CN115568281A - 一种含有咪唑啉衍生物化合物作为有效成分的用于治疗黄斑变性的药物组合物 - Google Patents

一种含有咪唑啉衍生物化合物作为有效成分的用于治疗黄斑变性的药物组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种含有咪唑啉衍生物化合物作为有效成分的用于治疗黄斑变性的药物组合物，根据含有根据本发明一方面的咪唑啉衍生物化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分的组合物具有可有效用于预防和/或治疗黄斑变性的效果，因为其可以通过选择性杀死衰老细胞来减少玻璃疣和黄斑萎缩。

Description

一种含有咪唑啉衍生物化合物作为有效成分的用于治疗黄斑 变性的药物组合物
技术领域
本发明涉及一种含有咪唑啉衍生物化合物作为有效成分的用于治疗黄斑变性的药物组合物。
背景技术
正常视力在光线进入眼睛前部时出现，其使用晶状体聚焦在眼睛后部内侧排列的感光细胞(photoreceptors)上，所述感光细胞为一种非常敏感和脆弱的细胞。感光细胞与其他神经细胞(neurons)一起构成眼睛的视网膜。黄斑(macula)为位于眼睛后部中心附近的视网膜的一部分，其包括负责清晰中心视力的中心凹(fovea)。位于眼睛内视网膜中央部的神经组织被称为黄斑，大部分对光刺激作出反应的视细胞都聚集在这里，并且成物体像的地方也是黄斑的中心，从而其在视力中起着非常重要的作用。
由于各种原因，视网膜可以发生各种疾病，例如视网膜炎、黄斑变性、糖尿病性视网膜症、黄斑水肿、视网膜损伤、青光眼、视神经病症、视网膜血管疾病、眼血管疾病、青光眼等，尤其，因各种原因引起黄斑部(视网膜色素上皮和布鲁赫膜(Bruch's membrane)以及脉络膜(choroid)毛细血管复合体)发生变性导致视力障碍的眼科疾病称为黄斑变性(症)，黄斑变性与青光眼和糖尿病视网膜疾病一起被称为三大失明疾病。这种黄斑变性会影响中心视力以使视野中心模糊，并且由于中心暗点、变视症(物像出现扭曲变形的症状)或局部视力丧失，可能导致难以进行复杂的活动，例如阅读、驾驶等，这是一种非常严重的疾病，在严重的情况下会导致失明。
导致黄斑变性的最具代表性的原因是年龄增长，除此之外，已知其与家族史、种族、吸烟等有一定的相关性。尤其，老年性(退行性)黄斑变性(AMD，age-related maculardegeneration)长期以来一直是西方社会55岁以上老年人最常见的致盲疾病，并且在美国，它是致老年人失明的第一大眼病，而在韩国，随着人口老龄化的迅速发展，患者人数也在显着增加。预计这是西方化的饮食习惯和由于臭氧层破坏导致紫外线照射增加的结果。尤其，黄斑变性原本为一种主要在老年人中发生的疾病，但近年来，在韩国，发病年龄段从60岁段向40至50岁段的中老年人逐渐降低，中老年人的发病率近年来也迅速上升。
黄斑变性大致可分为干性和湿性两种类型，约90％的黄斑变性患者为干性黄斑变性患者。作为黄斑变性的一种形式，干性黄斑变性归类为萎缩性(非渗出性)并称为地理性萎缩(geographical atrophy)，是一种玻璃疣(drusen)在视网膜下水平沉积在视网膜上的早期疾病。这种玻璃疣的沉积可以导致黄斑组织的衰老或薄膜化。由于这种玻璃疣沉积，中心视力的损害可能会逐渐发展。通常，老年性黄斑变性与干性黄斑变性一起开始。干性黄斑变性的特征在于，早期没有症状，自我诊断困难，虽然其进展缓慢且失明的风险相对较低，但由于干性黄斑变性没有成熟的治疗方法，因此需要进一步强调预防的必要性。
现有技术文献
专利文献
(专利文献1)韩国注册专利10-2050506
发明内容
技术问题
本发明一方面提供一种用于预防或治疗黄斑变性的药物组合物，其含有由以下化学式1所示的咪唑啉衍生物化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分。
【化学式1】
Figure BDA0003276696860000031
其中，R1至R3各自独立地为H、C1至C10烷基、C2至C10烯基、C2至C10炔基或C1至C10烷氧基，X1和X2各自独立地为卤素。
本发明另一方面提供一种用于预防或治疗黄斑变性的药物组合物，其含有所述咪唑啉衍生物化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分，并且所述咪唑啉衍生物化合物与抗氧化剂联合施用。
本发明另一方面提供一种用于预防或改善黄斑变性的保健功能食品，其含有由所述化学式1所示的咪唑啉衍生物化合物或其盐作为有效成分。
本发明另一方面还提供一种用于预防或治疗黄斑变性的方法，其包括：向有需要的受试者施用由以下化学式1所示的的咪唑啉衍生物化合物或其药学上可接受的盐。
【化学式1】
Figure BDA0003276696860000041
其中，R1至R3各自独立地为H、C1至C10烷基、C2至C10烯基、C2至C10炔基或C1至C10烷氧基，X1和X2各自独立地为卤素。
本发明另一方面还提供一种由以下化学式1所示的咪唑啉衍生物化合物或其药学上可接受的盐在制备预防或治疗黄斑变性的药物中的用途。
【化学式1】
Figure BDA0003276696860000042
其中，R1至R3各自独立地为H、C1至C10烷基、C2至C10烯基、C2至C10炔基或C1至C10烷氧基，X1和X2各自独立地为卤素。
技术方案
本发明一方面提供一种用于预防或治疗黄斑变性的药物组合物，其含有由以下化学式1所示的咪唑啉衍生物化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分。
【化学式1】
Figure BDA0003276696860000051
其中，R1至R3各自独立地为H、C1至C10烷基、C2至C10烯基、C2至C10炔基或C1至C10烷氧基，X1和X2各自独立地为卤素。
所述咪唑啉衍生物化合物可以任选地被至少一个取代基，例如下面举例说明的那些，或者如本发明的某些类别、亚类别和种类举例说明的那些取代。
如本文所用，术语“烷基”是指含有1至10(例如，1至8、1至6或1至4)个碳原子的饱和脂肪族烃基。烷基可以为直链型或支链型。烷基的例子包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正庚基或2-乙基己基。烷基可以被至少一个取代基，例如卤素(halo)、磷(phospho)、环脂族[例如，环烷基或环烯基]、杂环脂族[例如，杂环烷基或杂环烯基]、芳基、杂芳基、烷氧基、芳酰基、杂芳酰基、酰基[例如,(脂族)羰基、(环脂族)羰基或(杂环脂族)羰基]、硝基、氰基、酰胺基(amido)[例如，(环烷基烷基)羰基氨基、芳基羰基氨基、芳烷基羰基氨基、(杂环烷基)羰基氨基、(杂环烷基烷基)羰基氨基、杂芳基羰基氨基、杂芳烷基羰基氨基烷基氨基羰基、环烷基氨基羰基、杂环烷基氨基羰基，芳基氨基羰基或杂芳基氨基羰基]、氨基[例如，脂肪族氨基、环脂族氨基或杂环脂族氨基]、磺酰基[例如，脂肪族-SO2-]、亚磺酰基、硫烷基(sulfanyl)、硫氧基(sulfoxy)、脲、硫脲、胺磺酰基、磺酰胺、氧代、羧基、氨甲酰基、环脂族氧基、杂环脂族氧基、芳基氧基、杂芳基氧基、芳烷基氧基、杂芳基烷氧基、烷氧基羰基、烷基羰基氧基或羟基取代(即，任选取代)。非限制性地，取代的烷基的一些例子包括羧基烷基(例如，HOOC-烷基、烷氧基羰基烷基和烷基羰基氧基烷基)、氰基烷基、羟基烷基、烷氧基烷基、酰基烷基、芳烷基、(烷氧基芳基)烷基、(磺酰基氨基)烷基(例如，(烷基-SO2-氨基)烷基)、氨基烷基、酰胺基烷基、(环脂族)烷基、卤烷基、胺阳离子、季铵、季鏻。
如本文所用，术语“烯基”是指含有2至10(例如，2至8、2至6或2至4)个碳原子和至少一个双键的脂肪族碳基团。与烷基类似，烯基可以为直链型或支链型。烯基的例子包括烯丙基、异戊二烯基、2-丁烯基和2-己烯基。烯基可以任选地被至少一个取代基，例如卤素(halo)、磷(phospho)、环脂族[例如，环烷基或环烯基]、杂环脂族[例如，杂环烷基或杂环烯基]、芳基、杂芳基、烷氧基、芳酰基、杂芳酰基、酰基[例如,(脂族)羰基、(环脂族)羰基或(杂环脂族)羰基]、硝基、氰基、酰胺基(amido)[例如，(环烷基烷基)羰基氨基、芳基羰基氨基、芳烷基羰基氨基、(杂环烷基)羰基氨基、(杂环烷基烷基)羰基氨基、杂芳基羰基氨基、杂芳烷基羰基氨基烷基氨基羰基、环烷基氨基羰基、杂环烷基氨基羰基，芳基氨基羰基或杂芳基氨基羰基]、氨基[例如，脂肪族氨基、环脂族氨基、杂环脂族氨基或脂肪族磺酰基氨基]、磺酰基[例如，烷基-SO2-、环脂族-SO2-或芳基-SO2-]、亚磺酰基、硫烷基(sulfanyl)、硫氧基(sulfoxy)、脲、硫脲、胺磺酰基、磺酰胺、氧代、羧基、氨甲酰基、环脂族氧基、杂环脂族氧基、芳基氧基、杂芳基氧基、芳烷基氧基、杂芳烷氧基、烷氧基羰基、烷基羰基氧基或羟基取代。非限制性地，取代的烯基的例子包括氰基烯基、烷氧基烯基、酰基烯基、羟基烯基、芳烯基、(烷氧基芳基)烯基、(磺酰基氨基)烯基(例如，(烷基-SO2-氨基)烯基)、氨基烯基、酰胺基烯基、(环脂族)烯基或卤烯基。
如本文所用，术语“炔基”是指含有2至10(例如，2至8、2至6或2至4)个碳原子并具有至少一个三键的脂肪族碳基团。炔基可以为直链型或支链型。炔基的例子包括但不限于炔丙基和丁炔基。炔基可以被至少一个取代基，例如芳酰基、杂芳酰基、烷氧基、环烷基氧基、杂环烷基氧基、芳基氧基、杂芳基氧基、芳烷基氧基、硝基、羧基、氰基、卤素、羟基、磺基、巯基、硫烷基[例如，脂肪族硫烷基或环脂族硫烷基]、亚磺酰基[例如，脂肪族亚磺酰基或环脂族亚磺酰基]、磺酰基[例如，脂肪族-SO2-、脂肪族氨基-SO2-或环脂族-SO2-]、酰胺基[例如，氨基羰基、烷基氨基羰基、烷基羰基氨基、环烷基氨基羰基、杂环烷基氨基羰基、环烷基羰基氨基、芳基氨基羰基、芳基羰基氨基、芳烷基羰基氨基、(杂环烷基)羰基氨基、(环烷基烷基)羰基氨基、杂芳烷基羰基氨基、杂芳基羰基氨基或杂芳基氨基羰基]、脲、硫脲、胺磺酰基、磺酰胺、烷氧基羰基、烷基羰基氧基、环脂族、杂环脂族、芳基、杂芳基、酰基[例如，(环脂族)羰基或(杂环脂族)羰基]、氨基[例如，脂族氨基]、硫氧基、氧代、羧基、氨甲酰基、(环脂族)氧基、(杂环脂族)氧基或(杂芳基)烷氧基任意取代。
如本文所用，术语“烷氧基”是指羟基的氢原子被所述烷基、烯基或炔基取代的基团。合适的烷氧基可以为但不限于C1-C10烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基和戊氧基等。
如本文所用，术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘。
本发明的化合物可以任选地被至少一个取代基取代，例如上面举例说明的，或如本发明的特定类别、亚类别和种类举例说明的那些。除非另有说明，本发明的R1至R3任选地被本文所述的至少一个取代基取代。特定基团的每个取代基更任选地被卤素、氰基、氧代、烷氧基、羟基、氨基、硝基、芳基、环脂族、杂环脂族、杂芳基、卤烷基和烷基中的1至3个取代。例如，烷基可以任选地被烷基硫烷基取代，并且烷基硫烷基可以任选地被卤素、氰基、氧代、烷氧基、羟基、氨基、硝基、芳基、卤烷基和烷基中的1至3个取代。作为进一步的例子，(环烷基)羰基氨基的环烷基部分可以任选地被卤素、氰基、烷氧基、羟基、硝基、卤烷基和烷基中的1至3个取代。当两个烷氧基与同一原子或相邻原子键合时，两个烷氧基与它们所连接的原子一起可以形成环。
根据一具体实施例，在所述化学式1中，所述R1可以为异丙基，所述R2可以为甲基，所述R3可以为氢，并且所述X1和X2可以为Cl。
根据一具体实施例，所述咪唑啉衍生物化合物可以为Nutlin-1、Nutlin-2或Nutlin-3，并且所述Nutlin-3可以为Nutlin-3a或Nutlin-3b。
根据一具体实施例，所述组合物可以进一步包括抗氧化剂，所述抗氧化剂可以为选自烟酰胺、花青素、苯二酚松香烷二萜、肌肽、类胡萝卜素、叶黄素和藏红花中的类胡萝卜素、姜黄素类、环戊烯酮前列腺素、类黄酮、异戊二烯类黄酮、类视黄醇、芪类、尿酸、维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B6、维生素B9、维生素B12、维生素C、维生素E、硒、锌、脂质过氧化和其副产物的抑制剂和清除剂、替拉扎特(Tirilazad)和其类似物、衍生物、盐以及其组合中的至少一个。
根据一具体实施例，所述咪唑啉衍生物化合物可以在衰老细胞中过表达p53和p21中的至少任何一个，从而可以选择性地杀死衰老细胞。
根据一具体实施例，所述黄斑变性可以为选自老年性黄斑变性(AMD，age-relatedmacular degeneration)、湿性黄斑变性和干性黄斑变性中的至少一个。当视网膜中出现玻璃疣(废物在黄斑中积聚的情况)或视网膜色素上皮萎缩等病变时，称为干性黄斑变性，而由视网膜下脉络膜新生血管生长引起的疾病称为湿性黄斑变性。当向衰老的视网膜施用本发明的咪唑啉衍生物化合物或联合施用咪唑啉衍生物化合物和抗氧化剂时，玻璃疣减少且布鲁赫膜变薄，从而其可能对干性黄斑变性有效。根据一实施例，当施用Nutlin-3或联合施用Nutlin-3和烟酰胺时，已确认玻璃疣减少且布鲁赫膜变薄。
本发明另一方面还提供一种用于预防或治疗黄斑变性的药物组合物，其含有由以下化学式1所示的咪唑啉衍生物化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分，并且所述咪唑啉衍生物化合物与抗氧化剂联合施用。
【化学式1】
Figure BDA0003276696860000091
其中，R1至R3各自独立地为H、C1至C10烷基、C2至C10烯基、C2至C10炔基或C1至C10烷氧基，X1和X2各自独立地为卤素。
本发明另一方面还提供一种用于预防或治疗黄斑变性的方法，其包括：向有需要的受试者施用由以下化学式1所示的的咪唑啉衍生物化合物或其药学上可接受的盐。
【化学式1】
Figure BDA0003276696860000092
其中，R1至R3各自独立地为H、C1至C10烷基、C2至C10烯基、C2至C10炔基或C1至C10烷氧基，X1和X2各自独立地为卤素。
所述联合施用可以是指同时、依次或分别和以任何顺序施用咪唑啉衍生物化合物和抗氧化剂。
具体地，所述联合施用可以是指同时施用咪唑啉衍生物化合物和抗氧化剂，或者在施用咪唑啉衍生物化合物和抗氧化剂中的任何一个后再施用另一个。例如，当通过反应程度、反应速率、疾病进展期或存活期来测量的功效在治疗学上优于可通过以常规剂量施用组合治疗法的一种或其余成分来实现的功效时，根据本发明的联合治疗法可被定义为能够提供协同效应。例如，当其功效在治疗学上优于单独使用所述每一种获得的功效时，联合治疗法的功效是协同的。尤其，在不损害反应程度、反应速率、疾病进展期和存活数据中的至少一项的情况下，特别是在不损害反应持续时间的情况下，与各成分以常规剂量使用时相比，当可以减少或具有很少不良副作用，或者/并且可以减少咪唑啉衍生物化合物的常规剂量时，其视为存在协同作用。当联合施用所述咪唑啉衍生物化合物和抗氧化剂时，所述咪唑啉衍生物化合物或其药学上可接受的盐的剂量可以为约1mg/kg至约100mg/kg，例如，10mg/kg至80mg/kg、10mg/kg至60mg/kg、20mg/kg至80mg/kg、20mg/kg至60mg/kg、30mg/kg至80mg/kg、30mg/kg至60mg/kg、40mg/kg至80mg/kg或40mg/kg至60mg/kg。
另外，所述抗氧化剂的剂量可以为约50mg/kg至150mg/kg，例如，60mg/kg至150mg/kg、60mg/kg至130mg/kg、60mg/kg至110mg/kg、70mg/kg至150mg/kg、70mg/kg至130mg/kg、70mg/kg至110mg/kg、80mg/kg至150mg/kg、80mg/kg至130mg/kg、80mg/kg至110mg/kg、90mg/kg至150mg/kg、90mg/kg至130mg/kg或90mg/kg至110mg/kg。
所述化合物可以以药学上可接受的盐的形式存在。所述药学上可接受的盐均包括酸或碱的加成盐及其立体化学异构体形式，例如，可以为有机酸或无机酸的加成盐。所述盐包括任何盐，没有特别限制，只要在待施用的受试者中保持母体化合物(parent compound)的活性并且不引起不良效果即可。
这种盐包括无机盐和有机盐，例如可以为乙酸、硝酸、天冬氨酸、磺酸、硫酸、马来酸、谷氨酸、甲酸、琥珀酸、磷酸、邻苯二甲酸、单宁酸、酒石酸、氢溴酸、丙酸、苯磺酸、苯甲酸、硬脂酸、乳酸(lactic acid)、重碳酸、重硫酸、重酒石酸、草酸、丁酸、依地酸钙、碳酸、氯苯甲酸、柠檬酸、依地酸、甲苯磺酸、富马酸、葡庚糖酸、乙磺酸(esylic acid)、双羟萘酸(pamoate)、葡萄糖酸、甲基硝酸、丙二酸、盐酸、氢碘酸、羟基萘甲酸、羟乙磺酸、乳糖酸、扁桃酸、黏酸、萘酸(naphthylic acid)、粘康酸、对硝基甲烷磺酸、环己磺酸、泛酸、一氢磷酸、二氢磷酸、水杨酸、氨基磺酸、对氨基苯磺酸、甲磺酸。
另外，作为所述盐的形式，包括如铵盐、锂盐、钠盐、钾盐、镁盐和钙盐的碱金属和碱土金属的盐，例如，具有有机碱如苄星、N-甲基-D-葡糖胺、海巴明盐(hydrabaminesalts)的盐以及具有氨基酸如精氨酸、赖氨酸的盐。此外，所述将盐形式也可以通过用合适的碱或酸处理来转化为游离形式。
术语“治疗剂”或“药物组合物”是指在施用于受试者时赋予一些有益效果的分子或化合物。有益效果包括：可以做出诊断决定；改善疾病、症状、紊乱或病状；减少或预防疾病、症状、紊乱或病状的发作；以及总体上对抗疾病、症状、紊乱或病状。
本发明的药物组合物可以为适合于预期施用方法的任何形式。在本发明的药物组合物中，“施用”是指通过任何合适的方法将预定物质引入患者体内，所述药物组合物的施用途径可以通过任何一般途径进行，只要药物可以到达靶组织即可。例如，可以提及但不限于眼球局部施用(例如，眼球周围(例如，sub Tenon's)、结膜下、眼球内、玻璃体内、前房内、视网膜下、脉络膜上和眼球后施用)、腹腔内施用、静脉内施用、肌肉内施用、皮下施用、皮内施用、口服施用、局部施用、鼻内施用、肺内施用、直肠内施用等。另外，本发明的药物组合物可以使用能够将有效成分移动到靶细胞的任何装置以施用。优选地，本发明的药物组合物根据待应用的疾病类型确定施用途径。
本文提供的药物组合物可以通过按照常规方法将其配制为口服剂型或非口服剂型等来使用，其中，所述口服剂型包括散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬液、乳液、糖浆、气雾剂等，所述非口服剂型包括混悬剂、乳剂、冻干制剂、外用制剂、栓剂、灭菌注射液、用于移植的制剂等。
除了有效成分(即，所述化合物或其药学上可接受的盐)之外，所述药物组合物可以进一步包括可用于制剂化的药学上可接受的赋形剂。
可用于制剂化本发明药物组合物的赋形剂可以包括选自载体、媒介物(vehicle)、稀释剂、溶剂，例如一元醇，例如乙醇、异丙醇和多元醇，例如甘油和食用油，例如大豆油、椰子油、橄榄油、红花油、棉籽油、油性酯，例如油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯；粘合剂、佐剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、崩解剂、助流剂、润滑剂、缓冲剂、乳化剂、湿润剂、悬浮剂、甜味剂、着色剂、调味剂、包衣剂、防腐剂、抗氧化剂、加工剂、药物递送改性剂和增强剂(enhancer)，例如作为磷酸钙、镁态、滑石、单糖类、双糖类、淀粉、明胶、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、右旋糖、羟丙基-β-环糊精、聚乙烯吡咯烷酮、低熔点蜡、离子交换树脂等中的至少一种，但不限于此。
本发明的药物组合物中包括的药学上可接受的载体通常在进行制剂化中使用，并且可以包括但不限于乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油等。除了所述成分之外，本发明的药物组合物可以进一步包括润滑剂、湿润剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、保存剂等。合适的药学上可接受的载体和制剂在Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed.，1995)中有详细描述。
所述药物组合物可以配制成各种口服施用剂型。
例如，其可以配置成任何用于口服施用的剂型，例如片剂、丸剂、硬/软胶囊剂、溶液剂、混悬剂、乳化剂、糖浆剂、颗粒剂、酏剂(elixirs)等。根据各剂型的常规组成，除了所述有效成分之外，所述用于口服施用的剂型还可以包括，例如，乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、纤维素和/或甘氨酸等的稀释剂，或二氧化硅、滑石、硬脂酸以及其镁或钙盐和/或聚乙二醇等的助流剂等的药学上可接受的载体。
另外，当所述用于口服施用的剂型为片剂时，可以包括如硅酸铝镁、淀粉糊、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷等的粘合剂，还可以根据情况包括如淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐的崩解剂或沸腾混合物和/或吸收剂、着色剂、调味剂或甜味剂等。
并且所述药物组合物可以配置成非口服施用剂型，此时，通过非口服施用方法给药，例如皮下注射、静脉内注射、肌肉内注射或胸腔内注射等。此时，为了配制成所述非口服施用剂型，将所述药物组合物制成溶液或混悬液，其中，所述有效成分与稳定剂或缓冲剂混合在水中，所述溶液或混悬液可以制成如安瓿或小瓶的单位剂型。
另外，所述药物组合物可以是无菌的，或者可以进一步包括如防腐剂、稳定剂、水和剂或乳化促进剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂等的佐剂，可以进一步包括其他治疗上有用的物质，并且可以根据混合、制粒或包衣的常规方法进行配制。
所述药物组合物中所述化合物或其药学上可接受的盐的含量可根据药物组合物的使用目的、剂型等适当调整，例如，基于药物组合物的总重量，按重量百分比计，其含量可以为但不限于0.001％至99％、0.001％至90％、0.001％至50％、0.01％至50％、0.1％至50％或1％至50％。
另外，本发明的药物组合物中所包括的所述化合物或其药学上可接受的盐的治疗有效量是指为了预期疾病治疗效果而施用所需的量。因此，可以根据患者的疾病类型、疾病的严重程度、施用的有效成分类型、剂型、患者的年龄、性别、体重、健康状况、饮食、给药时间和给药方式进行调整。例如，可以向包括人类在内的哺乳动物以每天0.01mg/kg至500mg/kg(体重)的药学有效量施用。所述药学有效量可取决于能够获得所需效果的量，例如治疗和/或预防与年龄相关的疾病。所述药学有效量可以通过口服或非口服途径(例如，眼球注射、静脉注射、肌内注射等)每天一次或分成至少两次施用。
可以治疗受试者的黄斑变性，其中包括以有效预防或治疗黄斑变性的量向受试者施用所述药物组合物的步骤。
所述受试者可以为哺乳动物。所述哺乳动物可以为人、狗、猫、牛、羊或猪。
如本文所用，术语“治疗”或“用于治疗”或“用于减轻”或“用于改善”可互换使用。这些术语是指获得有益或期望结果的方法，包括但不限于治疗益处和/或预防益处。治疗益处是指对治疗中的至少一种疾病、病症或症状的任何治疗上显着的改善或其效果。为了预防益处，可以将组合物施用于有患特定疾病、病症或症状风险的受试者，或者可以向报告疾病的至少一种生理学症状的受试者施用，即使所述受试者的疾病、病症或症状尚未出现。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以产生有益或期望结果的作用剂的量。治疗有效量可根据所治疗的受试者和病症、受试者的体重和年龄、病症的严重程度、施用方式等中的至少一种而不同，这可以由本领域普通技术人员容易地确定。另外，所述术语适用于提供用于通过本文所述的任何成像方法进行检测的图像的剂量。特定剂量可根据所选择的特定作用剂、要遵循的施用方案、是否与其他化合物联合施用、施用时间、被成像的组织以及将其递送的身体递送系统中的至少一种而不同。
本发明另一方面还提供一种用于预防或改善黄斑变性的保健功能食品，其含有由以下化学式1所示的咪唑啉衍生物化合物或其盐作为有效成分。
【化学式1】
Figure BDA0003276696860000151
其中，R1至R3各自独立地为H、C1至C10烷基、C2至C10烯基、C2至C10炔基或C1至C10烷氧基，X1和X2各自独立地为卤素。
根据一具体实施例，所述保健功能食品可以进一步包括抗氧化剂。
本发明中使用的术语“保健功能食品”是指根据保健功能食品法第6727号的规定，使用对人体具有有益功能的原料或成分制备并加工的食品，并且其是指为了获得对健康有益的效果，例如调节人体结构和功能所需的营养物质或生理作用等而摄入的。
当本发明的组合物用作食品添加物时，所述组合物可以原样添加或与其他食品或成分一起使用，并且可以根据常规方法适当使用。有效成分的混合量可根据使用目的适当确定。所述食品添加物是指为改善外观、风味、组织或耐贮性而通常有意地少量添加到食品中的添加物，其使用目的在于，改善食品质量以提高耐贮性或适口性并增强食品的营养价值和实用价值。根据食品卫生法第二条第二款的定义，这可以为在制备、加工或保存食品时通过添加、混合、浸渍或其他方法用于食品的物质。
本发明的食品种类没有特别限制。可以添加本发明组合物的食品的例子包括肉类、香肠类、面包类、巧克力类、糖果类、小吃类、饼干类、拉面、其他面条、口香糖类、包括冰淇淋类的乳制品、各种汤、饮料、茶、保健饮料、酒精饮料和维生素复合剂等，并且可以包括常规意义上的所有食品，也包括用作动物饲料的食品。
本发明的保健功能食品可以包括常规的食品添加物，是否适合作为食品添加物，除另有规定外，根据食品医药品安全厅批准的《食品添加物公典》的通则和通用试验方法等，按照有关项目的标准和基准进行判断。
另外，本发明的食品组合物可以包括各种营养剂、维生素、电解质、调味剂、着色剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、酒精、碳酸饮料中使用的碳酸化剂等。另外，可以包括用于制备天然果汁、果汁饮料和蔬菜饮料的果肉。
此外，所述食品也可以根据已知的制备方法以片剂、颗粒、粉末、胶囊、液体的溶液和丸剂等的剂型制备。除了包括本发明的化合物作为有效成分之外，对其他成分没有特别限制，并且可以包括各种常规调味剂或天然碳水化合物等作为附加成分。
例如，将作为本发明有效成分的所述化学式1化合物与赋形剂、粘合剂、崩解剂和其他添加剂的混合物按常规方法造粒，然后加入助流剂等进行压缩成型，或直接对所述混合物进行压缩成型，即可得到片剂形式的保健功能食品。另外，如果需要，所述片剂形式的保健功能食品可以包括矫味剂等。
在胶囊形式的保健功能食品中，硬胶囊剂可以通过将作为本发明有效成分的所述化学式1化合物与赋形剂等添加剂的混合物填充到常规硬胶囊中来制备，而软胶囊剂可以通过将所述化学式1化合物与赋形剂等添加剂的混合物填充到如明胶的胶囊基质中来制备。如果需要，所述软胶囊剂可以包括甘油或山梨糖醇等的增塑剂、着色剂、保存剂等。
丸形式的保健功能食品可以通过以已知方法将作为本发明有效成分的所述化学式1化合物与赋形剂、粘合剂、崩解剂等的混合物成型来制备，如果需要，可以使用蔗糖或其他制皮剂进行制皮，或者也可以在表面涂上淀粉、滑石等的材料。
颗粒形式的保健功能食品可以通过以已知方法将作为本发明有效成分的所述化学式1化合物与赋形剂、粘合剂、崩解剂等的混合物制成颗粒形式来制备，如果需要，可以包括增香、矫味剂等。
所述发明中描述的术语和方法等同样适用于每个发明。
有益效果
根据含有根据本发明一方面的咪唑啉衍生物化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分的组合物具有可有效用于预防和/或治疗黄斑变性的效果，因为其可以通过选择性杀死衰老细胞来减少玻璃疣和黄斑萎缩。
附图说明
图1为当用阿霉素处理ARPE-19细胞时，通过SA-β-gal染色确认细胞被诱导为衰老细胞的照片。
图2为当用阿霉素处理ARPE-19细胞时，显示用SA-β-gal染色的细胞数量以确认细胞被诱导为衰老细胞的图表。
图3为在用阿霉素处理ARPE-19细胞以诱导的衰老细胞中，确认p53高表达的照片和图表。
图4为在用阿霉素处理ARPE-19细胞以诱导的衰老细胞中，确认p21高表达的照片和图表。
图5为在用阿霉素处理ARPE-19细胞以诱导的衰老细胞中，确认炎症因子高表达的图表。
图6为当处理Nutlin-3时，确认发生衰老细胞死亡的图表。
图7为当处理Nutlin-3时，确认p53在衰老细胞中更加过表达的图表。
图8为当处理Nutlin-3时，确认p53在衰老细胞中更加过表达的照片。
图9为当用阿霉素处理小鼠视网膜组织时，通过SA-β-gal染色确认细胞被诱导为衰老细胞的照片。
图10为在用阿霉素处理小鼠视网膜组织以诱导的衰老细胞中，确认p53和p21高表达的照片。
图11为在用阿霉素处理小鼠视网膜组织以诱导的衰老细胞中，确认玻璃疣标志物APOE高表达的照片。
图12为当用阿霉素处理小鼠视网膜组织时，确认玻璃疣的量增加并布鲁赫膜的厚度变厚的照片。
图13为当用Nutlin-3处理小鼠视网膜组织的衰老细胞时，确认发生衰老细胞死亡的照片。
图14为当用Nutlin-3处理小鼠视网膜组织的衰老细胞时，确认发生衰老细胞死亡的图表。
图15为当用Nutlin-3处理小鼠视网膜组织的衰老细胞时，确认废物减少并细胞组织排列状态得到改善的图片。
图16为当用Nutlin-3处理小鼠视网膜组织的衰老细胞时，确认玻璃疣的量减少并布鲁赫膜的厚度变薄的照片。
图17为当用Nutlin-3处理小鼠视网膜组织的衰老细胞时，确认布鲁赫膜的厚度变薄的图表。
图18为当联合使用Nutlin-3和烟酰胺处理小鼠视网膜组织的衰老细胞时，确认发生衰老细胞死亡的图表。
图19为当联合使用Nutlin-3和烟酰胺处理小鼠视网膜组织的衰老细胞时，确认发生衰老细胞死亡的照片。
图20为当联合使用Nutlin-3和烟酰胺处理小鼠视网膜组织的衰老细胞时，确认废物减少的图表。
图21为当联合使用Nutlin-3和烟酰胺处理小鼠视网膜组织的衰老细胞时，确认废物减少的照片。
图22为当联合使用Nutlin-3和烟酰胺处理小鼠视网膜组织的衰老细胞时，确认玻璃疣标志物APOE的表达减少并细胞组织排列状态得到改善的照片。
具体实施方式
下面将通过实施例更详细地描述本发明。对于本领域的普通技术人员显而易见的是，这些实施例仅用于举例说明本发明，本发明的范围不应被解释为受这些实施例的限制。
实施例1、通过用阿霉素(doxorubicin)处理来确认衰老细胞诱导
使用阿霉素(doxorubicin，Dox)将作为人视网膜色素上皮(retinal pigmentepithelium，RPE)细胞系的ARPE-19诱导为衰老细胞，所述阿霉素形成过氧化物阴离子，诱导DNA损伤，并用作细胞衰老诱导物质。
ARPE-19细胞获自美国模式培养物集存库(ATCC,American Type CultureCollection，CRL-2302,美国弗吉尼亚州)，并且将其在补充有10％胎牛血清(Invitrogen16000，美国沃尔瑟姆)和青霉素-链霉素(pen/strep，WellGene，LS 202-02)的杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM，Dulbecco modified Eagle Medium)/营养混合物F-12(WellGene,LM 002-04,韩国)中在37℃、5％CO2的加湿培养箱中培养。
在细胞传代15至25次并聚集约70％至80％后，使用了细胞。
在用阿霉素(Dox，Tocris Bioscience#2252，英国布里斯托尔)诱导所述培养的ARPE-19细胞的细胞衰老之前，在24孔或6孔板中以每孔25000或100000个细胞的密度进行接种。24小时后，加入250nM阿霉素并将细胞再培养3天。3天后，将细胞置于不含阿霉素的培养基中，并且每天更换培养基。在第10天，将经阿霉素处理的衰老细胞(SnCs)和未经阿霉素处理且仅更换培养基的非衰老细胞(non-SnCs)接种于24孔或6孔板以备进行进一步实验。
为了对24孔板中生长并诱导衰老的ARPE-19细胞进行衰老相关β-半乳糖苷酶(Senescence-associated beta-galactosidase，SA-β-gal)染色，将细胞在室温下用固定液固定15分钟并用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，然后用染色液染色6小时。使用倒置显微镜(Carl Zeiss Axio ScopeA1，德国哥廷根)捕获图像。
其结果，如图1和图2所示，确认了经阿霉素处理的ARPE-19细胞诱导为衰老细胞。
实施例2、确认衰老细胞中p53和p21的过表达
为了确认所述实施例1中诱导的衰老细胞是否过表达p53和p21，进行了如下实验。
将所述实施例1的6孔板中生长的经阿霉素处理的衰老细胞(SnCs)和非衰老细胞(non-SnCs)在补充有蛋白酶抑制剂混合物(Roche，11697498001，瑞士巴塞尔)的RIPA缓冲液(Thermo Fisher Scientific，89901)中溶解。细胞的蛋白质浓度使用BCA分析(Pierce，23227，美国沃尔瑟姆)以定量。在10％至12％聚丙烯酰胺凝胶上通过SDS-PAGE分离等量的蛋白质并将其转移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜上。
然后，用5％脱脂奶粉缓冲液封闭PVDF膜1小时，加入抗-p53(1：500，Santa CruzBiotechnology，SC-126)、抗-p21(1：500，Santa Cruz Biotechnology，SC-6246)和抗-β-肌动蛋白(1：2000，Abcam，ab8226)抗体并且于4℃培养过夜，然后与芥菜过氧化物酶(horseradish peroxidase)偶联的抗-小鼠IgG(1：5000，Cell Signaling，7076S)抗体一起培养。然后，使用化学发光底物(Amersham，RDN2232，英国小查尔方特)可视化免疫反应性蛋白质，并使用ImageJ软件(NIH，美国)和密度计定量。所有实验至少重复3次。
其结果，如图3和图4所示，已确认与非衰老细胞相比，p53和p21在衰老细胞中更高表达。
实施例3、确认衰老细胞中炎症因子的过表达
为了确认所述实施例1中诱导的衰老细胞是否过表达炎症因子，进行了如下实验。
使用TRIzol试剂(Invitrogen，15596026)从在所述实施例1的6孔板中生长的经阿霉素处理的衰老细胞(SnC)和非衰老细胞(non-SnC)中分离总RNA。分离RNA后，使用逆转录酶(Thermo Fisher Scientific,4368813)将mRNA转录成cDNA。使用CFX连接实时系统(BIO-RAD，美国加利福尼亚州)在40个循环中用特定引物定量mRNA。
通过熔解曲线分析(melting curve analysis)鉴定PCR产物。使用2-ΔΔCt方法计算相对mRNA表达。GAPDH用作内参基因。平均Ct值归一化为GAPDH。每组重复实时荧光定量(Real-time PCR)至少3次。
其结果，如图5所示，确认了炎症因子在非衰老细胞中不表达，炎症因子IL-1β、IL-6、MMP3和CXCL10在衰老细胞中高表达。
实施例4、确认Nutlin-3对衰老细胞的选择性杀伤作用
为了确认Nutlin-3是否选择性杀死衰老细胞，如下所示，细胞用Nutlin-3处理并用碘化丙啶(propidium iodide)染色。
用不同浓度的Nutlin-3对所述实施例1的24孔板中生长的经阿霉素处理的衰老细胞(SnC)和非衰老细胞(non-SnC)进行处理。
24小时后，去除培养基并向每个孔中加入含有碘化丙啶(PI，BD Biosciences，51-66211E，1.5ug/ml)和烟酸己可碱(Hoechst)33342(Invitrogen，H1399，1ug/ml)的培养基。30分钟后，使用超高分辨率共聚焦激光扫描显微镜(Carl Zeiss，LSM 800)获得图像。
其结果，如图6所示，与非衰老细胞相比，衰老细胞在50uM浓度下被杀死7倍，衰老细胞在75uM浓度下被杀死3倍。这些结果表明Nutlin-3具有选择性杀死衰老细胞的作用。
实施例5、确认Nutlin-3对p53过表达的诱导作用
如实施例4所示，为了确认Nutlin-3选择性杀死衰老细胞的原因，进行了如下实验。
在用不同浓度的Nutlin-3处理所述实施例1的6孔板中生长的经阿霉素处理的衰老细胞(SnC)和非衰老细胞(non-SnC)后，将其在补充有蛋白酶抑制剂混合物(Roche，11697498001，瑞士巴塞尔)的RIPA缓冲液(Thermo Fisher Scientific，89901)中溶解。细胞的蛋白质浓度使用BCA分析(Pierce，23227，美国沃尔瑟姆)以定量。在10％至12％聚丙烯酰胺凝胶上通过SDS-PAGE分离等量的蛋白质并将其转移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidenedifluoride，PVDF)膜上。
然后，用5％脱脂奶粉缓冲液封闭PVDF膜1小时，加入抗-p53(1：500，Santa CruzBiotechnology，SC-126)和抗-β-肌动蛋白(1：2000，Abcam，ab8226)抗体并且于4℃培养过夜，然后与芥菜过氧化物酶(horseradish peroxidase)偶联的抗-小鼠IgG(1：5000，CellSignaling，7076S)抗体一起培养。然后，使用化学发光底物(Amersham，RDN2232，英国小查尔方特)可视化免疫反应性蛋白质，并使用ImageJ软件(NIH，美国)和密度计定量。所有实验至少重复3次。
其结果，如图7和图8所示，与非衰老细胞相比，p53在衰老细胞中过度表达，当用Nutlin-3处理时，显示出p53的表达更高。这些结果表明，Nutlin-3处理使得p53进一步过度表达，并诱导衰老细胞的凋亡。
实施例6、确认在体内(in vivo)衰老细胞的诱导
使用衰老细胞诱导物质，如下将小鼠的视网膜组织诱导为衰老细胞。
在光学显微镜(Olympus SZ51，日本东京)下，使用30号无菌针(BD Science，美国圣何塞)在角膜缘(limbus)上打一个小孔。
然后将钝的35号Hamilton微量注射器(Hamilton Company,美国内华达州)缓慢插入孔中。将100ng/μl Dox或1uL的1.4μg/μl Alu RNA分别注射到C57BL/6N或C57BL/6J小鼠的视网膜下空间中，所述注射持续7天。
然后，用二氧化碳气体麻醉小鼠，并立即摘除眼睛。
在冷PBS中解剖前眼球。小心去除视网膜后，将RPE/脉络膜/巩膜复合组织或切片化的视网膜立即用与SA-β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色试剂盒(BioVision，#K320，美国加利福尼亚州)一起提供的固定液在室温下固定20分钟，并且根据制造商的协议，用与SA-β-gal染色试剂盒一起提供的染色溶液混合物染色。在37℃下进行SA-β-gal染色过夜后，漂白RPE/脉络膜中的深色黑色素，以显示出这些组织中被黑色素掩盖的SA-β-gal染色。为了对RPE/脉络膜进行脱色，将RPE/脉络膜/巩膜复合组织浸入30％H2O2中，在55℃加热块中培养45分钟，然后用PBS冲洗，并在光学显微镜(OlympusSZ51)下用细尖镊子和手术刀片(WorldPrecision Instruments，美国佛罗里达州)压平。使用倒置显微镜(Leica Microsystems#DMi1，德国韦茨拉尔)捕获所染色的RPE/脉络膜封固载片或切片化的视网膜的图像。
其结果，如图9所示，确认了小鼠视网膜组织的细胞诱导为衰老细胞。
实施例7、确认在体内(in vivo)衰老细胞的p53和p21过表达
为了确认所述实施例6中诱导的衰老细胞是否过表达p53和p21，进行了如下实验。
用PBS中1％BSA封闭所述视网膜组织1小时后，将所固定的组织或细胞与p53(1：50，Santa Cruz Biotechnology，美国得克萨斯州)和p21(1：50，Santa CruzBiotechnology)的一抗一起在4℃下培养过夜。所染色的组织或细胞用PBS在5分钟时间里洗涤两次，，然后与Alexa Fluor偶联的二抗在室温下培养2小时。作为所述二抗，使用了Alexa Fluor 555偶联山羊抗小鼠IgG(Thermo Fisher Scientific，A-11029，美国沃尔瑟姆)、Alexa Fluor 488偶联山羊抗小鼠IgG(Thermo Fisher Scientific，A-21424)、AlexaFluor 555偶联山羊抗兔IgG(Thermo Fisher Scientific，A-21424)或Alexa Fluor 488偶联山羊抗兔IgG(Thermo Fisher Scientific，A-11034)。所有二抗均以1:1000的稀释度使用。与二抗一起培养后，将组织或细胞在室温下用核染料DAPI(1：4000，Thermo FisherScientific，62248)或烟酸己可碱(Hoechst)33342(1：3000，Thermo Fisher Scientific，H3570)在PBS中染色15分钟。然后，用固定培养基(Ployscience，18606-20，美国宾夕法尼亚州)固定组织。在倒置显微镜(Carl Zeiss，LSM 900，德国奥伯考亨)下观察所染色的细胞。
其结果，如图10所示，确认了与未诱导为衰老细胞的正常细胞相比，诱导为衰老细胞的小鼠视网膜组织的细胞过表达p53和p21。
实施例8、确认体内(in vivo)由衰老细胞引起的玻璃疣(drusen)表达
为了确认所述实施例6中诱导的衰老细胞是否表达玻璃疣，进行了如下实验。
用PBS中1％BSA封闭所述视网膜组织1小时后，将所固定的组织或细胞与玻璃疣标志物APOE的一抗(1：50，Santa Cruz Biotechnology)一起在4℃下培养过夜。所染色的组织或细胞用PBS在5分钟时间里洗涤两次，然后与Alexa Fluor偶联的二抗在室温下培养2小时。作为所述二抗，使用了Alexa Fluor 555偶联山羊抗小鼠IgG(Thermo FisherScientific，A-11029，美国沃尔瑟姆)、Alexa Fluor 488偶联山羊抗小鼠IgG(ThermoFisher Scientific，A-21424)、Alexa Fluor 555偶联山羊抗兔IgG(Thermo FisherScientific，A-21424)或Alexa Fluor 488偶联山羊抗兔IgG(Thermo Fisher Scientific，A-11034)。所有二抗均以1:1000的稀释度使用。与二抗一起培养后，将组织或细胞在室温下用核染料DAPI(1：4000，Thermo Fisher Scientific，62248)或烟酸己可碱(Hoechst)33342(1：3000，Thermo Fisher Scientific，H3570)在PBS中染色15分钟。然后，用固定培养基(Ployscience，18606-20，美国宾夕法尼亚州)固定组织。在倒置显微镜(Carl Zeiss，LSM900，德国奥伯考亨)下观察所染色的细胞。
其结果，如图11所示，确认了与未诱导为衰老细胞的正常细胞相比，诱导为衰老细胞的小鼠视网膜组织的细胞表达玻璃疣。
另外，小鼠眼球用0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.0)中含有2％戊二醛和3.75％蔗糖的溶液固定30分钟，用含有3.75％蔗糖的0.1M PBS在30分钟时间里洗涤3次，以准备用于TEM的样品。眼睛用0.05M磷酸钠缓冲液(pH7.0)中含有0.1％四氧化锇和5％蔗糖的溶液固定1小时，然后用蒸馏水冲洗3次。然后，将样品在一系列分级的丙酮溶液(20％步骤)中脱水并埋入环氧树脂中。将树脂在70℃聚合12小时。使用RMC CR-X超薄切片机获得超薄型切片(100nm)，然后使用JEOL JEM-1400电子显微镜成像。使用TEM测量布鲁赫膜(Bruch’smembrane)的厚度。通过测量每组9个图像的厚度来确定布鲁赫膜的平均厚度，其结果如图12所示。如图12所示，当用阿霉素诱导衰老细胞时，确认了玻璃疣的量增加且布鲁赫膜的厚度变厚。
实施例9、确认在体内(in vivo)由Nutlin-3引起的衰老细胞杀伤作用
在光学显微镜(Olympus SZ51，日本东京)下，使用30号无菌针(BDScience，美国圣何塞)在角膜缘(limbus)上打一个小孔。
然后将钝的35号Hamilton微量注射器(Hamilton Company,美国内华达州)缓慢插入孔中。将100ng/μl Dox或1uL的1.4μg/μl Alu RNA分别注射到C57BL/6N或C57BL/6J小鼠的视网膜下空间中，所述注射持续7天，然后将20ng/μl的Nutlin-3(#SML0580，美国圣路易斯)或媒介物(正常生理盐水中的0.4％DMSO)用钝的35号Hamilton微量注射器在7天时间里每3天向玻璃体内注射一次，共注射2次。
然后，用二氧化碳气体麻醉小鼠，并立即摘除眼睛。
在冷PBS中解剖前眼球。小心去除视网膜后，将RPE/脉络膜/巩膜复合组织或切片化的视网膜立即用与SA-β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色试剂盒(BioVision，#K320，美国加利福尼亚州)一起提供的固定液在室温下固定20分钟，并且根据制造商的协议，用与SA-β-gal染色试剂盒一起提供的染色溶液混合物染色。在37℃下进行SA-β-gal染色过夜后，漂白RPE/脉络膜中的深色黑色素，以显示出这些组织中被黑色素掩盖的SA-β-gal染色。为了对RPE/脉络膜进行脱色，将RPE/脉络膜/巩膜复合组织浸入30％H2O2中，在55℃加热块中培养45分钟，然后用PBS冲洗，并在光学显微镜(OlympusSZ51)下用细尖镊子和手术刀片(WorldPrecision Instruments，美国佛罗里达州)压平。使用倒置显微镜(Leica Microsystems#DMi1，德国韦茨拉尔)捕获所染色的RPE/脉络膜封固载片或切片化的视网膜的图像。
其结果，如图13和图14所示，与媒介物注射组相比，Nutlin-3注射组中β-半乳糖苷酶表达低，已确认发生了衰老细胞死亡。这些结果表明Nutlin-3具有杀死衰老细胞的作用。
实施例10、确认在体内(in vivo)由Nutlin-3引起的病变缓解作用
在所述实施例9中诱导衰老细胞后，如下确认了已注入Nutlin-3或媒介物的眼球的病变状态。
使用连接到数字成像系统(Nikon，日本)和HRA2(HeidelbergEngineering，德国海德堡)的TRC-50IX相机(Topcon，日本东京)扩张眼球后，分别捕获小鼠眼睛的彩色眼底照片(Color fundus photography)和眼底自发荧光图像(Color fundusphotography)。其结果，如图15所示，与注入含废物的媒介物的组相比，确认了注入Nutlin-3的组中的废物显着减少。
另外，为了确认细胞组织排列状态，确认了ZO-1的表达。具体而言，用PBS中1％BSA封闭所述视网膜组织1小时后，将所固定的组织或细胞与ZO-1(1：250，Invitrogen)的一抗一起在4℃下培养过夜。所染色的组织或细胞用PBS在五分钟时间里洗涤两次，，然后与Alexa Fluor偶联的二抗在室温下培养2小时。作为所述二抗，使用了Alexa Fluor 555偶联山羊抗小鼠IgG(Thermo Fisher Scientific，A-11029，美国沃尔瑟姆)、Alexa Fluor 488偶联山羊抗小鼠IgG(Thermo Fisher Scientific，A-21424)、Alexa Fluor 555偶联山羊抗兔IgG(Thermo Fisher Scientific，A-21424)或Alexa Fluor 488偶联山羊抗兔IgG(Thermo Fisher Scientific，A-11034)。所有二抗均以1:1000的稀释度使用。
与二抗一起培养后，将组织或细胞在室温下用核染料DAPI(1：4000，ThermoFisher Scientific，62248)或烟酸己可碱(Hoechst)33342(1：3000，Thermo FisherScientific，H3570)在PBS中染色15分钟。然后，用固定培养基(Ployscience，18606-20，美国宾夕法尼亚州)固定组织。在倒置显微镜(Carl Zeiss，LSM 900，德国奥伯考亨)下观察所染色的细胞。其结果，如图15所示，与注入媒介物的组相比，确认了注入Nutlin-3的组的细胞组织排列状态得到改善。
上述结果表明，由于Nutlin-3使衰老细胞死亡，因此视网膜组织中的废物减少，细胞组织排列得到改善，从而病变得到缓解。
实施例11、确认在体内(in vivo)由Nutlin-3引起的玻璃疣(drusen)表达抑制作用
在所述实施例9中诱导衰老细胞后，如下确认了已注入Nutlin-3或媒介物的眼球的病变状态。
如所述实施例9所示，在仅注入媒介物的组、注入阿霉素和媒介物的组、注入阿霉素和Nutlin-3的组中，小鼠眼球用0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.0)中含有2％戊二醛和3.75％蔗糖的溶液固定30分钟，用含有3.75％蔗糖的0.1M PBS洗涤3次30分钟，以准备用于TEM的样品。眼睛用0.05M磷酸钠缓冲液(pH7.0)中含有0.1％四氧化锇和5％蔗糖的溶液固定1小时，然后用蒸馏水冲洗3次。然后，将样品在一系列分级的丙酮溶液(20％步骤)中脱水并埋入环氧树脂中。将树脂在70℃聚合12小时。使用RMC CR-X超薄切片机获得超薄型切片(100nm)，然后使用JEOL JEM-1400电子显微镜成像。使用TEM测量布鲁赫膜(Bruch’s membrane)的厚度。通过测量每组9个图像的厚度来确定布鲁赫膜的平均厚度，其结果如图16和图17所示。
如图16和图17所示，当施用Nutlin-3时，与仅施用媒介物的衰老细胞相比，确认了玻璃疣的量减少并布鲁赫膜的厚度变薄。上述结果表明，由于Nutlin-3使衰老细胞死亡，因此视网膜组织中的玻璃疣减少，从而病变得到缓解。
实施例12、确认在体内(in vivo)Nutlin-3和烟酰胺(nicotinamide)联合施用时的衰老细胞杀伤作用
在光学显微镜(Olympus SZ51，日本东京)下，使用30号无菌针(BDScience，美国圣何塞)在角膜缘(limbus)上打一个小孔。
然后将钝的35号Hamilton微量注射器(Hamilton Company,美国内华达州)缓慢插入孔中。将100ng/μl Dox或1uL的1.4μg/μl Alu RNA分别注射到C57BL/6N或C57BL/6J小鼠的视网膜下空间中，所述注射持续7天，在第0天和第3天向视网膜施用20ng/μl的Nutlin-3(#SML0580，美国圣路易斯)或媒介物(正常生理盐水中的0.4％DMSO)，将Nutlin-3和烟酰胺以1：2的比例，即50mg/kg的Nutlin-3和100mg/kg的烟酰胺混合，每天使用口服施用探针进行口服施用，所述施用持续3天。
然后，用二氧化碳气体麻醉小鼠，并立即摘除眼睛。
在冷PBS中解剖前眼球。小心去除视网膜后，将RPE/脉络膜/巩膜复合组织或切片化的视网膜立即用与SA-β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色试剂盒(BioVision，#K320，美国加利福尼亚州)一起提供的固定液在室温下固定20分钟，并且根据制造商的协议，用与SA-β-gal染色试剂盒一起提供的染色溶液混合物染色。在37℃下进行SA-β-gal染色过夜后，漂白RPE/脉络膜中的深色黑色素，以显示出这些组织中被黑色素掩盖的SA-β-gal染色。为了对RPE/脉络膜进行脱色，将RPE/脉络膜/巩膜复合组织浸入30％H2O2中，在55℃加热块中培养45分钟，然后用PBS冲洗，并在光学显微镜(Olympus SZ51)下用细尖镊子和手术刀片(WorldPrecision Instruments，美国佛罗里达州)压平。使用倒置显微镜(Leica Microsystems#DMi1，德国韦茨拉尔)捕获所染色的RPE/脉络膜封固载片或切片化的视网膜的图像。
其结果，如图18和图19所示，确认了在Nutlin-3和烟酰胺联合施用的组中，视网膜组织的衰老细胞被更好地杀死。
实施例13、确认在体内(in vivo)Nutlin-3和烟酰胺(nicotinamide)联合施用时的病变缓解作用
所述实施例12中，在诱导衰老细胞后，如下确认了单独注入Nutlin-3或联合注入Nutlin-3与烟酰胺的眼球的病变状态。
使用连接到数字成像系统(Nikon，日本)和HRA2(Heidelberg Engineering，德国海德堡)的TRC-50 IX相机(Topcon，日本东京)扩张眼球后，分别捕获小鼠眼睛的眼底自发荧光图像(Color fundus photography)。其结果，如图20和图21所示，与注入含废物的媒介物的组相比，确认了注入Nutlin-3或联合注入Nutlin-3和烟酰胺的组中的废物显着减少，并且与单独注入Nutlin-3的组相比，确认了联合注入Nutlin-3和烟酰胺的组具有更小的误差范围。
另外，为了确认细胞组织排列状态，确认了ZO-1表达和玻璃疣标志物APOE的表达。具体而言，用PBS中1％BSA封闭所述视网膜组织1小时后，将所固定的组织或细胞与ZO-1(1：250，Invitrogen)或APOE的一抗(1：50，Santa Cruz Biotechnology)一起在4℃下培养过夜。所染色的组织或细胞用PBS在5分钟时间里洗涤两次，然后与Alexa Fluor偶联的二抗在室温下培养2小时。作为所述二抗，使用了Alexa Fluor 555偶联山羊抗小鼠IgG(ThermoFisher Scientific，A-11029，美国沃尔瑟姆)、Alexa Fluor 488偶联山羊抗小鼠IgG(Thermo Fisher Scientific，A-21424)、Alexa Fluor 555偶联山羊抗兔IgG(ThermoFisher Scientific，A-21424)或Alexa Fluor 488偶联山羊抗兔IgG(Thermo FisherScientific，A-11034)。所有二抗均以1：1000的稀释度使用。与二抗一起培养后，将组织或细胞在室温下用核染料DAPI(1：4000，Thermo Fisher Scientific，62248)或烟酸己可碱(Hoechst)33342(1：3000，Thermo Fisher Scientific，H3570)在PBS中染色15分钟。然后，用固定培养基(Ployscience，18606-20，美国宾夕法尼亚州)固定组织。在倒置显微镜(CarlZeiss，LSM 900，德国奥伯考亨)下观察所染色的细胞。其结果，如图22所示，与注入媒介物的组相比，确认了在注入Nutlin-3或联合注入Nutlin-3和烟酰胺的组中，细胞组织排列状态得到改善并且玻璃疣减少。此外，已证实，与单独施用Nutlin-3的组相比，在联合注入Nutlin-3和烟酰胺的组中，玻璃疣更减少并且细胞组织排列状态更加得到改善。

Claims (12)

1.一种用于预防或治疗黄斑变性的药物组合物，其含有由以下化学式1所示的咪唑啉衍生物化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分，其中，【化学式1】
Figure FDA0003276696850000011
R1至R3各自独立地为H、C1至C10烷基、C2至C10烯基、C2至C10炔基或C1至C10烷氧基，X1和X2各自独立地为卤素。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述咪唑啉衍生物化合物为Nutlin-1、Nutlin-2或Nutlin-3。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，进一步包括抗氧化剂。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其中，所述抗氧化剂为选自烟酰胺、花青素、苯二酚松香烷二萜、肌肽、类胡萝卜素、叶黄素和藏红花中的类胡萝卜素、姜黄素类、环戊烯酮前列腺素、类黄酮、异戊二烯类黄酮、类视黄醇、芪类、尿酸、维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B6、维生素B9、维生素B12、维生素C、维生素E、硒、锌、脂质过氧化和其副产物的抑制剂和清除剂、替拉扎特和其类似物、衍生物、盐以及其组合中的至少一个。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述咪唑啉衍生物化合物在衰老细胞中过表达p53和p21中的至少任何一个。
6.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述黄斑变性为选自老年性黄斑变性、湿性黄斑变性和干性黄斑变性中的至少一个。
7.一种用于预防或治疗黄斑变性的药物组合物，其含有由以下化学式1所示的咪唑啉衍生物化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分，并且所述咪唑啉衍生物化合物与抗氧化剂联合施用，其中，
【化学式1】
Figure FDA0003276696850000021
R1至R3各自独立地为H、C1至C10烷基、C2至C10烯基、C2至C10炔基或C1至C10烷氧基，X1和X2各自独立地为卤素。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中，所述联合施用是指同时施用咪唑啉衍生物化合物和抗氧化剂，或者在施用咪唑啉衍生物化合物和抗氧化剂中的任何一个后再施用另一个。
9.一种用于预防或改善黄斑变性的保健功能食品，其含有由以下化学式1所示的咪唑啉衍生物化合物或其盐作为有效成分，其中，
【化学式1】
Figure FDA0003276696850000031
R1至R3各自独立地为H、C1至C10烷基、C2至C10烯基、C2至C10炔基或C1至C10烷氧基，X1和X2各自独立地为卤素。
10.根据权利要求9所述的保健功能食品，进一步包括抗氧化剂。
11.一种用于预防或治疗黄斑变性的方法，其包括：向有需要的受试者施用由以下化学式1所示的的咪唑啉衍生物化合物或其药学上可接受的盐，其中，
【化学式1】
Figure FDA0003276696850000032
R1至R3各自独立地为H、C1至C10烷基、C2至C10烯基、C2至C10炔基或C1至C10烷氧基，X1和X2各自独立地为卤素。
12.一种由以下化学式1所示的咪唑啉衍生物化合物或其药学上可接受的盐在制备预防或治疗黄斑变性的组合物中的用途，其中，
【化学式1】
Figure FDA0003276696850000041
R1至R3各自独立地为H、C1至C10烷基、C2至C10烯基、C2至C10炔基或C1至C10烷氧基，X1和X2各自独立地为卤素。
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