CN115515965A - 新型免疫刺激剂及其在免疫治疗中的用途 - Google Patents

新型免疫刺激剂及其在免疫治疗中的用途 Download PDF

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CN115515965A CN202180013139.8A CN202180013139A CN115515965A CN 115515965 A CN115515965 A CN 115515965A CN 202180013139 A CN202180013139 A CN 202180013139A CN 115515965 A CN115515965 A CN 115515965A
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迪迪埃·迪布勒伊
阿兰·帕蒂内克
穆里尔·派普利尔
雅克·勒庞迪
雅克·勒布雷顿
维吉妮·布洛特
阿诺德·泰西尔
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Universite de Nantes
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Nantes
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
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Abstract

本发明涉及一种新的iNKT刺激剂家族，称为6”‑O‑PEGm‑NHR‑GalCer，是KRN7000的有效类似物。这些iNKT刺激剂可以有利地用于治疗，特别是用于预防和/或治疗需要刺激免疫反应的许多疾病，例如癌症、病毒、细菌或寄生虫病、自身免疫性疾病或炎症性疾病。本发明的iNKT细胞刺激剂可以与生物载体，例如治疗剂和/或靶向剂偶联，或例如在纳米颗粒中被载体化，以特异性地递送至靶细胞。

Description

新型免疫刺激剂及其在免疫治疗中的用途
【技术领域】
本发明涉及免疫刺激剂及其在免疫治疗中的用途。
【背景技术】
iNKT(恒定自然杀伤T)细胞是一种独特的淋巴细胞群体，能够特异性识别糖脂抗原。这些抗原需要通过非经典MHC-I(主要组织相容性复合体I类)分子CD1d呈递，例如通过抗原呈递细胞呈递。
KRN7000(也称为α-GalCer或阿尔法-半乳糖神经酰胺)是iNKT细胞的典型配体。事实上，KRN7000是一种合成糖脂，来源于海洋海绵Agelas mauritianus产生的agelasphin9b。响应于KRN7000与iNKT细胞的结合，这些细胞迅速释放大量的能够启动或增强免疫反应的细胞因子。KRN7000在各种体内模型中显示出对LPS诱导的休克具有保护作用，并显示出强大的抗肿瘤活性。因此，在临床试验中研究了KNR7000脉冲DC(树突状细胞)或加载于CD1d受体的DC，例如用于治疗慢性乙型和丙型肝炎感染和癌症治疗(特别是非小细胞癌、肺癌、转移癌、肝癌、乳腺癌、颈部皮肤癌、前列腺癌和头颅癌、黑色素瘤和实体瘤(骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤等)。
KRN7000具有下式(I)：
Figure BDA0003784381790000011
已经公开了KNR7000的许多类似物，包括少数6”-O-修饰的GalCer衍生物，但与参考KRN7000相比，后一系列类似物表现出相同或轻微的iNKT激活改善(30％至40％)，在一段时间内具有更好的Th1型偏移。
仍然需要提供新的免疫刺激剂，其优选更有效和/或优选具有更好的靶向治疗选择性，用于免疫治疗，特别是用于预防和/或治疗癌症。
【发明内容】
发明人合成了一种新的人类iNKT细胞刺激剂家族，令人惊讶的是，这些刺激剂被发现是迄今为止已知的最强大的iNKT刺激剂，其中一些比参考糖脂KRN7000高得多。
该新家族的iNKT刺激剂包含下式(II)的化合物或由其组成：
Figure BDA0003784381790000021
其中X表示m为1至24的整数的PEG片段-[CH2-CH2-O]m-、n为1至24的整数的烷基链-(CH2)n-，或者支链烃基，
其中R表示H、-CO-R1、-CONR1、-COOR1、-CSR1、-CSNR1或-CSOR1，
其中R1表示烷基、芳基、杂环基团、p为1至24的整数的PEG片段-[CH2-CH2-O]p-R2，或者q为1至24的整数的烷基链-(CH2)q-R2，
其中R2表示允许与携载体(Carrier)D偶联的官能反应基团或表示L-D，其中L是连接子且D是携载体。
例如，下式(IV)的化合物6-PEG3-NH2-GalCer 2a：
Figure BDA0003784381790000031
在iNKT释放细胞因子方面的效力比亲本KRN7000高近103倍，而下式(V)的6-PEG3-NHAc-GalCer 2b对应物显示出的效力高104-5倍：
Figure BDA0003784381790000032
由于其强大的生物活性，本文所公开的这些iNKT刺激剂在免疫治疗中非常有用，特别是针对癌症和其他疾病，例如细菌感染、病毒感染、寄生虫病或自身免疫性疾病(例如I型糖尿病或多发性硬化症)。
此外，本文所揭示的iNKT刺激剂的另一个优点是其使用肿瘤细胞—迄今为止被认为是“非CD1d细胞”—作为呈递细胞本身的意外能力，以激活iNKT，而无需动员典型的APC(抗原呈递细胞)，例如DC(树突状细胞)、巨噬细胞等。
在本文公开的iNKT刺激剂中，6-Mal-PEG6GalCer 3a(源自式(IV)的6-PEG3-NHR-GalCer 2a)具有下式(VII)：
Figure BDA0003784381790000041
式(VII)的iNKT刺激剂显示的iNKT激活效力比亲本KRN7000的激活效力高近10倍，并且可以有利地连接至生物携载体，例如蛋白质或抗体，或者被载体化，例如在纳米颗粒中，例如在病毒样颗粒或脂质体中。这种偶联可以有利地允许将iNKT刺激剂递送至靶细胞，从而减少达到治疗效果所需的治疗剂量和/或减少可能的副作用。
例如，西妥昔单抗是靶向EGFR(表皮生长因子受体)的人源化单克隆抗体；如本文所述，西妥昔单抗抗体与iNKT刺激剂的偶联允许诱导所述抗体的已知免疫效应(ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性))同时激活iNKT细胞，从而释放细胞因子。因此，包含与iNKT刺激剂偶联的西妥昔单抗抗体的生物偶联物通过重新激活靠近肿瘤环境的免疫系统而对肿瘤靶点产生联合生物效应。
包含与iNKT刺激剂偶联的抗体的生物偶联物优选为非酶切连接的糖缀合物，以便在肿瘤环境中诱导iNKT刺激时产生极大的选择性，而不会在身体其他部位(或局部)有效。因此，包含与上述iNKT刺激剂偶联的抗体的生物偶联物允许减少或抑制由免疫刺激剂单独非定位激活iNKT引起的几种副作用，并实现选择性肿瘤靶向。
因此，本发明的第一目的是iNKT刺激剂，其中所述iNKT刺激剂包含下式(II)的化合物：
Figure BDA0003784381790000051
其中X表示m为1至24的整数的PEG片段-[CH2-CH2-O]m、n为1至24的整数的烷基链-(CH2)n-，或者支链烃基，
其中R表示-CO-R1、-CONR1、-COOR1、-CSR1、-CSNR1或-CSOR1，
其中R1表示烷基、芳基、杂环基团、p为1至24的整数的PEG片段-[CH2-CH2-O]p-R2、或q为1至24的整数的烷基链-(CH2)q-R2，
其中R2表示允许与携载体D偶联的官能反应基团或表示L-D，其中L是连接子且D是携载体。
如上所定义的iNKT刺激剂优选选自由以下组成的组：
-下式(V)的化合物：
Figure BDA0003784381790000052
-下式(VI)的化合物：
Figure BDA0003784381790000061
-下式(VII)的化合物：
Figure BDA0003784381790000062
-下式(VIII)的化合物：
Figure BDA0003784381790000063
本发明的另一目的是包含与至少一种携载体偶联的至少一种iNKT刺激剂的偶联物，其中所述偶联物：
(i)包含如上所定义的式(II)的化合物
其中X表示m为1至24的整数的PEG片段-[CH2-CH2-O]m、n为1至24的整数的烷基链-(CH2)n-，或者支链烃基，其中R表示-CO-R1、-CONR1、-COOR1、-CSR1、-CSNR1或-CSOR1，其中R1表示p为1至24的整数的PEG片段-[CH2-CH2-O]p-L-D或q为1至24的整数的烷基链-(CH2)q-L-D，其中L是连接子且D是携载体，或
(ii)通过使如上所定义的式(II)的iNKT刺激剂与携载体D偶联而获得，其中X表示m为1至24的整数的PEG片段-[CH2-CH2-O]m、n为1至24的整数的烷基链-(CH2)n-，或者支链烃基，其中R表示-CO-R1、-CONR1、-COOR1、-CSR1、-CSNR1或-CSOR1，其中R1表示p为1至24的整数的PEG片段-[CH2-CH2-O]p-R2或q为1至24的整数的烷基链-(CH2)q-R2，其中R2表示允许与所述携载体D偶联的官能反应基团。
在如上所定义的iNKT刺激剂或如上所定义的偶联物中，携载体D优选是治疗剂和/或靶向剂。
如上所定义的携载体D可以是抗体、抗体片段、糖、凝集素、粘附素、生长因子、抗原、化学分子、蛋白质、肽、糖蛋白、适配体、负载细胞、病毒和/或碳水化合物。
本发明的另一目的是运载体(vector)，例如纳米颗粒，包含如上所定义的至少一种iNKT刺激剂、如上所定义的至少一种偶联物和/或包含下式(IV)的化合物的至少一种iNKT刺激剂：
Figure BDA0003784381790000071
本发明的另一目的是一种药物组合物，其包含：
(i)如上所定义的至少一种iNKT刺激剂、如上所定义的至少一种偶联物、如上所定义的至少一种运载体和/或如上所定义的包含下式(IV)化合物的至少一种iNKT刺激剂，和
(ii)至少一种药学上可接受的载体。
本发明的另一目的涉及如上所定义的iNKT刺激剂、如上所定义的偶联物、如上所定义的运载体、如上所定义的药物组合物和/或如上所定义的包含下式(IV)化合物的iNKT刺激剂作为药物的用途，优选用于预防和/或治疗癌症、自身免疫性疾病、炎症性疾病、病毒感染、细菌感染和/或寄生虫病。
本发明的另一目的涉及如上所定义的iNKT刺激剂、如上所定义的偶联物、如上所定义的运载体或如上所定义的包含下式(IV)化合物的iNKT刺激剂用以激活iNKT细胞的体外用途。
iNKT刺激剂
因此，本发明提供一种新的iNKT刺激剂家族。
表述“iNKT刺激剂”，也称为“iNKT激活剂”，在本文中是指iNKT细胞的免疫刺激剂，即能够激活iNKT细胞的化合物。
表述“能够激活iNKT细胞的化合物”在本文中是指，与没有所述化合物的情况相比，在所述化合物和CD1d表达细胞存在的情况下，iNKT细胞表达或增加至少一种细胞因子的表达。
其表达在存在iNKT刺激剂的情况下被诱导或增加的至少一种细胞因子，Th1或Th2细胞因子(优选用于癌症治疗的Th1细胞因子)，例如选自由干扰素-伽马(INF-γ)、TNF-和白细胞介素(如IL-13、IL-2、IL-10、IL12或IL4)组成的组的细胞因子。
CD1d是非多态性的主要组织相容性复合体I类抗原呈递分子。
CD1d表达细胞，也称为“CD1d细胞”，可以是自然表达CD1d的细胞或转染以表达CD1d的细胞。
CD1d表达细胞可以是低水平或高水平表达CD1d的细胞。
“低水平表达CD1d的细胞”在本文中是指该细胞表达的CD1d不能通过流式细胞术检测，但可以通过RT-PCR检测。到目前为止，低水平表达CD1d的细胞被认为是“非CD1d细胞”。
“高水平表达CD1d的细胞”在本文中是指该细胞表达的CD1d可以通过RT-PCR和流式细胞仪检测。
低水平表达CD1d的细胞例如是肿瘤细胞，例如海拉(HeLa)细胞(即未转染的海拉细胞)、HEK293细胞(即未转染的HEK293细胞)、Meso13细胞、Meso34细胞、Meso225细胞(来自呼吸癌)、SW116细胞或HTC116细胞(来自结直肠癌)。
高水平表达CD1d的细胞的非限制性示例是APC(抗原呈递细胞)，例如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、B淋巴细胞、上皮细胞(特别是来自结肠或肠道)和任何转染以表达CD1d的细胞。
高水平表达CD1d的细胞可以以PBMC(外周血单个核细胞)的形式提供。PBMC可以通过技术人员熟知的任何方法获得，例如使用Ficoll通过密度梯度离心法从全血中提取。
iNKT细胞(恒定自然杀伤T细胞)是识别CD1d的淋巴细胞群。INKT细胞(恒定自然杀伤T细胞)表达来自NK细胞(如CD16和CD56)和来自T细胞(如CD3、CD4和CD8)的标记物。它们的主要特殊性是限于CD1d分子的恒定TCR的表达。该TCR仅识别脂质和糖脂抗原，而不像经典TCR那样识别肽。
iNKT细胞最著名的天然抗原是KRN7000。
为评估化合物是否为iNKT刺激剂，可以使用本领域技术人员熟知的任何方法。
通常，CD1d表达细胞在存在或不存在待评估化合物的情况下培养过夜，允许加载在CD1d分子上。然后，CD1d细胞与iNKT共同孵育。共培养6小时足以检测上清液中大多数细胞因子的释放(如IFN-γ、IL-13和/或IL-2)。取决于某些晚期细胞因子(如IL-10)的动力学，可以进行长达48小时的不同时间的孵育。因此，在孵育6小时至48小时后，在上清液中测量至少一种细胞因子的量或浓度。与不存在评估化合物的情况相比，存在评估化合物的情况下至少一种细胞因子的量或浓度增加，意味着所述化合物是iNKT刺激剂。
当在上述试验中使用低水平表达CD1d的细胞时，与不存在该化合物时相比，存在该化合物时至少一种细胞因子的量或浓度增加，意味着该化合物是一种有效的iNKT刺激剂。
6-PEGm-NHR-GalCer化合物
iNKT刺激剂优选包含下式(II)的KRN7000类似物或由其组成，在本文中也称为化合物6-PEGm-NHR-GalCer：
Figure BDA0003784381790000101
其中X表示m为1至24的整数的PEG片段-[CH2-CH2-O]m-、n为1至24的整数的烷基链-(CH2)n-，或者支链烃基，
其中R表示H、-CO-R1、-CONR1、-COOR1、-CSR1、-CSNR1或-CSOR1，
其中R1表示烷基、芳基、杂环基团、p为1至24的整数的PEG片段-[CH2-CH2-O]p-R2，或者q为1至24的整数的烷基链-(CH2)q-R2，
其中R2表示允许与携载体D偶联的官能反应基团或表示L-D，其中L是连接子且D是携载体。
当R2表示允许与携载体D偶联的官能反应基团时，R2例如是N-马来酰亚胺、N3、炔烃、烯烃、丙烯酰、降冰片烯、环辛二烯、TCO、四嗪、异氰酸酯、硫醇或醛。
官能反应基团可允许通过各种方式与携载体偶联，例如通过赖氨酸，与氧化的碳水化合物还原偶联，通过半胱氨酸残基和/或通过基于腙、二硫化物和/或肽的连接。
文献中描述了配体和药物偶联物之间的各种双异官能团连接试剂，其可用于通过官能反应基团使iNKT刺激剂与携载体偶联。
例如，携载体D如下文“携载体(carrier)”部分中所定义。
连接子优选为共价连接子。
连接子，特别是共价连接子，优选为非酶切连接子。
例如，连接子来源于将如上所定义的式(II)化合物与携载体偶联的方法，其中R1表示p为1至24的整数的PEG片段-[CH2-CH2-O]p-R2、或q为1至24的整数的烷基链-(CH2)q-R2，且其中R2表示允许与携载体D偶联的官能反应基团。
例如，连接子包含下式(XI)或下式(XIII)的化合物或由其组成：
Figure BDA0003784381790000111
在一个实施方式中，如上所定义的iNKT刺激剂的特征在于R具有下式(III)：
Figure BDA0003784381790000121
或下式(XIV)：
Figure BDA0003784381790000122
其中R是式(III)的如上所定义的iNKT刺激剂可由式(II)的iNKT刺激剂，特别是其中R表示H，与SM(PEG)n交联剂的反应产生。
“SM(PEG)n连接子”在本文中是指丁二酰亚胺-PEGn-马来酰亚胺连接子。
在PEG片段-[CH2-CH2-O]m中，m是1至24的整数，优选为1至20、优选为1至15、更优选为1至12。例如，m可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或12，优选1、3、6或12。
在PEG片段-[CH2-CH2-O]p-R2中，p是1至24的整数，优选为1至20、优选为1至15、更优选为1至10。例如，p可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12，优选1、3、6或12。
“烷基”在本文中是指包含1至24个碳原子、优选1至12个碳原子的直链烃基，或包含1至12个碳原子的支链或环状烃基。烷基基团的示例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、正己基和环己基基团，优选甲基或乙基。
在烷基链-(CH2)n-中，n优选是1至24的整数，例如，1至20、1至15、1至12、1至10。例如，n可以为1、2、3、4、5、7、8、9、10、11或12，优选1、3、6或12。
在烷基链-(CH2)q-R2中，q优选是1至24的整数，例如1至20、1至15、1至10。例如，q可以为1、2、3、4、5、7、8、9、10、11或12，优选1、3、6或12。
“支链烃基”在本文中是指具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个碳原子的支链，其链可以是线性的或支化的，饱和或可包含一个或多个双键或三键，其链可被一个或多个杂原子打断，或被一个或多个杂原子或被包含杂原子的一个或多个取代基取代。在这方面，“杂原子”在本文中是指除碳或氢以外的任何原子，该原子通常是氮、氧或硫原子。
“芳基”在本文中是指单环或多环芳烃基团，其可任选地被酸、酰胺、酰胺、尿素、胺、硫醇、醇、醚、酯基团取代。芳基优选苯基、苄基、萘基、蒽基。芳基可被至少一个烷基基团取代。芳基的优选示例为苯基基团。
“杂环基团”在本文中是指未经取代或被取代的基团，其包含选自由氮原子、氧原子和硫原子组成的组的1至4个杂原子作为环的组成元素。杂环基团可以为单环或多环。
杂环基团的示例包括3元环、4元环、5元环、6元环、7元环、8元环和9元环。
5元环的示例包括吡咯烷、吡咯、四氢呋喃、呋喃、四氢噻吩、噻吩、咪唑啉、咪唑、吡唑烷、吡唑、噁唑烷、噁唑、异噁唑烷、异噁烷、二氧戊环、三硫环戊烷。
6元环的示例包括哌啶、吡啶、四氢吡喃、吡喃、硫化环戊烷、噻喃、哌嗪、二嗪、吗啉、噁嗪、硫吗啉、噻嗪、二氧六环、二噁英、二噻烷、二噻英、六氢-1,3,5-三嗪、三嗪、三噁烷、三噻烷、四嗪、五嗪、三唑、呋咱、噁二唑、噻二唑、二噁唑、二噻唑、四唑、噁四唑、特拉唑嗪或五唑。
如上所定义的式(II)的iNKT刺激剂是有利的可溶性水性甲醇和/或DMSO溶剂。
例如，优选的iNKT刺激剂具有下式(IV)：
Figure BDA0003784381790000141
式(IV)的iNKT刺激剂诱导高CD8+反应，导致高细胞毒性反应。
例如，另一优选的iNKT刺激剂具有下式(V)：
Figure BDA0003784381790000142
例如，另一优选的iNKT刺激剂具有下式(VI)：
Figure BDA0003784381790000143
例如，另一优选的iNKT刺激剂具有下式(VII)：
Figure BDA0003784381790000151
例如，另一优选的iNKT刺激剂具有下式(VIII)：
Figure BDA0003784381790000152
因此，iNKT刺激剂优选选自由如上所定义的式(IV)化合物、式(V)化合物、式(VI)化合物、式(VII)化合物和式(VIII)化合物组成的组。
如上所定义的iNKT刺激剂可包含携载体D，例如当R1表示p为1至24的整数的PEG片段-[CH2-CH2-O]p-L-D或q为1至24的整数的烷基链-(CH2)q-L-D时，或可进一步与携载体D偶联，例如当R2表示官能反应基团时。
iNKT刺激剂可以以包含所述iNKT刺激剂的运载体的形式提供，具体如下文所定义。
iNKT刺激剂可以以药物组合物的形式提供，具体如下文所定义。
例如，iNKT刺激剂通过如下文所定义的方法获得。
生产化合物6-PEGm-NHR-GalCer的方法
本发明还涉及生产如上所定义的式(II)的iNKT刺激剂的方法，其中所述方法包括：
-任选地，使半乳糖和植物鞘氨醇反应以获得具有下式(IX)的化合物：
Figure BDA0003784381790000161
其中所述反应优选包括：
·通过半乳糖的正交保护和异头激活制备糖基供体，
·通过植物鞘氨醇的正交保护及随后的N-酰化和脱保护步骤制备糖基受体，和
·进行糖基化步骤和初级羟基的脱保护。
-使式(IX)的化合物与N3-CH2-CH2-PEG3-N＝C＝O反应，以氢化后获得具有下式(X)的化合物：
Figure BDA0003784381790000162
-任选地，使式(X)的化合物与
甲醇钠反应，用于生产式(IV)，
乙酸酐反应随后与甲醇钠反应，用于生产式(V)的化合物，或
苯乙酰氯反应随后与甲醇钠反应，用于生产式(VI)的化合物，和
-任选地，使式(IV)的化合物与SM(PEG)6交联剂反应，用于生产式(VII)的化合物，或与SM(PEG)2交联剂反应，用于生产式(VIII)的化合物。
实施例1中进一步详细介绍了用于生产式(IV)、(V)、(VI)、(VII)或(VIII)的iNKT刺激剂的方法的示例。
携载体(carrier)
本发明还涉及如上所定义的iNKT刺激剂，其包含至少一种携载体或与至少一种携载体偶联。
携载体在本文中也称为“携载体D”或“D”。
当iNKT刺激剂包含一种或至少一种携载体D或与其偶联时，它也被称为复合体、偶联物、生物偶联物或糖缀合物。
携载体可以是能够提高iNKT刺激剂的效率和/或稳定性和/或半衰期、能够定位iNKT刺激剂(例如标记剂)、能够特异性递送iNKT刺激剂(例如靶向剂)和/或具有治疗活性(例如治疗剂)的任何化合物。
携载体优选是靶向剂和/或治疗剂。
靶向剂是允许将如上所定义的iNKT刺激剂递送至靶细胞和/或靶细胞周围或附近区域的任何化合物。靶剂例如是与CD1d细胞表达的受体结合的化合物。
例如，在预防和/或治疗癌症的框架中，靶向剂可特异性结合肿瘤细胞受体，特别是在CD1d细胞上表达的受体，或结合肿瘤环境中存在的细胞。
治疗剂是具有治疗效果，特别是预防性和/或治疗性治疗效果的任何化合物。治疗剂优选对相同疾病具有治疗作用，但优选通过不同于iNKT的作用机制。
例如，靶向剂和/或治疗剂可以是蛋白质、肽、糖蛋白、适配体、病毒、化学分子，优选小化学分子或碳水化合物。
靶向剂的非限制性示例是与靶标特异结合的抗体、抗体片段(例如Fab、scFv、纳米抗体)、糖、凝集素、粘附素、生长因子或化学分子。
治疗剂的非限制性实例是抗原，例如细菌抗原或病毒抗原、抗体、抗体片段或化学分子(例如合成的生物活性分子)。
表述“小化学分子”在本文中是指分子量等于或低于500kDa的化学分子。
如上所定义的抗原可以是碳水化合物抗原或肽抗原。
因此，给定的携载体可以是治疗剂和靶向剂二者，例如在抗体的情况下。
携载体可以是内化携载体或非内化携载体。
“内化携载体”在本文中是指在与靶细胞结合时内化在所述靶细胞中的携载体。
如上所定义的内化携载体优选是治疗剂和靶向剂二者。
如上所定义的内化携载体优选是抗体。
在包含与至少一种内化携载体偶联的至少一种iNKT刺激剂的偶联物的情况下，内化携载体优选能够内化所述偶联物。
当包含与至少一种内化携载体偶联的至少一种iNKT刺激剂的偶联物在靶细胞中内化时，则iNKT刺激剂优选从偶联物中释放，从而允许在CD1d分子上负载、呈现至靶细胞表面和iNKT刺激。
当携载体是抗体时，抗体优选是单克隆抗体。
单克隆抗体优选是人单克隆抗体或人源化单克隆抗体。
如上所定义的抗体可以是单特异性抗体或多特异性抗体，例如双特异性抗体。
如上所定义的抗体可特异性结合肿瘤细胞上表达的至少一种受体。
可用作携载体的抗体的非限制性示例是抗EGFR抗体(例如西妥昔单抗或帕尼单抗)、抗HER2抗体(例如曲妥珠单抗)。
抗EGFR抗体，例如西妥昔单抗或帕尼单抗是内化携载体的示例。
因此，本发明还涉及一种偶联物，其包含与如上所定义的至少一种携载体偶联的如上所定义的至少一种iNKT刺激剂，优选经由iNKT刺激剂和携载体之间的连接子偶联。
偶联物的携载体优选是治疗剂和/或靶向剂。
iNKT刺激剂与携载体之间的偶联可以是共价的。
本发明特别涉及如上所定义的偶联物，其中至少一种iNKT刺激剂优选以非酶可切割的方式共价连接至至少一种携载体。
一种、两种、三种或至少四种iNKT刺激剂可偶联至一种、两种、三种或至少四种携载体以形成一种偶联物。
当如上所定义的偶联物包含至少两种iNKT刺激剂时，iNKT刺激剂可以为相同或不同。
当如上所定义的偶联物包含至少两种携载体时，携载体可以为相同或不同。
优选的偶联物是如上所定义的偶联物，其包含至少一种iNKTs刺激剂和一种携载体(即，单分子携载体)，一种或多种iNKT刺激剂任选经由连接子优选与携载体连接。
例如，偶联物中存在的连接子可由用于将iNKT刺激剂与携载体偶联的的方法产生。
例如，本发明涉及一种偶联物，其包含与至少一种(优选一种)携载体偶联的至少一种(优选一种或两种)iNKT刺激剂，其中所述偶联物：
(i)包含式(II)的化合物
Figure BDA0003784381790000191
其中X表示m为1至24的整数的PEG片段-[CH2-CH2-O]m、n为1至24的整数的烷基链-(CH2)n-，或者支链烃基，其中R表示-CO-R1、-CONR1、-COOR1、-CSR1、-CSNR1或-CSOR1，其中R1表示p为1至24的整数的PEG片段-[CH2-CH2-O]p-L-D或q为1至24的整数的烷基链-(CH2)q-L-D，其中L是连接子且D是携载体，或
(ii)通过使上式(II)的iNKT刺激剂与携载体D偶联而获得，其中X表示m为1至24的整数的PEG片段-[CH2-CH2-O]m、n为1至24的整数的烷基链-(CH2)n-，或者支链烃基，其中R表示-CO-R1、-CONR1、-COOR1、-CSR1、-CSNR1或-CSOR1，其中R1表示p为1至24的整数的PEG片段-[CH2-CH2-O]p-R2或q为1至24的整数的烷基链-(CH2)q-R2，其中R2表示允许与所述携载体D偶联的官能反应基团。
作为非限制性示例，可以通过使Traut试剂与携载体反应来获得作为抗体、蛋白质、肽或糖蛋白的所述携载体的偶联，以获得Traut-巯基活化携载体，然后将Traut活化携载体与iNKT刺激剂偶联，特别是式(II)的iNKT刺激剂，其中R是如上所定义的式(III)的基团，以获得包含与携载体偶联的iNKT刺激剂的偶联物。
Traut试剂是2-亚氨基噻吩。
仍然优选的一种偶联物是如上所定义的偶联物，其包含一种iNKT刺激剂(即，单分子iNKT刺激剂)和一种携载体(即，单分子携载体)，iNKT刺激剂优选经由连接子与携载体连接。
另一种优选的偶联物是如上所定义的偶联物，其包含两种iNKT刺激剂(即，两分子iNKT刺激剂)和一种携载体(即，单分子携载体)，每一种iNKT刺激剂优选经由连接子与携载体连接。
因此，如上所定义的包含与至少一种(优选一种)携载体偶联的至少一种(优选一种、两种或至少两种)iNKT刺激剂的偶联物优选包含式(II)的化合物
Figure BDA0003784381790000211
其中X表示m为1至24的整数的PEG片段-[CH2-CH2-O]m、n为1至24的整数的烷基链-(CH2)n-，或者支链烃基，其中R表示-CO-R1、-CONR1、-COOR1、-CSR1、-CSNR1或-CSOR1，其中R1表示p为1至24的整数的PEG片段-[CH2-CH2-O]p-L-D、或q为1至24的整数的烷基链-(CH2)q-L-D，其中L是连接子且D是携载体。因此，如上所定义的式(II)化合物是经由连接子L与携载体D偶联的iNKT刺激剂。如上所定义的式(II)化合物可经由携载体D与至少另一化合物偶联。与携载体D偶联的所述其他化合物优选为iNKT刺激剂。与携载体D偶联的所述其他化合物优选与iNKT刺激剂相同，其经由如上所定义的式(II)中的连接子L与携载体D偶联。
因此，如上所定义的偶联物具有以下结构：(iNKT刺激剂1)-(连接子L1)-(携载体D)-(连接子L2)-(iNKT刺激剂2)，其中L1和L2优选为相同和/或iNKT刺激剂1和2优选为相同。
因此，如上所定义的包含与至少一种(优选一种)携载体偶联的至少一种(优选一种、两种或至少两种)iNKT刺激剂的偶联物通过使式(II)的至少一种(例如，一种、两种或至少两种)iNKT刺激剂与一种携载体D偶联而获得：
Figure BDA0003784381790000221
其中X表示m为1至24的整数的PEG片段-[CH2-CH2-O]m、n为1至24的整数的烷基链-(CH2)n-，或者支链烃基，其中R表示-CO-R1、-CONR1、-COOR1、-CSR1、-CSNR1或-CSOR1，其中R1表示p为1至24的整数的PEG片段-[CH2-CH2-O]p-R2，或者q为1至24的整数的烷基链-(CH2)q-R2，且其中R2表示允许与所述携载体D偶联的官能反应基团。
运载体(vector)
如上所定义的iNKT刺激剂或如上所定义的偶联物可以以包含所述iNKT刺激剂或偶联物的运载体的形式提供。
运载体可以是能够封装化合物的任何递送载体。
例如，运载体可以是纳米颗粒，例如脂质体(例如聚合物脂质体或脂质体)、类病毒颗粒(VLP)、树状物、胶束、纳米乳液和纳米悬浮液。
因此，本发明还涉及包含至少一种如上所定义的iNKT刺激剂或至少一种如上所定义的偶联物的运载体。
iNKT刺激剂或偶联物可存在于运载体内，特别是在脂质体、树状物、胶束、纳米乳液或纳米悬浮液的情况下。
作为选择，iNKT刺激剂或偶联物可位于运载体表面，以便能够直接结合细胞表达的CD1d。
运载体还可以包含至少一种如上所定义的靶向剂和/或至少一种如上所定义的治疗剂。
药物组合物
如上所定义的iNKT刺激剂、如上所定义的偶联物和/或如上所定义的运载体可配制成药物组合物。
因此，本发明涉及一种药物组合物，其包含(i)如上所定义的iNKT刺激剂、或如上所定义的偶联物、或如上所定义的运载体和(ii)，任选地，药学上可接受的载体。
表述“药学上可接受的载体”意指包括任何不干扰活性成分的生物活性的有效性并且优选对所施用的宿主无毒的载体。
药学上可接受的载体可通过本领域技术人员已知的任何方法制备。
合适的药学上可接受的载体可包括赋形剂和助剂，其有助于将活性化合物加工成可在药学上使用的制剂。合适的药学上可接受的载体在Remington的PharmaceuticalSciences(Mack Publishing Company，Easton，USA，1985)中进行了描述，这是该领域的标准参考文本。可以根据施用方式、iNKT刺激剂的溶解度和稳定性常规选择药学上可接受的载体。例如，用于静脉施用的制剂可包括无菌水溶液，其中也可包含缓冲剂、稀释剂和/或其他合适的添加剂。文献中公开了用于药物递送的生物材料和/或其他聚合物的用途，以及验证特定施用模式的不同技术和模型。
药物组合物可以是液体，例如溶液或悬浮液。
如上所定义的iNKT刺激剂优选以有效实现预期目的的量存在于药物组合物中。例如，该量可能取决于拟施用的哺乳动物的状况(例如，体重、年龄、性别、健康、同时治疗(如有)和治疗频率)、施用模式和制剂类型。
例如，药物组合物可包含5μg至50mg的iNKT刺激剂、优选10μg至40mg的iNKT刺激剂、优选50μg至20mg的iNKT刺激剂、优选75μg至10mg、优选100μg至5mg、更优选100μg至1mg的iNKT刺激剂。
药物组合物可包含至少一种附加活性成分。
附加活性成分例如可以是如上所定义的治疗剂、药物或前药。
药物组合物可以是疫苗。
当如上所定义的药物组合物为疫苗时，所述组合物可包含至少一种iNKT刺激剂和至少一种抗原，例如病毒抗原或细菌抗原。
在一个实施方式中，药物组合物以单位剂型呈现，以便于准确给药。术语“单位剂型”是指适合作为人类受试者或其他哺乳动物的单位剂量的物理离散单位，每个单位包含预先确定的量的活性物质，经计算以产生预期治疗效果，与合适的药物载体有关。典型的单位剂型包括液体药物组合物的预填充、预测量安瓿或注射器。在这种组合物中，iNKT刺激剂通常是次要成分。
本发明进一步提供一种试剂盒，其包含如上所定义的药物组合物和关于施用方式的说明书。这些说明例如可以指示医疗适应症、施用途径、剂量和/或待治疗患者组。
iNKT刺激剂、偶联物或运载体作为药物的用途
本发明特别涉及如上所定义的iNKT刺激剂、如上所定义的偶联物或如上所定义的运载体特别是在免疫治疗中作为药物的用途，例如用于预防和/或治疗需要刺激免疫反应的任何疾病，特别是在有需要的受试者中。
本发明还涉及一种预防和/或治疗有需要的受试者的需要刺激免疫反应的疾病的方法，其中所述方法包括对所述受试者施用如上所定义的iNKT刺激剂、如上所定义的偶联物或如上所定义的运载体。
“需要刺激免疫反应的疾病”在本文中是指其预防和/或治疗需要增强或启动免疫反应或将通过增强或启动免疫反应来改善的疾病。
例如，受试者是人类或非人类哺乳动物。
人类也被称为“个人”或“患者”。
所述人类可以是任何年龄的人，例如婴儿、儿童、青少年、成年人、老年人和任何性别的人。
非人类哺乳动物优选是猫、狗、兔子、灵长类、小鼠或大鼠。
待接受治疗的受试者可能患有或可能受到需要刺激免疫反应的疾病的影响。
预防需要刺激免疫反应的疾病包括疫苗接种。
例如，需要刺激免疫反应的疾病可以选自由癌症、自身免疫性疾病、炎症性疾病、病毒感染、细菌感染、寄生虫病和/或任何免疫缺陷病理学组成的组。
可根据本发明预防和/或治疗的癌症可以是其中细胞表达CD1d的任何癌症，例如肺癌、转移癌、颈部皮肤癌、头癌、乳腺癌、胃癌、结肠癌、腺癌和/或冷肿瘤。
可根据本发明预防和/或治疗的自身免疫性疾病例如可以是腹腔疾病、1型糖尿病、格雷夫斯病、炎症性肠病、多发性硬化症、银屑病、类风湿性关节炎或系统性红斑狼疮。
可根据本发明预防和/或治疗的炎症性疾病例如可以是慢性消化性溃疡、结核病、类风湿性关节炎、牙周炎、溃疡性结肠炎或克罗恩病。
例如，病毒感染可以是由病毒引起的任何感染，例如丙型肝炎感染或乙型肝炎感染。
例如，细菌感染可以是由细菌引起的任何感染。
例如，寄生虫病可以是由寄生虫引起的任何感染。
iNKT刺激剂如上所定义。
特别是，iNKT刺激剂可通过如上所限定的方法获得。
iNKT刺激剂、偶联物或运载体可以以如上所定义的药物组合物的形式提供。
iNKT刺激剂可包含如上所定义的携载体，或与如上所定义的携载体偶联。
使用靶向剂作为携载体有利地允许将iNKT刺激剂递送至表达靶向剂配体和CD1d两者的靶细胞，从而允许减少可能的副作用和/或达到治疗效果所需的剂量。
例如，为预防和/或治疗癌症，iNKT刺激剂有利地与靶向存在于肿瘤环境中的特定受体的试剂偶联，例如肿瘤细胞自身的特定受体，优选表达CD1d的肿瘤细胞的特定受体，或肿瘤周围特异性发现的细胞的特定受体。
携载体优选是抗体或抗体片段，如上所定义。
例如，包含与EGFR-抗体偶联的如上所定义的至少一种iNKT刺激剂的偶联物可使用或施用以预防和/或治疗癌症，优选结直肠癌和/或呼吸癌。
例如，包含与EGFR-抗体偶联的如上所定义的至少一种iNKT刺激剂的偶联物可使用或施用以预防和/或治疗癌症，优选结直肠癌、呼吸癌和/或腺癌。
例如，包含与HER2-抗体偶联的如上所定义的至少一种iNKT刺激剂的偶联物可使用或施用以预防和/或治疗癌症，优选乳腺癌、胃癌、结肠癌和/或腺癌。
包含抗EGFR抗体的如上所定义的偶联物可有利地使用或施用以预防和/或治疗有需要的受试者的癌症，而与该受试者是否携带至少一个Kras和/或一个或多个N-Ras突变无关。相反，单独使用西妥昔单抗或帕尼单抗对携带Kras和/或一个或多个N-Ras突变的患者无效，仅用于治疗携带野生型Kras和N-Ras基因的受试者。在本发明的框架中，抗EGFR确实主要用作靶向剂。
因此，如上所定义的包含抗EGFR抗体的偶联物可有利地使用或施用以预防和/或治疗任何有需要的受试者的癌症，特别是对仅使用抗EGFR抗体治疗产生耐药性的受试者。此外，因此可以有利地使用或施用如上所定义的包含抗EGFR抗体的偶联物，而预先不需要寻找一个或多个Kras或N-Ras突变的存在。
包含与粘附素或化学分子，优选小化学分子，偶联的如上所定义的至少一种iNKT刺激剂的偶联物可使用或施用以预防和/或治疗细菌或病毒感染，所述粘附素或化学分子能够识别细菌或病毒化合物(例如细菌或病毒抗原)。
iNKT刺激剂优选以治疗有效量使用或施用。
“治疗有效量”在本文中是指足以实现免疫反应的启动或增强的量。此类有效量可由技术人员常规确定。实际施用的iNKT刺激剂的量通常由医生根据相关情况确定，包括要预防或治疗的状况、选择的施用途径、实际施用的药剂、个体受试者的年龄、性别、体重和反应、受试者症状的严重程度等。本领域技术人员还应了解，剂量可能取决于所施用的药剂的稳定性。
有效量也可根据可与如上所定义的iNKT刺激剂共同施用的一种或多种治疗剂、一种或多种药物和/或一种或多种前药而变化。
治疗有效量包括iNKT刺激剂的任何毒性或有害影响被治疗有益影响所抵消的量。
iNKT刺激剂、偶联物、运载体或药物组合物可通过任何合适的途径使用或施用，例如动脉途径、静脉途径、组织内途径、腹腔途径、鼻内途径、脑内途径、眼途径和/或口服途径。
iNKT刺激剂、包含其的偶联物、运载体或药物组合物的施用可以以单剂量或多剂量实现，所述多剂量同时、单独或相继注射。
例如，iNKT刺激剂、偶联物、运载体或药物组合物可以以10μg至4800μg iNKT刺激剂/m2体表的治疗剂量使用或施用，例如，20μg至2000μg iNKT刺激剂/m2体表，如20μg至500μg iNKT刺激剂/m2体表或50μg至500μgiNKT刺激剂/m2体表。
iNKT刺激剂的体外用途
本发明还涉及如上所定义的iNKT刺激剂、如上所定义的偶联物或如上所定义的运载体激活iNKT细胞的体外用途，特别是诱导或增加如上所定义的至少一种细胞因子的表达。
本发明特别涉及如上所定义的iNKT刺激剂、如上所定义的偶联物或如上所定义的运载体用于诱导免疫CD1d依赖性iNKT反应的刺激和/或增强的体外用途。
因此，如上所定义的iNKT刺激剂、如上所定义的偶联物或如上所定义的运载体可用于需要体外刺激和/或增强免疫CD1d依赖性iNKT反应的任何分析中。
以下附图和实施例将进一步说明本发明。然而，这些实施例和附图不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
【附图说明】
图1：CD1d在海拉细胞上的表达及与其各自的CD1d转染子的比较。
图2：在用HEK293(A)或海拉(B)细胞及其各自的CD1d转染模型(加载有KRN7000)激活后，IKNT细胞的IFN-γ、IL-2和IL-13分泌。
图3：在用HEK293(A)或海拉(B)细胞及其各自的CD1d转染模型(加载有6-PEG3-NH2-GalCer(2a))激活后，IKNT细胞的IFN-γ、IL-2和IL-13分泌。
图4：加载有6-PEG3-NH2-GalCer(2a)的PBMC或非CD1d-HEK293细胞激活iNKT细胞后的IFN-γ分泌。
图5：使用HEK293CD1d转染细胞(左图A)和对照HEK293细胞(右图B)作为抗原呈递细胞观察iNKT细胞激活的CD1d依赖性。在存在或不存在抗CD1d抗体时6-PEG3-NH2-GalCer(2a)诱导的IL-2分泌。
图6：用作抗原呈递细胞(SW620，未转染HEK293和HEK293转染以表达CD1d)的细胞系上CD1d表达的RT-PCR分析。
图7：用6-PEG3-NH2-GalCer(2a)或KRN7000激活后，iNKT对海拉-CD1d细胞诱导的细胞毒性(以死细胞百分比表示)。
图8：iNKT表型。在KRN7000或6-PEG 3 -NH2-GalCer(2a)的存在下，PBMC中iNKT细胞的扩增，表达为CD8+/CD4+的比率。
图9：用6-PEG3-NH2-GalCer(2a)或KRN7000激活后，iNKT在海拉-CD1d球体模型上诱导的细胞毒性。
图10和11：用6-PEG3-NHAc-GalCer(2b)、6-PEG3-NH2-GalCer(2a)、6-PEG3-NHBz-GalCer(2c)和KRN7000激活后，iNKT的IFN-γ和IL-13分泌。
图10：海拉-CD1d细胞(A)和非CD1d海拉细胞(C)分泌IFN-γ，用海拉-CD1d细胞(B)和非CD1d海拉细胞(D)激活后iNKT分泌IL-13。
图11：用HEK293-CD1d细胞(E)和非CD1d HEK293细胞(G)的IFN-γ分泌，用HEK293-CD1d细胞(F)和非CD1d HEK293细胞(H)激活后iNKT的IL-13分泌。
图12：用加载有6-PEG3-NHAc-GalCer(2b)、6-PEG3-NH2-GalCer(2a)、6-PEG3-NHBz-GalCer(2c)、6-Mal-PEG-GalCer(3b)、6-Mal-PEG6-GalCer(3a)和KRN7000的海拉细胞激活后，iNKT的IFN-γ分泌。
图13：偶联(“偶联的西妥昔单抗”)或“模拟(mock)”偶联(“单独的西妥昔单抗”)反应后纯化的西妥昔单抗对EGFR的识别。
图14：在用加载有西妥昔单抗+6-PEG3-NH2-GalCer(2a)(左图)或单独的6-PEG3-NH2-GalCer(2a)(右图)的海拉-CD1d细胞(A)或未转染的海拉细胞(B)激活后，iNKTs的IFN-γ分泌。
表1
图14，A，左图 a b c
偶联产物浓度 10μg/ml 1μg/ml 0,1μg/ml
起始浓度 10<sup>-7</sup>M 10<sup>-8</sup>M 10<sup>-9</sup>M
观测浓度 10<sup>-10</sup>M 10<sup>-11</sup>M 10<sup>-12</sup>M
表2
图14，B，左图 a b c
偶联产物浓度 10μg/ml 1μg/ml 0,1μg/ml
起始浓度 10<sup>-7</sup>M 10<sup>-8</sup>M 10<sup>-9</sup>M
观测浓度 &lt;10<sup>-10</sup>M &lt;10<sup>-10</sup>M &lt;10<sup>-10</sup>M
图15：用加载有通过TRAUT激活形成的复合西妥昔单抗6-Mal-PEG6-GalCer(3a)(左图)或单独的6-Mal-PEG6-GalCer(3a)(右图)的海拉-CD1d细胞(C)或未转染的海拉细胞(D)激活后，iNKT的IFN-γ分泌。
表3
图15，C，左图 a b c
偶联产物浓度 10μg/ml 1μg/ml 0,1μg/ml
起始浓度 10<sup>-7</sup>M 10<sup>-8</sup>M 10<sup>-9</sup>M
观察到的浓度 &gt;10<sup>-8</sup>M &gt;10<sup>-8</sup>M &gt;10<sup>-8</sup>M
表4
Figure BDA0003784381790000301
图16：加载于非CD1d海拉细胞上后，与6-Mal-PEG6-GalCer 3a相比，部分A和B在iNKT细胞上的活性。
【实施例】
实施例1：合成6-PEG-NHR-GalCer 2和6-Mal-PEGn-GalCer 3
式IV(2a)、V(2b)、V(2c)(R分别为H、Ac和PhCH2CO)的化合物6-PEG3-NHR-GalCer以及6-Mal-PEGn-GalCer VII(3a)和VIII(3b)的合成基于文献中描述的常规化学途径。
利用半乳糖和植物鞘氨醇前体，通过略微修改的既定化学程序(见下面的方案1)，合成关键保护的6”OH-Galcer中间体，以生产6-PEG3-NHR-GalCer2和3。
Figure BDA0003784381790000302
a)PhSH、BF3.Et2O、DCM、MS4
Figure BDA0003784381790000303
c)MeONa/MeOH；d)TBDPSCl、Et3N、Pyr.；e)NaH、BnBr、DMF/THF；f)NBS、DAST、DCM，-15℃。
Figure BDA0003784381790000311
a)Boc2O、Et3N、DMF；b)TBDPSCl、咪唑、DMAP、DMF；c)Ac2O、Pyr、DMAP；d)TFA、DCM，0℃；e)蜡酸、PyBOP、Et3N、DCM、f)HF、吡啶、THF；g)SnCl2、AgClO4、THF/Et2O、MS
Figure BDA0003784381790000312
h)TBAF.3H2O、THF；i)NIS、TfOH、DCM/Et2O/THF，0℃，然后室温。
方案1
从受保护的6”-OH-Galcer，可获得所有6-PEG3-NHR-GalCer 2和6-Mal-PEGn-GalCer 3(见下面的方案2和3)。
Figure BDA0003784381790000313
a)ClCO2Et、Et3N、THF，0℃至室温，30分钟，然后NaN3、H2O/THF，0℃至室温，1小时定量；b)甲苯，90℃，15分钟；c)DABCO、甲苯，回流4小时，86％。
Figure BDA0003784381790000321
a)H2、Pd/C HCl(4M，二氧六环中)、DCM；b)MeONa、MeOH，室温；c)Ac2O、DMAP、吡啶，室温；d)PhCH2COCl、NEt3、DCM，室温。
方案2
Figure BDA0003784381790000322
方案3
实施例2：6-PEG3-NHR-GalCer 2和6-Mal-PEGn-GalCer 3激活iNKT
为分析6-PEG3-NHR-GalCer 2和6-Mal-PEGn-GalCer 3激活iNKT的能力，使用了几种类型的呈递细胞，例如转染以在其膜上表达CD1d分子的HEK293或海拉细胞。由于糖脂对iNKT细胞的呈递依赖于CD1d，因此“乍一看”也将未转染细胞用作阴性对照。
通过流式细胞术分析HEK293和海拉+/-CD1d上的CD1d表达(图1)。用抗CD1d-FITC或相关同型对照物标记细胞20分钟，并洗涤以在Accuri C6流式细胞仪上读取。如图1所示，在这两种情况下，未转染的细胞均呈阴性，尤其是与其CD1d转染的对应细胞相比。
然后将这些细胞用作抗原呈递细胞(APC)，以比较标准α-GalCer(KRN7000)配体与经氨基PEG连接臂6-PEG3-NH2-GalCer 2a修饰的类似物6”的iNKT细胞激活效力。在不同浓度下共孵育过夜后，使APC负载糖脂。第二天，洗涤细胞并与iNKT(2个APC对应1个iNKT)共同培养。6小时后，收集上清液，并通过ELISA测定细胞因子分泌(Th1组的IFN-γ和IL-2以及Th2组的IL-13)(图2和3)。
首先，通过HEK293(图2A)或海拉(图2B)细胞和相关的CD1d转染模型将标准配体KRN7000呈递给iNKT细胞。在这两种情况下，在CD1d在转染CD1d的细胞上存在高表达时，KRN7000诱导IFN-γ、IL2和IL13释放(在表1中总结了LogIC50)，强调了iNKT细胞对糖脂识别的CD1d依赖性。当使用6-PEG3-NH2-GalCer 2a(图3A和3B)时，我们观察到更强的IFN-γ、IL13和IL-2分泌，几乎是KRN7000的100倍(见表1中的比较)。
但更令人惊讶的是，在没有CD1d的情况下(在非CD1d的海拉和HEK293细胞上进行的测试)，仍然检测到显著的细胞因子剂量反应分泌，而KRN7000的活性仍然很低或无效。当使用SW620细胞作为对照时，未观察到这些意外结果(缺乏CD1d，数据未显示)。
与非CD1d-HEK293细胞相比，从PBMC细胞释放的IFN-γ证实了类似的细胞因子释放曲线，其代表更接近人类培养基(见图4)。
这一结果表明，6-PEG3-NH2-GalCer 2a是迄今为止已知的最强大的h-iNKT激活剂之一。对于KRN7000临床试验的开发，6-PEG3-NH2-GalCer 2a的这些生物学结果使这种新型候选物在癌症免疫治疗的背景下非常有趣。
表5
Figure BDA0003784381790000331
Figure BDA0003784381790000341
实施例3：“非CD1d”肿瘤细胞：错误范式
根据对“非CD1d”肿瘤细胞的INKT激活的有趣观察，研究了6-PEG3-NH2-GalCer 2a在看似CD1d阴性细胞时如何激活INKT细胞。因此，未转染的海拉和HEK293细胞用作自身抗原呈递细胞。提出的假设是关于在非CD1d肿瘤细胞表面存在CD1d池，甚至非常低，但足以被允许激活iNKT的高效6-PEG3-NH2-GalCer a2糖脂识别，而KRN7000未能实现这一目标。
然后检查在流式细胞术无法在正常非CD1d肿瘤细胞上检测到的CD1d极低表达是否可能提供了iNKT细胞的激活。为此，进行了相同的激活实验，但存在抗CD1d抗体。如前所述，用6-PEG3-NH2-GalCer a2加载HEK293细胞和HEK293-CD1d。在与iNKT细胞共培养之前，将加载的呈递细胞与抗CD1d抗体共培养1小时，在悬浮液中直接添加iNKT，并在上清液中进行细胞因子分析(ELISA)之前共培养6小时。如果通过CD1d呈现修饰的糖脂来提供激活信号，则在用抗CD1d抗体阻断信号后，预计会观察到细胞因子分泌的阻断，或至少是减少。
当使用CD1d-HEK293阳性细胞时，在抗体存在的情况下仅观察到不完全抑制(见图5A)。这极有可能是由于6-PEG3-NH2-GalCer 2a的超高效力与转染细胞上CD1d的高水平表达相结合。然而，当使用“非CD1d”细胞时，细胞因子信号几乎完全消除(见图5B)。该实验清楚地表明，到目前为止，未转染的HEK293细胞上存在未知的低水平CD1d分子。
为证实这一假设，检测CD1d低信号的最敏感方法是使用PCR测定CD1d的ARN表达。分析了三种细胞系，以CD1d作为阳性对照的HEK293，以6-PEG3-NH2-GalCer 2a作为阴性对照的不激活iNKT细胞的SW620，以及未转染的HEK293细胞(见图6)。
如图6所示，HEK293-CD1d阳性细胞显示出强烈的CD1d信号，而SW620细胞被证明为CD1d阴性，这与它们不能作为6-PEG3-NH2-GalCer化合物2a的抗原呈递细胞的功能一致。有趣的是，对于非CD1d-HEK293细胞，检测到显著的信号。这证实了，与范式相反，这些细胞表达低水平的CD1d，不足以使用KRN7000诱导iNKT激活，但足以使用6-PEG3-NH2-GalCer 2a激活，其强度是100至1000倍。
这些结果清楚地表明，6-PEG3-NH2-GalCer 2a出乎意料地证明比KRN7000更有效，尽管同样依赖于CD1d呈递。
另一个有趣的点是6-PEG3-NH2-GalCer 2a即使在肿瘤细胞中CD1d表达水平非常低的情况下仍能保持有效。这重新定义了非CD1d细胞在抗癌治疗中的概念，因为这些结果表明，以前被认为是CD1d阴性的肿瘤细胞固有性表达少量CD1d，当加载非常有效的6-PEG3-NHR-GalCer糖脂时，足以诱导iNKT细胞激活。
这表明，为了在肿瘤环境中启动免疫反应，癌细胞可能被用作呈递细胞，在存在这些有效糖脂的情况下激活iNKT细胞，绕过对经典CD1d抗原呈递细胞(如单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞和B淋巴细胞)的需要。为了证实这一发现，通过RT-PCR筛选了各种其他结肠癌、肺癌、胚胎肾癌和宫颈癌细胞系，以界定表达少量CD1d的细胞系，并确认其自我呈现新的强效iNKT激动剂的能力(见表6)。
表6
Figure BDA0003784381790000351
Figure BDA0003784381790000361
此外，6-PEG3-NH2-GalCer 2a不仅是已知的细胞因子分泌的iNKT细胞的最强激活剂之一，而且还能够诱导比KRN7000更好的iNKT细胞毒性作用。在不同浓度的糖酯的存在下将iNKT与转染海拉-CD1d的细胞共培养24小时，然后通过流式细胞术分析目标海拉-CD1d细胞的死亡率。如图7所示，6-PEG3-NH2-GalCer 2a诱导细胞毒性的效率是KRN7000的至少10倍。
进行比较研究以确定使用6-PEG3-NH2-GalCer 2a和KRN7000可以诱导免疫反应的CD4或CD8方向(见图8)。PBMC在高剂量KRN或6-PEG3-NH2-GalCer 2a的存在下培养，10天后，通过流式细胞术分析iNKT的表型。非常有趣的是，6-PEG3-NH2-GalCer 2a似乎诱导PBMC细胞产生比KRN7000更高的细胞毒性CD8+反应，KRN7000似乎无法区分CD4+和CD8+细胞刺激。该结果已经通过iNKT刺激建立了6-PEG3-NH2-GalCer 2a的免疫细胞毒性效率。在海拉-CD1d3D球体模型(图9A)上进行的其他细胞毒性试验(72小时)证实了这种能力，该模型是另一种更复杂、更具抗性的模型，其中，6-PEG3-NH2-GalCer 2a再一次看起来比KRN7000更有效地诱导细胞死亡(初步数据，见图9B)。
实施例4：评估6-PEG3-NH2-GalCer 2a的类似物6-PEG3-NHR-GalCer2b和2c
为了更好地理解6-PEG3-NH2-GalCer 2a令人惊讶的iNKT刺激效力以及6”-O-PEG取代的KRN7000类似物的末端氨基功能的影响，已经设想通过乙酸酯2b和苯甲羰基2c基团阻断NH2基团。预计将确定三元CD1d肿瘤细胞/6-PEG3-NH2-GalCer/TCR-iNKT复合体的可疑稳定性是否可以通过间隔物14个原子链末端存在游离胺来解释，或者PEG序列是否允许在不损失性能的情况下在端基上发生一些变化。
因此制备了两种新的6-PEG3-NH2-GalCer 2a的受保护NHR类似物，其中R是乙酸酯6-PEG3-NHAc-GalCer 2b或苯甲酰基6-PEG3-NHCOBn-GalCer2c。同样，还制备了两种激活的衍生物6-Mal-PEGn-GalCer 3a和3b(n分别为6或1)，旨在与生物载体进行连接。
两个末端NHR保护基据认为都可以避免或改变在游离NH2末端基存在时可能与CD1d肿瘤细胞和TCR受体发生的相互作用。
在刺激INF-γ和IL13分泌的转染的CD1d和非CD1d海拉和HEK293细胞上评估6-PEG3-NH2-GalCer 2a的6-PEG3-NHR-GalCer类似物(见图10和11)。
根据模型的不同，6-PEG3-NHAc-GalCer 2b在CD1d转染肿瘤细胞上激活iNKT的能力(海拉CD1d转染细胞上对于IFN-γ为LogIC50>-12)比其自身的PEG3-NH2-GalCer 2a(LogIC50＝-10.89)高近10至100倍，比KRN7000(LogIC50＝-8.8)高近104倍，而6-PEG3-NHCOBn-GalCer 2c的细胞因子分泌效力与KRN7000更接近。
这些数据在非CD1d肿瘤细胞上得到证实，PEG3-NH2-GalCer 2a和6-PEG3-NHAc-GalCer 2b在激活iNKT方面保持几乎比KRN7000更有效，差异为log23(2at 3log)(图11G和H)，而6-PEG3-NHCOBn-GalCer 2c再次具有与KRN7000相同的轮廓效应。
这些数据表明，当R为乙酸酯时，PEG3-NHR-GalCer衍生物的活性对NHR末端基团的性质敏感，对转染的肿瘤细胞在近pM范围内显示iNKT刺激效力，更有趣的是对非CD1d肿瘤细胞在亚nM范围内显示iNKT刺激效力。
还进行了比较研究，以评估在6-PEG3-NH2-GalCer 2a的末端位置引入PEGn-马来酰亚胺(n＝1和6)片段引起的变异(见图12)。
数据表明，呈现马来酰亚胺激活功能的6-Mal-PEG6-GalCer 3a略微降低iNKT细胞的激活，几乎比KRN7000高出十倍)。
无论如何，这些数据已经使新型6-Mal-PEG6-GalCer 3a成为与治疗性抗体或其他生物携载体相关联的候选物，以诱导靠近肿瘤环境的携载体的累积的生物抗癌细胞因子释放和细胞毒性效应。
实施例5：非酶切西妥昔单抗复合体的制备
对由6-PEG3-NH2-GalCer 2a合成6-Mal-PEG6-GalCer 3a进行了优化。中间体2a呈现具有适当反应性马来酰亚胺末端基团(虚线框)的长饵，旨在与Traut激活的西妥昔单抗抗体原位反应，以实现两个伴侣之间的共价连接(图4)。
还成功实验了一锅法以从6-PEG3-NH2-GalCer 2a获得GalCer/西妥昔单抗复合体C1，而无需纯化马来酰亚胺6-Mal-PEG6-Galcer中间体3a。为此，在20℃将6-PEG3-NH2-GalCer 2a溶解在含有10％DMSO的磷酸盐缓冲液(PB)中，然后与马来酰亚胺-PEG6-丁二酰亚胺连接子直接反应(根据我们之前的结果选择6个PEG单元的长度)，得到6-Mal-PEG6-Galcer 3a，其与激活的Traut-西妥昔单抗伴侣直接孵育，得到GalCer/西妥昔单抗复合体C1。
Figure BDA0003784381790000391
方案4
(i)糖脂与西妥昔单抗的偶联及纯化
a)偶联条件
保留以下条件以用于与西妥昔单抗偶联。
首先，西妥昔单抗通过添加TRAUT功能进行修饰，比率为100个TRAUT分子/1个抗体。它允许向西妥昔单抗添加至少4个TRAUT功能，如根据之前研究的Ellman反应所确定(数据未显示)。洗涤混合物，然后孵育1/1当量的6-Mal-PEG6-GalCer 3a和激活的西妥昔单抗以启动连接。
表7：偶联条件
Figure BDA0003784381790000392
Figure BDA0003784381790000401
这些实验中遇到的主要困难是确保在与抗体偶联反应后消除介质中未反应的糖脂。测试了各种方法：蛋白质A、排阻色谱法、电泳、过滤。当通过在VivaSpin15柱(MWCO：50Kda)上过滤将所得部分洗涤3次时，获得了成功。
使用两种不同的实验条件验证纯化过程(见表7)。
-部分B：西妥昔单抗未经TRAUT激活修饰，并添加不具有连接西妥昔单抗的化学能力的6-PEG3-NH2-GalCer 2a。在洗涤条件下清除未结合的糖脂后，将该条件用作对照。考虑到6-PEG3-NH2-GalCer 2a对iNKT刺激的高反应性，残留衍生物，即使是微量的存在可以通过显著的细胞因子释放检测到；
-部分A：使用6-Mal-PEG6-GalCer 3a和TRAUT激活的西妥昔单抗提供糖脂与抗体和靶向的GalCer/西妥昔单抗复合体C1的共价连接。
b)通过GalCer/西妥昔单抗复合体纯化和激活iNKT
对两系列转染的CD1d-海拉细胞和非CD1d-海拉细胞进行实验，并评估了部分A和B的3个稀释样品(10μg/ml、1μg/ml和0,1μg/ml)。在每个系列的海拉细胞中，预先评估单独的糖脂的刺激活性作为IFN-γ分泌后的参考。
起始浓度＝
如果洗涤过程效率低下，则偶联反应后可保留在稀释部分中的游离糖脂(未结合)的最大理论浓度。
观测浓度＝
洗涤过程后必须保留在稀释部分中以诱导观察到的细胞因子分泌水平(基于与游离糖脂的反应对照)的糖脂的估计理论浓度。
实验表明，洗涤过程可消除糖脂(高达99.9％)。
部分B作为对照实验的结果：
-如图14A，左图所示，纯化后，西妥昔单抗+6-PEG3-NH2-GalCer 2a混合物产生的部分不能连接在一起，导致在1/10稀释后细胞因子释放减少。在使用高灵敏度CD1d海拉细胞的本实验中，稀释部分样品中剩余6-PEG3-NH2-GalCer 2a的浓度(观测浓度)似乎至少比添加到混合物中的起始浓度(起始浓度)低3log。稀释至0.1μg/ml时，其活性可忽略不计，导致缺乏iNKT刺激。
-使用非CD1d海拉细胞的相同实验(图14B，左图)导致即使在10μg/ml时也缺乏细胞因子释放，这表明在生理模型中，可以认为通过洗涤过程将未结合的6-PEG3-NH2-GalCer2a从组分B中完全去除，或至少作为微量(未转染海拉细胞的检测极限为<10-10M)。
部分A的结果＝连接的西妥昔单抗-GalCer复合体C1：
如图所示，抗体在6-Mal-PEG6-GalCer 3a存在下经TRAUT激活后形成的复合体GalCer/西妥昔单抗C1诱导所有稀释部分(10μg/ml、1μg/ml和0,1μg/ml)的iNKT细胞释放IFN-γ细胞因子。从高灵敏度转染的CD1d细胞和非CD1d细胞中都观察到了这些令人惊讶的结果(分别为图15C，左图和图15D，左图)。
主要有趣的是，在这两种情况下，尽管各部分被稀释，但仍保持着iNKT激活。这些结果似乎表明，在西妥昔单抗-GalCer复合体C1存在的情况下，CD1d池的激活可过度表达。
应记住，起始浓度是在洗涤失败且未消除糖酯残留物的情况下计算的实验中估计的最大理论浓度。然而，根据以往的经验，在第一次洗涤步骤后，几乎99.9％的糖脂过量(未结合)被消除。因此，在3个洗涤步骤后评估为参考的理论浓度因此被极大高估，因此偶联的西妥昔单抗-GalCer复合体的“真实”效应在现实中更有效的多。
在非CD1d肿瘤细胞上进行的后一个实验表明，偶联的西妥昔单抗-GalCer复合体C1能够诱导细胞因子以较高水平分泌，其水平高于在较高浓度下以其自由形式使用的6-Mal-PEG3-GalCer 3a诱导的分泌对应的最大释放量。
这些观察结果已由非CD1d HEK293细胞和PBMC细胞(外周血单个核细胞)证实(数据未显示)。
c)GalCer/西妥昔单抗C1的质谱分析
GalCer/西妥昔单抗C1通过质谱(ESI)分析，表明至少一个或两个6-Mal-PEG6-GalCer 3a类似物分子与西妥昔单抗连接(见下表8)。
表8：具有连接的1个和2个GalCer部分的复合体C1的重链
Figure BDA0003784381790000421
全抗体谱显示153191Da和155884Da处的几个主要pic，LC的3,85和3,89分钟处的pic反褶积谱对应于连接至GalCer片段的西妥昔单抗重链(数据未显示)。用于分析的技术对抗体具有破坏性(导致只有重链上的连接数据清晰，而已降解的轻链上的连接数据不清楚)，整个抗体上连接的GalCer残基的最大准确数量尚未完全确定。
(ii)糖脂与西妥昔单抗的偶联和纯化(与没有TRAUT的偶联相比)
a)偶联条件
保留以下条件以用于与西妥昔单抗偶联。
首先，西妥昔单抗通过添加TRAUT功能进行修饰，比率为100个TRAUT分子/1个抗体。它允许向西妥昔单抗添加至少4个TRAUT功能，如根据之前研究的Ellman反应所确定(数据未显示)。洗涤混合物，然后孵育1/2当量的6-Mal-PEG6-GalCer 3a和激活的西妥昔单抗以启动连接。
表9：偶联条件
Figure BDA0003784381790000431
这些实验中遇到的主要困难是确保在与抗体偶联反应后消除介质中未反应的糖脂。测试了各种方法：蛋白质A、排阻色谱法、电泳、过滤。当通过在VivaSpin15柱(MWCO：50Kda)上过滤将所得部分洗涤3次，随后在用于尺寸排阻色谱法的Superdex 200 10/300GL柱上纯化时，获得了成功。
使用两种不同的实验条件验证纯化过程(见表9)。
-部分B：西妥昔单抗未经TRAUT激活和6-Mal-PEG6-GalCer 3a修饰。在洗涤条件下清除未结合的糖脂后，将该条件用作对照。考虑到6-Mal-PEG6-GalCer 3a对iNKT刺激的高反应性，残留衍生物(即使是微量)的存在可以通过显著的细胞因子释放检测到；
-部分A：使用6-Mal-PEG6-GalCer 3a和TRAUT激活的西妥昔单抗提供糖脂与抗体和靶向的GalCer/西妥昔单抗复合体C1的共价连接。
b)GalCer/西妥昔单抗C1的质谱分析
GalCer/西妥昔单抗C1通过质谱(ESI)分析，表明两个6-Mal-PEG6-GalCer3a类似物分子与西妥昔单抗连接(见下表10)。
表10：具有连接的1个和2个GalCer部分的重链
Figure BDA0003784381790000441
全抗体谱显示，当偶联时，仅在152 583Da和156 056Da处有几个主要的pic。该结果表明，平均有两个6-Mal-PEG6-GalCer 3a分子(MW：1 562Da)与抗体相连。对重链和轻链的更精确研究表明，偶联主要发生在重链上。
c)GalCer/西妥昔单抗复合体激活iNKT
在非CD1d-海拉细胞上进行实验，并评估部分A和B的3个稀释样品(10μg/ml、1μg/ml和0,1μg/ml)。质谱分析表明，每个抗体连接了两个6-Mal-PEG6-GalCer 3a分子，因此当使用10μg/ml的部分A时，其大约相当于10-7M的等效6-Mal-PEG6-GalCer 3a浓度。在每个系列的海拉细胞中，在IFN-γ分泌后，之前评估的单独糖脂的刺激活性作为参考。
部分B作为对照实验的结果：
如图16所示，纯化后，从西妥昔单抗+6-Mal-PEG6-GalCer 3a的混合物中得到的部分，其中通过质谱分析未观察到连接，未观察到细胞因子分泌，表明洗涤过程消除了未结合的糖脂。
部分A的结果＝连接的西妥昔单抗-GalCer复合体C1：
如图所示，抗体在6-Mal-PEG6-GalCer 3a存在下经TRAUT激活后形成的复合体GalCer/西妥昔单抗C1诱导所有稀释部分(10μg/ml、1μg/ml和0,1μg/ml)的iNKT细胞释放IFN-γ细胞因子。在非CD1d细胞上观察到了这些令人惊讶的结果。
这些结果似乎表明西妥昔单抗-GalCer复合体C1能够载体化并向肿瘤细胞释放6-Mal-PEG6-GalCer 3a，使其呈现在海拉细胞中观察到的弱CD1d表达上，从而激活iNKT细胞。
(iv)GalCer/西妥昔单抗复合体中的西妥昔单抗仍然能够识别EGFR
然后评估在与6-Mal-PEG6-Galcer 3a偶联后，西妥昔单抗是否没有改变，并且仍然能够识别EGFR。如图13所示，西妥昔单抗与表达EGFR的细胞的结合在偶联后没有改变，因为天然西妥昔单抗(直接来自瓶子)与用于偶联反应的3个测试条件之间没有差异。结果在同样表达EGFR的3种不同细胞系上得到证实(未显示)。
(v)GalCer/西妥昔单抗复合体中的西妥昔单抗及内化
在EGFR识别后，西妥昔单抗被内化，在临床条件下，它可以降低EGFR的表面表达，并降低肿瘤细胞无组织增殖的能力。GalCer/西妥昔单抗复合体c1内化后，用活体显微镜观察21小时。复合体C1用标记物标记，当其在酸性内切体/溶酶体中内化时，该标记物仅为亮红色。大多数海拉细胞在共孵育11小时后已内化复合体C1(数据未显示)。假设在溶酶体中内化和支持后，C1复合体在酸性条件下释放6-Mal-PEG6-GalCer 3a，允许加载于CD1d分子上并呈现至肿瘤细胞表面，导致在上文iii)部分中观察到的iNKT细胞激活。
(vi)GalCer/西妥昔单抗复合体的ADCC行为
西妥昔单抗的另一个重要功能是其诱导ADCC的能力。检查GalCer/西妥昔单抗复合体C1对这种行为的保护很重要。ADCC检测是在海拉细胞和HCT116细胞系(分别为图14A和B)上进行的，因为后者被证明是我们在初步实验中测试的几个细胞系中反应最快的细胞系，并且HCT116呈现Kras突变。将靶细胞(HCT116和海拉细胞)与单独的西妥昔单抗(蓝色左图)或西妥昔单抗-GalCer复合体C1(红色右图)共孵育1小时。然后通过添加NK92-CD16+细胞(用于ADCC测定的传统细胞系)然后培养24小时来启动ADCC。通过流式细胞术分析靶细胞的死亡率。
在两种模型的所有条件下，西妥昔单抗的ADCC效力均保持不变，表明糖脂片段的连接不会改变抗体对EGFR识别的行为。
(vii)结论
具有共价连接的GalCer/西妥昔单抗复合体C1能够激活hiNKT细胞，以使用CD1d肿瘤细胞作为抗原呈递伴侣释放细胞因子。重要的信息是，以前被认为是CD1d阴性的癌细胞可通过以前未检测到的非常低的CD1d池作为自呈递细胞，这种行为与西妥昔单抗-GalCer复合体C1的异常效力有关。此外，尽管GalCer衍生物通过相对较短的PEG间隔物与抗体连接，但其仍保持活性。
考虑到我们的数据可以做出的一个假设是，西妥昔单抗可能通过内化过程实现西妥昔单抗-GalCer复合体C1的载体化和糖脂浓缩进入EGFR肿瘤细胞。随后可能在酸性细胞内条件或抗体降解下，从复合体中释放糖脂，使其加载在未知的CD1d内部池中，从而可以在肿瘤细胞膜表面表达。这种CD1d转换似乎能够动员iNKT细胞并诱导细胞因子刺激，恢复接近肿瘤环境的免疫反应。
从这个意义上讲，西妥昔单抗-GalCer复合体C1可以被视为有效的免疫治疗候选药物，结合西妥昔单抗的ADCC特性，或至少其细胞毒性作用，以及iNKT的强大免疫刺激活性，提供增强的细胞毒性作用。
结论
本申请公开了一种新的高效免疫刺激剂6-PEG3-NH2-GalCer 2a，其表达的hiNKT刺激效力比亲本KRN7000高近1000倍。
更有趣的是，相应的GalCer/西妥昔单抗复合体C1(见图15)通过激活iNKT细胞保持诱导细胞因子释放的能力。
这些数据将导致重新定义CD1d阴性细胞的概念，因为一些以前被认为是CD1d阴性的肿瘤细胞(海拉和HEK293)固有性表达CD1d的水平足以有效激活iNKT细胞，尽管几乎无法检测到。在实验生理水平上处于低水平的iNKT本身，当加载有6-PEG3-NH2-GalCer糖脂2a时，诱导细胞因子释放，但当加载GalCer/西妥昔单抗复合体C1时也诱导细胞因子释放。这表明抗体已经可以被视为在肿瘤环境中携带GalCer免疫刺激剂以启动iNKT刺激的良好载体。该过程可以绕过经典CD1d呈递细胞(如单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞)的要求，即使糖脂激动剂与抗体连接，癌细胞也能够自呈递。

Claims (11)

1.一种iNKT刺激剂，其中所述iNKT刺激剂由下式(II)的化合物组成：
Figure FDA0003784381780000011
其中X表示m为1至24的整数的PEG片段-[CH2-CH2-O]m、n为1至24的整数的烷基链-(CH2)n-，或者支链烃基，
其中R表示-CO-R1、-CONR1、-COOR1、-CSR1、-CSNR1或-CSOR1，
其中R1表示烷基、芳基、杂环基团、p为1至24的整数的PEG片段-[CH2-CH2-O]p-R2，或者q为1至24的整数的烷基链-(CH2)q-R2，
其中R2表示允许与携载体D偶联的官能反应基团或表示L-D，其中L是连接子且D是携载体。
2.根据权利要求1所述的iNKT刺激剂，其中所述iNKT刺激剂选自由以下组成的组：
-下式(V)的化合物：
Figure FDA0003784381780000012
-下式(VI)的化合物：
Figure FDA0003784381780000021
-下式(VII)的化合物：
Figure FDA0003784381780000022
Figure FDA0003784381780000023
和
-下式(VIII)的化合物：
Figure FDA0003784381780000024
3.一种偶联物，所述偶联物包含与至少一种携载体偶联的至少一种iNKT刺激剂，其中所述偶联物：
(i)包含式(II)的化合物
Figure FDA0003784381780000031
其中X表示m为1至24的整数的PEG片段-[CH2-CH2-O]m、n为1至24的整数的烷基链-(CH2)n-，或者支链烃基，其中R表示-CO-R1、-CONR1、-COOR1、-CSR1、-CSNR1或-CSOR1，其中R1表示p为1至24的整数的PEG片段-[CH2-CH2-O]p-L-D或q为1至24的整数的烷基链-(CH2)q-L-D，其中L是连接子且D是携载体，或
(ii)通过使上式(II)的至少一种iNKT刺激剂与一种携载体D偶联而获得，其中X表示m为1至24的整数的PEG片段-[CH2-CH2-O]m、n为1至24的整数的烷基链-(CH2)n-，或者支链烃基，其中R表示-CO-R1、-CONR1、-COOR1、-CSR1、-CSNR1或-CSOR1，其中R1表示p为1至24的整数的PEG片段-[CH2-CH2-O]p-R2或q为1至24的整数的烷基链-(CH2)q-R2，其中R2表示允许与所述携载体D偶联的官能反应基团。
4.根据权利要求1所述的iNKT刺激剂或根据权利要求3所述的偶联物，其中所述携载体D是治疗剂和/或靶向剂。
5.根据权利要求1或4所述的iNKT刺激剂或根据权利要求3或4所述的偶联物，其中所述携载体D是抗体、抗体片段、糖、凝集素、粘附素、生长因子、抗原、蛋白质、肽、糖蛋白、适配体、负载细胞、病毒和/或碳水化合物。
6.一种运载体，所述运载体包含根据权利要求1、2、4或5中任一项所述的至少一种iNKT刺激剂、根据权利要求3至5中任一项所述的至少一种偶联物和/或由下式(IV)的化合物组成的至少一种iNKT刺激剂：
Figure FDA0003784381780000041
7.根据权利要求6所述的运载体，其中所述运载体是纳米颗粒。
8.一种药物组合物，包括：
(i)根据权利要求1、2、4和5中任一项所述的至少一种iNKT刺激剂、根据权利要求3至5中任一项所述的至少一种偶联物、根据权利要求6或7所述的至少一种运载体和/或由下式(IV)的化合物组成的至少一种iNKT刺激剂：
Figure FDA0003784381780000042
和
(ii)至少一种药学上可接受的载体。
9.根据权利要求1、2、4和5中任一项所述的iNKT刺激剂、根据权利要求3至5中任一项所述的偶联物、根据权利要求6或7所述的运载体、根据权利要求8所述的药物组合物或由下式(IV)的化合物组成的iNKT刺激剂：
Figure FDA0003784381780000051
作为药物的用途。
10.根据权利要求9所述的iNKT刺激剂、偶联物、运载体或药物组合物在预防和/或治疗癌症、自身免疫性疾病、炎症性疾病、病毒感染、细菌感染和/或寄生虫病中的用途。
11.根据权利要求1、2、4或5中任一项所述的iNKT刺激剂、根据权利要求3至5中任一项所述的偶联物、根据权利要求6或7所述的运载体或由下式(IV)化合物组成的iNKT刺激剂用以激活iNKT细胞的体外用途：
Figure FDA0003784381780000052
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090275483A1 (en) * 2008-04-14 2009-11-05 Academia Sinica Quantitative microarray of intact glycolipid cd1d interaction and correlation with cell-based cytokine production
WO2014133106A1 (ja) * 2013-02-27 2014-09-04 独立行政法人理化学研究所 アレルギー疾患治療薬
CN104379592A (zh) * 2012-04-26 2015-02-25 独立行政法人理化学研究所 新的氨基甲酸酯糖脂及其用途
US20150210728A1 (en) * 2012-06-28 2015-07-30 Universiteit Gent Galactopyranosyl derivatives useful as medicaments

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090275483A1 (en) * 2008-04-14 2009-11-05 Academia Sinica Quantitative microarray of intact glycolipid cd1d interaction and correlation with cell-based cytokine production
CN104379592A (zh) * 2012-04-26 2015-02-25 独立行政法人理化学研究所 新的氨基甲酸酯糖脂及其用途
US20150152128A1 (en) * 2012-04-26 2015-06-04 Riken New carbamate glycolipid and use thereof
US20150210728A1 (en) * 2012-06-28 2015-07-30 Universiteit Gent Galactopyranosyl derivatives useful as medicaments
WO2014133106A1 (ja) * 2013-02-27 2014-09-04 独立行政法人理化学研究所 アレルギー疾患治療薬

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