CN115554458B - 一种丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于抗菌敷料领域，涉及一种丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料及其制备方法。通过以改性丝瓜络为基体材料，经软化、水煎复合药物浸泡得到药性丝瓜络；随后将药性丝瓜络浸泡于溶菌酶水溶液中，并与防粘连网膜复合，形成丝瓜络溶菌酶抗菌吸水层；最后将吸水层与离型纸、粘贴层进行复合分切，制贴成片，得到丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料。本发明中丝瓜络与溶菌酶均为生物基材料，制备过程中未使用任何如戊二醛等有细胞毒性的化学交联剂，不会对细菌产生抗药性，制备过程简单，成本低廉；且吸水性优良，能够迅速吸收伤口渗液，有效减少创面发生化脓现象，敷料抗菌持久，适于市面推广与应用。

Description

一种丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料及其制备方法
技术领域
本发明属于抗菌敷料领域，具体涉及一种丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料的制备方法。
背景技术
敷料是一种医用材料，它能保持伤口创面的湿润，吸收并去除多余的渗液，不仅透气，还能避免创面被细菌和尘粒污染，提供有利于创面愈合的环境。
传统医用敷料基材(如纱布、棉花)存在组织粘连严重、抗菌和止血性能差、渗液吸收量少等缺点，导致不能满足患者的需求。新型敷料通常在敷料基材上负载抗生素、抗菌金属粒子、壳聚糖或季铵盐等阳离子抗菌剂来增强敷料的抗菌性能，如通过负载庆大霉素和阿奇霉素实现敷料抗菌，但庆大霉素和阿奇霉素容易使细菌产生抗药性(CN202110912992.5)；制备以壳聚糖-泊洛沙姆为基质的纳米银抗菌敷料，通过在敷料基材上负载平均粒径为25-50nm的纳米银颗粒取得优异的抗菌效果，但纳米材料颗粒小比表面积大，生物毒性大(CN201810595187.2)；活性炭中负载季铵盐来赋予敷料抗菌性，然而季铵盐毒性大、生物相容性差(CN202122521219.4)；以壳聚糖为原料制备的敷料存在制备周期长、稳定性差、所用交联剂(如戊二醛)不环保且具有细胞毒性等缺点(CN202111104184.2)。
丝瓜络主要由纤维素、半纤维素、木质素组成，具有多孔疏松网络结构，质轻，稳定性好，柔韧且富有弹性，吸液能力强，透气性好，有利于细胞快速生长，环保，价廉。目前，丝瓜络已经结合封闭负压引流技术被应用于创面修复，具体是以丝瓜络为创面敷料主体，其内包埋多空引流管，采用环氧乙烷灭菌术，结合负压引流装置，敷料表面为含有丙烯酸黏附剂的生物半透膜。研究表明丝瓜络敷料能抑制细菌增生，明显改善创面循环，缩短创面愈合时间，降低回植皮肤坏死率，减轻术后患者局部功能障碍程度。但基于丝瓜络的敷料也有缺点，比如，存在细胞粘附性，创面肉芽组织易向敷料内生长引起组织粘连，在敷料揭除时造成二次创伤，另外还存在亲肤性差、保水性和润湿性差等缺点。因此，需要研制一种抗粘连、亲肤性好的敷料，满足临床应用需求。
溶菌酶作为一种阳离子抗菌蛋白，能够有效水解细菌细胞壁N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之间的β-1,4糖苷键，细菌细胞壁上的黏多糖被分解形成细胞壁破损，细菌内容物外渗死亡，发挥杀菌作用。另外，溶菌酶能促使白细胞增多、减轻内毒素、改善和增强巨噬细胞细胞免疫，当机体受损时可以加快自身免疫反应释放炎症因子，同时溶菌酶还具有激活血小板、加强人体第二道防线的作用。虽然溶菌酶生物相容性好，对人体无毒副作用，不会使细菌产生耐受性，但溶菌酶抗菌稳定性欠佳、抗菌谱范围稍窄，常与多糖等其他活性物质复配来提高抗菌稳定性和抗菌性能。
因此，如何提供一种抗组织粘连、抗菌稳定性优良，不会产生细菌抗药性的敷料是本领域技术人员亟待解决的技术难题。
发明内容
有鉴于此，本发明针对现有技术中存在的上述技术问题，提供一种丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料的制备方法。将溶菌酶与丝瓜络相结合以克服丝瓜络亲肤差、敷料与组织粘连以及溶菌酶抗菌稳定性不佳的缺点。
需要说明的是，本发明以改性丝瓜络为基体材料，氯乙酸钠改性后的丝瓜络表面带有负电荷，能够与溶菌酶表面正电荷通过正负电荷耦合作用形成稳定的复合物，一方面使得溶菌酶的吸附稳定性增强且溶菌酶的活性基本保持不变，另一方面在发挥抗菌作用时溶菌酶可以缓慢释放，溶菌酶通过水解细菌细胞壁上的肽聚糖结构，在带负电荷的细菌细胞膜上穿孔形成有规则的离子孔道，引起胞内大量K+和内容物外流，导致细胞内容物外渗死亡，从而发挥抗菌作用。
此外，因溶菌酶具有良好的生物相容性和亲肤性，不会对细菌产生抗药性，而使制备得到的丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料吸液能力强、抗粘连、抗菌稳定性优良，能够促进创面愈合。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料的制备方法，所述方法具体包括如下步骤：
(1)取丝瓜络置于碱液中搅拌，并依次加入乙醇和水的混合液、氯乙酸钠，随后置于微波反应器中反应，用乙酸水溶液中和反应液，过滤，清洗，冷冻干燥，得到改性丝瓜络；
(2)将所述改性丝瓜络与稀碱液、乙醇置于反应釜中进行软化处理，随后将软化处理后的丝瓜络在水煎复合药物中浸泡，得到药性丝瓜络；
(3)将所述药性丝瓜络浸泡于溶菌酶水溶液中，水洗，冷冻干燥，得到丝瓜络溶菌酶复合物；
(4)将所述丝瓜络溶菌酶复合物与防粘连网膜复合，形成丝瓜络溶菌酶抗菌吸水层；随后将所述抗菌吸水层与离型纸、粘贴层进行复合分切，在敷料制贴机上制贴成片，得到丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料。
值得说明的是，丝瓜络具有较好的吸湿性、散湿性、透气性、热稳定性等，经过与溶菌酶复合后还具有较好的抗菌性；且丝瓜络具有亲油和亲水的化学结构，可吸附多种水剂和油剂。
可选地，步骤(1)中，所述碱液为质量浓度为10-25wt.％的NaOH或KOH水溶液，所述丝瓜络、氯乙酸钠、碱液、乙醇和水的质量体积比为0.1-1g：0.05-8g：10-20mL：8-15mL：3-5mL；
及，所述微波反应器的功率为300-500W，反应温度为50℃-65℃，反应时间为15-60min。
此外，清洗步骤是依次用乙醇清洗3次，水洗3次。所述乙酸水溶液中乙酸的质量百分数为5wt.％，乙酸是用来中和过量的碱液，且乙酸水溶液的用量无特殊要求，用pH试纸检测溶液至中性即可。
可选地，步骤(2)中，所述软化处理是将改性丝瓜络、稀碱液和乙醇溶剂转移至水热反应釜中加热反应，加热温度为80-100℃，加热时间为0.5-2h；
其中，所述稀碱液为10-25wt.％的NaOH水溶液，且所述NaOH水溶液与乙醇溶剂的体积比为1-2:1。
需要说明的是，所述软化处理是为去除丝瓜络中的杂质，增加丝瓜络的表面积，使丝瓜络更有弹性、更柔软、更亲肤舒适；且所述NaOH水溶液与乙醇溶剂按体积比为1-2:1配制，丝瓜络与NaOH水溶液和乙醇溶剂之间无特殊的比例关系，只要能使丝瓜络被淹没即可。
可选地，所述复合药物是由止血药物和止痛药物按照质量比1:1组成；其中，
所述止血药物至少包括三七、艾叶、白及、白蔹、侧柏叶、小蓟、大蓟、茜草中的一种；所述止痛药物至少包括莪术、乳香、没药、三棱、薄荷、桃仁、红花、香附、蒲黄、五灵脂、益母草、白芷中的一种；
且，所述复合药物与水的质量体积比为100g：500mL，水煎时间为2-5h。
进一步地，所述止血药物的组成为：三七7-12g，艾叶5-10g，白及5-15g，白蔹6-12g，侧柏叶4-8g，小蓟10-16g，大蓟10-15g，茜草5-15g；所述止血药物组成能够作用于血管，使得血管收缩，增加血小板数量促进凝血作用，从而达到止血效果。
所述止痛药物的组成为：莪术12-16g，乳香10-13g，没药8-12g，三棱6-11g，薄荷5-8g，桃仁5-7g，红花12-15g，香附10-13g，蒲黄6-9g，五灵脂9-12g，益母草10-12g，白芷1-3g；所述止痛药物组成的作用是能够通过杀菌、抗炎达到镇痛的效果。
可选地，步骤(3)中，所述溶菌酶水溶液的质量浓度为5-8wt.％，并用0.2mol/L的硼酸-硼砂缓冲液调节溶菌酶水溶液的pH值为7.4；所述溶菌酶的分子量为14.4kDa，所述溶菌酶的比活力为30000-50000U/mg，从成本和效果方面考虑，优选比活力为30000U/mg，溶菌酶比活力越大，价格越贵，抗菌效果越好；
且，所述药性丝瓜络与溶菌酶水溶液的质量体积比为0.5-1g：5-15mL，浸泡时间为15-60min。所述硼酸-硼砂缓冲液购自北京雷根生物技术有限公司，型号为IH0209，所述溶菌酶购自麦克林试剂网。所述水洗即采用去离子水清洗。
以及，步骤(1)和步骤(3)中，所述冷冻干燥是将样品置于真空冷冻干燥机中，打开循环泵后约1min，开启压缩机对冻干箱致冷，冻至-40℃，保温2h，然后开启真空泵，调节温度至-20℃，保温6小时，冻干室的压力为30Pa，真空冷冻干燥完成。
可选地，步骤(4)中，所述防粘连网膜为聚氨酯、聚乙烯、聚氯乙烯塑料薄膜，所述离型纸为硅油纸或淋膜纸，所述粘贴层为涂硅凝胶无纺布、涂硅凝胶水刺布或涂硅凝胶热轧布。
此外，本发明还请求保护一种如上述方法制备的丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明提供的一种丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料及其制备方法，具有如下优异效果：
(1)本发明制备的丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料以改性丝瓜络为基体材料使之表面带有大量羧酸根负离子，改性丝瓜络与溶菌酶表面正电荷通过正负电荷耦合作用形成稳定的复合物，增强了溶菌酶的稳定性同时能够通过缓慢释放溶菌酶发挥持续抗菌功效。所述丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料中的溶菌酶通过水解细菌细胞壁上的肽聚糖结构来发挥抗菌功效。丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料吸液能力强、抗粘连、抗菌稳定性优良、不会对细菌产生抗药性，能够有效促进创面愈合。将溶菌酶与丝瓜络相结合克服了丝瓜络亲肤差、敷料与组织粘连以及溶菌酶抗菌稳定性不佳的缺点。
(2)与现有技术中抗菌敷料相比，本发明中丝瓜络与溶菌酶均为生物基材料，制备过程中未使用任何如戊二醛等有细胞毒性的化学交联剂，不会对细菌产生抗药性，制备过程简单，成本低廉。
(3)本发明中丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料吸水性优良，能够迅速吸收伤口渗液，有效减少创面发生化脓现象，敷料抗菌持久且对细菌不产生抗药性，针对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的抗菌率均大于99.2％。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料的结构示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例及说明书附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料的制备方法，通过将溶菌酶与丝瓜络结合以克服丝瓜络亲肤差、敷料与组织粘连及溶菌酶抗菌稳定性不佳的缺点。
为更好地理解本发明，下面通过以下实施例对本发明作进一步具体的阐述，但不可理解为对本发明的限定，对于本领域的技术人员根据上述发明内容所作的一些非本质的改进与调整，也视为落在本发明的保护范围内。
下面，将结合具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的说明。
实施例1
(1)取1g丝瓜络剪碎成最长粒径尺寸不大于5mm的碎块，置于质量浓度为20wt.％的NaOH水溶液中搅拌30min，依次加入15mL乙醇和5mL水的混合液、5g氯乙酸钠，置于400W的微波反应器中，反应温度为60℃，反应30min，然后用5wt.％的乙酸水溶液中和反应液至中性，过滤，依次用无水乙醇清洗3次、水洗3次，冷冻干燥，得到改性丝瓜络。
(2)将改性丝瓜络与20wt.％的NaOH水溶液、乙醇置于反应釜中进行软化处理，NaOH水溶液与乙醇溶剂按体积比为1:1，反应釜的加热温度为100℃，加热时间为2h；将软化处理的丝瓜络在水煎复合药物中浸泡10h后取出，水洗3次后烘干，得到药性丝瓜络；
所述复合药物的配方为分别将止血药物和止痛药物混匀，各取相同质量的止血药物和止痛药物配成复合药物，复合药物与水的质量体积比为100g：500mL，具体止血药物的组成为：三七10g，艾叶6g，白及7g，白蔹6g，侧柏叶5g，小蓟15g，大蓟12g，茜草6g；止痛药物的组成为：莪术14g，乳香10g，没药8g，三棱7g，薄荷6g，桃仁5g，红花13g，香附10g，蒲黄6g，五灵脂10g，益母草10g，白芷2g。所述复合药物的水煎时间为4h。
(3)将1g药性丝瓜络浸泡于15mL、8wt.％的溶菌酶水溶液中浸泡60min，水洗，冷冻干燥，得到丝瓜络溶菌酶复合物。
(4)将上述步骤中的丝瓜络溶菌酶复合物与聚氨酯塑料薄膜复合，形成丝瓜络溶菌酶抗菌吸水层，将吸水层与硅油纸、涂硅凝胶水刺布进行复合，由上至下依次排列为硅油纸、丝瓜络溶菌酶抗菌吸水层、涂硅凝胶水刺布在敷料制贴机上制贴成片，得到丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料。
对比例1
对比例1与实施例1相比只有步骤(1)不同，即丝瓜络未经过氯乙酸钠改性，步骤(2)～(4)均与实施例1相同。对比例1与实施例1中步骤(1)不同的具体实施方法如下：
(1)取1g丝瓜络剪碎成最长粒径尺寸不大于5mm的碎块，置于质量浓度为20wt.％的NaOH水溶液中搅拌30min，依次加入15mL乙醇和5mL水的混合液，置于400W的微波反应器中，反应温度为60℃，反应30min，然后用5wt.％的乙酸水溶液中和反应液至中性，过滤，依次用无水乙醇清洗3次、水洗3次，冷冻干燥，得到未改性丝瓜络。
对比例2
对比例2与实施例1相比只缺少步骤(2)，对比例2中的改性丝瓜络没有在复合药物中浸泡，只保留步骤(1)、步骤(3)和步骤(4)均与实施例1相同。
实施例2
实施例2与实施例1相比，区别在于：实施例2的步骤(2)中的复合药物组成不同，其他步骤与实施例1相同。其中，实施例2的具体药物组成如下：
止血药物的组成为：三七12g，艾叶6g，白蔹6g，侧柏叶8g，大蓟13g，茜草6g；止痛药物的组成为：莪术12g，乳香11g，没药8g，三棱8g，薄荷6g，桃仁7g，香附13g，蒲黄7g，益母草10g，白芷3g；且所述复合药物的水煎时间为4h。
相比于实施例1，实施例2的复合药物中，其中止血药物中缺少了小蓟和白及，止痛药物中缺少了红花和五灵脂。
小蓟和白及具有优良的止血消肿、消脓的效果，表现在细胞粘附性上，如表1所示，实施例2的细胞黏附性要大于实施例1的细胞黏附性。这说明，实施例1中的复合药物组合能有效避免敷料与细胞组织的粘连，这大大减轻了创面疼痛。
实施例3
实施例3与实施例1相比，区别在于：实施例3的步骤(2)中所述复合药物组成不同，其他步骤与实施例1相同。其中，实施例3的具体药物组成如下：
止血药物的组成为：三七10g，艾叶6g，白及7g，白蔹6g，小蓟15g；止痛药物的组成为：莪术16g，没药12g，红花15g，五灵脂12g；且所述复合药物的水煎时间为4h。
相比于实施例1，实施例3的复合药物中，其中，止血药物中缺少了侧柏叶、大蓟和茜草，止痛药物中缺少了乳香、三棱、薄荷、桃仁、香附、蒲黄、益母草和白芷。
从表1中实施例1和实施例3的细胞黏附性结果显示，实施例1的吸光度值为0.0688，实施例3的吸光度值为0.0778，吸光度值越高，表明该孔孔底实施例1与实施例3中敷料材料的吸附细胞越多，进而表明实施例1中所得敷料对细胞黏附率低，有利于减少敷料和组织的粘连。
对比例3
对比例2与实施例1相比只缺少步骤(3)，对比例2中的药性丝瓜络没有在溶菌酶水溶液中浸泡，只保留步骤(1)、步骤(2)和步骤(4)均与实施例1相同。
实施例4
(1)取1g丝瓜络剪碎成最长粒径尺寸不大于5mm的碎块，置于质量浓度为20wt.％的NaOH水溶液中搅拌30min，依次加入12mL乙醇和4mL水的混合液、8g氯乙酸钠，置于300W的微波反应器中，反应温度为55℃，反应45min，然后用5wt.％的乙酸水溶液中和反应液至中性，过滤，依次用无水乙醇清洗3次、水洗3次，冷冻干燥，得到改性丝瓜络。
(2)将改性丝瓜络与20wt.％的NaOH水溶液、乙醇置于反应釜中进行软化处理，NaOH水溶液与乙醇溶剂按体积比为2:1，给反应釜的加热温度为90℃，加热时间为1.5h；将软化处理的丝瓜络在水煎复合药物中浸泡12h后取出，水洗3次后烘干，得到药性丝瓜络；
其中，所述复合药物的配方为分别将止血药物和止痛药物混匀，各取相同质量的止血药物和止痛药物配成复合药物，复合药物与水的质量体积比为100g：500mL，具体止血药物的组成为：三七7g，艾叶8g，白及6g，白蔹10g，侧柏叶6g，小蓟12g，大蓟11g，茜草5g；止痛药物的组成为：莪术12g，乳香11g，没药9g，三棱6g，薄荷7g，桃仁6g，红花15g，香附13g，蒲黄6g，五灵脂9g，益母草11g，白芷1g。所述复合药物的水煎时间为2h。
(3)将0.8g药性丝瓜络浸泡于13mL、5wt.％的溶菌酶水溶液中浸泡60min，水洗，冷冻干燥，得到丝瓜络溶菌酶复合物。
(4)将上述步骤中的丝瓜络溶菌酶复合物与聚乙烯塑料薄膜复合，形成丝瓜络溶菌酶抗菌吸水层，将吸水层与硅油纸、涂硅凝胶热轧布进行复合，由上至下依次排列为硅油纸、丝瓜络溶菌酶抗菌吸水层、涂硅凝胶热轧布在敷料制贴机上制贴成片，得到丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料。
实施例5
(1)取1g丝瓜络剪碎成最长粒径尺寸不大于5mm的碎块，置于质量浓度为25wt.％的NaOH水溶液中搅拌30min，依次加入10mL乙醇和3mL水的混合液、3g氯乙酸钠，置于500W的微波反应器中，反应温度为65℃，反应60min，然后用5wt.％的乙酸水溶液中和反应液至中性，过滤，依次用无水乙醇清洗3次、水洗3次，冷冻干燥，得到改性丝瓜络。
(2)将改性丝瓜络与25wt.％的NaOH水溶液、乙醇置于反应釜中进行软化处理，NaOH水溶液与乙醇溶剂按体积比为1:1，给反应釜的加热温度为80℃，加热时间为1.0h；将软化处理的丝瓜络在水煎复合药物中浸泡6h后取出，水洗3次后烘干，得到药性丝瓜络；
其中，所述复合药物的配方为分别将止血药物和止痛药物混匀，各取相同质量的止血药物和止痛药物配成复合药物，复合药物与水的质量体积比为100g：500mL，具体止血药物的组成为：三七7g，艾叶5g，白及15g，白蔹12g，侧柏叶4g，小蓟16g，大蓟13g，茜草7g；止痛药物的组成为：莪术16g，乳香13g，没药8g，三棱8g，薄荷5g，桃仁5g，红花12g，香附11g，蒲黄7g，五灵脂10g，益母草12g，白芷3g。所述复合药物的水煎时间为1h。
(3)将0.5g药性丝瓜络浸泡于18mL、6wt.％的溶菌酶水溶液中浸泡15min，水洗，冷冻干燥，得到丝瓜络溶菌酶复合物。
(4)将上述步骤中的丝瓜络溶菌酶复合物与聚氯乙烯塑料薄膜复合，形成丝瓜络溶菌酶抗菌吸水层，将吸水层与淋膜纸、涂硅凝胶无纺布进行复合，由上至下依次排列为淋膜纸、丝瓜络溶菌酶抗菌吸水层、涂硅凝胶无纺布在敷料制贴机上制贴成片，得到丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料。
对比例4
选用热轧布涂胶无纺布做为实施例5中丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料的对照组，所述热轧布涂胶无纺布购自深圳市圣美新材料有限公司。
且，吸水性检测、蛋白吸附性检测、细胞粘附性检测均与实施例1、实施例4和实施例5相同。
具体地，测试项的操作内容如下：
酶活力单位的定义：室温25℃、pH为6.2时，波长450nm处，每分钟引起吸收度下降0.001为一个酶活力单位，每毫克溶菌酶的活力单位U为：ΔOD450/(0.001×M)，其中，ΔOD450的单位为U/mg，M为样品量(mg)，ΔOD450为75s和15s时反应液吸光度值的差值，样品量为每0.5mL标准酶液中含溶菌酶的重量(毫克)。溶菌酶及丝瓜络溶菌酶复合物中溶菌酶的活性测定方法为：将723分光光度计调至450nm波长处，底物悬浮液与酶液(丝瓜络溶菌酶复合物的浸提液)置于25℃下，吸取2.5mL底物悬浮液与0.5mL标准酶液，加入到1cm比色池中，迅速混匀计时，每隔15s测一次ΔOD450，一共测试6次，空白组用浓度为0.2mol/L、pH为6.4的磷酸盐缓冲液(PBS溶液)进行测试。
且，溶菌酶及丝瓜络溶菌酶复合物的活性的测试原理为：溶菌酶对菌体有溶解作用，菌体的解体使底物悬浮液的吸光度降低。所用底物悬浮液的制备方法为：将溶壁微球菌接种于营养琼脂斜面上，30℃、48h培养后，取出置于2～4℃下保存，使用时用0.2mol/L、pH为6.2的磷酸盐缓冲液将新鲜菌体清洗下来，经研磨、稀释底物悬浮液至所需吸光度值。丝瓜络溶菌酶复合物的浸提液是采用0.2mol/L、pH为6.2的磷酸盐缓冲液经6次浸泡过滤提取的溶液，相当于用磷酸盐缓冲液稀释30倍得到的丝瓜络溶菌酶复合物浸提液。所述溶壁微球菌购自盖德化工网，货号为XK-SH-6093，所用磷酸盐缓冲溶液购自阿拉丁，产品编号为P397575。
丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料依据标准GB15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》进行抗菌性能测试，测试用菌为大肠杆菌、金黄色葡萄菌和白色念珠菌；依据GB/T16886系列标准对丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料进行体外细胞毒性试验和皮内反应试验。测试得到实施例中的丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的抗菌率均高于99.2％，细胞毒性均为0级，且均无皮内反应。
吸水性检测：取丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料并称重(W1)，于温度25±0.5℃下在磷酸盐缓冲溶液中浸泡5h使丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料充分溶胀。测试时，从溶液中取出丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料，用滤纸吸去丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料表面的水，立刻称重(W2)，每个样品平行测试5次以保证数据的准确性。丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料吸水性能按照(W2–W1)/W1计算得到吸水率。磷酸盐缓冲溶液购自阿拉丁，产品编号为P397575。
蛋白吸附性检测：配制0.2wt.％的牛血清白蛋白溶液，25±0.5℃下将丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料浸入牛血清白蛋白溶液中，浸泡24h后取出，用蒸馏水反复冲洗5-8次，蒸馏水的每次冲洗用量为100mL，再将丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料置于0.1wt.％的十二烷基磺酸钠溶液中，在温度37℃下摇床24h，将吸附于丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料的蛋白溶出。蛋白吸附量测定方法按照蛋白测定试剂盒标准操作流程执行。其中，牛血清白蛋白购买自阿拉丁，十二烷基磺酸钠购买自麦克林试剂网，产品编号为S817668。
细胞粘附性检测：将丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料剪成圆形，尺寸与24孔培养板的孔径一致，将丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料铺满培养板底部。使用前先将丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料紫外灭菌20min。在敷料表面接种数量为4×104的人体成纤维细胞，并加入由DMEM培养基和10wt.％小牛血清配制的培养液2mL，在37℃下培育4h后取出，用磷酸盐缓冲溶液反复冲洗以除去未粘附的细胞，加入20μL，0.5wt.％MTT(化学名称为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，商品名为噻唑蓝，是一种黄色染料)的磷酸盐缓冲溶液，置于37℃下孵育4h后加入200μL的DMSO(二甲基亚砜)溶剂，振荡均匀后采用酶标仪于570nm处读取吸光度值。吸光度值越高，表明该孔孔底材料吸附细胞越多。细胞粘附率由100％×粘附细胞数/细胞总数计算得到，采用市面上常用的热轧布涂胶无纺布(购自深圳市圣美新材料有限公司)做对照，空白对照为24孔板孔板，测试结果如表1所示，丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料可阻止细胞粘附，有利于减少敷料和组织的粘连。
其中，试剂3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐购买自阿拉丁，小牛血清购买自默克网，产品编号为B7446，DMSO购买自阿拉丁，DMEM培养基购买自麦克林，产品编号为D917431。
以上测试项的结果均在表1中列出，如下：
表1实施例及对比例测试结果
Figure BDA0003883112550000151
Figure BDA0003883112550000161
综合上述表1测试数据，分析如下：
1)将对比例1与实施例1相比，所述丝瓜络未经氯乙酸钠改性，而经过氯乙酸钠改性的丝瓜络表面带有羧基负电荷，能够与带正电荷的溶菌酶发生正负电荷耦合作用，从而稳定溶菌酶，使溶菌酶保持一定活性和稳定性。而未经过氯乙酸钠改性的丝瓜络表面没有负电荷，不能与溶菌酶形成复合物，只是形成简单的物理混合，溶菌酶处于游离状态，稳定性下降，溶菌酶的酶活性也相应下降，从而不能有效发挥抗菌作用。
2)将对比例2与实施例1相比，所述改性丝瓜络未在复合药物中浸泡，实施例2中改性丝瓜络通过浸泡在水煮的复合药物中，复合药物中组分吸附在丝瓜络上，由此制备得到的丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料中的溶菌酶与药物共同发挥抗菌、止血止痛作用，从而起到抵抗创面化脓的效果。
3)将对比例3与实施例1相比，对比例3未与溶菌酶复合，溶菌酶能够水解细菌细胞壁N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之间的β-1,4糖苷键，发挥抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效，而没有溶菌酶存在下抗菌效果就会明显下降。
将对比例2、对比例3与实施例1综合对比可知，实施例1中丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料的蛋白吸附量和细胞黏附率远远低于对比例2和对比例3，说明丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料中的溶菌酶与药物能够发生协同作用，同时在抗菌性和细胞黏附性方面具有更优良的性能。
4)将对比例4与实施例3相比，即将商用的热轧涂胶无纺布敷料与本发明的敷料相对比可知，本发明的敷料具有抗粘连、抗菌、吸湿性高的优点；热轧涂胶无纺布敷料在吸水性和抗菌方面均与本发明相比差距很大，且热轧涂胶无纺布敷料容易与组织细胞发生粘连，透气性不如丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (9)

1.一种丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料的制备方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：
(1)取丝瓜络置于碱液中搅拌，并依次加入乙醇和水的混合液、氯乙酸钠，随后置于微波反应器中反应，用乙酸水溶液中和反应液，过滤，清洗，冷冻干燥，得到改性丝瓜络；
(2)将所述改性丝瓜络与稀碱液、乙醇置于反应釜中进行软化处理，随后将软化处理后的丝瓜络在水煎复合药物中浸泡，得到药性丝瓜络；
(3)将所述药性丝瓜络浸泡于溶菌酶水溶液中，水洗，冷冻干燥，得到丝瓜络溶菌酶复合物；
(4)将所述丝瓜络溶菌酶复合物与防粘连网膜复合，形成丝瓜络溶菌酶抗菌吸水层；随后将所述抗菌吸水层与离型纸、粘贴层进行复合分切，在敷料制贴机上制贴成片，得到丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料。
2.根据权利要求1所述的一种丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述碱液为质量浓度为10-25wt.％的NaOH或KOH水溶液，所述丝瓜络、氯乙酸钠、碱液、乙醇和水的质量体积比为0.1-1g：0.05-8g：10-20mL：8-15mL：3-5mL；
及，所述微波反应器的功率为300-500W，反应温度为50℃-65℃，反应时间为15-60min。
3.根据权利要求1所述的一种丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述软化处理是将改性丝瓜络、稀碱液和乙醇转移至水热反应釜中加热反应，加热温度为80-100℃，加热时间为0.5-2h；
其中，所述稀碱液为10-25wt.％的NaOH水溶液，且所述NaOH水溶液与乙醇的体积比为1-2:1。
4.根据权利要求1或3所述的一种丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料的制备方法，其特征在于，所述复合药物是由止血药物和止痛药物按照质量比1:1组成；其中，
所述止血药物至少包括三七、艾叶、白及、白蔹、侧柏叶、小蓟、大蓟、茜草中的一种；所述止痛药物至少包括莪术、乳香、没药、三棱、薄荷、桃仁、红花、香附、蒲黄、五灵脂、益母草、白芷中的一种；
且，所述复合药物与水的质量体积比为100g：500mL，水煎时间为2-5h。
5.根据权利要求4所述的一种丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料的制备方法，其特征在于，所述止血药物的组成为：三七7-12g，艾叶5-10g，白及5-15g，白蔹6-12g，侧柏叶4-8g，小蓟10-16g，大蓟10-15g，茜草5-15g；
所述止痛药物的组成为：莪术12-16g，乳香10-13g，没药8-12g，三棱6-11g，薄荷5-8g，桃仁5-7g，红花12-15g，香附10-13g，蒲黄6-9g，五灵脂9-12g，益母草10-12g，白芷1-3g。
6.根据权利要求1所述的一种丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述溶菌酶水溶液的质量浓度为5-8wt.％，并用0.2mol/L的硼酸-硼砂缓冲液调节溶菌酶水溶液的pH值为7.4；所述溶菌酶的分子量为14.4kDa，所述溶菌酶的比活力为30000-50000U/mg；
且，所述药性丝瓜络与溶菌酶水溶液的质量体积比为0.5-1g：5-15mL，浸泡时间为15-60min。
7.根据权利要求1所述的一种丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述防粘连网膜为聚氨酯塑料薄膜、聚乙烯塑料薄膜或聚氯乙烯塑料薄膜，所述离型纸为硅油纸或淋膜纸，所述粘贴层为涂硅凝胶无纺布。
8.根据权利要求7所述的一种丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料的制备方法，其特征在于，所述粘贴层为涂硅凝胶水刺布或涂硅凝胶热轧布。
9.一种如权利要求1-8任一所述方法制备的丝瓜络基溶菌酶抗菌敷料。
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