CN115521951A - 一种对废酿酒酵母泥进行诱导培养以积累油脂的方法 - Google Patents

一种对废酿酒酵母泥进行诱导培养以积累油脂的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种对废酿酒酵母泥进行诱导培养以积累油脂的方法，包括如下步骤：依次进行复苏阶段、缓冲阶段和诱导阶段；在所述复苏阶段，将废酿酒酵母泥采用预先冷却的无菌水稀释，同时向其中添加葡萄糖、甘油和乙醇，得培养体系，在无氧条件下搅拌设定时间；在缓冲阶段，向培养体系中补加葡萄糖，并通入无菌空气，通过逐步增加通气量的方式逐步增加培养体系的溶氧量；并提高培养温度至26～30℃，培养设定时间；在诱导阶段，向培养体系中添加葡萄糖和乙酸盐，调节溶解氧为5～30％，培养温度为26～30℃，培养设定时间。通过总共三个阶段的分阶段培养，可使废酿酒酵母泥的细胞油脂含量从初始的5％左右提高至30％左右，大幅提升了细胞油脂含量。

Description

一种对废酿酒酵母泥进行诱导培养以积累油脂的方法
技术领域
本发明属于废弃酿酒酵母泥资源化利用技术领域，涉及一种对废酿酒酵母泥进行诱导培养以积累油脂的方法，具体涉及一种利用酿造业产生的废弃酿酒酵母泥进行分阶段培养并诱导其细胞内大量积累油脂的方法。
背景技术
这里的陈述仅提供与本发明相关的背景技术，而不必然地构成现有技术。
中国是酿造业大国，在酿造行业生产过程中会产生大量的废弃酵母泥，单是啤酒酿造业一项，我国每年就可产生约数十万吨(按干物质计)的废弃酿酒酵母泥，这些废弃酿酒酵母泥只有不到一半被回收用于动物饲料、酵母提取物等产品的开发生产，而其余60％左右的酿酒酵母泥都被直接排弃。这主要是当前废弃酿酒酵母开发利用技术不足和产品种类有限且价值较低所导致。而这些大量被排弃的酿酒酵母泥不但造成有用资源的浪费，还会增加生产企业污水处理的负担，并导致环境的污染。
酿酒酵母细胞的油脂中富含一种价格昂贵且在商业化种植的油料作物的油脂中非常稀有的ω-7单不饱和脂肪酸-棕榈油酸(十六碳烯酸，C16:1)，含量可达50％左右。大量研究表明，棕榈油酸对代谢功能综合征、II型糖尿病、高血压、高血脂等疾病具有显著的预防和治疗效果，并已被开发成医药制剂在欧美等国家上市。
一般而言，只有当细胞内的油脂含量高于细胞干重的20％时，才可作为油脂提取原料。但酿酒酵母细胞的油脂含量不高，一般只有细胞干重的5％左右，其直接用于油脂提取不具有经济价值。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种对废酿酒酵母泥进行诱导培养以积累油脂的方法。
为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：
第一方面，本发明提供一种对废酿酒酵母泥进行诱导培养以积累油脂的方法，包括如下步骤：依次进行复苏阶段、缓冲阶段和诱导阶段；
在所述复苏阶段，将废酿酒酵母泥采用预先冷却的无菌水稀释，同时向其中添加葡萄糖、甘油和乙醇，得培养体系，在无氧条件下搅拌设定时间；
在缓冲阶段，向培养体系中补加葡萄糖，并通入无菌空气，通过逐步增加通气量的方式逐步增加培养体系的溶氧量；并提高培养温度至26～30℃，培养设定时间；
在诱导阶段，向培养体系中添加葡萄糖和乙酸盐，调节溶解氧为5～30％，培养温度为26～30℃，培养设定时间。
第二方面，本发明提供一种废酿酒酵母泥，由所述方法诱导而来，其油脂含量为细胞干重的20％-35％。
上述本发明的一种或多种实施例取得的有益效果如下：
本发明通过总共三个阶段的分阶段培养，可使废酿酒酵母泥的细胞油脂含量从初始的5％左右提高至30％左右，大幅提升了细胞油脂含量，使废弃酿酒酵母泥成为一种富含棕榈油酸的油脂资源，并赋予将废弃酿酒酵母泥应用于棕榈油酸以及富含棕榈油酸油脂的生产以坚实的工业可行性，可带来巨大的经济效益。
从作用机理层面来讲，本方法所含有的三个阶段具有各自不同的作用，它们相互紧密连接才能起到促进废弃酿酒酵母泥积累油脂的作用。具体来讲，复苏阶段的目的在于使长期处于厌氧条件下且大部分细胞已进入半休眠状态的酿酒酵母菌泥逐渐恢复活力，如果缺失这一步直接进入第二阶段或第三阶段，则会导致废酿酒酵母泥中的细胞大量死亡。
缓冲阶段的目的在于使废酿酒酵母泥中的细胞逐渐适应溶氧量和温度的变化，使其代谢类型逐步由厌氧呼吸向好氧呼吸转变，并同时恢复细胞内各种在有氧条件下更为活跃的生理代谢活动(如脂肪酸合成、乙醇氧化等)，为接下来的诱导阶段做准备，如果缺失这一步而直接进入第三阶段，则同样会导致菌体的大量死亡，且细胞内油脂的积累也会受到明显抑制。
诱导阶段的目的在于使废弃酿酒酵母细胞在经过复苏和缓冲阶段的适应后快速进行油脂的合成与积累。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1是实施例1条件下废酿酒酵母细胞生物量和油脂含量的变化；
图2为实施例2条件下废酿酒酵母细胞生物量和油脂含量的变化；
图3为实施例3条件下废酿酒酵母细胞生物量和油脂含量的变化；
图4为只进行第二、三阶段培养时废弃酿酒酵母细胞生物量和油脂含量的变化；
图5为只进行第三阶段培养时废弃酿酒酵母细胞生物量和油脂含量的变化。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
第一方面，本发明提供一种对废酿酒酵母泥进行诱导培养以积累油脂的方法，包括如下步骤：依次进行复苏阶段、缓冲阶段和诱导阶段；
在所述复苏阶段，将废酿酒酵母泥采用预先冷却的无菌水稀释，同时向其中添加葡萄糖、甘油和乙醇，得培养体系，在无氧条件下搅拌设定时间；
在缓冲阶段，向培养体系中补加葡萄糖，并通入无菌空气，通过逐步增加通气量的方式逐步增加培养体系的溶氧量；并提高培养温度至26～30℃，培养设定时间；
在诱导阶段，向培养体系中添加葡萄糖和乙酸盐，调节溶解氧为5～30％，培养温度为26～30℃，培养设定时间。
所述的废酿酒酵母泥是指酿造业在以酿酒酵母为菌种、经酿制工艺生产后通过沉淀、离心等分离手段收获其主产物后所剩余的未经灭活处理的酿酒酵母菌体，其通常呈泥浆状。其中，所述的酿造业包括但不限于啤酒酿造业、白酒酿造业以及生物燃料乙醇生产企业。
复苏阶段的目的在于使长期处于厌氧条件下且大部分细胞已进入半休眠状态的酿酒酵母菌泥逐渐恢复活力。
添加葡萄糖的目的是为酿酒酵母细胞提供少量的有机碳源，恢复细胞的代谢能力。
添加甘油的目的是为酿酒酵母细胞提供一定的渗透压，避免细胞在稀释后因吸水膨胀导致细胞破裂，并为细胞内的各种细胞器提供一个温和的胞内环境，避免液泡破裂导致细胞发生自溶。
添加乙醇的目的是为酿酒酵母细胞提供一个类似于酿造业相关工艺后期的发酵环境，避免酿酒酵母细胞因培养环境中代谢产物浓度的剧烈变化而产生生理活性的剧烈波动，同时还兼有抑制培养体系中杂菌滋生的作用。
缓冲阶段的目的在于使废酿酒酵母泥中的细胞逐渐适应溶氧量的变化，使其代谢类型逐步由厌氧呼吸向好氧呼吸转变，并同时恢复细胞内各种在有氧条件下更为活跃的生理代谢活动(如脂肪酸合成、乙醇氧化等)，并同时适应26～30℃的常温发酵条件，为接下来的诱导阶段做准备。
诱导阶段的目的在于使废弃酿酒酵母细胞在经过复苏和缓冲阶段的适应后快速进行油脂的合成与积累。
其中，添加葡萄糖是为酿酒酵母细胞提供能量和碳源，并为脂肪酸和油脂的合成提供一部分底物，添加乙酸钠的目的是为酿酒酵母细胞提供一定的胁迫压力，这种胁迫压力会促进酿酒酵母细胞内油脂的合成，同时，乙酸盐还可在细胞内形成乙酰辅酶A，为脂肪酸的从头合成提供一部分前体，最终促进胞内油脂的积累。
在一些实施例中，复苏阶段，预先冷却的无菌水的温度为10～20℃。
优选的，无菌水稀释后的废酿酒酵母泥的浓度为20～200g/L。
在一些实施例中，复苏阶段，培养体系中，葡萄糖的浓度为10～50g/L，甘油的浓度为5～20g/L和乙醇5～20g/L。
优选的，复苏阶段，无氧条件下搅拌的时间为2-10小时。
在一些实施例中，缓冲阶段，向培养体系中添加的葡萄糖的量为10～20g/L。
在一些实施例中，缓冲阶段，无菌空气的通气量由0vvm逐步上调至0.5vvm，使培养体系的溶氧量由0％逐步上升至10～30％。
优选的，缓冲阶段，培养参数的调整均以线性或接近线性的方式进行。
在一些实施例中，诱导阶段，向培养体系中添加20～400g/L的葡萄糖和20～30g/L的乙酸盐。
优选的，诱导阶段持续培养的时间为48～72小时。
优选的，所述乙酸盐的添加方式为连续流加的方式。采用连续流加是为了让酿酒酵母细胞缓慢适应逐步增加的乙酸盐胁迫压力，避免一次添加或分批补加大量的乙酸盐导致细胞不耐受而大量死亡。
第二方面，本发明提供一种废酿酒酵母泥，由所述方法诱导而来，其油脂含量为细胞干重的20％-35％。
以下通过实施例对本发明作进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。
同时，本发明各实施例中所用到的废酿酒酵母泥均为啤酒厂酿造啤酒结束后排出的未灭活处理的酿酒酵母泥浆，普通技术人员可以通过商业渠道购买得到，但实施例并不构成对利用本发明技术用于白酒酿造和生物燃料乙醇制造业等所生产的废弃酿酒酵母泥油脂诱导积累的限制。
实施例1
低初始生物量条件下废酿酒酵母泥的细胞生物量和油脂含量变化，具体步骤如下：
从啤酒厂获得废酿酒酵母泥后，依次进行复苏阶段、缓冲阶段和诱导阶段等三个阶段的培养。
在复苏阶段，将废酿酒酵母泥以预先冷却至15℃的无菌水稀释，使其细胞干重在20g/L，并同时向稀释后的菌液中添加10g/L的葡萄糖、5g/L的甘油、5g/L的乙醇，在不通气的条件下缓慢搅拌2小时。
在缓冲阶段，再次向培养液中添加10g/L的葡萄糖，并开始向经过复苏的发酵液中通入无菌空气，通气量由0vvm逐步上调至0.5vvm，期间，适量调高搅拌转速，使发酵液的溶氧量由0％逐步上升至30％，同时，同步上调发酵液的培养温度，使培养温度逐步上升至26℃，整个缓冲阶段持续时间为12小时，上述所有培养参数的调整均以线性或接近线性的方式进行。
在诱导阶段，以一次性添加的方式向培养液中添加20g/L的葡萄糖，并以连续流加的方式向培养基中添加20g/L的乙酸钠，通过调节通气量和搅拌转速控制溶氧为30％，培养温度为26℃，诱导阶段持续时间为48小时。培养结束后测定生物量和油脂含量。
结果如图1所示，在本实施例所述的条件下，废酿酒酵母经三个阶段的培养后生物量可以维持与初始生物量接近，表明酿酒酵母细胞没有发生大量死亡、溶解，保持了良好的细胞活性。在三阶段培养结束后，酿酒酵母泥的细胞的油脂含量由初始的5％提高至30％以上。
由此可见，本方法在促进废弃酿酒酵母泥的油脂积累方面效果显著。
实施例2
中等初始生物量条件下废酿酒酵母泥的细胞生物量和油脂含量变化，具体步骤如下：
从啤酒厂获得废酿酒酵母泥后，依次进行复苏阶段、缓冲阶段和诱导阶段等三个阶段的培养。
在复苏阶段，将所述的废酿酒酵母泥以预先冷却至10℃的无菌水稀释，使其细胞干重在100g/L，并同时向稀释后的菌液中添加30g/L的葡萄糖、10g/L的甘油、10g/L的乙醇，在不通气的条件下缓慢搅拌6小时。
在缓冲阶段，再次向培养液中添加15g/L的葡萄糖，并开始向经过复苏的发酵液中通入无菌空气，通气量由0vvm逐步上调至0.5vvm，期间，适量调高搅拌转速，使发酵液的溶氧量由0％逐步上升至20％，同时，同步上调发酵液的培养温度，使培养温度逐步上升至28℃，整个缓冲阶段持续时间为18小时，上述所有培养参数的调整均以线性或接近线性的方式进行。
在诱导阶段，以连续流加的方式向培养液中添加200g/L的葡萄糖，并以连续流加的方式向培养基中添加25g/L的乙酸钠，通过调节通气量和搅拌转速控制溶氧为15％，培养温度为28℃，诱导阶段持续时间为60小时。培养结束后测定生物量和油脂含量。
结果如图2所示，在本实施例所述的条件下，废酿酒酵母经三个阶段的培养后生物量可以维持与初始生物量接近，表明酿酒酵母细胞没有发生大量死亡、溶解，保持了良好的细胞活性。在三阶段培养结束后，酿酒酵母泥的细胞的油脂含量由初始的5％提高至30％左右。
由此可见，本方法在促进废弃酿酒酵母泥的油脂积累方面效果显著。
实施例3
高初始生物量条件下废酿酒酵母泥的细胞生物量和油脂含量变化，具体步骤如下：
从啤酒厂获得废酿酒酵母泥后，依次进行复苏阶段、缓冲阶段和诱导阶段等三个阶段的培养。
在复苏阶段，将所述的废酿酒酵母泥以预先冷却至20℃的无菌水稀释，使其细胞干重在200g/L，并同时向稀释后的菌液中添加50g/L的葡萄糖、20g/L的甘油、20g/L的乙醇，在不通气的条件下缓慢搅拌10小时。
在缓冲阶段，再次向培养液中添加20g/L的葡萄糖，并开始向经过复苏的发酵液中通入无菌空气，通气量由0vvm逐步上调至0.5vvm，期间，适量调高搅拌转速，使发酵液的溶氧量由0％逐步上升至10％，同时，同步上调发酵液的培养温度，使培养温度逐步上升至30℃，整个缓冲阶段持续时间为24小时，上述所有培养参数的调整均以线性或接近线性的方式进行。
在诱导阶段，以连续流加的方式向培养液中添加400g/L的葡萄糖，并以连续流加的方式向培养基中添加30g/L的乙酸钠，通过调节通气量和搅拌转速控制溶氧为5％，培养温度为30℃，诱导阶段持续时间为72小时。培养结束后测定生物量和油脂含量。
结果如图3所示，在本实施例的条件下，废酿酒酵母经三个阶段的培养后生物量可以维持与初始生物量接近，表明酿酒酵母细胞没有发生大量死亡、溶解，保持了良好的细胞活性。在三阶段培养结束后，酿酒酵母泥的细胞的油脂含量由初始的5％提高至30％左右。由此可见，本方法在促进废弃酿酒酵母泥的油脂积累方面效果显著。
实施例4
只进行第二、三阶段的培养后废酿酒酵母泥的细胞生物量和油脂含量变化，具体步骤如下：
从啤酒厂获得废酿酒酵母泥后，依次进行缓冲阶段和诱导阶段两个阶段的培养。在缓冲阶段，将所述的废酿酒酵母泥以常温无菌水稀释至生物量为20g/L，向培养液中添加10g/L的葡萄糖，并开始向发酵液中通入无菌空气，通气量由0vvm逐步上调至0.5vvm，期间，适量调高搅拌转速，使发酵液的溶氧量由0％逐步上升至30％，同时，同步上调发酵液的培养温度，使培养温度逐步上升至26℃，整个缓冲阶段持续时间为12小时，上述所有培养参数的调整均以线性或接近线性的方式进行。
在诱导阶段，以一次性添加的方式向培养液中添加20g/L的葡萄糖，并以连续流加的方式向培养基中添加20g/L的乙酸钠，通过调节通气量和搅拌转速控制溶氧为30％，培养温度为26℃，诱导阶段持续时间为50小时。培养结束后测定生物量和油脂含量。
结果如图4所示，在本实施例所述的条件下，废酿酒酵母只经过后两个阶段的培养后生物量大幅度降低，表明酿酒酵母细胞发生大量死亡、溶解，细胞活性较差。在培养结束后，酿酒酵母泥的细胞的油脂含量由初始的5％提高至15％左右。由此可见，本发明所提供的方法中三个阶段的依次连续使用在促进废弃酿酒酵母泥的油脂积累方面较为重要。
实施例5
只进行第三阶段的培养后废酿酒酵母泥的细胞生物量和油脂含量变化，具体步骤如下：
从啤酒厂获得废酿酒酵母泥后，只进行诱导阶段一个阶段的培养。在诱导阶段，将所述的废酿酒酵母泥以常温无菌水稀释至生物量为20g/L，以一次性添加的方式向培养液中添加20g/L的葡萄糖，并以连续流加的方式向培养基中添加20g/L的乙酸钠，通过调节通气量和搅拌转速控制溶氧为30％，培养温度为26℃，诱导阶段持续时间为62小时。培养结束后测定生物量和油脂含量。
结果如图5所示，在本实施例所述的条件下，废酿酒酵母只经过第三个阶段的培养后生物量大幅度降低，表明酿酒酵母细胞发生大量死亡、溶解，细胞活性较差。在培养结束后，酿酒酵母泥的细胞的油脂含量由初始的5％提高至10％左右。
由此可见，本发明所提供的方法中三个阶段的依次连续使用在促进废弃酿酒酵母泥的油脂积累方面较为重要。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种对废酿酒酵母泥进行诱导培养以积累油脂的方法，其特征在于：包括如下步骤：依次进行复苏阶段、缓冲阶段和诱导阶段；
在所述复苏阶段，将废酿酒酵母泥采用预先冷却的无菌水稀释，同时向其中添加葡萄糖、甘油和乙醇，得培养体系，在无氧条件下搅拌设定时间；
在缓冲阶段，向培养体系中补加葡萄糖，并通入无菌空气，通过逐步增加通气量的方式逐步增加培养体系的溶氧量；并提高培养温度至26～30℃，培养设定时间；
在诱导阶段，向培养体系中添加葡萄糖和乙酸盐，调节溶解氧为5～30％，培养温度为26～30℃，培养设定时间。
2.根据权利要求1所述的对废酿酒酵母泥进行诱导培养以积累油脂的方法，其特征在于：复苏阶段，预先冷却的无菌水的温度为10～20℃。
3.根据权利要求1所述的对废酿酒酵母泥进行诱导培养以积累油脂的方法，其特征在于：无菌水稀释后的废酿酒酵母泥的浓度为20～200g/L。
4.根据权利要求1所述的对废酿酒酵母泥进行诱导培养以积累油脂的方法，其特征在于：复苏阶段，培养体系中，葡萄糖的浓度为10～50g/L，甘油的浓度为5～20g/L和乙醇5～20g/L。
5.根据权利要求1所述的对废酿酒酵母泥进行诱导培养以积累油脂的方法，其特征在于：复苏阶段，无氧条件下搅拌的时间为2-10小时。
6.根据权利要求1所述的对废酿酒酵母泥进行诱导培养以积累油脂的方法，其特征在于：缓冲阶段，向培养体系中添加的葡萄糖的量为10～20g/L；
无菌空气的通气量由0vvm逐步上调至0.5vvm，使培养体系的溶氧量由0％逐步上升至10～30％。
7.根据权利要求1所述的对废酿酒酵母泥进行诱导培养以积累油脂的方法，其特征在于：缓冲阶段，培养参数的调整均以线性或接近线性的方式进行。
8.根据权利要求1所述的对废酿酒酵母泥进行诱导培养以积累油脂的方法，其特征在于：诱导阶段，向培养体系中添加20～400g/L的葡萄糖和20～30g/L的乙酸盐；诱导阶段持续培养的时间为48～72小时。
9.根据权利要求8所述的对废酿酒酵母泥进行诱导培养以积累油脂的方法，其特征在于：所述乙酸盐的添加方式为连续流加的方式。
10.一种废酿酒酵母泥，其特征在于：由权利要求1-9任一所述的对废酿酒酵母泥进行诱导培养以积累油脂的方法诱导而来，其油脂含量为细胞干重的20％-35％。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN102100260A (zh) * 2010-12-03 2011-06-22 滨州学院 酵母油脂及其制备方法和应用
CN112391421A (zh) * 2020-11-19 2021-02-23 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种通过调节酿酒酵母发酵液总盐含量提高酿酒酵母油脂含量的培养方法及高产油酿酒酵母
WO2021254076A1 (zh) * 2020-06-15 2021-12-23 江南大学 一种产油酵母及其应用

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