CN115558712A - Fam177a1的新用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于FAM177A1应用研究领域，尤其涉及FAM177A1的新用途。主要公开了：检测FAM177A1的制剂在制备心肌细胞肥大疾病的检测产品中的应用。FAM177A1或其表达促进剂在制备治疗心肌细胞肥大疾病药物中的应用。FAM177A1在制备治疗MAPK/ERK通路活化诱发疾病药物中的应用。FAM177A1在制备MAPK酶非诊断治疗活性抑制剂中的应用。本发明中FAM177A1对MAPK抑制作用，FAM177A1可以成为抗心脏肥大靶点，从而预防或治疗心脏肥大的发生及发展；FAM177A1还可作为诊断治疗外周血管阻力如主动脉弓缩窄、高血压导致的心脏肥大的产品而应用。

Description

FAM177A1的新用途
技术领域
本发明属于FAM177A1应用研究领域，尤其涉及FAM177A1的新用途。
背景技术
序列相似性家族177成员A1，英文名称为FAM177A1，别名为C14orf24；Chromosome14 Open Reading Frame 24；包含236个氨基酸，其分子量为23960Da。NCBI参考序列号:NP_775878.2，氨基酸序列如下：
MEVGLPAITLFLTSASSPVVATTMDQEPVGGVERGEAVAASGAAAAAAFGESAGQMSNERGFENVELGVIGKKKKVPRRVIHFVSGETMEEYSTDEDEVDGLEKKDVLPTVDPTKLTWGPYLWFYMLRAATSTLSVCDFLGEKIASVLGISTPKYQYAIDEYYRMKKEEEEEEEENRMSEEAEKQYQQNKLQTDSIVQTDQPETVISSSFVNVNFEMEGDSEVIMESKQNPVSVPP。
近年来，序列相似性家族(Family With Sequence Similarity，FAM)成员针对肿瘤进展、代谢性心血管疾病的研究引起了极大的关注，其中代谢性心血管疾病包括代谢综合征、糖尿病、心肌肥大等。FAM177A1是FAM家族中发现的一种功能未知的新成员，抑制IL-1β激活的NF-κB和炎症基因转录，其对心血管及代谢相关疾病的作用尚不明确。我们的前期研究发现FAM177A1能够明显抑制主动脉弓缩窄导致的心肌细胞肥大，延迟心脏肥大的发展。同时，也发现FAM177A1能够减少苯肾上腺素(Phenylephrine，PE)致外周血管阻力导致的高血压的发生率，因此我们推测FAM177A1可能在心脏生物学，特别是外周血管阻力导致的心脏功能不良的调节中起着重要作用。目前尚不明确FAM177A1是否可以作为防治心脏肥大药物应用的潜能。
心脏肥大的原因有很多，包括高血压性左心室肥大、充血性心力衰竭、前壁心肌梗死、二尖瓣反流、主动脉瓣狭窄、肥厚型心肌病、肺动脉高压、肺心病、扩张性心肌病、心内膜炎、左心室室壁瘤、二尖瓣狭窄等。心脏肥大可分为扩大及肥大两大类：①扩大指心脏的肌肉没有变厚，有时心肌反而变薄。引起这种状况通常是心脏肌肉失去原有弹性，因容量及压力增加，使心脏扩大。常见原因为心肌炎、心瓣膜关闭不全、甲状腺功能亢进症及维生素B1缺乏等。②肥大指心脏肌肉变厚，但心腔没有增大，有时反而会变小，但整个心脏外观比正常大。引起心脏肥大的常见原因为心脏的出口狭窄，如主动脉瓣狭窄等；外周血管阻力增加，如高血压等；心肌病变，如遗传性肥厚型心肌病等。心脏肥大的主要危害是心脏在扩大之后收缩力下降，因而出现心功能不全的表现。
目前，抗心脏肥大方法主要分为3类：①逆转心脏肥大：常用药物包括血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素受体抑制剂或者β受体阻滞剂、醛固酮受体拮抗剂等，通过神经-体液调节的因素一定程度上逆转心腔扩大；②减轻心脏负荷：通过减轻心脏负荷，从而纠正心衰，治疗方法包括利尿治疗、扩张血管治疗等，常用的利尿剂主要是袢利尿剂；③应用扩张血管药物：ACEI(血管紧张素转换酶抑制剂)、ARB(血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂)以及硝酸酯类的药物。FAM177A1作为一种新发现的蛋白，其在心脏肥大中的作用尚无研究。
丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是一组能被不同的细胞外刺激，如细胞因子、神经递质、激素、细胞应激及细胞黏附等激活的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。现在已经出现了一些针对MAPK的活性抑制剂，比如PD98059、黄酮类物质Scutellarin、Selumetinib(AZD6244)等。FAM177A1作为一种新发现的蛋白，其在丝裂原活化蛋白激酶中的调节作用尚无研究。蛋白酶抑制剂是90年代中后期的新产品，药物合成工艺难度大，也是导致抗HⅣ治疗费用居高不下的主要原因，被称为"必须跨越壁垒"。蛋白酶抑制剂主要有：奈非那韦、沙奎邦韦、茚地那韦、安泼那韦、利托那韦、洛匹那韦及复合制剂。
发明内容
针对上述问题，本发明提供FAM177A1的新用途，主要解决了FAM177A1在一些疾病诊断治疗中的应用空白，同时还解决了FAM177A1在蛋白调节中的应用空白。
为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
检测FAM177A1的制剂在制备心肌细胞肥大疾病的检测产品中的应用。
在一些方式中，所述检测FAM177A1的制剂为FAM177A1表达检测剂；所述心肌细胞肥大疾病包括心肌肥大、心脏肥大。
在一些方式中，所述心脏肥大包括心室肥厚、心脏扩大、心房扩大。
其中，所述心脏肥大为外周血管阻力增加(如高血压)或心脏出口狭窄(如主动脉瓣狭窄)或心肌病变(如遗传性肥厚型心肌病)诱发的肥厚性心肌病。
FAM177A1或其表达促进剂在制备治疗心肌细胞肥大疾病药物中的应用。
FAM177A1在制备治疗MAPK/ERK通路活化诱发疾病药物中的应用。
在一些方式中，FAM177A1为过表达FAM177A1，所述表达促进剂为FAM177A1过表促进剂；所述心肌细胞肥大疾病为心肌肥大或心脏肥大。
在一些方式中，所述心脏肥大包括心室肥厚、心脏扩大、心房扩大。
其中，所述心脏肥大为外周血管阻力增加(如高血压)或心脏出口狭窄(如主动脉瓣狭窄)或心肌病变(如遗传性肥厚型心肌病)诱发的肥厚性心肌病。
在一些方式中，所述FAM177A1或其表达促进剂表现为抑制心肌细胞肥大、胶原纤维增加。
FAM177A1在制备防治高血压药物(包括PE致外周血管阻力导致的高血压)中的应用。
FAM177A1在制备MAPK酶或MAPK/ERK激酶或/ERK激酶非诊断治疗活性抑制剂中的应用。
在一些方式中，所述FAM177A1为过表达FAM177A1。
本发明的有益效果是：
FAM177A1对MAPK抑制作用，FAM177A1可以成为抗心脏肥大靶点，从而预防或治疗心脏肥大的发生及发展；FAM177A1还可作为诊断治疗外周血管阻力如主动脉弓缩窄、高血压导致的心脏肥大的产品而应用。
附图说明
图1为大鼠原代心肌细胞给予PE处理FAM177A1蛋白表达；
图2为对照组和处理组心肌肥厚相关因子(ANP、BNP)基因表达；
图3为假手术组(sham)和手术组(TAC)利用WB和QPCR检测大鼠心肌原代细胞蛋白/基因表达；
图4为对照组和处理组利用MASSON染色检测心脏肥大情况；
图5为对照组和处理组利用MASSON染色检测心脏胶原纤维(蓝色)和肌纤维(红色)表达情况；
图6为MAPK信号通路分子蛋白、酶的表达。
具体实施方式
下面对本发明的技术做进一步说明：
本部分第一方面介绍FAM177A1在诊断心肌细胞肥大疾病中的应用：
检测FAM177A1的制剂在制备心肌细胞肥大疾病的检测产品中的应用。
FAM177A1与心肌细胞肥大疾病的发生正相关。通过检测FAM177A1实现对心肌细胞肥大疾病的检测，通过FAM177A1来对心肌细胞肥大疾病的发展进行关联检测。前述的检测FAM177A1的制剂不局限于试剂(如探针、引物等)，其他能够实现FAM177A1检测目的的方式并用于评价心肌细胞肥大疾病的也均应在本发明范围内，包括新的可行技术。
其中之一，所述心肌细胞肥大疾病包括心肌肥大、心脏肥大。其中，所述心脏肥大包括心室肥厚、心脏扩大、心房扩大。
心肌细胞肥大疾病具有多种诱发类型，包括：高血压或主动脉狭窄或室内压增高诱发的肥厚性心肌病；所述检测产品包括诊断产品。
其中之二，所述检测FAM177A1的制剂为FAM177A1表达检测剂。检测剂包括PCR、WB检测等。通过PCR检测技术检测待检物中FAM177A1的表达量，当待检物为相应病症的样品时，其FAM177A1表达也会相应升高，具体的表达量升高标准以常规医学标准为参考。
本部分第二方面介绍FAM177A1在防治心肌细胞肥大疾病中的应用：
第一，FAM177A1或其表达促进剂在制备治疗心肌细胞肥大疾病药物中的应用。FAM177A1或其表达促进剂在制备治疗心肌细胞肥大疾病药物中作为主要的有效成分。
其中，所述心肌细胞肥大疾病包括心肌肥大、心脏肥大。其中，所述心脏肥大包括心室肥厚、心脏扩大、心房扩大。
同时，所述心肌细胞肥大疾病包括高血压或室内压增高诱发的肥厚性心肌病。心肌细胞肥大疾病还包括由心肌细胞肥大的并发疾病，包括心肌细胞肥大诱发的心内膜炎、心力衰竭、动脉栓塞、心律失常等，通过减缓心肌细胞肥大也可相应的实现并发疾病的治疗。
第二，FAM177A1在制备治疗MAPK/ERK通路活化诱发疾病药物中的应用。FAM177A1通过抑制MAPK/ERK通路活化实现对相应病症的治疗。MAPK/ERK通路活化诱发疾病包含心肌细胞肥大疾病，还包含其他一些通过抑制MAPK/ERK即可实现治疗缓解的诱发病症。
其中，关于抑制MAPK/ERK即可实现治疗缓解的诱发病症。前述的诱发病症除了包含心肌细胞肥大疾病外，还可解释为在本发明申请日前已经被证实通过抑制MAPK/ERK即可实现治疗的疾病至少包括下述相关疾病。如：通过抑制MAPK/ERK抗皮肤老化与辐射性皮肤早衰(CN113853218A)、分泌型卷曲相关蛋白1通过MAPK/ERK信号通路抑制结直肠癌细胞的迁移侵袭(《安徽医药》)，基于MAPK/ERK信号通路探讨温经化瘀止痛法治疗寒凝血瘀证原发性痛经的机制(《中国实验方剂学杂志》)等，也应当属于本条记载的FAM177A1制药可治疗疾病，具体的验证实验本发明就不再赘述。
在医药用途中，FAM177A1主要在药物中作为主要的有效成分，其在制药过程中作为一个成分使用。
在部分实例中，FAM177A1为过表达FAM177A1，比如为FAM177A过表达腺病毒。FAM177A1表达促进剂为FAM177A1过表促进剂，不做具体限定，采用现有的促进剂即可。
在作为药物治疗中，所述FAM177A1或其表达促进剂表现为抑制心肌细胞肥大、胶原纤维增加。由此实现相应病症的治疗。
本部分第三方面介绍FAM177A1在非诊断治疗场景中的应用：
FAM177A1在MAPK酶非诊断治疗活性抑制剂中的应用。本条应用主要针对的是非疾病诊断治疗的应用场景，不属于制药方面。其主要表现为一些生物调节制剂，比如一些商用抑制剂。比如使用FAM177A1作为MAPK酶、心钠肽(ANP)、脑钠肽(BNP)、MAPK/ERK激酶、ERK酶、Jnk酶、p38酶任一的体外活性抑制剂，从而实现部分实验环境的控制。在非诊断治疗中，FAM177A1既可作为抑制剂的一个有效成分，也可直接单独进行使用。包括将FAM177A1用于制备抑制剂，还包括将FAM177A1直接作为MAPK酶非诊断治疗活性抑制剂使用，均属于本条所述的应用。
并且，在前段使用环境中，抑制MAPK活性包括抑制其多个信号通路。
其中，所述FAM177A1可为过表达FAM177A1，使用过表达FAM177A1能够显著抑制相关物质表达。
本部分第四方面结合具体研究项目进行介绍：
实验内容
Masson染色实验：Masson染色是指用两种或三种阴离子染料混合，胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色。用来显示组织中纤维以及炎性因子的染色方法之一。将心脏特异性过表FAM177A1(FAM)和对照(GFP)大鼠分别行假手术(SHAM)和主动脉弓缩窄术手术(TAC)。术后8周分离大鼠心脏组织，进行Masson染色分析(百奥斯生物，湖北武汉)，结果用OlympuscellSens Entry拍摄。
PE诱导心肌细胞肥大实验：将大鼠心肌原代细胞接种于6孔板中，培养至80％密度。细胞使用溶剂对照、PE(50μM)分别处理细胞24h后，收集细胞，使用蛋白免疫印迹(WB)或实时定量荧光PCR(qPCR)检测心肌肥厚指标变化。
大鼠主动脉弓缩窄术(transverse aortic constriction，TAC)实验：TAC用于模拟高血压或室内压增高而引起的肥厚性心肌病。大鼠主动脉弓暴露后，弓部穿线打结，结内垫缩窄用的针头，线扎紧后，取出针头，关闭胸腔，缝合颈部和胸部的皮肤。术后1、2、4、8周检测心肌肥厚相应指征变化，使用Olympus cellSens通道对手术后的心脏进行拍照。
腺病毒包装及转染：293细胞接种于1个60mm培养盘中，当细胞密度为50-70％时，将6μg质粒通过PEI转染细胞，培养6-8h后，移去培养基，加入2-3ml DMEM完全培养基(体积密度10％的FBS)，在转染后7到10天将细胞用移液器吹下来。收集溶液，离心弃上清，将细胞重悬于2.0ml PBS，于液氮中冻结细胞，37℃水浴中溶解，剧烈振荡。此步骤共进行3次，得到含病毒上清液。将293细胞以50-70％的汇合率铺于60mm培养盘中，以30-50％的体积比加入含病毒上清液。在感染后2-3天即可看到明显的细胞裂解或细胞病变效应(cytopathiceffect，CPE)现象，再次收集病毒上清。进行3轮扩增得到滴度足够的病毒。大鼠原代心肌细胞培养至细胞密度为70-80％，将收集的病毒感染大鼠心肌原代细胞，24-48h后，显微镜下观测细胞荧光。
MAPK酶、ERK激酶等体外活性调节实验：体外蛋白孵育的实验，所用的蛋白为大鼠来源FAM177A1，蛋白浓度为0.1ug/ml。验证MAPK酶等在FAM177A1作用下的表达情况。
结果分析
结果一：PE诱导心肌肥大后，ANP、FAM177A1表达上升，且FAM177A1表达与PE诱导心肌肥大正相关。
图1中a为雄性SD大鼠心肌代原细胞培养，分别给予对照(Vehicle)、PE(50μM)处理24h；图1中b为不同浓度PE(5、50、150μM)处理大鼠原代心肌细胞。收集不同处理组蛋白，WB检测FAM177A1、心肌肥厚指标ANP蛋白表达量。
由图1中a可知，与对照处理组相比，PE处理诱导大鼠心肌原代细胞中FAM177A1表达上升；由图1中b可知，大鼠心肌原代细胞随着PE处理浓度的上升，FAM177A1表达上升，且心肌肥大指标ANP表达上升，提示FAM177A1随着PE诱导的心肌细胞肥大的增加而表达上升，及FAM177A1表达与心肌肥大正相关。
同时验证了，FAM177A1能够减少苯肾上腺素(Phenylephrine，PE)致外周血管阻力导致的高血压的发生率(具体验证方式与前序相近，不多加赘述)，前述高血压为PE诱发高血压。
结果二：干预FAM表达调控心肌细胞肥大。
图2为大鼠心肌原代细胞给予对照(Adv-GFP)、FAM177A1过表腺病毒(Adv-FAM)、FAM177A1敲低腺病毒(Adv-sh-FAM)后行磷酸盐缓冲溶液(PBS)、PE(50μM)处理24h，收集细胞，提取RNA，采用qPCR技术检测心肌肥厚相关指标(ANP(图2a)、BNP(图2b))和心肌细胞特异表达指标MYH7(图2c))表达水平。
由图2中可知，在无刺激条件下，过表或者敲低FAM，心肌细胞中ANP、BNP均略有上升，PE诱导下，过表FAM显著抑制ANP、BNP表达，敲低FAM导致心肌肥厚指标表达显著上升(图2a和b)；而PE和/或干预FAM表达处理，对心肌细胞指标MYH7表达无相同作用。以上结果说明，在PE诱导的心肌细胞肥大模型中，干预FAM表达调控心肌细胞肥大。
结果三：TAC术导致大鼠心肌肥厚后ANP、BNP、FAM177A1表达上升，FAM177A1表达与心肌肥厚程度正相关。
大鼠分别行假手术(sham)或TAC手术后，利用WB和qPCR实验检测心肌细胞相关指标表达情况。
图3中a为假手术组(sham组)和TAC术后8周(TAC 8w)利用WB实验检测心脏FAM177A1、β-tubulin蛋白表达情况。其中第一列为FAM177A1表达，第二列为内参蛋白β-tubulin表达。
利用qPCR检测假手术组(sham)、TAC术后1周(TAC 1w)、TAC术后2周(TAC 2w)、TAC术后4周(TAC 4w)和TAC术后8周(TAC 8w)大鼠心脏中fam177a1(图3b)、ANP(图3c)、BNP(图3d)、MYH6(图3e)。
由图3中a和b可知，大鼠行TAC手术导致FAM177A1的蛋白水平和RNA水平均显著上升；由图3中c和d可知，TAC手术导致心肌肥厚指标ANP、BNP表达上升，心肌细胞特异性指标MYH6的表达随着TAC术后时间延长而表达下降(图3e)。结果可知，TAC术导致大鼠心肌肥厚，FAM177A1表达与心肌肥厚程度正相关。
结果四：过表FAM177A1显著抑制了TAC手术导致的大鼠心脏肥大、心室增大。
图4为FAM177A1心脏特异性过表大鼠(FAM)和对照大鼠(GFP)分别行假手术(SHAM)和TAC手术，8周后Masson染色检测心脏横切面情况。
图4中a为对照大鼠行假手术(GFP+SHAM组)心脏横切面，图4中b为对照大鼠行TAC(GFP+TAC组)心脏横切面，图4中c为FAM过表大鼠行假手术(FAM+SHAM组)心脏横切面，图4中d为FAM过表大鼠行TAC(FAM+TAC组)心脏横切面。
由图4中a和b可知，TAC手术导致大鼠心脏肥大、心室增大。
由图4中b和d可知，过表FAM177A1显著抑制了TAC手术导致的大鼠心脏肥大、心室增大。
结果五：过表FAM177A1显著抑制了TAC手术导致的大鼠心肌细胞肥大、胶原纤维增加。
图5为FAM177A1心脏特异性过表大鼠(FAM)和对照大鼠(GFP)分别行假手术(SHAM)和TAC手术，8周后Masson染色检测心脏胶原纤维(蓝色，箭头标注了部分)和肌纤维(红色)表达情况。
图5中a为对照大鼠行假手术(GFP+SHAM组)心脏胶原纤维和肌纤维表达情况，图5中b为对照大鼠行TAC(GFP+TAC组)心脏胶原纤维和肌纤维表达情况，图5中c为FAM过表大鼠行假手术(FAM+SHAM组)心脏胶原纤维和肌纤维表达情况，图5中d为FAM过表大鼠行TAC(FAM+TAC组)心脏胶原纤维和肌纤维表达情况。
由图5中a和b可知，TAC手术导致大鼠心肌细胞肥大、胶原纤维增加。
由图5中b和d可知，过表FAM177A1显著抑制了TAC手术导致的大鼠心肌细胞肥大、胶原纤维增加。
结果六：FAM177A1能够直接抑制PE诱导的MAPK/ERK信号通路，并可通过机理进一步抑制心肌细胞肥大和心脏肥大。并可体外抑制ERK等酶活性。
大鼠心肌原代细胞分别给予腺病毒对照(GFP)、FAM177A1过表达腺病毒(Adv)、FAM177A1敲低腺病毒处理24h后，给予PBS或PE(50μM)处理24h，通过WB检测MAPK信号通路变化情况。
图6中a第一列为磷酸化jnk(P-jnk)表达，第二列为总的jnk(t-jnk)表达，第三列为磷酸化的cjun(P-cjun)表达，第四列为内参蛋白GAPDH表达。
图6中b第一列为磷酸化erk(P-erk)表达，第二列为总的erk(t-erk)表达，第三列为磷酸化的p38(P-p38)表达，第四列为总的p38(t-p38)表达，第五列为内参蛋白GAPDH表达。
由图6中a和b可知，PE促进MAKP/ERK的磷酸化增加，而过表达FAM177A1，显著抑制PE诱导的大鼠心肌原代细胞MAPK/ERK信号通路的激活；反之，抑制FAM177A1表达显著促进MAPK/ERK信号通路的激活。
由图6中c，体外蛋白孵育的实验，所用的蛋白为大鼠来源FAM177A1，蛋白浓度为0.1ug/ml。表明FAM177A1也可直接在蛋白层面起到调节作用，验证了非疾病环境对MAPK酶和MAPK/ERK激酶、ERK酶、Jnk酶、p38酶的活性抑制作用，可以直接作为酶活性抑制，实现工业化应用，尤其作为一些商业实验制剂。
综上实验结果可知，FAM177A1能够直接抑制PE诱导的MAPK/ERK信号通路，抑制心肌细胞肥大和心脏肥大。并且，FAM177A1还能直接对活性起到调节作用，验证了体外酶活性、肽表达抑制剂的可行性。
本领域的技术人员可以明确，在不脱离本发明的总体精神以及构思的情形下，可以做出对于以上实施例的各种变型。其均落入本发明的保护范围之内。本发明的保护方案以本发明所附的权利要求书为准。

Claims (10)

1.检测FAM177A1的制剂在制备心肌细胞肥大疾病的检测产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述检测FAM177A1的制剂为FAM177A1表达检测剂；所述心肌细胞肥大疾病包括心肌肥大、心脏肥大。
3.根据权利要求2所述的应用，其中，所述心脏肥大包括心室肥厚、心脏扩大、心房扩大；心脏肥大为外周血管阻力增加或心脏出口狭窄或心肌病变诱发的心脏疾病。
4.FAM177A1或其表达促进剂在制备治疗心肌细胞肥大疾病药物或高血压药物中的应用。
5.FAM177A1在制备治疗MAPK/ERK通路活化诱发疾病药物中的应用。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其中，FAM177A1为过表达FAM177A1；表达促进剂为FAM177A1过表促进剂，心肌细胞肥大疾病包括心肌肥大、心脏肥大。
7.根据权利要求6所述的应用，其中，所述心脏肥大包括心室肥厚、心脏扩大、心房扩大；心脏肥大为外周血管阻力增加或心脏出口狭窄或心肌病变诱发的心脏疾病。
8.根据权利要求4所述的应用，其中，所述FAM177A1或其表达促进剂表现为抑制心肌细胞肥大和/或抑制胶原纤维增加。
9.FAM177A1在制备MAPK酶或MAPK/ERK激酶或/ERK激酶非诊断治疗活性抑制剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其中，所述FAM177A1为过表达FAM177A1。
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