备适当的脱乙酰度，能够与微生物有更好的亲和力，且具有更好的抑菌能力。
(5)本发明所制备的壳多糖衍生物可以完全生物降解，不会产生环境污染。
附图说明
图1为壳多糖的分子结构通式示意图；
图2为壳多糖脱乙酰基后形成壳聚糖的化学方程式示意图；
图3为本发明在细胞毒性测试实验中实施例1壳多糖衍生物在不同浓度条件下的细胞存活率统计结果；
图4为本发明在舒缓功能测试实验中空白对照组的显微拍照图片；
图5为本发明在舒缓功能测试实验中实施例1壳多糖衍生物的纤维拍照图片。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
一种壳多糖衍生物的制备方法，包括以下步骤：
(1)甲壳素的预处理：将13g市售蟹壳来源的甲壳素粉碎至200目，随后加入55mL水、4mL甲酸，在300rpm转速下搅拌8h，过滤后，水洗至pH为中性7.0，随后加入30mL水、8mL异丙醇、4g氢氧化钠、2mL脂肪醇聚氧乙烯醚JFC，在300rpm转速下搅拌3h，随后在-17℃冷冻32h，再水洗至pH为中性7.0，在80℃下水浴烘干，得到预处理后的甲壳素(产率76.92％)，经过预处理后的甲壳素水分含量为1.0％，其灰份含量为0.3％；
(2)甲壳素的酶法降解：将10g经过预处理的甲壳素加入酶解釜中，加入80mL的去离子水，搅拌30min至均匀，加入3mL的甲壳素酶，升温至40℃，搅拌酶解12h；酶解结束，升温至98℃，搅拌20min，降温至室温，获得甲壳素酶解液；
其中，甲壳素酶来源于现有专利CN104450561B-一株产甲壳素酶菌株及其利用蟹壳发酵产甲壳素酶的应用中实施例1获得的甲壳素酶粗酶液，由类芽孢杆菌CS0611生产获得，该类芽孢杆菌CS0611保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2014458，保藏日期为2014年10月8日；
(3)壳多糖衍生物的分离：在甲壳素酶解液中加入6mL的醋酸，以管式离心机过滤，获得滤液，即为粗壳多糖衍生物；
(4)壳多糖衍生物的精制：在粗壳多糖衍生物滤液中加入15mL 60vt％酒精和8mL5wt％氢氧化钠调节pH至9.0；采用板框过滤，滤渣分别用纯水、20vt％酒精、50vt％酒精、75vt％酒精、95vt％酒精依次洗涤，含酒精滤液回收；滤渣采用立式真空干燥箱干燥，干燥温度40℃，压力-0.1MPa，获得5g壳多糖衍生物。
实施例二
一种壳多糖衍生物的制备方法，包括以下步骤：
(1)甲壳素的预处理：将12g市售蟹壳来源的甲壳素粉碎至100目，随后加入50mL水、3mL甲酸，在200rpm转速下搅拌6h，过滤后，水洗至pH为6.8，随后加入24mL水、6mL异丙醇、3g氢氧化钠、1mL脂肪醇聚氧乙烯醚JFC，在200rpm转速下搅拌2h，随后在-15℃冷冻24h，再水洗至pH为6.8，在75℃下水浴烘干，得到预处理后的甲壳素(产率83.33％)，该经过预处理后的甲壳素水分含量为1.5％，其灰份含量为0.2％；
(2)甲壳素的酶法降解：将10g经过预处理的甲壳素加入酶解釜中，加入50mL的去离子水，搅拌15min至均匀，加入1mL的甲壳素酶，甲壳素酶来源与实施例1相同，升温至30℃，搅拌酶解8h；酶解结束，升温至95℃，搅拌15min，降温至室温，获得甲壳素酶解液；
(3)壳多糖衍生物的分离：在甲壳素酶解液中加入5mL的醋酸，以管式离心机过滤，获得滤液，即为粗壳多糖衍生物；
(4)壳多糖衍生物的精制：在粗壳多糖衍生物滤液中加入10mL 60vt％酒精和5mL5wt％氢氧化钠调节pH至8.5；采用板框过滤，滤渣分别用纯水、20vt％酒精、50vt％酒精、75vt％酒精、95vt％酒精依次洗涤，含酒精滤液回收；滤渣采用立式真空干燥箱干燥，干燥温度35℃，压力-0.09MPa，获得5.5g壳多糖衍生物。
实施例三
一种壳多糖衍生物的制备方法，包括以下步骤：
(1)甲壳素的预处理：将12.5g市售蟹壳来源的甲壳素粉碎至150目，随后加入60mL水、3.5mL甲酸，在250rpm转速下搅拌12h，过滤后，水洗至pH为7.2，随后加入26mL水、10mL异丙醇、3.5g氢氧化钠、3mL脂肪醇聚氧乙烯醚JFC，在250rpm转速下搅拌4h，随后在-10℃冷冻30h，再水洗至pH为7.2，在78℃下水浴烘干，得到预处理后的甲壳素(产率80％)，该经过预处理后的甲壳素水分含量为1.2％，其灰份含量为0.4％；
(2)甲壳素的酶法降解：将10g经过预处理的甲壳素加入酶解釜中，加入85mL的去离子水，搅拌45min至均匀，加入2mL的甲壳素酶，甲壳素酶来源与实施例1相同，升温至35℃，搅拌酶解10h；酶解结束，升温至96℃，搅拌25min，降温至室温，获得甲壳素酶解液；
(3)壳多糖衍生物的分离：在甲壳素酶解液中加入7mL的醋酸，以管式离心机过滤，获得滤液，即为粗壳多糖衍生物；
(4)壳多糖衍生物的精制：在粗壳多糖衍生物滤液中加入20mL 60vt％酒精和6mL5wt％氢氧化钠调节pH至9.5；采用板框过滤，滤渣分别用纯水、20vt％酒精、50vt％酒精、75vt％酒精、95vt％酒精依次洗涤，含酒精滤液回收；滤渣采用立式真空干燥箱干燥，干燥温度45℃，压力-0.098MPa，获得4.5g壳多糖衍生物。
实施例四
一种壳多糖衍生物的制备方法，包括以下步骤：
(1)甲壳素的预处理：将13.5g市售蟹壳来源的甲壳素粉碎至100目，随后加入52mL水、4.5mL甲酸，在400rpm转速下搅拌10h，过滤后，水洗至pH为6.9，随后加入36mL水、12mL异丙醇、4g氢氧化钠、1.5mL脂肪醇聚氧乙烯醚JFC，在400rpm转速下搅拌2.5h，随后在-20℃冷冻48h，再水洗至pH为6.9，在90℃下水浴烘干，得到预处理后的甲壳素(产率74.07％)，该经过预处理后的甲壳素水分含量为0.5％，其灰份含量为0.5％；
(2)甲壳素的酶法降解：将10g经过预处理的甲壳素加入酶解釜中，加入100mL的去离子水，搅拌20min至均匀，加入3mL的甲壳素酶，甲壳素酶来源与实施例1相同，升温至35℃，搅拌酶解16h；酶解结束，升温至99℃，搅拌30min，降温至室温，获得甲壳素酶解液；
(3)壳多糖衍生物的分离：在甲壳素酶解液中加入8mL的醋酸，以管式离心机过滤，获得滤液，即为粗壳多糖衍生物；
(4)壳多糖衍生物的精制：在粗壳多糖衍生物滤液中加入18mL 60vt％酒精和7mL5wt％氢氧化钠调节pH至8.6；采用板框过滤，滤渣分别用纯水、20vt％酒精、50vt％酒精、75vt％酒精、95vt％酒精依次洗涤，含酒精滤液回收；滤渣采用立式真空干燥箱干燥，干燥温度38℃，压力-0.092MPa，获得5.5g壳多糖衍生物。
实施例五
一种壳多糖衍生物的制备方法，包括以下步骤：
(1)甲壳素的预处理：将14g市售蟹壳来源的甲壳素粉碎至150目，随后加入58mL水、5mL甲酸，在350rpm转速下搅拌7h，过滤后，水洗至pH为7.0，随后加入28mL水、9mL异丙醇、5g氢氧化钠、2.5mL脂肪醇聚氧乙烯醚JFC，在300rpm转速下搅拌3.5h，随后在-18℃冷冻36h，再水洗至pH为7.0，在85℃下水浴烘干，得到预处理后的甲壳素(产率71.43％)，该经过预处理后的甲壳素水分含量为0.8％，其灰份含量为0.3％；
(2)甲壳素的酶法降解：将10g经过预处理的甲壳素加入酶解釜中，加入75mL的去离子水，搅拌25min至均匀，加入5mL的甲壳素酶，甲壳素酶来源与实施例1相同，升温至45℃，搅拌酶解14h；酶解结束，升温至100℃，搅拌20min，降温至室温，获得甲壳素酶解液；
(3)壳多糖衍生物的分离：在甲壳素酶解液中加入5.5mL的醋酸，以管式离心机过滤，获得滤液，即为粗壳多糖衍生物；
(4)壳多糖衍生物的精制：在粗壳多糖衍生物滤液中加入10mL 60vt％酒精和10mL5wt％氢氧化钠调节pH至9.1；采用板框过滤，滤渣分别用纯水、20vt％酒精、50vt％酒精、75vt％酒精、95vt％酒精依次洗涤，含酒精滤液回收；滤渣采用立式真空干燥箱干燥，干燥温度42℃，压力-0.1MPa，获得6g壳多糖衍生物。
实施例六
一种壳多糖衍生物的制备方法，包括以下步骤：
(1)甲壳素的预处理：将12.5g市售蟹壳来源的甲壳素粉碎至200目，随后加入60mL水、4mL甲酸，在250rpm转速下搅拌9h，过滤后，水洗至pH为7.1，随后加入32mL水、11mL异丙醇、4.5g氢氧化钠、1mL脂肪醇聚氧乙烯醚JFC，在350rpm转速下搅拌2h，随后在-12℃冷冻30h，再水洗至pH为7.1，在82℃下水浴烘干，得到预处理后的甲壳素(产率80％)，该经过预处理后的甲壳素水分含量为0.9％，其灰份含量为0.2％；
(2)甲壳素的酶法降解：将10g经过预处理的甲壳素加入酶解釜中，加入60mL的去离子水，搅拌35min至均匀，加入4mL的甲壳素酶，甲壳素酶来源与实施例1相同，升温至40℃，搅拌酶解15h；酶解结束，升温至97℃，搅拌25min，降温至室温，获得甲壳素酶解液；
(3)壳多糖衍生物的分离：在甲壳素酶解液中加入6.5mL的醋酸，以管式离心机过滤，获得滤液，即为粗壳多糖衍生物；
(4)壳多糖衍生物的精制：在粗壳多糖衍生物滤液中加入15mL 60vt％酒精和9mL5wt％氢氧化钠调节pH至9.0；采用板框过滤，滤渣分别用纯水、20vt％酒精、50vt％酒精、75vt％酒精、95vt％酒精依次洗涤，含酒精滤液回收；滤渣采用立式真空干燥箱干燥，干燥温度35℃，压力-0.095MPa，获得6.5g壳多糖衍生物。
对比例一
一种壳多糖衍生物的制备方法，包括以下步骤：
(1)甲壳素的酶法降解：将13g市售蟹壳来源的甲壳素加入酶解釜中，加入80mL的去离子水，搅拌30min至均匀，加入3mL的甲壳素酶，甲壳素酶来源与实施例1相同，升温至40℃，搅拌酶解12h；酶解结束，升温至98℃，搅拌20min，降温至室温，获得甲壳素酶解液；
(2)壳多糖衍生物的分离：在甲壳素酶解液中加入6mL的醋酸，以管式离心机过滤，获得滤液，即为粗壳多糖衍生物；
(3)壳多糖衍生物的精制：在粗壳多糖衍生物滤液中加入15mL 60vt％酒精和8mL5wt％氢氧化钠调节pH至9.0；采用板框过滤，滤渣分别用纯水、20vt％酒精、50vt％酒精、75vt％酒精、95vt％酒精依次洗涤，含酒精滤液回收；滤渣采用立式真空干燥箱干燥，干燥温度40℃，压力-0.1MPa，获得4.6g壳多糖衍生物。
对比例二
一种壳多糖衍生物的制备方法，各步骤及各步骤使用的试剂、工艺参数均与实施例一相同，不同的地方在于，在步骤(2)中，采用等量的几丁质酶替代甲壳素酶，几丁质酶来自绿色木酶，产自Sigma-Aldrich公司；在步骤(4)中，最终获得4.5g的壳多糖衍生物。
对比例三
一种壳多糖衍生物的制备方法，各步骤及各步骤使用的试剂、工艺参数均与实施例一相同，不同的地方在于，在步骤(2)中，采用等量的混合酶替代甲壳素酶，混合酶包括质量比为1：1的木瓜蛋白酶和果胶酶；在步骤(4)中，最终获得3.2g的壳多糖衍生物。
对比例四
一种壳多糖衍生物的制备方法，各步骤及各步骤使用的试剂、工艺参数均与实施例一相同，不同的地方在于，在步骤(3)中获得的粗壳多糖衍生物不进行精制，直接采用板框过滤，滤渣采用立式真空干燥箱干燥，干燥温度40℃，压力-0.1MPa，获得8.5g壳多糖衍生物。
性能检测试验
1、脱乙酰度测试：分别称取0.4g实施例和对比例的壳多糖衍生物，分别溶于30mL0.1mol/L的HCl溶液中，再用0.1mol/L NaOH溶液回滴过量的盐酸。
按下式计算：
Figure BDA0003924085720000111
Figure BDA0003924085720000112
其中，C1 V1为加入HCl溶液的浓度及体积；C2V2为滴定消耗的NaOH溶液的浓度及体积；G为样品重量。
2、粘均分子量测试：以0.1mol/L乙酸溶液和0.2mol/Ll氯化钠溶液为溶剂配置1g/L的壳聚糖衍生物溶液。
用乌氏粘度计测定溶液粘度[η],按下式计算壳聚糖衍生物的粘均分子量M：
[η]＝KMα
其中，K＝1.81×10-3cm3·g-1，α＝0.93。
3、灰分测试：灰分的测定步骤如下：
1)坩埚质量称重。
将空坩蜗置于高温电炉中，半开坩蜗盖，于550℃灼烧2h，冷却后称重，再放入高温电炉中于550℃灼烧1h，冷却后再称重，两次质量差小于0.0005g为恒定质量。
2)灰化与称量。
取制备好的实施例和对比例的壳多糖衍生物5g于坩埚中，将盛样坩埚放在调温电炉上，稍开坩蜗盖，加热，使样品慢慢冒烟，等烟冒完后，再烧15min。把坩蜗移入高温电炉中，半开坩蜗盖，由室温升到400℃，保持30min，再升到550℃，保持6h，与称空坩蜗同样步骤称量。再于550℃灼烧2h，称至恒定质量。
(3)结果计算
灰分＝m1-m0/m×100％
其中，m1为灰分和空坩埚的质量；m0为空坩埚的质量；m为样品质量
4、溶解度测试：参考《中国药典》2015年版二部中规定的溶解度测定方法。
表1-本申请实施例1-6和对比例1-4中壳多糖衍生物的性能检测结果
Figure BDA0003924085720000121
结合表1中实施例1和对比例1-5的性能检测结果可知，本申请采用的甲壳素酶可以显著提高壳多糖衍生物的溶解度，同时产品的灰分较低，纯度较高，甲壳素的预处理步骤可以破坏甲壳素致密的晶型，有助于降低甲壳素的灰分，从而利于后续酶解反应的进行，使得最终壳多糖衍生物的灰分更低，溶解度更高。在精制步骤中采用不同浓度的酒精对壳多糖衍生物进行洗涤，低浓度的酒精可以溶解更多的可溶性成分，同时去掉了更低分子量的衍生物，使得最终获得的壳多糖衍生物分子量分布更加均匀，分布相对更窄，且灰分更低。
5、细胞毒性测试：
(1)细胞(小鼠巨噬细胞Raw 264.7)培养：试验前24h制备细胞悬液，将细胞悬液接种于96孔细胞培养板，每孔100μL，每孔细胞数为3×104个，培养24h；
(2)暴露：弃去孔中原培养液，每孔加入100μL不同浓度的实施例1的壳多糖衍生物样品，以及阴性对照或阳性对照，培养箱孵育24h，相差倒置显微镜下观察细胞形态和特性；
(3)MTT测试：每孔加入100μL 0.1mg/mL MTT溶液，培养箱孵育4h，去除孔中液体，每孔加入150μL DMSO，置于振荡器振荡15min后，在酶标仪570nm波长处测定吸收值；
(4)各组数据以均值±标准差表示，以对照组细胞活性为100％，计算各组相对细胞活性(Viability)，计算公式为
Figure BDA0003924085720000131
实施例1的壳多糖衍生物在不同浓度时的细胞存活率结果如图3所示；
(5)选取实施例1-6和对比例1-4的壳多糖衍生物配置浓度为10mg/mL的水溶液重复进行细胞毒性步骤，以对比考察细胞毒性影响，结果如表2所示。
表2-实施例1-6和对比例1-4的细胞毒性测试结果
Figure BDA0003924085720000132
6、保湿功能测试：参考QB/T 4256-2011《化妆品保湿功效评价指南》标准，测试部位为前臂内侧(每一样品10个志愿者)，样品及空白对照区(不涂抹任何样品)按测试区域随机分布于志愿者前臂内侧区域，每个区域大小为3.0cm×3.0cm，样品用量为(2.0±0.1)mg/cm2，样品与水混合后浓度为0.5wt％、0.1wt％，在产品使用前、使用第1h、2h、4h后进行皮肤角质层水分含量测试，数据记为T0、T1、T2、T4，结果取平均值，实施例1获得壳多糖衍生物和市售脱乙酰壳多糖的测试结果如表3-4所示，市售脱乙酰度壳多糖的脱乙酰度为96％，分子量为8×104g/mol。
表3-实施例1获得壳多糖衍生物的保湿功能测试结果
Figure BDA0003924085720000133
Figure BDA0003924085720000141
表4-市售脱乙酰壳多糖的保湿功能测试结果
Figure BDA0003924085720000142
如表3-4的测试结果可以看出，使用样品4小时后与初始值相比较，本申请实施例1中浓度0.5wt％、0.1wt％的壳多糖衍生物均有一定提升皮肤角质层水分含量效果，其中浓度为0.5wt％的壳多糖衍生物提升皮肤角质层水分含量效果明显优于浓度0.1wt％。同时，在同等浓度的条件下，本发明的壳多糖衍生物保湿能力优于市售的脱乙酰壳多糖。
7、发丝保湿测试：采用同一来源的真人直发，每个样品各取3束头发(空白对照组1束)，使用前称量各发束重量，把发束放置于不同浓度的样品水溶液中浸泡3分钟(空白对照组使用去离子水)，样品水溶液浓度为0.1wt％、0.2wt％、0.5wt％，取出自然晾干24小时，此步骤重复4次，每次更换新的水溶液，使用后称量各发束重量，计算平均值、差值和变化率，测试结果如表5所示。
表5-实施例1获得壳多糖衍生物和市售脱乙酰壳多糖的发丝保湿测试结果
Figure BDA0003924085720000151
结合表5中的发丝保湿测试结果可知，重复浸泡发束4次后晾干，与空白对照组相比，不同浓度的实施例1制备的壳多糖衍生物和市售的壳多糖衍生物均具有一定的保湿效果，且保湿效果随着浓度增加而提高，其中本发明的壳多糖衍生物的发丝保湿效果优于市售脱乙酰壳多糖。
8、舒缓功能测试：通过斑马鱼胚胎尾鳍中性粒细胞聚集测试探究本发明壳多糖衍生物的舒缓功能，测试样品为实施例1-6和对比例1-4的壳多糖衍生物以及市售脱乙酰壳多糖。斑马鱼胚胎的中性粒细胞和人体中性粒细胞在形态、生化和生理功能上高度相似，中性粒细胞是在损伤或病菌入侵部位第一批出现的白细胞，作用于清除感染或有害物质。应用硫酸铜诱导斑马鱼胚胎侧线区域神经丘细胞损伤而引起中性粒细胞聚集的模型进行测试，比较受试物处理组和模型对照组的鱼胚胎侧线区域的中性粒细胞的数量变化，计算中性粒细胞抑制率以评价原料、配方或产品的舒缓功效，中性细胞抑制率越高，则产品的舒缓效果越好。
实验步骤：
(1)随机挑选24尾斑马鱼胚胎，转移至3cm培养皿中，加入5mL含0.16mg/L无水硫酸铜的鱼胚胎培养液，作为空白对照组；
(2)随机挑选24尾斑马鱼胚胎，转移至3cm培养皿中，加入5mL含0.16mg/L无水硫酸铜和0.075g/L壳多糖样品的鱼胚胎培养液，作为样品处理组；
(3)将空白对照组和样品处理组置于28℃的条件下培养40-45min后，对鱼胚胎固定染色，并置于显微镜下对鱼胚胎尾部进行拍照，计算每尾鱼胚胎从肛门起四分之三尾部侧线区域的中性粒细胞数目；计算公式为：抑制率＝(C-T)/C×100％；式中，T为样品处理组鱼胚胎中性粒细胞数目的平均值；C为空白对照组鱼胚胎中性粒细胞数目的平均值，空白对照组如图4所示，中性粒细胞聚集抑制率为0％，实施例1的观察结果如图5所示，中性粒细胞聚集抑制率为24％，实施例1-6和对比例1-4以及市售脱乙酰壳多糖的抑制率统计结果如表6所示。
表6-实施例1-6和对比例1-4的壳多糖衍生物及市售脱乙酰壳多糖的抑制率
Figure BDA0003924085720000161
Figure BDA0003924085720000171
9、降低表面活性剂刺激性测试：参考SN/T2329-2009《化妆品眼刺激性腐蚀性的鸡胚绒毛尿囊膜试验》标准进行测试。
绒毛尿囊膜(CAM)是一个呼吸性膜，包围在鸡胚周围，鸡胚绒毛尿囊膜试验利用孵化的鸡胚中期绒毛尿囊膜血管系统完整、清晰和透明的特点，将一定量受试物直接与鸡胚尿囊膜接触，作用一段时间之后观察绒毛尿囊膜毒性效应指标(如：出血、凝血和血管融解)的变化，这些指标反映血管及血管网的形态结构、颜色和通透性的变化，以及反映绒毛尿囊膜蛋白质变性等现象及其受损程度，然后组合得到一个评分，用于评估受试物的眼刺激性。
鸡蛋指标：
(1)来源：新兴大华农禽蛋有限公司SPF试验动物中心；
(2)品种/品系：BWEL-SPF鸡；
(3)日龄：0日龄；
(4)质量检测：依据《GB/T 17999.1-2008SPF鸡微生物学监测第1部分：SPF鸡微生物学监测总则》检验合格；
样品制备：采用实施例1-6和对比例1-4的壳多糖衍生物以及市售脱乙酰壳多糖分别与基质香波混合，每个样品的浓度分别设置0.1wt％、0.2wt％、0.5wt％，基质香波的组分及含量如表7所示。
表7-基质香波的组分及含量
Figure BDA0003924085720000172
Figure BDA0003924085720000181
测试步骤：
(1)将鸡蛋放入培养箱孵化至9天，温度37.5℃、相对湿度55-70％；
(2)用铅笔将鸡蛋气室位置画出，同时观察鸡胚是否发育良好，血管是否正常生长；
(3)试验时每个样品用3只鸡胚(阴性对照和阳性对照各用1只鸡胚，阴性对照组为生理盐水，阳性对照组为1wt％十二烷基硫酸钠溶液)，沿着所画的气室标志，利用工具去掉标记的蛋壳部分，用吸管滴加生理盐水使蛋膜湿润，将生理盐水倾出，小心地用镊子去掉内膜，保证血管不受损，观察鸡胚无明显出血或浑浊现象，即判断可用于试验；
(4)采用反应时间法的试验：用移液枪吸取300μL的样品加到CAM膜中，开始计时，拍照记录刚刚加样状态；观察圈内血管变化，当出现出血、溶血、凝血等状态变化时，记录时间、拍照记录鸡胚状态；加样5min后，拍照记录鸡胚状态，结束观察。
(5)刺激性评分计算：采用反应时间法进行的试验，按下式计算刺激性评分(IS)，结果保留小数点后两位：
Figure BDA0003924085720000191
式中，H为CAM膜上观察到开始发生出血的平均时间，单位为秒(s)；L为CAM膜上观察到开始发生血管溶解的平均时间，单位为秒(s)；C为CAM膜上观察到开始出现凝血的平均时间，单位为秒(s)；反应结果评分标准如表7所示，测试结果如表9-10所示。
表8-鸡胚反应结果刺激性评分标准
刺激评分 刺激性分类
IS<1 无刺激性
1≤IS<5 轻刺激性
5≤IS<9 中度刺激性
IS≥9 强刺激性/腐蚀性
表9-鸡胚绒毛尿囊膜刺激性测试结果
Figure BDA0003924085720000192
/>
Figure BDA0003924085720000201
表10-鸡胚绒毛尿囊膜刺激性测试结果
Figure BDA0003924085720000202
/>
Figure BDA0003924085720000211
结合表9-10的测试结果可知，本发明实施例的壳多糖衍生物的可以降低基质香波的刺激性，且壳多糖衍生物的浓度越大，则降低基质香波刺激性的能力越强，当壳多糖衍生物的浓度一致时，实施例1-6的壳多糖衍生物降低基质香波刺激性的能力强于对比例1-5。
10、抑菌能力测试：
测试方法参考《QB/T 2738-2012日化产品抗菌抑菌效果的评价方法》；
测试对象：实施例1-6的壳多糖衍生物(1wt％的水溶液)。
试验菌株：糠秕马拉色菌(Malassezia furfur)CMCC(F)Y 17(菌种来源：广东微生物分析检测中心)；痤疮丙酸杆菌(菌种来源：BNCC336649，商城北纳创联生物科技有限公司)。
抑菌率(％)＝(Ⅰ-Ⅱ)/Ⅰ×100％；
式中：Ⅰ-对照组平均菌落数；
Ⅱ-试验组平均菌落数；
如试验样品的抑菌率优于(高于)空白对照组的抑菌率且统计学差异P值＜0.05，则可以认为试验样品具有一定的去屑或抗痤疮功效，测试结果如表11所示。
表11-壳多糖衍生物及市售脱乙酰壳多糖的抑制能力测试结果
检测项目 糠秕马拉色菌抑菌率(％) 痤疮丙酸杆菌抑菌率(％)
空白对照组 12.56 32.8
实施例1 95.92 89.54
实施例2 91.77 88.72
实施例3 93.28 90.38
实施例4 91.75 91.25
实施例5 92.34 87.15
实施例6 92.57 90.47
对比例1 45.72 33.65
对比例2 80.29 78.46
对比例3 25.18 42.53
对比例4 32.6 45.08
市售脱乙酰壳多糖 43.25 35.73
注：P＜0.05
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步的详细说明，应当理解，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限定本发明的保护范围。特别指出，对于本领域技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种壳多糖衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将甲壳素粉碎后加入第一份水、试剂A，搅拌6-12h，过滤并水洗至pH为6.8-7.2，加入第二份水、试剂B、碱性盐和试剂C，搅拌、冷冻后水洗，烘干后制得预处理后的甲壳素，所述试剂A为甲酸、乙酸、丙酸中的一种或多种，所述试剂B为异丙醇、甲醇、乙醇、正丙醇、丙酮、石油醚中的一种或多种，所述碱性盐为氢氧化钠和/或氢氧化钾，所述试剂C为脂肪醇聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚、十二烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠、脂肪醇聚醚磷酸酯盐中的一种或多种；所述甲壳素、第一份水、第二份水、试剂A、试剂B、试剂C的质量比为(12-14)：(50-60):(3-5)：(24-36):(6-12):(3-5):(1-3)；
(2)在所述预处理后的甲壳素加入水和甲壳素酶，酶解反应后获得甲壳素酶解液，所述甲壳素酶来源于类芽孢杆菌CS0611生产的甲壳素酶，类芽孢杆菌CS0611的保藏编号为CCTCC NO:M2014458；
(3)在所述甲壳素酶解液中加入酸，过滤收集滤液，获得粗壳多糖衍生物；
(4)在所述粗壳多糖衍生物中加入浓度为55-65vt％的酒精溶液，调节pH为8.5-9.5，过滤后滤渣分别用水、15-25vt％的酒精溶液、45-55vt％的酒精溶液、70-80vt％的酒精溶液和95vt％的酒精溶液依次洗涤，滤渣真空干燥后获得壳多糖衍生物。
2.如权利要求1所述的一种壳多糖衍生物的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述预处理后的甲壳素水分含量<1.5％；其灰分含量<0.5％。
3.如权利要求1所述的一种壳多糖衍生物的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述壳多糖衍生物的脱乙酰度为45-75％，粘均分子量为3.77-10.64×104g/mol，灰分含量<0.05％，溶解度＞98g/L。
4.如权利要求1所述的一种壳多糖衍生物的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述甲壳素来源于虾壳和/或蟹壳，所述甲壳素的制备方法为：将虾壳和/或蟹壳水洗除杂后，加盐酸浸酸脱钙，水洗后加稀碱，煮碱脱脂脱蛋白，随后水洗再加酸二次浸酸脱钙，再水洗后加稀碱，二次煮碱脱脂脱蛋白，水洗后获得所述甲壳素。
5.如权利要求1所述的一种壳多糖衍生物的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，酸为醋酸、甲酸、盐酸、硫酸、磷酸、多聚磷酸、草酸、乳酸、柠檬酸中的一种或多种。
6.如权利要求1所述的一种壳多糖衍生物的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，将甲壳素粉碎至100-200目，加入第一份水、试剂A，在200-400rpm转速下搅拌6-12h，过滤并水洗至pH为6.8-7.2，加入第二份水、试剂B、碱性盐、试剂C，在200-400rpm转速下搅拌2-4h，在-10～-20℃温度下冷冻24-48h，水洗至pH为6.8-7.2，在75-90℃温度下水浴烘干，得到预处理后的甲壳素。
7.如权利要求1所述的一种壳多糖衍生物的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，在所述预处理后的甲壳素中加入水，搅拌均匀，加入甲壳素酶，升温至30-45℃，搅拌酶解8-16h；酶解结束后，升温至95-100℃，搅拌15-30min，降至室温获得甲壳素酶解液，所述甲壳素、水与甲壳素酶的质量比为10:(50-100):(1-5)。
8.如权利要求1所述的一种壳多糖衍生物的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，在所述甲壳素酶解液加入所述预处理后的甲壳素质量50％-80％的酸，过滤收集滤液，即为粗壳多糖衍生物；
在步骤(4)中，在粗壳多糖衍生物溶液中加入所述预处理后的甲壳素质量100-200％的55-65vt％浓度酒精，加碱调节pH至8.5-9.5；过滤后滤渣分别用水、15-25vt％的酒精溶液、45-55vt％的酒精溶液、70-80vt％的酒精溶液和95vt％的酒精溶液依次洗涤，滤渣真空干燥后获得壳多糖衍生物。
9.一种采用如权利要求1-8任一所述的制备方法获得的壳多糖衍生物。
10.一种如权利要求9所述的壳多糖衍生物在制备头发洗护产品中的应用。
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