CN115521284A - 高稳定长波长荧光染料、其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供作为高稳定长波长荧光染料的式A所示的化合物、其制备方法及应用，其中R1‑R9如文中所定义。本发明构建的荧光染料结构新颖，合成简单。本发明的荧光染料的最大吸收波长在630nm到650nm之间，最大荧光发射波长在650nm到680nm之间，具有强烈的长波长吸收能力、荧光发射能力和高稳定性，能够用于细胞、组织或生物活体成像，在生物医学基础研究及临床应用上均有重要潜力。
Description
技术领域
本发明属于染料化学领域，具体涉及高稳定长波长荧光染料、其制备方法及应用。
背景技术
高性能荧光染料在生物技术与医学诊断领域有广泛应用，包括核酸测序、荧光原位杂交、分子信标、荧光成像、流式细胞分析和分子探针等。近些年来，包括高分辨成像、核酸检测和流式细胞分析等应用对于超高稳定性的荧光染料有重大需求，现有染料无法满足应用需求。因此，开发具有抗漂白、抗氧化能力的荧光染料是染料化学领域的重要研究内容。当前，在应用中广泛使用的一个染料是Cy5(Cyanine 5)及其衍生物，其最大吸收波长在640nm左右，染料在光照、氧化剂、亲核试剂存在情况下，容易失去被破坏，失去发射荧光的能力。
本领域亟待开发最大吸收波长在640nm左右的高稳定荧光染料母核。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种高稳定长波长荧光染料、其制备方法及应用。本发明构建的荧光染料结构新颖，合成简单，具有强烈的长波长吸收能力、荧光发射能力和高稳定性，能够用于细胞、组织或生物活体成像，在生物医学基础研究及临床应用上均有重要潜力。
本发明的一个方面提供式A所示的化合物：
其中，R1-R5各自独立选自氢、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、卤素取代的C1-C4烷基、卤素取代的C1-C4烷氧基和C1-C4烷氧基取代的C1-C4烷基，R6-R9各自独立选自C1-C4烷基。
在一个或多个实施方案中，R1-R5各自独立选自氢、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基和卤素取代的C1-C4烷基。
在一个或多个实施方案中，R2-R4为氢，R1和R5各自独立选自氢、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、卤素取代的C1-C4烷基、卤素取代的C1-C4烷氧基和C1-C4烷氧基取代的C1-C4烷基；优选地，R1和R5各自独立选自氢、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基和卤素取代的C1-C4烷基。
在一个或多个实施方案中，R2-R5为氢，R1选自C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、卤素取代的C1-C4烷基、卤素取代的C1-C4烷氧基和C1-C4烷氧基取代的C1-C4烷基；优选地，R1选自C1-C4烷基、C1-C4烷氧基和卤素取代的C1-C4烷基。
在一个或多个实施方案中，式A化合物具有式I所示的结构：
其中，R1-R5如本文任一实施方案所述。
本发明的另一个方面提供制备本发明所述的化合物的方法，所述方法包括：
步骤1：使式a化合物与R10-I反应，得到式b化合物，其中，R10选自C1-C4烷基；
步骤2：使式b化合物与甲醛进行缩合反应，得到式c化合物，其中R6-R9各自独立选自C1-C4烷基；
步骤3：使式c化合物与锂试剂进行锂卤交换反应，再与
反应，经过氧化，得到式d化合物；
步骤4：使式d化合物进行关环反应，得到式e化合物；
步骤5：使式e化合物与
反应，经过脱水，得到式A化合物；
其中，R1-R5各自独立选自氢、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、卤素取代的C1-C4烷基、卤素取代的C1-C4烷氧基和C1-C4烷氧基取代的C1-C4烷基。
在一个或多个实施方案中，步骤1中，使用乙腈作为溶剂，使用碳酸钾作为催化剂。
在一个或多个实施方案中，步骤2中，使用乙酸和/或乙腈作为溶剂，使用路易斯酸、例如浓硫酸作为催化剂。
在一个或多个实施方案中，步骤3中，锂卤交换反应的锂试剂为正丁基锂和/或仲丁基锂，锂卤交换反应的溶剂为醚类溶剂。
在一个或多个实施方案中，步骤3中，与
反应的溶剂为醚类溶剂。
在一个或多个实施方案中，步骤3中，氧化反应的氧化剂为高锰酸钾，氧化反应的溶剂为丙酮。
在一个或多个实施方案中，步骤4中，使用卤代烃作为溶剂，使用甲基磺酸作为催化剂。
在一个或多个实施方案中，步骤5中，与
反应的溶剂为醚类溶剂。
在一个或多个实施方案中，步骤5中，脱水反应的催化剂为甲基磺酸，脱水反应的溶剂为卤代烃。
本发明也提供荧光检测试剂，其含有本文任一实施方案所述的化合物，例如式A化合物或式I化合物。
本发明也提供本文任一实施方案所述的化合物在制备荧光染料中的用途，或在细胞成像、组织成像或生物活体成像中的用途，或在制备用于细胞成像、组织成像或生物活体成像的试剂中的用途，或在基于影像技术的疾病诊断、疾病的光动力治疗或疾病的光热消融中的用途，或在制备用于基于影像技术的疾病诊断、疾病的光动力治疗或疾病的光热消融的试剂中的用途。所述化合物例如可以是式A化合物或式I化合物。所述成像可以是体外成像，例如体外细胞成像、体外组织成像。所述试剂可以是荧光检测试剂。
附图说明
图1为化合物DM2在(A)二氯甲烷、(B)二甲基亚砜、(C)甲醇和(D)磷酸缓冲盐溶液中的吸收发射光谱图。
图2为化合物DM2的氧化剂稳定性实验结果图，其中，图2(A)为不同当量的氧化剂ONOO-存在下化合物DM2的吸收光谱图，图2(A)中的曲线由上至下依次为0当量、1当量、2当量、3当量、4当量和5当量的氧化剂ONOO-存在下化合物DM2的吸收光谱；图2(B)为不同当量的氧化剂ONOO-存在下Cy5染料的吸收光谱图，图2(B)中的曲线由上至下依次为0当量、1当量、2当量、3当量、4当量和5当量的氧化剂ONOO-存在下Cy5染料的吸收光谱；图2(C)为化合物DM2和Cy5染料在不同浓度的氧化剂ONOO-存在下的吸光度(A)与不存在氧化剂ONOO-时的吸光度(A0)的比值的散点图，所述吸光度是吸收波长为640nm时的吸光度。
图3为化合物DM2的光稳定性实验结果图，其中，图3(A)为不同激光照射时间下化合物DM2的吸收光谱图，图3(A)中的曲线由上至下依次为激光照射0min、5min、10min、15min、20min、25min和30min时化合物DM2的吸收光谱；图3(B)为不同激光照射时间下Cy5染料的吸收光谱图，图3(B)中的曲线由上至下依次为激光照射0min、5min、10min、15min、20min、25min和30min时Cy5染料的吸收光谱；图3(C)为化合物DM2和Cy5染料在不同激光照射时间下的吸光度(A)与未进行激光照射时的吸光度(A0)的比值的散点图，所述吸光度是吸收波长为640nm时的吸光度。
图4为Hela细胞在浓度为0nM、0.5μM、1.2μM、2.0μM和2.5μM的DM2下的共聚焦成像图，白色标尺的长度为5μm，由图4中所有的图共用。
具体实施方式
为使本领域技术人员可了解本发明的特点及效果，以下谨就说明书及权利要求书中提及的术语及用语进行一般性的说明及定义。除非另有指明，否则文中使用的所有技术及科学上的字词，均为本领域技术人员对于本发明所了解的通常意义，当有冲突情形时，应以本说明书的定义为准。
本文描述和公开的理论或机制，无论是对或错，均不应以任何方式限制本发明的范围，即本发明内容可以在不为任何特定的理论或机制所限制的情况下实施。
本文所描述的数值范围应视为已涵盖且具体公开所有可能的次级范围及范围内的任何单独的数值。例如，“含有1至20个碳原子”将包括含有1至10个碳原子、含有2至10个碳原子、含有5个碳原子等。
本文中，当描述实施方案、实施例或实例时，应理解，其并非用来将本发明限定于这些实施方案、实施例或实例。相反地，本发明所描述的方法及材料的所有的替代物、改良物及均等物，均可涵盖于权利要求书所限定的范围内。本领域技术人员将可确认许多可用于实施本发明的类似于或相当于本文中所描述的方法及材料。
本文中，为使描述简洁，未对各个实施方案、实施例或实例中的各个技术特征的所有可能的组合都进行描述。因此，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，各个实施方案、实施例或实例中的各个技术特征可以进行任意的组合，所有可能的组合都应当认为是本说明书记载的范围。
在本文中定义的某些化学基团前面通过简化符号来表示该基团中存在的碳原子总数。例如，C1-C4烷基是指具有总共1至4个碳原子的如下文所定义的烷基。简化符号中的碳原子总数不包括可能存在于所述基团的取代基中的碳。
本文中，卤素包括F、Cl、Br和I。
本文中，烷基是指直链或支链单价饱和烃基，通常含有1-12个碳原子(C1-C12烷基)，优选含有1-6个碳原子，更优选含有1-4个碳原子(C1-C4烷基)。烷基的例子包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基。本文中，若无特别说明，丙基指的是正丙基，丁基指的是正丁基。
本文中，亚烷基是指直连或支链二价饱和烃基，通常含有1-12个碳原子(C1-C12亚烷基)，优选含有1-6个碳原子，更优选含有1-4个碳原子(C1-C4亚烷基)。亚烷基的例子包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基等。
本文中，烷氧基是指“烷基-O-”，其中，烷基可以具有1-12个碳原子，优选具有1-6个碳原子，更优选具有1-4个碳原子。烷氧基的例子包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙基氧基、异丙基氧基、正丁基氧基、异丁基氧基、仲丁基氧基、叔丁基氧基。
本文中，取代指被取代的基团或化合物上的氢原子被1个或多个(如1-3个)选自C1-C4烷基、卤素、羟基、C1-C4烷氧基、苄氧基、卤素取代的C1-C4烷基、C1-C4烷氧基取代的C1-C4烷基、羧基和磺酸根的基团所取代。
本发明提供一类结构新颖的长波长荧光染料和构建长波长荧光染料的方法，采用本发明的方法可以较容易地构建出一系列长波长荧光染料。本发明中，“长波长”是指荧光染料的最大吸收波长在640nm左右，例如在630nm到650nm之间。
本发明提供式A所示的化合物：
其中，R1-R5各自独立选自氢、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、卤素取代的C1-C4烷基、卤素取代的C1-C4烷氧基和C1-C4烷氧基取代的C1-C4烷基，R6-R9各自独立选自C1-C4烷基。
本发明中，当R1-R5为卤素取代的C1-C4烷基、卤素取代的C1-C4烷氧基或C1-C4烷氧基取代的C1-C4烷基时，被取代的C1-C4烷基和C1-C4烷氧基上取代基的个数可以为1-3个。在一些实施方案中，取代基的个数为1个。
在一些实施方案中，式A化合物中，R1-R5各自独立选自氢、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基和卤素取代的C1-C4烷基。在一些实施方案中，式A化合物中，R1-R5各自独立选自氢、C1-C4烷基和C1-C4烷氧基。
在一些实施方案中，式A化合物中，R2-R4为氢，R1和R5各自独立选自氢、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、卤素取代的C1-C4烷基、卤素取代的C1-C4烷氧基和C1-C4烷氧基取代的C1-C4烷基。在一些实施方案中，式A化合物中，R2-R4为氢，R1和R5各自独立选自氢、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基和卤素取代的C1-C4烷基。在一些实施方案中，式A化合物中，R2-R4为氢，R1和R5各自独立选自氢、C1-C4烷基和C1-C4烷氧基。
在一些实施方案中，式A化合物中，R2-R4为氢，R1和R5各自独立选自氢、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、卤素取代的C1-C4烷基、卤素取代的C1-C4烷氧基和C1-C4烷氧基取代的C1-C4烷基，且R1和R5中至少有一个为氢。在一些实施方案中，式A化合物中，R2-R4为氢，R1和R5各自独立选自氢、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基和卤素取代的C1-C4烷基，且R1和R5中至少有一个为氢。在一些实施方案中，式A化合物中，R2-R4为氢，R1和R5各自独立选自氢、C1-C4烷基和C1-C4烷氧基，且R1和R5中至少有一个为氢。
在一些实施方案中，式A化合物中，R2-R4为氢，R1和R5各自独立选自氢、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、卤素取代的C1-C4烷基、卤素取代的C1-C4烷氧基和C1-C4烷氧基取代的C1-C4烷基，且R1和R5中至多有一个为氢。在一些实施方案中，式A化合物中，R2-R4为氢，R1和R5各自独立选自氢、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基和卤素取代的C1-C4烷基，且R1和R5中至多有一个为氢。在一些实施方案中，式A化合物中，R2-R4为氢，R1和R5各自独立选自氢、C1-C4烷基和C1-C4烷氧基，且R1和R5中至多有一个为氢。
在一些实施方案中，式A化合物中，R1-R5为氢。
在一些实施方案中，式A化合物中，R2-R5为氢，R1选自C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、卤素取代的C1-C4烷基、卤素取代的C1-C4烷氧基和C1-C4烷氧基取代的C1-C4烷基。在一些实施方案中，式A化合物中，R2-R5为氢，R1选自C1-C4烷基、C1-C4烷氧基和卤素取代的C1-C4烷基。在一些实施方案中，式A化合物中，R2-R5为氢，R1选自C1-C4烷基和C1-C4烷氧基。
在一些实施方案中，式A化合物中，R2-R4为氢，R1和R5各自独立选自C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、卤素取代的C1-C4烷基、卤素取代的C1-C4烷氧基和C1-C4烷氧基取代的C1-C4烷基。在一些实施方案中，式A化合物中，R2-R4为氢，R1和R5各自独立选自C1-C4烷基、C1-C4烷氧基和卤素取代的C1-C4烷基。在一些实施方案中，式A化合物中，R2-R4为氢，R1和R5各自独立选自C1-C4烷基和C1-C4烷氧基。
在一些实施方案中，式A化合物中，作为R1-R5的C1-C4烷基选自甲基和乙基。在一些实施方案中，式A化合物中，作为R1-R5的C1-C4烷基为甲基。
在一些实施方案中，式A化合物中，作为R6-R9的C1-C4烷基选自甲基和乙基。在一些实施方案中，式A化合物中，作为R6-R9的C1-C4烷基为甲基。
在一些实施方案中，式A化合物中，作为R1-R5的C1-C4烷氧基选自甲氧基和乙氧基。在一些实施方案中，式A化合物中，作为R1-R5的C1-C4烷基为甲氧基。
在一些实施方案中，式A化合物中，作为R1-R5的卤素取代的C1-C4烷基选自卤素取代的甲基和卤素取代的乙基。在一些实施方案中，式A化合物中，作为R1-R5的卤素取代的C1-C4烷基为卤素取代的甲基。
在一些实施方案中，式A化合物中，作为R1-R5的卤素取代的C1-C4烷氧基选自卤素取代的甲氧基和卤素取代的乙氧基。在一些实施方案中，式A化合物中，作为R1-R5的卤素取代的C1-C4烷氧基为卤素取代的甲氧基。
在一些实施方案中，作为烷基和烷氧基的取代基的卤素选自氟、氯和溴。在一些实施方案中，作为烷基和烷氧基的取代基的卤素为溴。
在一些实施方案中，式A化合物中，作为R1-R5的C1-C4烷氧基取代的C1-C4烷基选自C1-C4烷氧基取代的甲基和C1-C4烷氧基取代的乙基。在一些实施方案中，式A化合物中，作为R1-R5的C1-C4烷氧基取代的C1-C4烷基为C1-C4烷氧基取代的甲基。
在一些实施方案中，作为烷基的取代基的烷氧基选自甲氧基和乙氧基。在一些实施方案中，作为烷基的取代基的烷氧基为甲氧基。
本发明还提供式I所示的化合物：
其中，R1-R5如前文式A化合物的任一实施方案中所述。
在一些实施方案中，本发明的化合物具有如下所示的结构：
本发明的化合物可以采用包括以下步骤的方法制备得到：
步骤1：使式a化合物与R10-I反应，得到式b化合物，其中，R10选自C1-C4烷基；
步骤2：使式b化合物与甲醛进行缩合反应，得到式c化合物，其中R6-R9各自独立选自C1-C4烷基；
步骤3：使式c化合物与锂试剂进行锂卤交换反应，再与
反应，经过氧化，得到式d化合物；
步骤4：使式d化合物进行关环反应，得到式e化合物；
步骤5：使式e化合物与
反应，经过脱水，得到式A化合物；
其中，R1-R5各自独立选自氢、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、卤素取代的C1-C4烷基、卤素取代的C1-C4烷氧基和C1-C4烷氧基取代的C1-C4烷基。
步骤1中，通过氨基亲核取代反应实现式a化合物的烷基化。反应的溶剂可以是乙腈。反应的催化剂可以是碳酸钾。反应在加热(例如80±10℃)下进行。可以理解的是，式b化合物上的两个R10可以相同或不同，例如当用于反应的R10-I为不同的R10-I的混合物时，可以得到分子结构中两个R10不相同的式b化合物。在一些实施方案中，步骤1中的R10-I为碘甲烷，得到的式b化合物为
步骤2中，缩合反应在酸性条件下进行。缩合反应使用的催化剂是路易斯酸，例如浓硫酸。缩合反应溶剂可以是乙酸、乙腈等。缩合反应可以在室温下进行，如果反应不彻底可适当升温。可以理解的是，当用于反应的式b化合物为不同的式b化合物的混合物时，可以得到分子结构中R6-R9不完全相同的式c化合物。在一些实施方案中，步骤2中的式b化合物为
则最终可以制备得到本发明的式I化合物。
步骤3中，先使式c化合物与锂试剂发生锂卤交换反应，得到二锂试剂。锂试剂可以是正丁基锂(n-BuLi)、仲丁基锂(sec-BuLi)等。锂卤交换反应的溶剂可以是醚类溶剂，例如四氢呋喃、乙醚、二氧六环等。锂卤交换反应在低温下进行，例如零下78±10℃。二锂试剂随后与
反应，反应的溶剂可以是醚类溶剂，例如四氢呋喃、乙醚、二氧六环等，反应在低温下进行，例如零下78±10℃，如果反应不完全可以将温度升至室温。接着对二锂试剂和
的反应产物进行氧化反应。氧化反应的氧化剂可以是高锰酸钾，反应溶剂可以是丙酮，反应温度可以是零下20±10℃。
步骤4中，对式d化合物进行关环反应。关环通常是酸关环，即在酸性条件下进行关环反应。作为关环反应催化剂的酸可以是甲基磺酸、浓硫酸等。关环反应可在室温下进行。关环反应溶剂可以是卤代烃，例如二氯甲烷。
步骤5中，先使式e化合物上的羰基与
反应成醇，反应溶剂可以是醚类溶剂，例如四氢呋喃、乙醚、二氧六环等，反应温度通常是零下78±10℃，如果反应不完全可以将温度升至室温。随后对式e化合物与
的反应产物进行脱水反应。脱水反应可以在酸性条件下进行。作为脱水反应催化剂的酸可以是甲基磺酸、浓硫酸等。脱水反应可在室温下进行。脱水反应的溶剂可以是卤代烃，例如二氯甲烷。
本发明所用的
可由
与锂试剂发生锂卤交换反应而得到。锂试剂可以是正丁基锂、仲丁基锂等。锂卤交换反应的溶剂可以是醚类溶剂，例如四氢呋喃、乙醚、二氧六环等。锂卤交换反应在低温下进行，例如零下78±10℃。
在一些实施方案中，本发明的式I化合物采用包括以下步骤的方法制备得到：
步骤1：使化合物a与碘甲烷反应，得到化合物b-1，反应溶剂为乙腈，催化剂为碳酸钾，反应温度为80℃左右；
步骤2：使化合物b-1与甲醛进行缩合反应，得到化合物c-1，反应溶剂为乙酸，催化剂为浓硫酸，反应温度为室温(r.t.)，反应时间为24h左右；
步骤3：先使化合物c-1与仲丁基锂在四氢呋喃(THF)中于-78℃左右反应，然后使反应产物与
在THF中于-78℃至室温下反应，然后使反应产物与高锰酸钾在丙酮中于-20℃左右反应，得到化合物d-1；
步骤4：使化合物d-1与甲基磺酸在二氯甲烷中于室温下反应，得到化合物e-1；
步骤5：使化合物e-1与
在THF中于-78℃至室温下反应，然后使反应产物与甲基磺酸在二氯甲烷中反应，得到式I化合物。
本发明的化合物的最大吸收波长在630nm到650nm之间，最大荧光发射波长在650nm到680nm之间，具有强烈的长波长吸收能力和荧光发射能力。因此，本发明的化合物可作为荧光染料或荧光探针，用于荧光检测、细胞成像、组织成像、生物活体成像和荧光成像。所述检测和成像可以是体外检测和体外成像。本发明的化合物还可以用于基于影像技术的疾病诊断、疾病的光动力治疗或疾病的光热消融。本发明的化合物具有优异的氧化剂稳定性，在高浓度的ONOO-中能保持稳定。本发明的化合物具有优异的光学稳定性，在636nm激光照射下能保持长时间稳定。本发明的化合物具有优异的细胞成像效果。本发明的化合物适用于共聚焦荧光成像，例如对Hela细胞进行共聚焦荧光成像。
本发明的荧光检测试剂可以是荧光成像试剂或显影剂。显影剂除含有本发明的化合物外，还可含有显影剂常用的载体或赋形剂。例如，该载体或赋形剂可以是生理盐水、磷酸缓冲盐溶液(PBS)、各类有机大分子或无极材料形成的各类纳米结构等。显影剂还可含有适量的本领域周知的助溶剂。可以对本发明的化合物进行稀释(例如将本发明的化合物稀释至0.5～5μM、例如2.5μM)后再用于细胞(例如Hela细胞)孵育。稀释所用的溶剂可以是细胞培养基。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从公开途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1：化合物b-1的制备
向500mL耐压瓶加入3-溴苯胺(50g，290.66mmol，1当量)、CH3I(99.73g，639.44mmol，2.2当量)和K2CO3(40g，639.44mmol，1当量)，溶于80mL的乙腈(MeCN)中，升温至80℃后连续搅拌反应12小时。待反应完全后冷却至室温，减压抽滤固体颗粒，用CH2Cl2洗涤滤饼三次，收集的滤液旋干后，得到棕黄色液体。利用硅胶(二氯甲烷(DCM)：石油醚(PE)＝1:10)柱层析对产物进行纯化，得到N,N-二甲基间溴苯胺(57.0g，无色液体)，收率87％。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.01(td,J＝8.1,2.8Hz,1H),6.74(d,J＝14.4Hz,2H),6.55(d,J＝8.3Hz,1H),3.28(s,6H)。
实施例2：化合物c-1的合成
将N,N-二甲基间溴苯胺(10g，65.75mmol，1当量)溶于40mL的CH3COOH中，加入37％的CH2O溶液(3.6mL，36.16mmol，0.55当量)和催化当量的浓硫酸在室温下连续搅拌24h。用薄层色谱(TLC)监测反应情况，直至原料反应完。反应完全后，有固体析出，减压抽滤，用PE多次洗涤，得到白色固体。用CH2Cl2对滤液进行少量多次萃取，并有机相合并，加入无水Na2SO4干燥后旋干，用硅胶(DCM:PE＝1:10)柱层析对产物进行纯化，得到纯净的c-1(白色固体，11.4g)，收率76％。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ6.87(d,J＝2.4Hz,2H),6.83(d,J＝8.6Hz,2H),6.51(dd,J＝8.6,2.4Hz,2H),3.96(s,2H),3.27(s,12H)。
实施例3：化合物d-1的合成
向干燥的100mL史莱克反应瓶中加入化合物c-1(5g，10.68mmol，1当量)，用20mL重蒸过的四氢呋喃(THF)溶解后,抽真空后进行氩气置换，在氩气球保护下，置于-78℃下的低温反应器中降温30min，缓慢滴加入2.50M的n-BuLi(10.68mL，26.69mmol，2.50当量)进行锂卤交换，保持在低温反应器中搅拌0.5h，往制备好的锂试剂中加入商业购买的99％的2-苯氧基苯甲酸甲酯(2.59mL，12.81mmol，1.20当量)后，将反应移至冰浴，连续搅拌至室温。反应完全后，加入饱和NH4Cl水溶液淬灭多余的锂试剂，用分液漏斗对混合物进行萃取分离，用乙酸乙酯(EA)对水相进行少量多次的萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥后，旋干备用。
向反应瓶中加入20mL的丙酮溶解，置于-20℃的低温反应器中，降温20min后，批量多次加入KMnO4固体(1.69g，10.68mmol，1当量)，两个小时内加完，继续反应3h，用TLC跟踪反应进程，直至反应完全。待反应降至室温后，用硅藻土过滤掉固体残渣，并用CH2Cl2反复洗涤，合并滤液，旋干后用硅胶(EA:PE＝1:20)柱层析对产物进行纯化，得到干净的d-1(黄色固体，1.9g)，收率32％。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.36(d,J＝7.7Hz,1H),7.93(d,J＝8.5Hz,2H),7.21(t,J＝7.6Hz,1H),6.94–6.85(m,2H),6.74(dd,J＝13.8,7.6Hz,3H),6.48(d,J＝2.6Hz,1H),6.46(s,3H),6.21(d,J＝7.8Hz,2H),3.37-3.20(m,8H),2.83(dd,J＝9.7,8.1Hz,1H),1.05(t,J＝7.1Hz,12H)。
实施例4：化合物e-1的合成
将2g纯化的化合物d-1溶于20mL二氯甲烷中，滴加入催化当量的CH3SO3H室温下搅拌24h，用TLC跟踪反应进程，原料关环完全。反应完全后用饱和NaHCO3水溶液中和至中性，将混合液倒入分液漏斗中用CH2Cl2萃取，水相用CH2Cl2少量多次萃取，合并有机相后，用无水Na2SO4干燥后旋干，用硅胶(EA:PE＝1:20)柱层析对产物进行纯化，得到纯净的e-1(黄色固体，1.5g)，收率75％。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ8.23(d,J＝9.0Hz,1H),7.18(dd,J＝8.2,1.1Hz,1H),7.16-7.10(m,1H),6.83-6.79(m,1H),6.73(dd,J＝7.9,1.4Hz,1H),6.60(dd,J＝8.9,2.1Hz,1H),6.11(d,J＝2.3Hz,1H),3.16(q,J＝7.1Hz,4H),0.91(t,J＝7.1Hz,6H)。13C NMR(151MHz,CDCl3):δ181.03,152.97,150.60,149.48,130.54,128.92,128.57,127.64,123.49,119.42,116.11,112.53,110.54,46.54,44.55,12.24。EI-MS(m/s):[M]+,calcd.for C34H34N2O2,503.2693；found 503.2700。
实施例5：化合物DM1的合成
向干燥的50mL的史莱克反应瓶中加入商业购买的98％的溴苯(1.26mL，9.95mmol，10当量)，加入重蒸的THF溶剂25mL，抽真空后进行Ar置换，在Ar气球保护下，置于-78℃下的低温反应器中降温30min，缓慢滴加入2.5M的n-BuLi(4.02mL，10.05mmol，10当量)，保持在低温反应器中搅拌0.5h。另取一个干燥的50mL的史莱克反应瓶，加入化合物e-1(500mg，994.71μmol，1当量)，溶解于20mL重蒸的无水THF溶剂，抽真空后进行Ar置换，在Ar气球保护下置于冰浴条件下，向其中逐滴加制备好的甲苯锂试剂，搅拌至室温。反应完全后，加入饱和NH4Cl水溶液淬灭，搅拌后用EA萃取，将几次的合有机相并，无水Na2SO4干燥后，旋干备用。将混合物溶于20mL的CH2Cl2，在室温下滴加入催化当量的甲基磺酸，搅拌24h，用TLC跟踪反应进程，直至反应完全。用硅胶(EA:PE＝1:20)柱层析对产物进行纯化，得到纯净的DM1(紫黑色固体，150mg)，收率48％。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ7.52(t,J＝7.2Hz,1H),7.45(dd,J＝12.9,6.9Hz,2H),7.32(s,4H),7.12(d,J＝8.5Hz,2H),7.00(s,2H),6.79-6.69(m,2H),6.64(d,J＝8.1Hz,2H),6.47(s,2H),3.41(s,8H),2.25(s,3H),1.05(s,12H)。13C NMR(151MHz,CDCl3):δ164.69,157.54,154.62,148.99,148.93,137.08,135.65,134.57,130.72,129.77,129.40,129.37,129.34,129.11,128.95,128.13,127.97,126.14,124.55,124.52,119.71,117.48,117.38,117.02,113.36,77.28,77.07,76.85,46.43,19.91,12.69。EI-MS(m/s):[M]+calcd.for C36H31N2O+,Exact Mass:507.2；found 507.3。
实施例6：化合物DM2合成
DM2的制备方法同DM1，将2-甲基溴苯制成锂试剂进攻化合物e-1，得到纯净的DM2(紫黑色固体，150mg)，收率33％。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ7.61(d,J＝5.8Hz,1H),7.33(d,J＝13.1Hz,2H),7.26(s,3H),7.22(dd,J＝10.6,7.0Hz,3H),7.18(d,J＝7.6Hz,1H),7.02(d,J＝6.6Hz,1H),6.99–6.90(m,2H),6.79(s,1H),6.64–6.55(m,2H),6.44–6.36(m,2H),3.93–3.78(m,3H),3.38(s,8H),1.03(s,12H)。13C NMR(151MHz,CDCl3):δ163.24,157.45,156.66,154.51,149.67,148.35,137.36,131.49,130.28,129.88,129.46,129.10,129.04,127.58,127.32,124.34,123.57,120.74,120.41,117.43,117.12,116.62,112.89,111.47,56.09,49.15,46.21,39.32,12.60。ESI-MS(m/s):[M]+calcd.for C37H33N2O+,521.2587；found521.2577。
实施例7：化合物DM3合成
DM3的制备方法同DM1，将2-溴苯甲醚制成锂试剂进攻化合物e-1，得到纯净的DM3(紫黑色固体，150mg)，收率27％。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ7.61(d,J＝5.8Hz,1H),7.33(d,J＝13.1Hz,2H),7.26(s,3H),7.22(dd,J＝10.6,7.0Hz,3H),7.18(d,J＝7.6Hz,1H),7.02(d,J＝6.6Hz,1H),6.99–6.90(m,2H),6.79(s,1H),6.64–6.55(m,2H),6.44–6.36(m,2H),3.93–3.78(m,3H),3.38(s,8H),1.03(s,12H)。13C NMR(151MHz,CDCl3):δ163.24,157.45,156.66,154.51,149.67,148.35,137.36,131.49,130.28,129.88,129.46,129.10,129.04,127.58,127.32,124.34,123.57,120.74,120.41,117.43,117.12,116.62,112.89,111.47,56.09,49.15,46.21,39.32,12.60。ESI-MS(m/s):[M]+calcd.for C37H33N2O2 +,537.2537；found537.2531。
实施例8：化合物DM4合成
DM4的制备方法同DM1，将2,6-二甲基溴苯制成锂试剂进攻化合物e-1，得到纯净的DM4(紫黑色固体，150mg)，收率21％。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ7.61(d,J＝5.8Hz,1H),7.33(d,J＝13.1Hz,2H),7.26(s,3H),7.22(dd,J＝10.6,7.0Hz,3H),7.18(d,J＝7.6Hz,1H),7.02(d,J＝6.6Hz,1H),6.99–6.90(m,2H),6.79(s,1H),6.64–6.55(m,2H),6.44–6.36(m,2H),3.93–3.78(m,3H),3.38(s,8H),1.03(s,12H)。13C NMR(151MHz,CDCl3):δ163.24,157.45,156.66,154.51,149.67,148.35,137.36,131.49,130.28,129.88,129.46,129.10,129.04,127.58,127.32,124.34,123.57,120.74,120.41,117.43,117.12,116.62,112.89,111.47,56.09,49.15,46.21,39.32,12.60。ESI-MS(m/s):[M]+calcd.for C41H41N2O2 +,593.3163；found 593.3169。
实施例9：化合物DM5合成
DM5的制备方法同DM1，将2,6-二甲氧基溴苯制成锂试剂进攻化合物e-1，得到纯净的DM5(紫黑色固体，150mg)，收率42％。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ7.61(d,J＝5.8Hz,1H),7.33(d,J＝13.1Hz,2H),7.26(s,3H),7.22(dd,J＝10.6,7.0Hz,3H),7.18(d,J＝7.6Hz,1H),7.02(d,J＝6.6Hz,1H),6.99–6.90(m,2H),6.79(s,1H),6.64–6.55(m,2H),6.44–6.36(m,2H),3.93–3.78(m,3H),3.38(s,8H),1.03(s,12H)。13C NMR(151MHz,CDCl3):δ163.24,157.45,156.66,154.51,149.67,148.35,137.36,131.49,130.28,129.88,129.46,129.10,129.04,127.58,127.32,124.34,123.57,120.74,120.41,117.43,117.12,116.62,112.89,111.47,56.09,49.15,46.21,39.32,12.60。ESI-MS(m/s):[M]+calcd.for C38H35N2O3 +,567.2642；found 567.2640。
测试例1：吸收发射光谱实验
用紫外可见光谱仪和荧光光谱仪检测化合物DM2在二氯甲烷(DCM)、二甲基亚砜(DMSO)、甲醇(MeOH)和PBS缓冲液中的紫外可见吸收发射光谱和基本光谱性质，结果如图1和表1所示。
表1：化合物DM2在不同溶剂中的基本光谱性质
图1和表1的结果表明，在不同溶剂中，DM2的最大吸收波长在640nm附近，最大荧光发射波长在659nm到672nm之间，具有强烈的长波长吸收能力和荧光发射能力。
测试例2：氧化剂稳定性实验
用紫外可见光谱仪检测化合物DM2的溶液(2μM，磷酸缓冲溶液，pH＝7.4，含10％DMF)的紫外可见吸收光谱随ONOO-的浓度的变化，商业化的Cy5染料作为对照分子，结果如图2所示。
图2的结果表明，DM2在高浓度的ONOO-存在时仍具有强烈的长波长吸收能力，表现出优异的氧化剂稳定性，而Cy5染料的吸收能力随着ONOO-浓度的增大显著衰弱。
测试例3：光稳定性实验
用紫外可见光谱仪检测化合物DM2的溶液(2μM，磷酸缓冲溶液，pH＝7.4，含10％DMF)在636nm激光照射下的紫外可见吸收光谱随光照时间的变化，商业化的Cy5染料作为对照分子，结果如图3所示。
图3的结果表明，DM2经过长时间的激光照射后仍具有强烈的长波长吸收能力，表现出优异的光稳定性，而Cy5染料的吸收能力随着光照时间的增长显著衰弱。
测试例4：细胞成像实验
将化合物DM2的母液(10mM)用细胞培养基稀释成梯度浓度(0.5μM、1.2μM、2.0μM、2.5μM)，与HeLa细胞共孵育10min，用PBS缓冲液多次洗涤后，用共聚焦荧光显微镜对细胞进行成像，640nm激光激发，细胞培养基(DM2浓度为0μM)作为对照，用675±25nm的带通滤镜片采集荧光发射，结果如图4所示。图4中的白色标尺代表5μm，由图4中所有的图共用。
图4的结果表明，DM2具有很好的共聚焦荧光成像效果。
Claims (10)
1.式A所示的化合物：
其中，R1-R5各自独立选自氢、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、卤素取代的C1-C4烷基、卤素取代的C1-C4烷氧基和C1-C4烷氧基取代的C1-C4烷基，R6-R9各自独立选自C1-C4烷基。
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R1-R5各自独立选自氢、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基和卤素取代的C1-C4烷基。
3.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，
R2-R4为氢，R1和R5各自独立选自氢、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、卤素取代的C1-C4烷基、卤素取代的C1-C4烷氧基和C1-C4烷氧基取代的C1-C4烷基；优选地，R1和R5各自独立选自氢、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基和卤素取代的C1-C4烷基；或者
R2-R5为氢，R1选自C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、卤素取代的C1-C4烷基、卤素取代的C1-C4烷氧基和C1-C4烷氧基取代的C1-C4烷基；优选地，R1选自C1-C4烷基、C1-C4烷氧基和卤素取代的C1-C4烷基。
4.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有式I所示的结构：
其中，R1-R5如权利要求1所述。
5.如权利要求1-4中任一项所述的化合物，其特征在于，
所述C1-C4烷基选自甲基和乙基，优选为甲基；和/或
所述C1-C4烷氧基选自甲氧基和乙氧基，优选为甲氧基；和/或
所述卤素选自氟、氯和溴，优选为溴。
6.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物选自：
7.制备权利要求1-6中任一项所述的化合物的方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤1：使式a化合物与R10-I反应，得到式b化合物，其中，R10选自C1-C4烷基；
步骤2：使式b化合物与甲醛进行缩合反应，得到式c化合物，其中R6-R9各自独立选自C1-C4烷基；
步骤3：使式c化合物与锂试剂进行锂卤交换反应，再与
反应，经过氧化，得到式d化合物；
步骤4：使式d化合物进行关环反应，得到式e化合物；
步骤5：使式e化合物与
反应，经过脱水，得到式A化合物；
其中，R1-R5各自独立选自氢、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、卤素取代的C1-C4烷基、卤素取代的C1-C4烷氧基和C1-C4烷氧基取代的C1-C4烷基。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法具有以下一项或多项特征：
(1)步骤1中，使用甲腈作为溶剂，使用碳酸钾作为催化剂；
(2)步骤2中，使用乙酸和/或乙腈作为溶剂，使用路易斯酸、例如浓硫酸作为催化剂；
(3)步骤3中，锂卤交换反应的锂试剂为正丁基锂和/或仲丁基锂，锂卤交换反应的溶剂为醚类溶剂；
(4)步骤3中，与
反应的溶剂为醚类溶剂；
(5)步骤3中，氧化反应的氧化剂为高锰酸钾，氧化反应的溶剂为丙酮；
(6)步骤4中，使用卤代烃作为溶剂，使用甲基磺酸作为催化剂；
(7)步骤5中，与
反应的溶剂为醚类溶剂；
(8)步骤5中，脱水反应的催化剂为甲基磺酸，脱水反应的溶剂为卤代烃。
9.含有权利要求1-6中任一项所述的化合物的荧光检测试剂。
10.权利要求1-6中任一项所述的化合物在制备荧光染料中的用途，或在制备用于细胞成像、组织成像或生物活体成像的试剂中的用途，或在制备用于基于影像技术的疾病诊断、疾病的光动力治疗或疾病的光热消融的试剂中的用途。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20221227 |