CN115558631A

CN115558631A - 一种大菱鲆肠道组织细胞系

Info

Publication number: CN115558631A
Application number: CN202211253204.7A
Authority: CN
Inventors: 薛亭; 刘怡萍; 李超
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2022-10-13
Filing date: 2022-10-13
Publication date: 2023-01-03

Abstract

本发明提供一种大菱鲆肠道组织细胞系，其保藏编号为CCTCCNO:C2022231。本发明所提供的大菱鲆肠道组织细胞系可连续传代，迄今已传至60代并保持稳定，能够提供大量稳定的大菱鲆肠道细胞，用于免疫功能基因和上皮粘附功能基因的研究等。所提供的细胞系性状优良，为成纤维细胞，细胞呈梭形或不规则三角形，胞体向外延伸出几个不规则突起，细胞间排列紧密。3‑4天传代一次，复苏效率高，并可进行质粒转染、siRNA干扰多类分子生物学实验。

Description

一种大菱鲆肠道组织细胞系

技术领域

本发明属于鱼类细胞培养技术领域，具体涉及一种大菱鲆肠道组织细胞系。

背景技术

大菱鲆(Scophthalmus maximus)隶属于菱鲆科(Scophthalmidae)、菱鲆属(Scophthalmus)，是许多国家的重要经济鱼种。然而，近年来，大菱鲆养殖频繁受到细菌性疾病的干扰，特别是杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、迟发爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)和鳗弧菌(Vibrio anguillarum)，严重制约了大菱鲆养殖的发展。因此，对大菱鲆的免疫系统和疾病机制的研究迫在眉睫。

细胞培养技术是生物学研究的重要技术，其主要是指从生物体内取出组织或细胞，在体外适当的条件下，使之存活、生长和繁殖，并维持其结构和功能的方法。相比于直接使用鱼类个体进行实验，利用鱼类细胞系进行实验有操作简便、不受场地季节等约束、重复性高等优势。细胞体外培养应用范围涉及鱼类免疫学、病毒学、分子遗传学、药理学、毒理学、细胞工程育种及种质保存等多种学科。

考虑到细菌性疾病是对水生生物危害最严重的疾病之一，严重影响我国水产养殖业的发展。随着细胞培养技术的发展，鱼类细胞培养在鱼类疾病学和免疫学研究中的作用也越来越明显。虽然鱼类细胞原代培养技术目前是一种较为成熟的技术，但是要获得稳定传代、适用于实验模型构建的细胞系仍存在较大偶然性及困难性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种大菱鲆肠道细胞系及其构建方法和应用，所保藏的细胞系传代稳定、存活率高；为大菱鲆肠道性细菌疾病的研究提供研究基础，从而弥补对鱼类肠道疾病研究的不足。

本发明所提供的大菱鲆肠道细胞SMI，于2022年08月24日保藏在中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2022231。

本发明提供的大菱鲆肠道细胞SMI是从大菱鲆幼鱼肠道组织构建后筛选获得的。

本发明所提供的大菱鲆肠道组织细胞SMI，其建立方法包括如下的步骤：

1)大菱鲆肠道组织的获取：

取6月龄的大菱鲆幼鱼的肠道组织，用PBS漂洗后，移入包含有青霉素、链霉素、庆大霉素和两性霉素B的DMEM基础培养基中；

2)原代培养：

将大菱鲆肠道组织浸泡于包含有青霉素、链霉素、庆大霉素和两性霉素B的DMEM基础培养基中2小时后，然后移至75％乙醇中浸泡1min，然后用PBS漂洗。最后将菱鲆肠道组织轻轻刮去粘液，用剪刀剪碎至1mm³大小的组织块。将组织块转移到T25的培养瓶中，吸去培养基，仅留一点用于保持湿润，将培养瓶放置于20℃放置2h使组织块贴附于培养瓶底。加入完全培养基培养，最后放置于20℃培养箱中培养；

3)传代培养：原代培养至迁出细胞铺满培养瓶底板的80％左右时，吸走培养基，并用PBS清洗除去多余的血清，然后用0.25％的胰蛋白酶消化贴壁细胞，再进行传代培养、筛选获得大菱鲆肠道组织细胞系。

在本发明的一个优选实施方案中，所述完全培养液为以DMEM+Hepes为基础培养基，包含有终浓度分别为15％胎牛血清FBS，5‰β-巯基乙醇，1×非必须氨基酸，500U/mL青霉素，500μg/mL链霉素，1.25μg/mL两性霉素B和250μg/mL庆大霉素。

本发明所提供的大菱鲆肠道组织细胞系用于免疫功能基因和上皮粘附功能基因的研究。

本发明所提供的细胞系还用于肠道菌群的功能性研究；

该细胞系还可用于检测水环境中重金属离子及其他化学物质对肠道细胞的毒性影响。

本发明再一个方面还提供一种培养上述的大菱鲆肠道组织细胞系SMI的方法，所述的方法是在添加有10-15％胎牛血清的DMEM或L15培养基中培养，培养的温度为20-28℃，优选为24℃。

本发明所提供的大菱鲆肠道组织细胞系可连续传代，迄今已传至60代并保持稳定，能够提供大量稳定的大菱鲆肠道细胞，用于免疫功能基因和上皮粘附功能基因的研究等。所提供的细胞系性状优良，为成纤维细胞，细胞呈梭形或不规则三角形，胞体向外延伸出几个不规则突起，细胞间排列紧密。3-4天传代一次，复苏效率高，并可进行质粒转染、siRNA干扰多类分子生物学实验。

附图说明

图1：大菱鲆肠道细胞系原代培养第15天的显微镜照片图(10×)，

图2：大菱鲆肠道细胞系复苏后培养24小时的显微镜照片图(10×)，

图3：大菱鲆肠道细胞系的染色体分析及核型分布图，

图4：大菱鲆肠道细胞系在不同浓度胎牛血清中培养5天细胞生长检测图，

图5：大菱鲆肠道细胞系在不同温度中培养5天细胞生长检测图，

图6：大菱鲆肠道细胞系在不同类型基础培养基中培养5天细胞生长检测图，

图7：细胞系转染GFP-siRNA 48小时的显微镜照片图，

图8：细胞转染pEGFP-N1 48小时的显微镜照片图。

具体实施方式

本发明使用的完全培养液包含DMEM+Hepes基础培养基、胎牛血清FBS，β-巯基乙醇、非必须氨基酸(Gibco，11140050)、青霉素、链霉素、两性霉素B和庆大霉素。其中DMEM培养基、胎牛血清FBS、非必须氨基酸为细胞生长提供必须的营养物质；Hepes为细胞提供稳定的生长环境；β-巯基乙醇刺激细胞增殖，提高细胞活性；青霉素、链霉素、两性霉素B和庆大霉素则扩大了抗菌谱，特别是在原代培养时能有效抑制细菌生长，防止污染。

下面结合附图及具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1：细胞系的构建

本发明构建细胞系所使用的大菱鲆来自于山东烟台海阳黄海水产有限公司。

本实施例中使用的溶液相关的信息如下：

1)PBS，为购买的商业1×PBS。

2)基础培养基：DMEM粉末13.5g(Invitrogen，12800-058)+Hepes粉末9.528g+1L三蒸水，4℃储存。

3)完全培养基：7.5mL胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS，Gibco)+0.5mL 100×青霉素-链霉素双抗溶液、终浓度为1.25μg/mL两性霉素B和250μg/mL庆大霉素、50μLβ-巯基乙醇、0.5mL 100×非必须氨基酸溶液及40mL基础培养基，4℃储存。

4)细胞冻存液：1mL DMSO(购自Invitrogen公司)+2mL胎牛血清+7mL完全培养基，现用现配。

本发明的大菱鲆肠道细胞系的建立方法的步骤如下：

1)将6月龄的大菱鲆幼鱼(长约10cm，重约25g)放入桶中，随后滴入2-3滴丁香酚，直至鱼停止游动，侧躺于桶底，鳃盖张合停止。以浸有75％酒精的棉球擦拭鱼体表面，用灭菌的手术剪分离组织。取出的肠道组织放入含青霉素-链霉素的PBS溶液的15mL离心管中，后立刻移入超净台进行操作。

2)超净工作台中，打开紫外灯灭菌，取肠道组织。在6孔板中加入3孔的PBS、1孔的75％无菌乙醇、2孔含有4种抗生素(青霉素、链霉素、庆大霉素和两性霉素B)的DMEM培养基中。将组织依次通过PBS、PBS、75％无菌乙醇(浸泡2min)、PBS、含抗生素DMEM(1h)、含抗生素DMEM(0.5-1h)。将组织块转移到6cm平皿中，用剪刀或解剖刀将组织切割成小块。将小块的组织块(1mm³)转移到T25的培养瓶中，摆放好组织，吸干多余的培养基，在20℃培养箱中平放培养瓶2h，竖放培养瓶0.5h，加入完全培养基培养。如图1所示，大菱鲆肠道细胞原代培养后12天，贴壁细胞及组织块周围即有新细胞迁出，第15天左右有小片细胞簇出现。

3)当原代细胞在培养瓶底的覆盖率达到80％左右时，可以进行传代培养。吸走培养基，并用PBS清洗除去多余的血清，然后用0.25％的胰蛋白酶消化贴壁细胞，消化时间约3min，不要晃动培养瓶，吸走胰酶，加入完全培养基吹打，悬浮肠道细胞，以1：2进行传代。传代后置于20℃培养箱培养。此后每隔3-4天传代一次，直至50代以后。培养期间细胞状态稳定，传代速度快，适合作为实验工具细胞。

最终筛选获得的大菱鲆肠道组织细胞系命名为SMI，于2022年08月24日保藏在中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2022231。

实施例2：大菱鲆肠道细胞SMI的冻存与复苏

1)冻存：取一瓶T25培养瓶中处于对数生长期的大菱鲆肠道细胞系细胞，0.25％胰蛋白酶消化后离心收集细胞。用冻存液按5×10⁵cells/mL冻存液重悬细胞，轻轻吹打细胞沉淀，使其均匀的分散在冻存液中。将细胞悬液分装到冻存管，每管1.5-1.8mL。细胞冻存遵循慢冻原则，4℃放置10min、-20℃放置30min、-80℃放置1天后转移到液氮中保存。

2)复苏：细胞复苏遵循速融原则。将冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃水浴锅，轻轻晃动冻存管使其快速均匀解冻，解冻时间不超过1min。将融化的细胞悬液1,200rpm离心5min，除去DMSO。用5mL完全培养基重悬离心的细胞，将细胞悬液移入T25细胞培养瓶，置于20℃培养箱中培养。

如图2，大菱鲆肠道细胞系复苏后24h贴壁率达到约80％，与冻存前细胞形态相似，状态良好。

实施例3：大菱鲆肠道细胞SMI的染色体核型分析

1)SMI细胞的染色体核型分析在第10代进行。取处于对数生长期的大菱鲆肠道细胞，用最终浓度为10μg/mL的秋水仙碱，继续培养12h后胰蛋白酶消化细胞，得到细胞悬液。

2)将收集到的细胞悬液1,200rpm离心10min，轻轻吸弃上清。加2mL 1×PBS到15mL离心管重悬细胞，再加10mL冰水使细胞低渗吸水膨胀。将细胞转移到T75的培养瓶中，室温放置10min。缓慢加入1mL固定液(冰醋酸:甲醇＝1:3)。将细胞转移到15mL离心管中，1200rpm离心7min，小心移去上清，缓慢滴加5mL固定液，小心吹打使细胞重悬，室温放置10min，1200rpm离心7min。上述步骤重复3次，加0.5mL固定液重悬细胞。将细胞悬液从高处滴落在预冷的载玻片上，自然干燥后用1×吉姆萨室温染色10min。用无酶无菌水轻轻冲洗玻片表面，干燥后中性树脂封片。

染色体的数目与核型是细胞遗传学的基础，是鉴定生物种属和性别的重要指标。在细胞培养中，染色体是鉴定细胞来源以及其在培养过程中是否发生转化的重要指标。如图3所示，对大菱鲆肠道细胞系的染色体分析显示其核型呈近似正态分布；46％观察到的分裂相细胞染色体数目为44条；染色体数目均在单倍体和四倍体之间(22-88条)。综上证明，本发明获得的细胞系与大菱鲆个体染色体数相同。

实施例4：大菱鲆肠道细胞SMI的最佳培养条件筛选

首先是最佳血清浓度的筛选。配制2％、5％、10％、15％和20％ FBS浓度的完全培养基。取52代SMI进行消化，调整细胞浓度，按每孔5×10⁴个细胞将SMI细胞接种到48孔板，每种细胞的每种血清浓度接种15个孔，将细胞放入20℃培养箱进行培养。之后每隔24h每种血清浓度中的细胞消化3个孔收集细胞，共收集5天，使用细胞计数仪进行细胞计数，计算每孔细胞总量。以培养时间为横坐标，细胞数为纵坐标，绘制细胞在不同基础培养基条件下的生长曲线，确定细胞生长培养基中适宜的血清浓度，结果如图4所示。随着血清浓度的升高，SMI的生长速度增高，血清浓度为20％时，SMI的生长速度最快，但在生长至第5天，细胞数量下降到与10％和15％的血清浓度基本一致，细胞的生长到达衰亡期。为保障SMI细胞的稳定生长，血清浓度维持在10％和15％即可。

其次取52代SMI进行最适生长温度测定。将SMI细胞按每孔5×10⁴个细胞接种到6个48孔板中，每个48孔板接种15个孔。将48孔板放入28℃培养箱中培养3h，待细胞贴壁后将48孔板转入16℃、20℃、24℃、28℃和32℃5种不同温度的培养箱中培养。之后每隔24h消化3个孔收集细胞，共收集5天。将收集的细胞用细胞计数仪进行计数，计算每孔细胞总量。以培养时间为横坐标，细胞数为纵坐标，绘制细胞在不同温度条件下的生长曲线，确定SMI细胞的最适生长温度，结果如图5所示。细胞在24℃环境下生长最为迅速，其次是20℃和28℃，在16℃条件下只能缓慢生长，在32℃条件下生长受到抑制。

配制分别以DMEM、DMEM:F12、M-199、RPMI-1640、和L15为基础培养基的全培养基进行SMI生长的最佳基础培养基的检测。取52代SMI进行消化，调整细胞浓度，按每孔5×10⁴个细胞将SMI细胞接种到48孔板，每种细胞的每种基础培养基接种15个孔，将细胞放入20℃培养箱进行培养。之后每隔24h每种细胞消化3个孔收集细胞，共收集5天，细胞计数仪进行细胞计数，计算每孔细胞总量。以培养时间为横坐标，细胞数为纵坐标，绘制细胞在不同基础培养基条件下的生长曲线，确定细胞生长的最佳基础培养基，结果如图6所示。SMI在DMEM和L15的基础培养基中生长最快，在DMEM:F12和1640的基础培养基中生长缓慢，在M-199的培养基中生长受到抑制。

实施例5：大菱鲆肠道细胞SMI的siRNA转染效果检测

提前一天将大菱鲆肠道细胞接种在24孔板中(3个孔)，以转染时细胞处于对数期且细胞密度在60％左右为宜。利用Takara的Xfect Transfection Reagent转染试剂盒，首先取25pmol GFP-siRNA到30μL Xfect Reaction Buffer中混匀，静置5s后再加入2.5μLXfect RNAPolymer混匀，室温放置10min。吸出24孔板中0.2mL培养基，剩0.3mL/孔，后将转染试剂加入24孔板。转染6h后，更换为0.5mL新鲜培养基继续培养48h。转染48h后在倒置荧光显微镜下观察细胞转染情况，并拍照记录。

RNA干扰技术通过抑制转录翻译，以阻止某特定基因的表达，成为后基因组时代验证基因功能和药物靶向的重要工具。转染48h后，在荧光显微镜下镜检，如图7，观察到报告的绿色荧光(GFP)。实验结果表明，建立的大菱鲆肠道组织细胞系能够适用于小RNA干扰实验。

实施例6：大菱鲆肠道细胞SMI的质粒转染效果检测

提前一天将大菱鲆肠道细胞接种在24孔板中(3个孔)，以转染时细胞处于对数期且细胞密度在60％左右为宜。利用Takara的Xfect Transfection Reagent转染试剂盒，首先取1μg pEGFP-N1到30μL Xfect Reaction Buffer中混匀，静置5s后再加入0.3μL XfectPolymer混匀，室温放置10min。吸出24孔板中0.2mL培养基，剩0.3mL/孔，后将转染试剂加入24孔板。转染6h后，更换为0.5mL新鲜培养基继续培养48h。转染48h后在倒置荧光显微镜下观察细胞转染情况，并拍照记录。结果如图8所示，观察到报告的绿色荧光(EGFP)。

实验结果表明，建立的大菱鲆肠道组织细胞系能够适用于质粒转染的相关实验。通过荧光显微镜的观察，SMI对siRNA和质粒的转染效率均超过30％，高于实验室常用的其它肠道组织来源的鱼类细胞，如EPC、ZF4等。

以上所述，仅为本发明得较佳实施例，故不能依此限定本发明得实施范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，都应仍属本发明涵盖范围。

Claims

1.一种大菱鲆细胞系，其特征在于，所述的细胞系的保藏编号为CCTCC NO:C2022231。

2.如权利要求1所述的细胞系，其特征在于，所述的细胞系是从大菱鲆幼鱼肠道组织构建后筛选获得的。

3.如权利要求1所述的细胞系，其特征在于，所述的细胞系的建立方法包括如下的步骤：

1)大菱鲆肠道组织的获取：

2)原代培养：

将大菱鲆肠道组织浸泡于包含有青霉素、链霉素、庆大霉素和两性霉素B的DMEM基础培养基中2小时后，然后移至75％乙醇中浸泡1min，然后用PBS漂洗；最后将菱鲆肠道组织剪碎至1mm³大小的组织块，将组织块转移到培养瓶中，使组织块贴附于培养瓶底，加入完全培养基培养，最后放置于20℃培养箱中培养；

3)传代培养：用0.25％的胰蛋白酶消化贴壁的原代培养细胞，再进行传代培养，筛选获得大菱鲆肠道组织细胞系。

4.如权利要求1所述的细胞系，其特征在于，所述的完全培养液为以DMEM+Hepes为基础培养基，包含有终浓度分别为15％胎牛血清FBS，5‰β-巯基乙醇，1×非必须氨基酸，500U/mL青霉素，500μg/mL链霉素，1.25μg/mL两性霉素B和250μg/mL庆大霉素。

5.权利要求1所述的细胞系在免疫功能基因和上皮粘附功能基因的研究中的应用。

6.权利要求1所述的细胞系在肠道菌群的功能性研究中的应用。

7.权利要求1所述的细胞系在检测水环境中重金属离子及其它化学物质对肠道细胞的毒性影响中的应用。

8.一种培养权利要求1所述的细胞系的方法，其特征在于，所述的方法是在添加有10-15％胎牛血清的培养基中进行培养。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的培养基为的DMEM或L15培养基。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的方法，其培养的温度为20-28℃。