CN115515971A - 治疗IL13Rα2阳性恶性病的靶向性嵌合抗原受体修饰的T细胞 - Google Patents

治疗IL13Rα2阳性恶性病的靶向性嵌合抗原受体修饰的T细胞 Download PDF

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Abstract

描述了靶向IL‑13Ra2的嵌合抗原受体。靶向域是相对于IL‑13Ra1对IL‑13Ra2具有增加的特异性的IL13变体。

Description

治疗IL13Rα2阳性恶性病的靶向性嵌合抗原受体修饰的T细胞
优先权要求
本申请要求于2020年3月12日提交的美国临时申请序列号62/988,828的权益。前述申请的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开内容涉及结合IL13受体的工程化的嵌合抗原受体(CAR)、表达此类CAR的T细胞、配制此类CAR T细胞的方法和用作抗癌剂的方法。
背景技术
IL13Rα2(Lupardus,Birnbaum et al.2010)，由于其在正常组织中的罕见表达(Debinski and Gibo Mol Med 6:440-449,2000)和在许多人类癌症中的过表达而成为一种通用的治疗靶物，所述癌症包括多形性胶质母细胞瘤(GBM)(Thaci,Brown et al.NeuroOncol 16:1304-1312,2014)，胰腺导管腺癌(Shimamura,Fujisawa et al.Clin CancerRes 16:577-586,2010)，黑素瘤(Beard,Abate-Daga et al.Clin Cancer Res 19:4941-4950,2013)，卵巢癌(Kioi,Kawakami et al.Cancer 107:1407-1418,2006)，透明细胞肾细胞癌(Shibasaki,Yamasaki et al.PLoS One 10:e0130980,2015)，乳腺癌(Papageorgis,Ozturk et al.Breast Cancer Res 17:98,2015)和肺癌(Xie,Wu et al.Oncotarget 6:32902-32913,2015)。第二个IL13受体家族成员IL13Rα1以较低的亲和力与IL13相互作用(Lupardus,Birnbaum et al.Structure 18:332-342,2010)，并且在健康组织中普遍表达(Debinski and Gibo Mol Med 6:440-449,2000)。此外，IL13Rα1和IL4Rα，一种以高亲和力结合IL13的受体对(Lupardus,Birnbaum et al.Structure 18:332-342,2010)以通过JAK/STAT6途径介导信号传导(Murata,Taguchi et al.Blood 91:3884-3891,1998)，在肺组织中共表达(Hecker,Zaslona et al.American Journal of Respiratory and CriticalCare Medicine 182,:805-818,2010)。尽管IL13结合配偶体在健康组织中这种广泛表达，但基于IL13配体的CAR在GBM中的局部区域中枢神经系统(CNS)递送的临床试验期间显示出对人体的安全性(Brown,Badie et al.Clin Cancer Res 21:4062-4072,2015；Brown,Alizadeh et al.N Engl J Med 375:2561-2569,2016)，表明在这种情况下，来自中靶/脱疾病结合的毒性不成问题。然而，对于系统性疾病的治疗，IL13结合配偶体在患病组织外的广泛表达可充当基于IL13的疗法的汇点(sink)，从而导致安全问题并可能阻碍向疾病部位的运输。本领域以前的工作试图通过生成源自IL13突变体的CAR来解决此问题，所述IL13突变体含有突变以引导结合远离IL13Rα1/IL4Rα。尽管具有E13Y突变，但是E13处的突变产生了对IL13Rα2相对于对IL13Rα1的改善的选择性(Kahlon,Brown et al.Cancer Res 64:9160-9166,2004,Krebs,Chow et al.Cytotherapy 16,1121-1131,2014)，所述E13Y突变在重组抗原和抗原表达性的癌细胞两者的背景中仍然允许IL13Rα1的可测量的识别(Krebs,Chow et al.(Kahlon,Brown et al.Cancer Res 64:9160-9166,2004,Krebs,Chow etal.Cytotherapy 16:1121-1131,2014)。将EK和R109K突变两者添加到基于IL13的CAR中也显示出相对于表达IL13Rα2的癌细胞对表达IL13Rα1的癌细胞的减弱但未消除的识别(Kong,Sengupta et al.Clin Cancer Res 18:5949-5960,2012)。虽然这些实例令人鼓舞，但需要额外的突变来开发IL13Rα2特异性IL13突变体。开发此类分子的挑战之一是无法预测IL13突变对含有IL13的CAR的功能的影响。
发明内容
本文描述了包含变体IL13的IL13Rα2靶向性CAR(“变体IL13 CAR”)以治疗多种癌症。描述的各种突变(E13Y、E13R、E92L和R109K)的氨基酸位置相对于以下序列：
Figure BDA0003843892780000021
野生型人IL13序列(信号序列加下划线)
Figure BDA0003843892780000022
Figure BDA0003843892780000031
如本文所示，相对于IL13Ra1，E92L突变增加对IL13Ra2的特异性。因此，此突变可以与其他突变组合，例如与E13Y、E13R和R109K中的一种或多种组合。对于包含在CAR中有用的IL-13变体可以包含SEQ ID NO:1的109、110、111、112、113个连续氨基酸或SEQ ID NO:1的具有1、2、3、4或5个单一氨基酸变化的整体，条件是在SEQ ID NO:1的第92位处没有E。因此，第92位可以选自：G,A,L,P,V,I,M,F,Y,W,S,T,C,N,Q,K,R和H；或可以选自：G,A,L,P,V,I,M,F,Y,W,S,T,C,N和Q；或者可以选自：G,A,L,P,V,I,M,F,Y和W；或者可以选自：G,A,L,P,V,I和M；或可以选自：G,A,L,V,I和M。对于包含在CAR中有用的IL-13变体可以包含SEQ IDNO:1的109、110、111、112、113个连续氨基酸或SEQ ID NO:1的具有1、2、3、4或5个单一氨基酸变化的整体，条件是SEQ ID NO:1的第92位存在有L。因此，第92位可以选自：G,A,L,P,V,I,M,F,Y,W,S,T,C,N,Q,K,R和H；或可以选自：G,A,L,P,V,I,M,F,Y,W,S,T,C,N和Q；或者可以选自：G,A,L,P,V,I,M,F,Y和W；或者可以选自：G,A,L,P,V,I和M；或可选自：G,A,L,V,I和M。
本文所述的变体IL13 CAR包含变体IL-13，其含有以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成(与wt IL13相比的突变为粗体且双下划线)：
Figure BDA0003843892780000032
或包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成(与wt IL13相比的突变为粗体且双下划线)：
Figure BDA0003843892780000033
或包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成(与wt IL13相比的突变为粗体且双下划线)：
Figure BDA0003843892780000041
或包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成(与wt IL13相比的突变为粗体且双下划线)：
Figure BDA0003843892780000042
或包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成(与wt IL13相比的突变为粗体且双下划线)：
Figure BDA0003843892780000043
或包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成(与wt IL13相比的突变为粗体且双下划线)：
Figure BDA0003843892780000044
或包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成(与wt IL13相比的突变为粗体且双下划线)：
Figure BDA0003843892780000045
或包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成(与wt IL13相比的突变为粗体且双下划线)：
Figure BDA0003843892780000046
本文描述了IL13 CAR，其包含：变体IL13，所述变体IL13包含选自SEQ ID NO:30-37(例如，SEQ ID NO:30-34和36)的氨基酸序列；间隔物(例如，包含SEQ ID NO:2-12的任一项)；跨膜域(例如，包含SEQ ID NO:13-20的任一项)；共刺激域(包含SEQ ID NO:22-25的任一项)；任选地3-15个氨基酸的接头(例如，GGG)；和CD3 zeta胞质域(SEQ ID NO:21)。
本文描述了IL13 CAR，其包含：变体IL13，该变体IL13包含选自SEQ ID NO:30-37(例如，SEQ ID NO:30-34和36)的氨基酸序列的113、112、111、110或109个连续氨基酸；间隔物(例如，包含SEQ ID NO:2-12的任一项)；跨膜域(例如，包含SEQ ID NO:13-20的任一项)；共刺激域(包含SEQ ID NO:22-25的任一项)；任选地3-15个氨基酸的接头(例如，GGG)；和CD3 zeta胞质域(SEQ ID NO:21)。
本文描述了包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列的核酸分子，其中所述嵌合抗原受体包含：靶向域，其包含选自SEQ ID NO:30-37(例如，SEQ ID NO:30-34和36)的氨基酸序列；间隔物，跨膜域；共刺激域；和CD3ζ信号传导域。在各种实施方案中：跨膜域选自：CD4跨膜域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体、CD8跨膜域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体、CD28跨膜域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体；其中IL13受体靶向域由选自SEQ ID NO:36-37(例如，SEQ ID NO:30-34和36)的氨基酸序列组成；共刺激域选自：41BB共刺激域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，CD28共刺激域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体；CD28gg共刺激域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，其中所述共刺激域是41BB共刺激域；41BB共刺激域包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列或其具有1-5个氨基酸修饰的变体；CD3ζ信号传导域包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；3至15个氨基酸的接头位于4-1BB共刺激域和CD3ζ信号传导域或其变体之间；CAR包含SEQ ID NO:30-37(例如，SEQ ID NO:30-34和36)的氨基酸序列或其具有1-5个氨基酸修饰的变体；CAR包含与SEQ ID NO:40-68中的任一项至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列或由与SEQ ID NO:40-68中的任一项至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成；CAR包含与SEQ ID NO:4-68中的任一项相比具有不超过5、4、3、2或1个单一氨基酸取代和/或缺失的氨基酸序列。还描述了包含前述任一个核酸分子的表达载体。还描述了包含任何前述核酸分子的病毒载体。
还描述了含有任何前述核酸分子的人T细胞或NK细胞群体。还描述了含有任何前述表达载体或病毒载体的人T细胞群体。在各种实施方案中，人T细胞群体包括中央记忆T细胞、幼稚记忆T细胞、泛T细胞或基本上消减了CD25+细胞和CD14+细胞的PBMC。
还描述了治疗患有胶质母细胞瘤、胰腺导管腺癌、黑素瘤、卵巢癌、肾细胞癌、乳腺癌或肺癌的患者的方法，包括施用含有本文所述核酸的自体或同种异体人T细胞群体。在各个实施方案中，局部或系统施用嵌合抗原受体；并且通过单次或重复给药施用嵌合抗原受体。
本文还描述了制备CAR T细胞的方法，包括：提供自体或同种异体人T细胞群并且通过包含本文所述核酸分子的载体转导T细胞。
还描述了含有表达变体IL13 CAR的载体的T细胞。在各种实施方案中：至少20％、30％或40％的转导的人T细胞是中央记忆T细胞；至少30％的转导人T细胞是CD4+和CD62L+或CD8+和CD62L+。在各种实施方案中：人T细胞群包含表达嵌合抗原受体的载体，所述嵌合抗原受体包含选自SEQ ID NO:40-68的氨基酸序列或其具有1-5个(例如，1或2个)氨基酸修饰(例如，取代)的变体；人T细胞群包含中央记忆T细胞(TCM细胞)，例如，至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％的细胞是TCM细胞，或T细胞群体包括中央记忆T细胞、幼稚T细胞和干中央记忆细胞的组合(TCM/SCM/N细胞)，例如，至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％的细胞是TCM/SCM/N细胞。在一些实施方案中，T细胞群体包括CD4+细胞和CD8+细胞两者(例如，至少20％的CD3+T细胞是CD4+并且至少3％的CD3+T细胞是CD8+和至少70、80或90％是CD4+或CD8+；至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％的细胞CD3+细胞是CD4+，并且至少4％、5％、8％,10％,20的CD3+细胞是CD8+细胞)。在一些实施方案中，人T细胞群体对于患者是自体的。在一些实施方案中，人T细胞群体对患者是同种异体的。
本文描述了包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列的核酸分子(例如，DNA或RNA)，其中所述嵌合抗原受体包含：靶向域，其包含选自：SEQ ID NO:30-37的氨基酸序列；间隔物域；跨膜域；共刺激域和CD3zeta域。
在各种实施方案中：间隔物域选自：和IgG4(EQ)间隔物域、IgG4(HL-CH3)间隔物域和IgG4(CH3)间隔物域；间隔物域包含SEQ ID NO:10；间隔物域包含SEQ ID NO:9；间隔物域包含SEQ ID NO:12；跨膜域选自：CD4跨膜域、CD8跨膜域和CD28跨膜域；共刺激域选自CD28共刺激域、CD28gg共刺激域和41-BB共刺激域；核酸分子包含选自下组的氨基酸序列或由选自下组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:40-68；CAR包含选自下组的氨基酸序列或由选自下组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:40-58，其中SEQ ID NO:10的氨基酸序列被SEQ ID NO:2-9和11中任一项的氨基酸序列替换。
还公开了核酸分子，其包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列，其中所述嵌合抗原受体包含：靶向域，其包括包含变体IL13域的氨基酸序列，所述变体IL13域包含SEQ IDNO:1的109、110、111、112、113个连续氨基酸或SEQ ID NO:1的具有1、2、3、4或5个单一氨基酸变化的整体，条件是在SEQ ID NO:1的第92位处存在有除E之外的氨基酸；间隔物域；跨膜域；共刺激域和CD3zeta域(例如，在SEQ ID NO:1的第91位存在有L)。
在各种实施方案中：T间隔域包含SEQ ID NO:2-12中任一项的氨基酸序列；共刺激域包含SEQ ID NO:22-25中任一项的氨基酸序列；CAR包含SEQ ID NO:40-68中任一项的缺失了1、2、3、4或5个连续氨基酸的氨基酸序列；CAR包含SEQ ID NO:40-68中任一项的具有多达5个单氨基酸取代的氨基酸序列。
还公开了：包含本文所述核酸分子的载体或表达载体；含有本文所述核酸分子的人T细胞或NK细胞群体。在各种实施方案中：人T细胞群体包括中央记忆T细胞、幼稚记忆T细胞、泛T细胞或基本上消减了CD25+细胞和CD14+细胞的PBMC。
还描述了治疗患有胶质母细胞瘤、胰腺导管腺癌、黑素瘤、卵巢癌、肾细胞癌、乳腺癌或肺癌的患者的方法，包括施用含有本文所述核酸分子的自体或同种异体细胞群体。在不同的实施方案中：局部或系统性或心室内施用细胞；通过单次或重复给药。
还描述了制备CAR T细胞的方法，包括：提供自体或同种异体人T细胞或NK细胞群体，并用包含本文所述核酸分子的载体转导细胞。
还描述了由本文描述的核酸编码的多肽。
IL13Rα2靶向性CAR
本文所述的CAR包含变体IL-13，所述变体IL-13包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成：本文所述的变体IL-13CAR包含变体IL-13，所述变体IL-13包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自：
Figure BDA0003843892780000071
Figure BDA0003843892780000081
有用的IL13变体CAR可以由SEQ ID NO:40-68的氨基酸序列(成熟的CAR，缺乏信号序列)组成或包含SEQ ID NO:40-68的氨基酸序列(成熟的CAR，缺乏信号序列)或IL13变体CAR可以由以下氨基酸序列组成或包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO:40-68的在氨基酸端添加有信号序列的氨基酸序列(未成熟CAR)，例如人GM-CSF受体α信号序列(GMCSFRa信号序列)。因此，CAR和可以以包括信号序列的形式表达，例如GMCSFRa信号序列(MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP；SEQ ID NO:38)。CAR可以在有对监测表达有用的额外序列，例如T2A跳跃序列(SEQ ID NO:26)和截短的EGFRt(SEQ ID NO:27)的情况下表达。CAR可以在有对监测表达有用的额外序列，例如T2A跳跃序列和截短的CD19t(SEQ ID NO:28)的情况下表达。变体IL13 CAR可以包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：SEQ ID NO:40-68中任一项的具有多达1、2、3、4或5个氨基酸变化(优选保守氨基酸变化)的氨基酸序列。在一些情况下，CAR缺乏SEQ ID NO:40-68中任一项的氨基端氨基酸中的1、2、3、4或5个。
在一些实施方案中，编码氨基酸序列SEQ ID NO:40-68的核酸分子得到密码子优化用于在人细胞中表达。
间隔物区
本文所述的CAR可以包含位于变体IL13域和跨膜域之间的间隔物。可以使用多种不同的间隔物。它们中的一些包括人Fc区的至少一部分，例如人Fc区的铰链部分或CH3域或其变体。下表1提供了可用于本文所述的CAR中的各种间隔物。
表1：间隔物示例
Figure BDA0003843892780000091
Figure BDA0003843892780000101
一些间隔物区包括整个或部分的免疫球蛋白(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)铰链区，即落在免疫球蛋白的CH1和CH2域之间的序列，例如，IgG4 Fc铰链或CD8铰链。一些间隔物区包括免疫球蛋白CH3域或CH3域和CH2域两者。免疫球蛋白衍生的序列可以包括一个或多个氨基酸修饰，例如1、2、3、4或5个取代，例如减少脱靶结合的取代。
铰链/接头区也可以包含具有序列ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO:4)或ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO:3)的IgG4铰链区。铰链/接头区也可以包含序列ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO:3)，后面有接头序列GGGSSGGGSG(SEQ ID NO:2)，后面有IgG4 CH3序列GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:12)。因此，整个接头/间隔物区可以包含序列ESKYGPPCPPCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:11)。在一些情况下，与SEQ ID NO:10或11相比，间隔物具有1、2、3、4或5个单一氨基酸变化(例如，保守变化)。在一些情况下，IgG4 Fc铰链/接头区以降低与Fc受体(FcR)结合的方式在两个位置处突变(L235E；N297Q)(例如，包含SEQ ID NO:10或11或由SEQ ID NO:10或11组成)。
跨膜域
可以使用多种跨膜域。表2包括合适的跨膜域的实例。在存在间隔物的情况下，跨膜域(TM)位于间隔物的羧基末端。
表2：跨膜域示例
Figure BDA0003843892780000111
共刺激域
共刺激域可以是适合与CD3ζ信号传导域一起使用的任何域。在一些情况下，共信号传导域是4-1BB共信号传导域，其包含与：KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:24)至少90％、至少95％、至少98％相同或者是相同的序列。在一些情况下，与SEQ ID NO:24相比，4-1BB共信号传导域具有5个氨基酸变化(优选保守的)中的1、2、3、4个。
共刺激域位于跨膜域和CD3ζ信号传导域之间。表3包括合适的共刺激域的示例以及CD3ζ信号传导域的序列。
表3：CD3ζ域和共刺激域示例
Figure BDA0003843892780000112
Figure BDA0003843892780000121
在各种实施方案中：共刺激域选自下组：表3中描述的共刺激域或其具有1-5(例如，1或2)个氨基酸修饰的变体，CD28共刺激域或其具有1-5(例如1或2)个氨基酸修饰的变体，CD28gg共刺激域或其具有1-5(例如1或2)个氨基酸修饰的变体、4-1BB共刺激域或其具有1-5(例如，1或2)个氨基酸修饰的变体和OX40共刺激域或其具有1-5(例如，1或2)个氨基酸修饰的变体。在某些实施方案中，存在4-1BB共刺激域或其具有1-5(例如，1或2)个氨基酸修饰的变体。在一些实施方案中，存在两个共刺激域，例如CD28共刺激域或其具有1-5(例如，1或2)个氨基酸修饰(例如，取代)的变体和4-1BB共刺激域或其具有1-5(例如，1或2)个氨基酸修饰(例如，取代)的变体。在各种实施方案中，1-5(例如，1或2)个氨基酸修饰是取代。共刺激域是CD3ζ信号传导域的氨基末端，并且由2-10个氨基酸，例如3个氨基酸(例如GGG)组成的短接头可以位于共刺激域和CD3ζ信号传导域之间。
CD3ζ信号传导域
CD3ζ信号传导域可以是适合于与CD3ζ信号传导域一起使用的任何域。在某些情况下，CD3ζ信号传导域包括与RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:21)至少90％、至少95％、至少98％相同或者是相同的序列。在某些情况下，与SEQ ID NO:21相比，CD3ζ信号传导具有5个氨基酸变化(优选保守的)中的1、2、3、4个。
截短的EGFR和截短的CD19
CD3ζ信号传导域之后可以有核糖体跳跃序列(例如，LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR；SEQ ID NO:26)和具有与以下序列至少90％、至少95％、至少98％相同或是相同的序列的截短的EGFR：LVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM(SEQ ID NO:27)。在一些情况下，截短的EGFR与SEQ ID NO:27相比具有5个氨基酸变化(优选保守的)中的1、2、3、4个。
或者，CD3ζ信号传导域之后可以有核糖体跳跃序列(例如，LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR；SEQ ID NO:26)和具有与以下序列至少90％、至少95％、至少98％相同或是相同的序列的截短的CD19R：MPPPRLLFFLLFLTPMEVRPEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCVPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWKVSAVTLAYLIFCLCSLVGILHLQRALVLRRKR(SEQ ID NO:28)。
氨基酸修饰是指蛋白质或肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。“氨基酸取代”或“取代”是指用另一种氨基酸替代亲本肽或蛋白质序列中特定位置处的氨基酸。可以以非保守方式(即，通过将密码子从属于具有特定大小或特征的氨基酸分组的氨基酸改变为属于另一个分组的氨基酸)或以保守方式(即，通过将密码子从属于具有特定大小或特征的氨基酸分组的氨基酸改变为属于同一分组的氨基酸)进行取代以改变所得蛋白质中的氨基酸。此类保守变化通常导致所得蛋白质的结构和功能变化较小。以下是各种氨基酸分组的例子：1)具有非极性R基团的氨基酸：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸；2)具有不带电荷的极性R基团的氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；3)具有带电极性R基团的氨基酸(在pH 6.0时带负电)：天冬氨酸、谷氨酸；4)碱性氨基酸(pH 6.0时带正电荷)：赖氨酸、精氨酸、组氨酸(pH6.0时)。另一分组可以是那些带有苯基的氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。
在某些情况下，可以使用载体产生CAR，其中CAR开放阅读框后面有T2A核糖体跳跃序列和截短的EGFR(EGFRt)或截短的CD19(CD19t)。在这种排列中，EGFRt或CD19t的共表达提供了一种惰性、非免疫原性的表面标志物，其允许准确测量基因修饰细胞，并使得能够阳性选择基因修饰细胞，以及有效的细胞追踪过继转移后体内的治疗性T细胞。有效控制增殖以避免细胞因子风暴和脱靶毒性是T细胞免疫治疗成功的重要障碍。慢病毒载体中掺入的EGFRt或CD19t可起自杀基因的作用以在治疗相关毒性的情况下消融CAR+T细胞。
本文所述的CAR可以通过本领域已知的任何方式产生，但优选使用重组DNA技术产生。编码嵌合受体的几个区域的核酸可以通过方便的本领域已知的标准分子克隆技术(基因组文库筛选、重叠PCR、引物辅助连接、定点诱变等)制备并组装成完整的编码序列。所得编码区优选插入表达载体并用于转化合适的表达宿主细胞系，优选T淋巴细胞，最优选自体T淋巴细胞。
从患者中分离的各种T细胞亚组可以用用于CAR表达的载体进行转导。中央记忆T细胞是一种有用的T细胞亚组。中央记忆T细胞可以通过选择CD45RO+/CD62L+细胞从外周血单个核细胞(PBMC)中分离，例如使用
Figure BDA0003843892780000141
装置以免疫磁性方式选择表达期望受体的细胞。富含中央记忆T细胞的细胞可以用抗CD3/CD28激活，用例如慢病毒载体转导，所述慢病毒载体指导CAR以及用于体内检测、消融和潜在的离体选择的非免疫原性表面标志物的表达。激活/遗传修饰的CAR T细胞可以在体外用IL-2/IL-15扩增，然后冷冻保存。制备CAR T细胞的其他方法可见于PCT/US2016/043392。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。本文描述了用于本发明的方法和材料；也可以使用本领域已知的其他合适的方法和材料。材料、方法和示例仅是说明性的而不是限制性的。出于任何和所有目的，本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献通过引用整体并入。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。
本发明的其他特征和优点将从以下详细描述和附图以及权利要求中显而易见。
附图说明
图1：WT IL13 CAR某些变体IL13 CAR的示意图。指出IL-13变体序列。指示了铰链/接头(间隔物)域、跨膜域和共刺激域中的变异。接头(例如，GGG)通常存在于共刺激域和CD3zeta之间。T2A核糖体跳跃序列和截短的CD19(CD19t)标记物的纳入是可选的。
图2：IL13变体CAR T细胞表现出对表达IL13Ra2、IL13Ra1或IL13Ra1/IL4R的肿瘤的差异靶向。将亲代HT1080肿瘤细胞，遗传修饰为过表达IL13Ra1、IL13Ra1和IL4或IL13Ra2的HT1080肿瘤细胞单独温育(白色条)或与模拟物转导的T细胞(模拟物)或转导为表达含有指示的IL-13变体的CAR的T细胞以1:1共温育。培养3天后，评估存活肿瘤细胞的数量。虽然所有CAR T细胞靶向表达IL13Ra2的肿瘤细胞，但仅先前描述的E13Y变体也指导杀死表达IL13Ra1和IL13Ra1/IL4R的肿瘤，而LK和L变体指导杀死表达IL13Ra1/IL4R的肿瘤。
图3：描绘了CAR的氨基酸序列，所述CAR具有：变体IL13靶向域、IgG4(EQ)间隔物、CD28 TM域、41-BB共刺激域和CD3zeta域(SEQ ID NO:39-40)。
图4：描绘了CAR的氨基酸序列，所述CAR具有：变体IL13靶向域、IgG4(EQ)间隔物、CD28 TM域、41-BB共刺激域和CD3zeta域(SEQ ID NO:41-42)。
图5：描绘了CAR的氨基酸序列，所述CAR具有：变体IL13靶向域、IgG4(EQ)间隔物、CD28 TM域、41-BB共刺激域和CD3zeta域(SEQ ID NO:43-44)。
图6：描绘了CAR的氨基酸序列，所述CAR具有：变体IL13靶向域、IgG4(EQ)间隔物、CD28 TM域、41-BB共刺激域和CD3zeta域(SEQ ID NO:45-46)。
图7：描绘了CAR的氨基酸序列，所述CAR具有：变体IL13靶向域、IgG4(EQ)间隔物、CD4 TM域、CD28共刺激域和CD3zeta域(SEQ ID NO:47-48)。
图8：描绘了CAR的氨基酸序列，所述CAR具有：变体IL13靶向域、IgG4(EQ)间隔物、CD4 TM域、CD28共刺激域和CD3zeta域(SEQ ID NO:49-50)。
图9：描绘了CAR的氨基酸序列，所述CAR具有：变体IL13靶向域、IgG4(EQ)间隔物、CD4 TM域、CD28共刺激域和CD3zeta域(SEQ ID NO:51-52)。
图10：描绘了CAR的氨基酸序列，所述CAR具有：变体IL13靶向域、IgG4(EQ)间隔物、CD4 TM域、CD28共刺激域和CD3zeta域(SEQ ID NO:53-54)。
图11：描绘了CAR的氨基酸序列，所述CAR具有：变体IL13靶向域、IgG4(EQ)间隔物、CD4 TM域、4-1BB共刺激域和CD3zeta域(SEQ ID NO:55-58)。
图12：描绘了CAR的氨基酸序列，所述CAR具有：变体IL13靶向域、IgG4(EQ)间隔物、CD8 TM域、41-BB共刺激域和CD3zeta域(SEQ ID NO:59-62)。
图13：酵母展示的IL13变体与重组人IL13Ra2蛋白的结合。将含有已鉴定突变的人IL13 cDNA克隆到酵母展示载体中并转化到酿酒酵母菌株EBY100中。在含有半乳糖的培养基中于20℃下诱导单个克隆，然后与重组人生物素化IL13Ra2-Fc温育，并通过流式细胞术评估与Alexa-647偶联的链霉亲合素的结合。报告基于滴定曲线计算的KD。
图14：酵母展示的IL13变体与重组IL13Ra1蛋白的结合。将含有已鉴定突变的人IL13 cDNA克隆到酵母展示载体中并转化到酿酒酵母菌株EBY100中。在含有半乳糖的培养基中在20℃下诱导单个克隆，然后与重组人生物素化IL13Ra1-Fc温育，并通过流式细胞术评估与Alexa-647偶联的链霉亲合素的结合。报告基于滴定曲线计算的KD。所有含有L变体的突变都显示出与IL13Ra1的结合减少。
图15：IL13变体CAR T细胞表现出对表达IL13Ra2、IL13Ra1或IL13Ra1/IL4R的肿瘤的差异靶向。将亲代HT1080肿瘤细胞、遗传修饰以过表达IL13Ra1、IL13Ra1和IL4或IL13Ra2的HT1080肿瘤细胞单独温育(白色条)或与模拟物转导的T细胞(模拟物)或转导以表达含有指定IL-13变体的CAR的T细胞共培养。培养2-3天后，评估存活肿瘤细胞的数量。
图16：YLK和RLK IL13-CD28变体CAR T细胞表现出对IL13Ra2表达肿瘤系相当的功效和相对于IL13Ra1或IL13Ra1/IL4R表达系增强的特异性。
图17：YLK和YL IL13-28tm-41BB变体CAR T细胞在6天的再攻击测定中表现出对表达IL13Ra2的患者衍生的脑肿瘤(PBT)的优越功效，其中1000个接种的T细胞用肿瘤重复攻击(总共20000个)。
图18：IL13-28t-41BB变体CAR T细胞针对工程化改造以过表达IL13Ra2的PBT103的体内功效。植入后7天，每只小鼠颅内递送0.3x106个CAR T细胞，然后监测肿瘤生物发光和存活。RLK和YL变体显示出优异的疗效。
图19：IL13-28t-41BB变体CAR T细胞(包括YLK变体)针对PBT103的体内功效，所述PBT103工程化改造为过表达IL13Ra2。植入后11天，每只小鼠颅内递送0.1x106 CAR，然后监测肿瘤生物发光和存活。YLK、RLK和YL显示出优越的疗效。
图20：描绘了CAR的氨基酸序列，其具有：变体IL13靶向域、IgG4(HL-CH3)(S228P)间隔物、CD28 TM域、41-BB共刺激域和CD3zeta域(SEQ ID NO:63-68)。
发明详述
在本公开中，描述了具有靶向IL13Rα2的变体IL13域的CAR的产生和抗肿瘤功效。CAR T细胞对表达L13Rα2的人类癌细胞系表现出有力的抗原依赖性细胞毒性。
IL13Rα2靶向性CAR
本文所述的CAR包括变体IL-13，其包含SEQ ID NO:30-37(例如，SEQ ID NO:30-34和36)的氨基酸序列或由SEQ ID NO:30-37(例如，SEQ ID NO:30-34和36)的氨基酸序列组成。在优选的实施方案中，序列包含不超过126个氨基酸。
有用的IL13变体CAR可以由SEQ ID NO:40-68的氨基酸序列组成或包含SEQ IDNO:40-68的氨基酸序列。CAR可以以包括信号序列的形式表达，例如人GM-CSF受体α信号序列(MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP；SEQ ID NO:29)。CAR可以在对监测表达有用的额外序列，例如T2A跳跃序列和截短的EGFRt的情况下表达。CAR可以在对监测表达有用的额外序列，例如T2A跳跃序列和截短的CD19t的情况表达。变体IL13 CAR可以包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列是SEQ ID NO:40-68中任一项的具有多达1、2、3、4或5个氨基酸变化(优选保守氨基酸变化)的氨基酸序列或IL13域中具有多达1、2、3、4或5个氨基酸变化的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码氨基酸序列SEQ ID NO:30-37(例如，SEQ ID NO:30-34和36)的核酸得到密码子优化用于在人细胞中表达。
在某些情况下，可以使用载体产生CAR，其中CAR开放阅读框后面有T2A核糖体跳跃序列和截短的EGFR(EGFRt)或截短的CD19(CD19t)。在这种排列中，EGFRt或CD19t的共表达提供了一种惰性、非免疫原性的表面标志物，其允许准确测量基因修饰细胞，并使得能够阳性选择基因修饰细胞，以及有效的细胞追踪过继转移后体内的治疗性T细胞。有效控制增殖以避免细胞因子风暴和脱靶毒性是T细胞免疫治疗成功的重要障碍。慢病毒载体中掺入的EGFRt或CD19t可起自杀基因的作用以在治疗相关毒性的情况下消融CAR+T细胞。
本文所述的CAR可以通过本领域已知的任何方式产生，但优选使用重组DNA技术产生。编码嵌合受体的几个区域的核酸可以通过方便的本领域已知的标准分子克隆技术(基因组文库筛选、重叠PCR、引物辅助连接、定点诱变等)制备并组装成完整的编码序列。所得编码区优选插入表达载体并用于转化合适的表达宿主细胞系，优选T淋巴细胞，最优选自体T淋巴细胞。
从患者中分离的各种T细胞亚组可以用用于CAR表达的载体进行转导。中央记忆T细胞是一种有用的T细胞亚组。中央记忆T细胞可以通过选择CD45RO+/CD62L+细胞从外周血单个核细胞(PBMC)中分离，例如使用
Figure BDA0003843892780000181
装置以免疫磁性方式选择表达期望受体的细胞。富含中央记忆T细胞的细胞可以用抗CD3/CD28激活，用例如慢病毒载体转导，所述慢病毒载体指导CAR以及用于体内检测、消融和潜在的离体选择的非免疫原性表面标志物的表达。激活/遗传修饰的CAR T细胞可以在体外用IL-2/IL-15扩增，然后冷冻保存。制备CAR T细胞的其他方法可见于PCT/US2016/043392。
实施例
本发明在以下实施例中进一步描述，所述实施例不限制权利要求书中描述的本发明的范围。
实施例1：IL13变体表现出与IL13Rα2的选择性结合
为了鉴定相对于IL13Rα1结合IL13Rα2的选择性增加的IL13变体。为了评估受体结合，将各种突变体与野生型L13(GPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN；SEQ ID NO:1)和先前已知的IL3 E13Y突变体(GPVPPSTALRYLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN；SEQ ID NO:69)比较。野生型IL13(WT)和各种变体各自展示在酵母表面上。使用具有固定化重组IL13Rα1和固定化IL13Rα2的表面等离振子共振来评估结合亲和力。该分析的结果列于表4。如预期，WT与IL13Rα1和IL13Rα2两者强烈结合。E13Y和E13R略更具选择性。E92L和R109K更具选择性。YLK和RLK是最具选择性的，在使用的条件下与IL13Rα1没有可测量的结合。
表4：WT IL13和变体的结合亲和力(nM)
Figure BDA0003843892780000191
实施例2：某些IL13变体CAR对杀死IL13Rα2细胞的选择性增加
使用IL13变体(E13Y(SEQ ID NO:69)、RLK(SEQ ID NO:31)、RL(SEQ ID NO:32)、YL(SEQ ID NO:33)、LK(SEQ ID NO:34)和L(SEQ ID NO:35)创建CAR构建体。在每种情况下，构建体包括IgG4(EQ)间隔物、CD28跨膜域、4-1BB共刺激域、GGG接头和CD3zeta。
简而言之，将亲代HT1080肿瘤细胞、遗传修饰以过表达IL13Ra1、IL13Ra1和IL4R的HT1080肿瘤细胞，以及遗传修饰以过表达IL13Ra2的HT1080肿瘤细胞单独温育或与模拟物转导的T细胞或转导为表达IL13变体CAR的T细胞以1:1共温育。培养3天后，评估存活肿瘤细胞的数量。如图2中可以看到，虽然所有CAR T细胞都靶向表达IL13Ra2的肿瘤细胞，但仅先前描述的E13Y变体也指导对表达IL13Ra1和IL13Ra1/IL4R的肿瘤的显著杀伤，而LK和L变体指导对表达IL13Ra1/IL4R的肿瘤的杀伤。
实施例3：IL13变体与重组IL13Ra2的结合
将人IL13 cDNA IL13变体克隆到酵母展示载体中并转化到酿酒酵母菌株EBY100中。在含有半乳糖的培养基中于20℃诱导单克隆，然后与重组人生物素化IL13Ra2-Fc温育，并通过流式细胞术评估与Alexa-647偶联的链霉亲合素的结合。报告了基于滴定曲线计算的KD(图13)。
实施例4：IL13变体与重组IL13Ra2的结合
将含有已鉴定突变的人IL13 cDNA克隆到酵母展示载体中并转化到酿酒酵母菌株EBY100中。在含有半乳糖的培养基中在20℃诱导单克隆，然后与重组人生物素化IL13Ra1-Fc温育，并通过流式细胞术评估与Alexa-647偶联的链霉亲合素的结合。相对结合示于图14的上图，下图中显示了不同的比例尺。
实施例5：IL13变体CAR的差异靶向
如图15所示，IL13变体CAR T细胞表现出对表达IL13Ra2、IL13Ra1或IL13Ra1/IL4R的肿瘤的差异靶向。将亲代HT1080肿瘤细胞、遗传修饰以过表达IL13Ra1、IL13Ra1和IL4或IL13Ra2的HT1080肿瘤细胞单独温育(白色条)或与模拟物转导的T细胞(模拟物)或转导为表达含有指定IL-13变体的CAR的T细胞共培养。CAR在CD3zeta外包含IgG4(EQ)间隔物、CD4TM域和CD28共刺激域或者在CD3zeta外包含IgG4(EQ)间隔物、CD28 TM域和4-1BB共刺激域。培养2-3天后，评估存活肿瘤细胞的数量。RLK-CD28是SEQ ID NO:48；R-CD28是SEQ ID NO:52；L-CD28是SEQ ID NO:53；K-CD28是SEQ ID NO:54。RLK-41BB是SEQ ID NO:40；RL-41BB是SEQ ID NO:41；YL-41BB是SEQ ID NO:42；L-41BB是SEQ ID NO:54；并且LK-41BB是SEQ IDNO:43。
实施例6：YLK和RLK IL13变体CAR T细胞具有增加的特异性
如图16所示，YLK和RLK IL13变体CAR T细胞表现出对IL13Ra2表达肿瘤系相当的功效，并且相对于IL13Ra1或IL13Ra1/IL4R表达系具有增强的特异性。除了CD3zeta之外，CAR包括IgG4(EQ)间隔物、CD4 TM域和CD28共刺激域，RLK-CD28是SEQ ID NO:48；YLK-CD28是SEQ ID NO:52；L-CD28是SEQ ID NO:53；K-CD28是SEQ ID NO:54。RLK-41BB是SEQ ID NO:40；RL-41BB是SEQ ID NO:47。
实施例7：YLK和YL IL13变体CAR T细胞对表达IL13Ra2的患者来源的脑肿瘤表现出优异的功效
如图17所示，YLK和YL IL13-28tm-41BB变体CAR T细胞在6天的再攻击测定中表现出对表达IL13Ra2的患者来源的脑肿瘤(PBT)的优异功效，其中1000个接种的T细胞用肿瘤重复攻击(总计20000)。在CD3zeta外，CAR包括IgG4(EQ)间隔物、CD28 TM域和4-1BB共刺激域。RLK-41BB是SEQ ID NO:40；RL-41BB是SEQ ID NO:41；YL-41BB是SEQ ID NO:42；RL-41BB是SEQ ID NO:41。
实施例8：IL13变体CAR T细胞的体内功效
图18描绘了IL13-28t-41BB变体CAR T细胞对工程化以过表达IL13Ra2的PBT103的体内功效的评估。植入后7天，每只小鼠颅内递送0.3x106个CAR T细胞，然后监测肿瘤生物发光和存活。在CD3zeta外，CAR包括IgG4(EQ)间隔物、CD28 TM域和4-1BB共刺激域。RLK-41BB是SEQ ID NO:40；RL-41BB是SEQ ID NO:41；YL-41BB是SEQ ID NO:42；并且RL-41BB是SEQ ID NO:41。RLK和YL变体显示出优异的功效。
图19描绘了包括YLK变体的IL13-28t-41BB变体CAR T细胞对工程化以过表达IL13Ra2的PBT103的体内功效的评估。植入后11天，每只小鼠颅内递送0.1x106 CAR，然后监测肿瘤生物发光和存活。在CD3zeta外，CAR包括IgG4(EQ)间隔物、CD28 TM域和4-1BB共刺激域。YLK-41BB是SEQ ID NO:39；RLK-41BB是SEQ ID NO:40；RL-41BB是SEQ ID NO:41；YL-41BB是SEQ ID NO:42；并且RL-41BB是SEQ ID NO:41。YLK、RLK和YL显示出优异的功效。
其他实施方案
应当理解，虽然本发明已经结合其详细描述进行了描述，但前述描述旨在说明而不是限制由所附权利要求书的范围限定的本发明的范围。其他方面、优点和修改在所附权利要求书的范围内。出于任何和所有目的，所有参考文献都全文并入本文。

Claims (25)

1.核酸分子，其包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列，其中所述嵌合抗原受体包含：靶向域，其包含选自：SEQ ID NO:30-37的氨基酸序列；间隔物域；跨膜域；共刺激域和CD3zeta域。
2.权利要求1的核酸分子，其中所述间隔物域选自下组：和IgG4(EQ)间隔物域、IgG4(HL-CH3)间隔物域和IgG4(CH3)间隔物域。
3.权利要求1的核酸分子，其中所述间隔物域包含SEQ ID NO:10。
4.权利要求1的核酸分子，其中所述间隔物域包含SEQ ID NO:9。
5.权利要求1的核酸分子，其中所述间隔物域包含SEQ ID NO:12。
6.前述权利要求中任一项的核酸分子，其中所述跨膜域选自下组：CD4跨膜域、CD8跨膜域和CD28跨膜域。
7.权利要求6的核酸分子，其中所述共刺激域选自CD28共刺激域、CD28gg共刺激域和41-BB共刺激域。
8.权利要求1的核酸分子，其中所述CAR包含选自下组的氨基酸序列或由选自下组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:40-68。
9.权利要求1的核酸分子，其中所述CAR包含选自下组的氨基酸序列或由选自下组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:40-58，其中SEQ ID NO:10的氨基酸序列被SEQ ID NO:2-9和11中任一项的氨基酸序列替换。
10.核酸分子，其包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列，其中所述嵌合抗原受体包含：靶向域，其包含含有变体IL13域的氨基酸序列，所述变体IL13域包含SEQ ID NO:1的109、110、111、112、113个连续氨基酸或SEQ ID NO:1的具有1、2、3、4或5个单一氨基酸变化的整体，条件是在SEQ ID NO:1的第92位处存在有除E以外的氨基酸；间隔物域；跨膜域；共刺激域和CD3zeta域。
11.权利要求10的核酸分子，其中在SEQ ID NO:1的第91位处存在有L。
12.前述权利要求中任一项的核酸分子，其中所述间隔物域包含SEQ ID NO:2-12中任一项的氨基酸序列。
13.前述权利要求中任一项的核酸分子，其中所述共刺激域包含SEQ ID NO:22-25中任一项的氨基酸序列。
14.权利要求1的核酸分子，其中所述CAR包含SEQ ID NO:40-68中任一项的缺失了1、2、3、4或5个连续氨基酸的氨基酸序列。
15.权利要求1的核酸分子，其中所述CAR包含SEQ ID NO:40-68中任一项的具有最多达5个单一氨基酸取代的氨基酸序列。
16.载体或表达载体，其包含前述权利要求中任一项的核酸分子。
17.人T细胞或NK群体，其含有权利要求1-15中任一项的核酸分子。
18.权利要求17的人T细胞群体，其中所述人T细胞群体包含中央记忆T细胞、幼稚记忆T细胞、泛T细胞或基本上消减CD25+细胞和CD14+细胞的PBMC。
19.治疗患有胶质母细胞瘤、胰腺导管腺癌、黑素瘤、卵巢癌、肾细胞癌、乳腺癌或肺癌的患者的方法，其包括施用含有权利要求1-15中任一项的核酸分子的自体或同种异体细胞群体。
20.权利要求19的方法，其中局部或全身施用所述细胞。
21.权利要求19的方法，其中心室内施用所述细胞。
22.权利要求20或21的方法，其中通过单次或重复给药施用所述细胞。
23.制备CAR T细胞的方法，其包括：提供自体或同种异体人T细胞或NK细胞群体，并用包含权利要求1-15中任一项的核酸分子的载体转导所述细胞。
24.多肽，其由权利要求1-15中任一项的核酸分子编码。
25.权利要求1-15中任一项的核酸分子，其中所述核酸分子是RNA或DNA。
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