CN115568477B - 一种防治芝麻枯萎病的复合药剂及其应用 - Google Patents

一种防治芝麻枯萎病的复合药剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种防治芝麻枯萎病的复合药剂及其应用，涉及生物技术领域。该复合药剂包括一种防治芝麻枯萎病的组合物，该组合物的有效成分包括莱哈衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)胞内提取物和萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus Nakamura)胞内提取物。本发明将莱哈衣藻胞内提取物和萎缩芽孢杆菌胞内提取物联用，制备得到一种防治芝麻枯萎病的复合药剂，利用莱哈衣藻胞内提取物来消除氧自由基，阻断了尖孢镰刀菌的增殖，从而加速了萎缩芽孢杆菌胞内提取物抗菌作用的发挥，有效防治了芝麻枯萎病，防治效果达到了90.9％。

Description

一种防治芝麻枯萎病的复合药剂及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种防治芝麻枯萎病的复合药剂及其应用。
背景技术
芝麻枯萎病病原为尖孢镰刀菌芝麻专化型(Fusarium oxysporum f.sp.sesami)，属半知菌亚门真菌。植株感染尖孢镰刀菌后，会导致维管束萎缩、植株叶片退绿、球茎和根枯萎腐烂等症状。尖孢镰刀菌在作物的全生育期均可感染其发病，植株被感染后，病原菌以菌丝或厚垣孢子的形式分布在土层中，成为来年发病的感染源，且随着连作年份的增加，该地块病原菌的浓度逐渐增大，发病率会越来越严重。没有寄主的情况下，病原菌也可在土壤中存活6年以上，给枯萎病的防治工作带来很大的挑战。
开发一种微生物源的复合药剂，用于防治芝麻枯萎病，对芝麻种植业的可持续健康发展具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种防治芝麻枯萎病的复合药剂及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的复合药剂可以有效防治芝麻枯萎病。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种防治芝麻枯萎病的组合物，有效成分包括莱哈衣藻胞内提取物和萎缩芽孢杆菌胞内提取物。
进一步地，所述莱哈衣藻胞内提取物和所述萎缩芽孢杆菌胞内提取物的质量比为1：1。
进一步地，所述莱哈衣藻胞内提取物或所述萎缩芽孢杆菌胞内提取物的提取方法包括：将莱哈衣藻或萎缩芽孢杆菌发酵培养后，分离得到菌体，之后冻干，加入提取溶剂，超声破壁萃取，分离得到萃取液，再将所述萃取液冻干，得到所述莱哈衣藻胞内提取物或所述萎缩芽孢杆菌胞内提取物。
进一步地，所述莱哈衣藻的发酵培养条件为：温度25℃，光照50μEm-2s-1，光暗比12h：12h，培养时间5天；所述萎缩芽孢杆菌的发酵培养条件为：温度37℃，培养时间2天。
进一步地，所述提取溶剂为体积分数为75％的乙醇水溶液。
进一步地，所述超声破壁的功率为500W。
本发明还提供一种防治芝麻枯萎病的复合药剂，包括上述的组合物。
进一步地，所述复合药剂还包括药学上可接受的辅料。
进一步地，所述复合药剂的剂型包括可湿性粉剂、粉剂、乳油、悬浮剂、浓乳剂和缓释剂。
本发明还提供上述的组合物或复合药剂在防治芝麻枯萎病中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明将莱哈衣藻胞内提取物和萎缩芽孢杆菌胞内提取物联用，利用莱哈衣藻胞内提取物来消除氧自由基，阻断了尖孢镰刀菌的增殖，从而加速了萎缩芽孢杆菌胞内提取物抗菌作用的发挥，有效防治了芝麻枯萎病，防治效果达到了90.9％。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例中的尖孢镰刀菌芝麻专化型(Fusarium oxysporum f.sp.sesami)菌株由河南省农业科学院芝麻研究中心提供，莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)GY-D55购自上海光语生物科技有限公司；莱哈衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)和萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus Nakamura)均购自中国工业微生物菌种保藏中心，菌株编号依次为bio-74897和bio-67656。
实施例1
1莱哈衣藻
1.1将莱哈衣藻接种于CHU-1l液体培养基，在25℃，光照50μEm-2s-1，光暗比12h：12h的条件下培养5天，离心获得沉淀。
1.2步骤1.1获得的沉淀冻干得到干粉，加入体积分数为75％的乙醇水溶液(干粉与乙醇水溶液的质量体积比为1：50)，超声破碎(500W)10min，之后搅拌萃取1h，10000r/min离心10min，弃去沉淀，得到上清，再用0.22μm过滤膜过滤，滤液冻干，得到莱哈衣藻胞内提取物。取莱哈衣藻胞内提取物，用无菌生理盐水配制成5g/L的药液A备用。
2.萎缩芽孢杆菌
2.1将萎缩芽孢杆菌接种于LB液体培养基，在37℃条件下培养2天，离心获得沉淀。
2.2步骤2.1获得的沉淀冻干得到干粉，加入体积分数为75％的乙醇水溶液(干粉与乙醇水溶液的质量体积比为1：50)，超声破碎(500W)10min，之后搅拌萃取1h，10000r/min离心10min，弃去沉淀，得到上清，再用0.22μm过滤膜过滤，滤液冻干，得到萎缩芽孢杆菌胞内提取物。取萎缩芽孢杆菌胞内提取物，用无菌生理盐水配制成5g/L的药液B备用。
3.取上述制备好的莱哈衣藻胞内提取物和萎缩芽孢杆菌胞内提取物，按照1：1的质量比混合，之后用无菌生理盐水配制成5g/L的药液C备用。
对比例1
同实施例1，区别在于，将莱哈衣藻替换为莱茵衣藻。取本对比例制备好的莱茵衣藻胞内提取物，用无菌生理盐水配制成5g/L的药液D备用。取本对比例制备好的莱茵衣藻胞内提取物和实施例1制备好的萎缩芽孢杆菌胞内提取物，按照1：1的质量比混合，之后加入无菌生理盐水配制成5g/L的药液E备用(即莱茵衣藻胞内提取物和萎缩芽孢杆菌胞内提取物在药液E中的浓度均为2.5g/L)。
抗氧化活性检测：
1.ABTS氧自由基清除能力测定
配制7.4mmol/L的ABTS溶液，用分析天平精确称取ABTS 3mg，加无水乙醇0.735mL；配制2.6mmol/L的K2S2O8，精确称取K2S2O8 1mg，加超纯水1.43mL；吸取等体积的7.4mmol/L的ABTS和2.6mmol/L的K2S2O8均匀混合后，黑暗放置12h后作为工作液备用。测定时，先将ABTS混合液用无水乙醇稀释40-50倍至其在734nm处的吸光度在0.7左右。之后取0.6mL微藻提取液与2.4mL稀释的ABTS混合，避光放置6min，测定其OD734。每个实验组重复三次，将所测得的三组实验结果取平均。ABTS氧自由基清除能力计算公式如下：
E＝[A0-(AS-AE)]/A0×100％ (1)
其中A0为稀释的ABTS与无水乙醇混合后的吸光度；AS为ABTS与微藻提取液混合后的吸光度；AE为样品液与无水乙醇混合后的吸光度。
2.DPPH氧自由基清除能力测定配置100μmol/L的DPPH工作液，用分析天平称取DPPH 1.97mg用无水乙醇溶解后定容至50mL，即得到100μmol/L的DPPH储液。吸取DPPH储液，用无水乙醇稀释至其在515nm处的吸光度处于0.2-0.8之间，做为DPPH工作液。取300μL微藻提取液与3mLDPPH工作液混合，避光反应30min后，测定其OD515，每组实验重复三次，实验结果取平均。DPPH氧自由基清除能力计算公式如公式(1)，区别在于将其中的ABTSA工作液替换为DPPH工作液。
经检测，实施例1制备的莱哈衣藻胞内提取物的ABTS氧自由基清除率为75.17％，DPPH氧自由基清除率为85.75％；对比例1制备的莱茵衣藻胞内提取物的ABTS氧自由基清除率为73.58％，DPPH氧自由基清除率为91.05％。
实施例2
采用菌丝生长速率法测定不同药剂(表1)对尖孢镰刀菌芝麻专化型菌丝生长的抑制作用。将尖孢镰刀菌芝麻专化型在PDA平板上培养7d后，自菌落边缘打取菌饼(直径5mm)，将菌饼接至含药平板中央，菌丝接触培养基，每处理重复3次，28℃培养，7d后用十字交叉法测量各处理的菌落直径，再减去菌柄直径0.5cm，得到最终菌落生长直径。按照下列公式计算抑制率。
抑制率＝(对照组菌落平均直径－处理组菌落平均直径)/对照组菌落平均直径×100％。
表1抑制率检测结果
组别 药液 抑制率
对照组 无菌生理盐水 /
实验组1 药液A 45.79％
实验组2 药液B 57.84％
实验组3 药液C 75.51％
实验组4 药液D 33.99％
实验组5 药液E 44.71％
从表1可以看出，本发明实施例1制备的莱哈衣藻胞内提取物和萎缩芽孢杆菌胞内提取物都对尖孢镰刀菌芝麻专化型表现出一定的抑制作用，当二者联用时，表现出增效作用，对尖孢镰刀菌芝麻专化型的抑制率达到了75.51％。
实施例3
取长势一致的健康芝麻幼苗700株，平均分成七组，每株喷施1mL尖孢镰刀菌芝麻专化型的孢子悬浮液(106CFU/mL)。1天后，按照表2所示，分别喷施药液，每株喷施2mL。喷施后，每3天观察发病情况，3周后统计发病率及防治效果，结果见表2。杀菌剂对病害的防治效果按公式(2)计算。
防治效果＝(对照组发病率-实验组发病率)/对照组发病率×100％ (2)
表2发病率统计结果
组别 药液 发病率 防治效果
对照组 无菌生理盐水 88％
实验组1 药液A 47％ 46.6％
实验组2 药液B 35％ 60.2％
实验组3 药液C 8％ 90.9％
实验组4 药液D 60％ 31.8％
实验组5 药液E 31％ 64.8％
从表2可以看出，莱哈衣藻胞内提取物和萎缩芽孢杆菌胞内提取物复配组成的药剂，对芝麻枯萎病具有非常高的防治效果。萎缩芽孢杆菌在生长和繁殖过程中会产生许多具有抑菌活性的代谢产物，如细菌素、伊枯草菌素、表面活性素、二磷酸硫胺素、几丁质酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、β-甘露聚糖酶和氨肽酶等。尖孢镰刀菌生长和繁殖过程中可以产生一些代谢物，一部分用于还原铁，一部分则参与氧化还原循环以产生过氧化氢，当过氧化氢遇到还原铁时，反应释放出大量氧自由基，破坏植物细胞壁，从而获得富含糖分的液体，用于尖孢镰刀菌的生长繁殖。本发明将莱哈衣藻胞内提取物和萎缩芽孢杆菌胞内提取物联用，利用莱哈衣藻胞内提取物来消除氧自由基，阻断了尖孢镰刀菌的增殖，从而加速了萎缩芽孢杆菌胞内提取物抗菌作用的发挥，有效防治了芝麻枯萎病。
同时，对比实验组3和实验组5的发病率和防治效果数据，可以看出，虽然莱茵衣藻胞内提取物的抗氧化活性同样很高，但其和萎缩芽孢杆菌胞内提取物的组合并未表现出较好的防治效果，这说明，莱哈衣藻胞内提取物和萎缩芽孢杆菌胞内提取物的组合具有一定的特殊性，我们推测，有可能是莱哈衣藻胞内提取物中含有某些特殊的抗菌物质，从而进一步增强了对尖孢镰刀菌的抑制作用。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种防治芝麻枯萎病的组合物，其特征在于，有效成分包括莱哈衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）胞内提取物和萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus Nakamura）胞内提取物；
所述莱哈衣藻和所述萎缩芽孢杆菌在中国工业微生物菌种保藏中心的菌株编号依次为bio-74897和bio-67656；
所述莱哈衣藻胞内提取物和所述萎缩芽孢杆菌胞内提取物的质量比为1：1；
所述莱哈衣藻胞内提取物或所述萎缩芽孢杆菌胞内提取物的提取方法包括：将莱哈衣藻或萎缩芽孢杆菌发酵培养后，分离得到菌体，之后冻干，加入提取溶剂，超声破壁萃取，分离得到萃取液，再将所述萃取液冻干，得到所述莱哈衣藻胞内提取物或所述萎缩芽孢杆菌胞内提取物；
所述提取溶剂为体积分数为75%的乙醇水溶液。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述莱哈衣藻的发酵培养条件为：温度25℃，光照50 μEm-2s-1，光暗比12 h：12 h，培养时间5天；所述萎缩芽孢杆菌的发酵培养条件为：温度37℃，培养时间2天。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述超声破壁的功率为500W。
4.一种防治芝麻枯萎病的复合药剂，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的组合物。
5.根据权利要求4所述的复合药剂，其特征在于，所述复合药剂还包括药学上可接受的辅料。
6.根据权利要求5所述的复合药剂，其特征在于，所述复合药剂的剂型包括可湿性粉剂、粉剂、乳油、悬浮剂、浓乳剂和缓释剂。
7.一种如权利要求1-3任一项所述的组合物或权利要求4-6任一项所述的复合药剂在防治芝麻枯萎病中的应用。
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