CN115572757A - 一种恒温扩增结合胶体金免疫层析法检测病毒或细菌的试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种恒温扩增结合胶体金免疫层析法检测病毒或细菌的试剂盒，包括试纸条和试剂，所述试剂扩增反应液和样本稀释液，所述试纸条包括胶条以及位于胶条内的反应层，所述反应层包括PVC背板以及依次设置于所述PVC背板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述硝酸纤维素膜上平行间隔设置检测线和质控线，所述胶体靠近所述样品垫的一端设置有反应杯，所述反应杯内含有冻干粉，所述反应杯内壁上设置有具有恒温加热功能的恒温层，还包括用于将反应杯底部戳破的加样控制组件。本发明的试剂盒及利用该试剂盒的检测方法，能够简便、快速、准确检测病毒或细菌，完全摆脱对设备的依赖，可用于现场检测，具有很大的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及快速检测领域，具体涉及一种恒温扩增结合胶体金免疫层析法检测病毒或细菌的试剂盒及其检测方法。
背景技术
致病病毒或细菌进入水体或土壤，某些病毒或细菌大量繁殖，致使水体恶化，土壤污染，直接或间接危害人类健康或影响生态系统。因此，建立一种快速、便携、准确、特异性和灵敏度高的能够现场检测的检测方法对防治病毒或细菌污染具有重大作用。
病毒检测通常有三种手段：全基因测序、核酸检测、免疫蛋白检测，但上述检测方法价格昂贵，不便捷，不适用于室外，如海关、普通诊所等场所；细菌检测中的培养法作为病原细菌检测的金标准，具有特异性高的显著优势，但却具有耗时长、费用大、培养难度高、通量低、灵敏度低等一系列缺点，很难满足临床实际需求。
恒温扩增方法可以在恒定的温度下发生反应，无需普通的PCR需要进行多个升温和降温循环，因此应用恒温扩增技术检测病毒或细菌，简单的数字水浴锅可以取代昂贵的PCR仪，大大降低了检测成本；胶体金免疫层析技术是将特异性的抗原或抗体以条带状固定在NC膜上形成检测线(T线)、质控线(C线)，胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上，使用胶体金免疫层析技术，能够快速发生免疫反应并形成肉眼可观察的显色结果，该技术操作简单快速，结果容易判定，无需复杂的仪器和专业的技术人员，具有很强的现场应用价值。现有的将上述两种方法联用的试剂盒中，胶体金试纸条与恒温扩增方法的试剂分开包装，使用时恒温扩增方法仍需使用水浴锅，未能真正摆脱设备的使用。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种恒温扩增结合胶体金免疫层析法检测病毒或细菌的试剂盒及其检测方法，能够快速、准确、灵敏检测病毒或细菌，且完全摆脱对设备的依赖，可用于现场检测。
本发明提供一种恒温扩增结合胶体金免疫层析法检测病毒或细菌的试剂盒，包括试纸条和试剂，所述试剂扩增反应液和样本稀释液，所述试纸条包括胶条以及位于所述胶条内的反应层，所述反应层包括PVC背板以及依次设置于所述 PVC背板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸在相邻处重叠设置，所述硝酸纤维素膜上平行间隔设置检测线(T线)和质控线(C线)，所述检测线和质控线所在的方向与所述PVC 背板的长度方向相垂直，所述胶体靠近所述样品垫的一端设置有反应杯，所述反应杯内含有冻干粉，所述反应杯内壁上设置有具有恒温加热功能的恒温层，还包括用于将反应杯底部戳破的加样控制组件。
进一步的，所述冻干粉包括解旋酶、重组酶、聚合酶、扩增引物、扩增探针、镁盐(氯化镁或硫酸镁)等，所述扩增引物使用Biotin(生物素)修饰，所述扩增探针的两端分别由FITC或FAM和3’Block修饰，所述结合垫包被有金标抗体，所述金标抗体由纳米金粒子和能与所述FITC结合的Anti-FITC抗体或能与FAM结合的Anti-FAM抗体结合而制得，检测线包被有能与Biotin结合的生物素配体，所述质控线包被有能与金标抗体结合的二抗抗体。
进一步的，所述反应杯包括设置于胶条上的环形件以及设置于所述环形件底部的封口膜，所述恒温层设置于所述环形件的内壁，所述加样控制件包括具有尖端的第一戳破件以及与所述第一戳破件相连的插接件，所述环形件和恒温层开设有供所述插接件穿过的穿过孔，所述第一戳破件的尖端与所述封口膜相对，扩增反应完成后，可通过对插接件施加向胶条方向的力，则带动第一戳破件相应向封口膜运动直至将封口膜戳破，之后含有扩增产物的液体则可顺利流至反应层。
进一步的，所述第一戳破件包括具有尖端的尖端部和与尖端部相连的流出部，所述尖端部的尖端与所述封口膜相对，所述流出部在所述胶条所在平面上的投影位于所述尖端部在所述胶条所在平面上的投影之内，如此尖端部将封口膜戳破后可继续运动至流出部位于戳破的加样孔处，流出部与加样孔之间具有间隙，如此含有扩增产物的液体则可顺利流至反应层。
进一步的，还包括隔离盖，所述隔离盖与所述环形件顶部的外壁螺纹连接，隔离盖可使反应杯进行扩增反应时其内部与外界隔离，防止污染。
进一步的，还包括灭菌组件，所述灭菌组件包括试剂腔、开设于所述隔离盖上的第一通孔、与所述第一通孔活动配合的按压件以及具有尖端的第二戳破件，所述试剂腔内装有灭菌剂，按压所述按压件时，所述第二戳破件将所述灭菌腔戳破而使灭菌剂流出流至反应层，如此可在层析完成显色后对反应杯和反应层进行无害化处理，减少病毒或细菌的核酸对人和环境的污染，安全性更高。
进一步的，所述试剂腔成型于所述按压件内，还包括与所述隔离盖平面部分的底部相连的连接件，所述第二戳破件与所述连接件的顶部相连，所述第二戳破件位于所述按压件的下方，按压按压件时，带动试剂腔运动直至第二戳破的尖端与其接触，继续按压使尖端戳破试剂腔，而使试剂腔内的灭菌剂流出。
进一步的，所述试剂腔包括与所述隔离盖平面部分的底部相连的筒部以及与筒部底部相连的膜部，所述第二戳破件与所述按压件的底部相连，按压按压件时，带动第二戳破件运动直至第二戳破件的尖端与试剂腔的膜部相接触，继续按压使尖端戳破试剂腔，而使试剂腔内的灭菌剂流出。
进一步的，所述灭菌组件还包括复位弹簧，所述复位弹簧绕设于所述按压件上，所述复位弹簧的两端分别与所述按压件和所述隔离盖平面部分的顶部相连，按压按压件后，复位弹簧受压缩，对按压件不施加压力，则受压缩的复位弹簧对按压件施加力而使其自动复位，第二戳破件的尖端与戳破处保持一定距离而使尖端对戳破处无阻挡而使试剂腔内的灭菌剂顺利流出。
本发明还提供一种恒温扩增结合胶体金免疫层析法检测病毒或细菌的试剂盒，使用如上述的恒温扩增结合胶体金免疫层析法检测病毒或细菌的试剂盒进行检测，包括以下步骤：
S1，拧开所述隔离盖，在反应杯内加入样本，之后加入扩增反应液，拧上所述隔离盖恒温扩增30分钟；
S2，拧开所述隔离盖，加入样本稀释液，拧上所述隔离盖，按下所述环形件外的插接件，插接件带动第一戳破件戳破所述封口膜形成加样孔，所述反应杯内的液体由所述加样孔流向反应层，反应15分钟后，判读结果；
S3，判读结果后，按压按压件，带动第二锥形件戳破所述膜部或试剂腔的底部，灭菌剂从戳破处流出流至反应层对其进行灭菌消毒；
所述判读结果具体为：若所述检测线和所述质控线出现带色的条带，结果为阳性；若所述检测线未出现带色的条带，所述质控线出现带色的条带，结果为阴性；若质控线未出现带色的条带，说明试剂盒失效或样本量不足。
与现有技术相比，本发明的有益效果表现为：
1、本发明提供一种恒温扩增结合胶体金免疫层析法检测病毒或细菌的试剂盒及利用该试剂盒对病毒或细菌进行检测的检测方法，能够简便、快速、准确检测病毒或细菌，不需要使用昂贵的仪器设备，完全摆脱对设备的依赖，可用于现场检测，对检测环境要求极低，可推广在条件简陋的实验室，基层医院，甚至海关、家庭等日常活动场合中使用，因此具有很大的应用价值。
2、使用本发明提供的试剂盒检测病毒或细菌，操作十分简便，使用时仅需将样本加入反应杯中即可，之后相应地进行拧开、拧紧隔离盖以及按压加样控制组件即可，且结果可直接进行肉眼判读，傻瓜式操作，对操作人员的要求极低，适合高中低等级医院、临床可推广性高，甚至普通人也可购置后自行进行检测，企业方面无需对操作人员进行较多的实操培训，也可减少企业培训成本；
3、本发明提供的试剂盒设置了灭菌组件，在结果判断完成后，进行简单地按压操作即可对病毒或细菌进行无害化灭菌处理，一方面减少其对环境的污染，另一方面能够避免对操作人员的安全危害，从而使该试剂盒的安全性更高，使其更适用于在条件简陋的实验室，基层医院，甚至海关、家庭等日常活动场合中使用，也填补了目前临床对于病毒或细菌恒温扩增-胶体金检测后快速灭菌这一空白领域；
4、使用本发明提供的试剂盒检测病毒或细菌，检测结果重复性好，精密度高，检测时间周期短，恒温扩增只需要30分钟，胶体金判读结果只需要15分钟，最快能在70分钟内完成检测，极大地节约了检测时间，能够加快临床诊断效率；且使用恒温扩增技术也避免了高温对酶的损耗，并且在体系中不需要加入过量的引物，降低了引物与模板错配或生成引物二聚体的可能性；传统胶体金免疫层析法检测对Ct值为27的病毒或细菌才能判断阳性，而使用本发明提供的试剂盒可以对Ct值为30的病毒或细菌也能判断出阳性，灵敏度更高，使临床诊断更准确。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例的描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为试纸条的整体结构示意图；
图2为试纸条的一结构剖视图；
图3是图2中A处的放大图；
图4为试纸条的另一结构剖视图；
图5为图4中B处的放大图；
图6为胶条、反应杯的结构示意图；
图7为图6中C处的放大图；
图8为隔离盖的一结构示意图；
图9为隔离盖的另一结构示意图；
图10为反应层的示意图。
图中，1、胶条；2、反应层；3、反应杯；3a、环形件；3b、封口膜；4、恒温层；5、加样控制组件；5a、第一戳破件；5a1、尖端部；5a2、流出部；5b、插接件；6、穿过孔；7、隔离盖；8、灭菌组件；8a、试剂腔；8a1、筒部；8a2、膜部；8b、第一通孔；8c、按压件；8d、第二戳破件；8e、复位弹簧；9、连接件。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例及附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，未详细描述的技术均按照本领域人员熟知的标准方法进行。
本发明实施例提供一种恒温扩增结合胶体金免疫层析法检测病毒或细菌的试剂盒，参考图1至图10，包括试纸条和试剂，所述试剂扩增反应液和样本稀释液，所述试纸条包括胶条1以及位于所述胶条1内的反应层2，所述反应层2 包括PVC背板以及依次设置于所述PVC背板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸在相邻处重叠设置，所述硝酸纤维素膜上平行间隔设置检测线(T线)和质控线(C线)，所述检测线和质控线所在的方向与所述PVC背板的长度方向相垂直，所述胶体靠近所述样品垫的一端设置有反应杯3，所述反应杯3内含有冻干粉，所述反应杯3内壁上设置有具有恒温加热功能的恒温层4，还包括用于将反应杯3底部戳破的加样控制组件5。
具体地，所述恒温层4的主要成分有碳粉、氯化钠固体、三氧化二铁固体以及含镁铝的盐类，利用铁氧化反应放热来发热的。实际上也就是根据铁在潮湿空气中发生吸氧腐蚀的原理。同时利用活性炭的强吸附性，在活性炭的疏松结构中储有水蒸气，水蒸气液化成水滴，流出与空气和铁粉接触，在氯化钠的催化作用下较为迅速的发生反应生成氢氧化铁，放出热量。该恒温层4的作用可对加入反应杯3的样本、扩增反应液和冻干粉进行加热并保持恒温，使其相应进行恒温扩增反应，无需额外使用水浴锅和反应容器。扩增完成后加入样本稀释液使其更易在反应层上层析移动。
加样控制组件5可在扩增反应完成后将反应杯3底部戳破，从而使扩增后含有扩增产物的液体流至反应层2进行层析反应，无需额外使用其他加样工具。
具体地，所述扩增反应液包括Tris-HCl(pH 8.0)、15％DMSO、DTT以及扩增所需的dNTP。
具体地，所述冻干粉包括解旋酶、重组酶、聚合酶、扩增引物、扩增探针、镁盐(氯化镁或硫酸镁)等，所述扩增引物使用Biotin(生物素)修饰，所述扩增探针的两端分别由FITC(异硫氰酸荧光素)或FAM(羧基荧光素)和3’ Block修饰，所述结合垫包被有金标抗体，所述金标抗体由纳米金粒子和能与所述FITC结合的Anti-FITC抗体或能与FAM结合的Anti-FAM抗体结合而制得，检测线包被有能与Biotin结合的生物素配体，所述质控线包被有能与金标抗体结合的二抗抗体。
使用时，若样品中含有目标病毒或细菌的核酸，经恒温扩增后，扩增产物的两端分别带有FITC或FAM和Biotin，则扩增产物经结合垫后，FITC或FAM 与金标抗体上的Anti-FITC抗体或Anti-FAM抗体结合，结合有金标抗体的扩增产物移动至检测线，扩增产物另一端的Biotin与检测线上的生物素配体结合，金标抗体在检测线出聚集，形成肉眼可见的条带而显色；若样品中不含目标病毒或细菌的核酸，经恒温扩增后，不产生两端分别带有FITC或FAM和Biotin 的扩增产物，则检测线不显色；无论样品中是否含有目标病毒或细菌的核酸，质控线中的金标抗体都与与二抗抗体结合而显色，若质控线若无颜色，证明试剂盒失效或样本量不足。
具体地，所述生物素配体为链霉亲和素或亲和素。
参考图3或图5或图7，所述反应杯3包括设置于胶条1上的环形件3a以及设置于所述环形件3a底部的封口膜3b，所述恒温层4设置于所述环形件3a 的内壁，所述加样控制件包括具有尖端的第一戳破件5a以及与所述第一戳破件 5a相连的插接件5b，所述环形件3a和恒温层4开设有供所述插接件5b穿过的穿过孔6，所述第一戳破件5a的尖端与所述封口膜3b相对，扩增反应完成后，可通过对插接件5b施加向胶条1方向的力，则带动第一戳破件5a相应向封口膜3b运动直至将封口膜3b戳破，之后含有扩增产物的液体则可顺利流至反应层2。
具体地，所述封口膜3b的材质为塑料。
参考图3或图5或图7，所述第一戳破件5a包括具有尖端的尖端部5a1和与尖端部5a1相连的流出部5a2，所述尖端部5a1的尖端与所述封口膜3b相对，所述流出部5a2在所述胶条1所在平面上的投影位于所述尖端部5a1在所述胶条1所在平面上的投影之内，如此尖端部5a1将封口膜3b戳破后可继续运动至流出部5a2位于戳破的加样孔处，流出部5a2与加样孔之间具有间隙，如此含有扩增产物的液体则可顺利流至反应层2。
参考图3或图5，还包括隔离盖7，所述隔离盖7与所述环形件3a顶部的外壁螺纹连接，隔离盖7可使反应杯3进行扩增反应时其内部与外界隔离，防止污染。
参考图3或图5，还包括灭菌组件8，所述灭菌组件8包括试剂腔8a、开设于所述隔离盖7上的第一通孔8b、与所述第一通孔8b活动配合的按压件8c 以及具有尖端的第二戳破件8d，所述试剂腔8a内装有灭菌剂，按压所述按压件8c时，所述第二戳破件8d将所述灭菌腔戳破而使灭菌剂流出流至反应层2，如此可在层析完成显色后对反应杯3和反应层2进行无害化处理，减少病毒或细菌的核酸对人和环境的污染，安全性更高。
灭菌组件8有两种结构，一种结构为，参考图3、图4和图8，所述试剂腔 8a成型于所述按压件8c内，还包括与所述隔离盖7平面部分的底部相连的连接件9，所述第二戳破件8d与所述连接件9的顶部相连，所述第二戳破件8d 位于所述按压件8c的下方，按压按压件8c时，带动试剂腔8a运动直至第二戳破的尖端与其接触，继续按压使尖端戳破试剂腔8a，而使试剂腔8a内的灭菌剂流出。
另一结构为，参考图5、图6和图9，所述试剂腔8a包括与所述隔离盖7 平面部分的底部相连的筒部8a1以及与筒部8a1底部相连的膜部8a2，所述第二戳破件8d与所述按压件8c的底部相连，按压按压件8c时，带动第二戳破件 8d运动直至第二戳破件8d的尖端与试剂腔8a的膜部8a2相接触，继续按压使尖端戳破试剂腔8a，而使试剂腔8a内的灭菌剂流出。
具体地，所述膜部8a2的材质为塑料。
参考图8和图9，所述灭菌组件8还包括复位弹簧8e，所述复位弹簧8e 绕设于所述按压件8c上，所述复位弹簧8e的两端分别与所述按压件8c和所述隔离盖7平面部分的顶部相连，按压按压件8c后，复位弹簧8e受压缩，对按压件8c不施加压力，则受压缩的复位弹簧8e对按压件8c施加力而使其自动复位，第二戳破件8d的尖端与戳破处保持一定距离而使尖端对戳破处无阻挡而使试剂腔8a内的灭菌剂顺利流出。
可选地，所述灭菌组件8也可对应设置于所述胶条1靠近所述反应杯3的一端，具体结构可同上，胶条1内对应开设有与试剂腔8a和反应层2相连通的孔道，如此按压所述按压件8c时，所述第二戳破件8d将所述试剂腔8a戳破而使灭菌剂流出后可由孔道流至反应层2。
具体地，所述结合垫的材质为玻璃纤维素膜。
具体地，所述灭菌剂为过氧化氢银离子消毒液、乙醇、碘和碘伏、过氧化氢和过氧乙酸的中的一种或多种任意组合物。
本发明实施例还提供一种恒温扩增结合胶体金免疫层析法检测病毒或细菌的试剂盒，使用如上述的恒温扩增结合胶体金免疫层析法检测病毒或细菌的试剂盒进行检测，包括以下步骤：
S1，拧开所述隔离盖7，在反应杯3内加入样本，之后加入扩增反应液，拧上所述隔离盖7恒温扩增30分钟；
S2，拧开所述隔离盖7，加入样本稀释液，拧上所述隔离盖7，按下所述环形件3a外的插接件5b，插接件5b带动第一戳破件5a戳破所述封口膜3b形成加样孔，所述反应杯3内的液体由所述加样孔流向反应层2，反应15分钟后，判读结果；
S3，判读结果后，按压按压件8c，带动第二锥形件戳破所述膜部8a2或试剂腔8a的底部，灭菌剂从戳破处流出流至反应层2对其进行灭菌消毒，
所述判读结果具体为：若所述检测线和所述质控线出现带色的条带，结果为阳性；若所述检测线未出现带色的条带，所述质控线出现带色的条带，结果为阴性；若质控线未出现带色的条带，说明样本量不足。
以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
实施例1
使用本发明提供的恒温扩增结合胶体金免疫层析法检测病毒或细菌的试剂盒，分别检测新型冠状病毒的临床临界阳性样本10例，具体步骤为见上述操作。
分别与qPCR和普通的胶体金免疫层析法(第一对比试剂)结果作对比，结果如下表：
实验结果
由上表可知，对临床阳性样本10例，qPCR结果都为阳性，第一对比试剂结果为4例阳性结果，使用本发明的试剂盒检测结果为10例阳性，第一对比试剂在Ct值为27才能判断阳，容易造成漏检，影响患者及时就医，而本发明的恒温扩增结合胶体金免疫层析法检测试剂检测结果与qPCR检测结果具有高度的一致性，说明使用本发明的试剂盒检测，检测结果准确、灵敏度高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种恒温扩增结合胶体金免疫层析法检测病毒或细菌的试剂盒，其特征在于，包括试纸条和试剂，所述试剂包括扩增反应液和样本稀释液，所述试纸条包括胶条(1)以及位于所述胶条(1)内的反应层(2)，所述反应层(2)包括PVC背板以及依次设置于所述PVC背板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸在相邻处重叠设置，所述硝酸纤维素膜上平行间隔设置检测线和质控线，所述检测线和质控线所在的方向与所述PVC背板的长度方向相垂直，所述胶条(1)靠近所述样品垫的一端设置有反应杯(3)，所述反应杯(3)内含有冻干粉，所述反应杯(3)内壁上设置有具有恒温加热功能的恒温层(4)，还包括用于将反应杯(3)底部戳破的加样控制组件(5)。
2.如权利要求1所述的恒温扩增结合胶体金免疫层析法检测病毒或细菌的试剂盒，其特征在于，所述冻干粉包括解旋酶、重组酶、聚合酶、扩增引物、扩增探针和镁盐，所述扩增引物使用Biotin修饰，所述扩增探针的两端分别由FITC或FAM和3’Block修饰，所述结合垫包被有金标抗体，所述金标抗体由纳米金粒子和能与所述FITC结合的Anti-FITC抗体或能与FAM结合的Anti-FAM抗体结合而制得，检测线包被有能与Biotin结合的生物素配体，所述质控线包被有能与金标抗体结合的二抗抗体。
3.如权利要求2所述的恒温扩增结合胶体金免疫层析法检测病毒或细菌的试剂盒，其特征在于，所述反应杯(3)包括设置于胶条(1)上的环形件(3a)以及设置于所述环形件(3a)底部的封口膜(3b)，所述恒温层(4)设置于所述环形件(3a)的内壁，所述加样控制件包括具有尖端的第一戳破件(5a)以及与所述第一戳破件(5a)相连的插接件(5b)，所述环形件(3a)和恒温层(4)开设有供所述插接件(5b)穿过的穿过孔(6)，所述第一戳破件(5a)的尖端与所述封口膜(3b)相对。
4.如权利要求3所述的恒温扩增结合胶体金免疫层析法检测病毒或细菌的试剂盒，其特征在于，所述第一戳破件(5a)包括具有尖端的尖端部(5a1)和与尖端部(5a1)相连的流出部(5a2)，所述尖端部(5a1)的尖端与所述封口膜(3b)相对，所述流出部(5a2)在所述胶条(1)所在平面上的投影位于所述尖端部(5a1)在所述胶条(1)所在平面上的投影之内。
5.如权利要求4所述的恒温扩增结合胶体金免疫层析法检测病毒或细菌的试剂盒，其特征在于，还包括隔离盖(7)，所述隔离盖(7)与所述环形件(3a)顶部的外壁螺纹连接。
6.如权利要求5所述的恒温扩增结合胶体金免疫层析法检测病毒或细菌的试剂盒，其特征在于，还包括灭菌组件(8)，所述灭菌组件(8)包括试剂腔(8a)、开设于所述隔离盖(7)上的第一通孔(8b)、与所述第一通孔(8b)活动配合的按压件(8c)以及具有尖端的第二戳破件(8d)，所述试剂腔(8a)内装有灭菌剂，按压所述按压件(8c)时，所述第二戳破件(8d)将所述灭菌腔戳破而使灭菌剂流出流至反应层(2)。
7.如权利要求6所述的恒温扩增结合胶体金免疫层析法检测病毒或细菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂腔(8a)成型于所述按压件(8c)内，还包括与所述隔离盖(7)平面部分的底部相连的连接件(9)，所述第二戳破件(8d)与所述连接件(9)的顶部相连，所述第二戳破件(8d)位于所述按压件(8c)的下方。
8.如权利要求6所述的恒温扩增结合胶体金免疫层析法检测病毒或细菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂腔(8a)包括与所述隔离盖(7)平面部分的底部相连的筒部(8a1)以及与筒部(8a1)底部相连的膜部(8a2)，所述第二戳破件(8d)与所述按压件(8c)的底部相连。
9.如权利要求6-8任一所述的恒温扩增结合胶体金免疫层析法检测病毒或细菌的试剂盒，其特征在于，所述灭菌组件(8)还包括复位弹簧(8e)，所述复位弹簧(8e)绕设于所述按压件(8c)上，所述复位弹簧(8e)的两端分别与所述按压件(8c)和所述隔离盖(7)平面部分的顶部相连。
10.一种恒温扩增结合胶体金免疫层析法检测病毒或细菌的检测方法，其特征在于，使用如权利要求9所述的恒温扩增结合胶体金免疫层析法检测病毒或细菌的试剂盒进行检测，包括以下步骤：
S1，拧开所述隔离盖(7)，在反应杯(3)内加入样本，之后加入扩增反应液，拧上所述隔离盖(7)恒温扩增30分钟；
S2，拧开所述隔离盖(7)，加入样本稀释液，拧上所述隔离盖(7)，按下所述环形件(3a)外的插接件(5b)，插接件(5b)带动第一戳破件(5a)戳破所述封口膜(3b)形成加样孔，所述反应杯(3)内的液体由所述加样孔流向反应层(2)，反应15分钟后，判读结果；
S3，判读结果后，按压按压件(8c)，带动第二锥形件戳破所述膜部(8a2)或试剂腔(8a)的底部，灭菌剂从戳破处流出流至反应层(2)对其进行灭菌消毒；
所述判读结果具体为：若所述检测线和所述质控线出现带色的条带，结果为阳性；若所述检测线未出现带色的条带，所述质控线出现带色的条带，结果为阴性；若质控线未出现带色的条带，说明样本量不足。
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