CN115490774A - 一种精胺修饰羟乙基直链淀粉基因转染材料及其制备方法和应用 - Google Patents

一种精胺修饰羟乙基直链淀粉基因转染材料及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因转染材料技术领域，具体涉及一种精胺修饰羟乙基直链淀粉基因转染材料及其制备方法和应用。该制备方法包括步骤：1)向氢氧化钾溶液中加入直链淀粉，再与环氧乙烷反应，制备得到羟乙基直链淀粉；将步骤1)制备得到的羟乙基直链淀粉与羰基二咪唑反应，制备得到酯基咪唑，再与精胺反应，得到所述的精胺修饰羟乙基直链淀粉基因转染材料。本发明的精胺修饰羟乙基直链淀粉基因转染材料能有效复合和压缩质粒DNA，形成紧密的纳米结构，并能有效转染pEGFP‑N1质粒至HEK‑293T细胞，实现较高的转染效。

Description

一种精胺修饰羟乙基直链淀粉基因转染材料及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于基因转染材料技术领域，具体涉及一种精胺修饰羟乙基直链淀粉基因转染材料及其制备方法和应用。
背景技术
高效、低毒和靶向性非病毒载体是解决基因治疗、小核酸药物和mRNA疫苗的关键技术。目前常用的非病毒转染载体主要包括阳离子脂质体、聚乙烯亚胺、树状大分子、壳聚糖等。这些载体材料能通过大量的正电荷压缩和包裹DNA，形成带正电荷的纳米复合物，易于携带核酸被细胞摄取，同时可避免DNA被DNA酶降解。但是过多的阳离子会导致细胞毒性，同时体内注射后易于被网状内皮系统快速清除并聚集至肝脾等器官。目前常用PEG修饰阳离子脂质体、胶束等转染材料的表面，以屏蔽过多的正电荷，以降低转染材料的细胞毒性，并延长体内系统给药的半衰期。但PEG无法生物降解，大量蓄积在溶酶体中无法排出，会导致“溶酶体蓄积”综合征。此外，PEG还会妨碍所载药物或基因的“核内体逃逸”，妨碍了基因或药物进入胞浆发挥作用，此两难境地被称为“PEG窘境(PEG dilemma)”。本发明旨在选择一种生物相容性好、亲水性好并且可生物降解的多糖代替PEG，在屏蔽阳离子的同时避免PEG的窘境。羟乙基淀粉(Hydroxyethyl Starch，HES)是玉米或土豆中支链淀粉的葡萄糖环经羟乙基化形成的高分子复合物，溶于水形成的胶体溶液是目前临床最常用的血浆扩容剂。虽然HES高度亲水，但其高度支化带来的空间位阻不利于进行修饰，此外其较大的分子量也不利于制备较小的纳米载体。本发明选择来源于玉米的直链淀粉，进行羟乙基化，得到的羟乙基直链淀粉(Hydroxyethyl Amylose，HEA)亲水且可溶，选择天然多胺小分子化合物精胺(Spermine，SP)对其进一步进行阳离子化修饰。精胺由于发现于精液中而得名，其阳离子多胺正电荷可结合带负电的DNA，从而保护DNA免受自由基氧化损伤。精胺虽然能结合和解离DNA，但分子量较小，无法压缩DNA，不能用于转染。目前常通过交联壳聚糖、明胶等聚合物来提高精胺的转染效率。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供了一种精胺修饰羟乙基直链淀粉基因转染材料及其制备方法和应。
本发明所提供的技术方案如下：
一种精胺修饰羟乙基直链淀粉基因转染材料，其结构通式如下：
Figure BDA0003800566660000021
其中，n为18000-20000，m为112-1138；优选的，n为18648，m为112、541、671、988或1138。
上述技术方案所提供的精胺修饰羟乙基直链淀粉基因转染材料能有效复合和压缩质粒DNA，形成紧密的纳米结构，并能有效转染pEGFP-N1质粒至HEK-293T细胞，实现较高的转染效。
本发明还提供了一种精胺修饰羟乙基直链淀粉基因转染材料的制备方法，包括以下步骤：
1)向氢氧化钾溶液中加入直链淀粉(重均分子量可为3.021×106)，再与环氧乙烷反应，制备得到羟乙基直链淀粉，其反应式如下：
Figure BDA0003800566660000031
2)选取步骤1)制备得到的羟乙基摩尔取代度为1.00的羟乙基直链淀粉与羰基二咪唑反应，制备得到酯基咪唑，再与精胺反应，得到所述的精胺修饰羟乙基直链淀粉基因转染材料，其反应式如下：
Figure BDA0003800566660000032
上述技术方案使用羰基二咪唑活化羟乙基直链淀粉(HEA)骨架上的羟基，并与精胺(SP)上的伯氨基进行交联，可得到系列接枝度不同的HEA-SP转染材料。
步骤1)的具体步骤如下：
1a)在0.9-1.1mol/L氢氧化钾溶液中加入其1.8-2.2wt％的直链淀粉，沸水浴中搅拌，使直链淀粉充分溶解；
1b)将直链淀粉溶液置于厚壁耐压瓶中，冷却至1-3℃，搅拌和氮气保护下加入预冷至1-3℃的环氧乙烷液体，耐压瓶封口，35-45℃持续搅拌反应12-20h，其中，环氧乙烷与直链淀粉葡萄糖单元的摩尔比为(4～32):1；
1c)反应结束后，冷却至1-3℃，打开耐压瓶，用0.9-1.1mol/L盐酸将溶液调节至中性，将溶液用超纯水透析，冷冻干燥，得到所述的羟乙基直链淀粉。
更具体的，步骤1)的具体步骤如下：在100mL1.0 mol/L氢氧化钾溶液中加入2％的直链淀粉，沸水浴中搅拌15min使直链淀粉充分溶解。然后将直链淀粉溶液置于厚壁耐压瓶中，冷却至2℃，搅拌和氮气保护下加入预冷至2℃的环氧乙烷液体(4～32mol/mol直链淀粉葡萄糖单元)，耐压瓶封口，40℃持续搅拌反应16h，反应结束后，冷却至2℃，打开耐压瓶，用1.0mol/L盐酸将溶液调节至中性，将溶液用超纯水透析72h，冷冻干燥得到HEA。
优选的，步骤1b)中，环氧乙烷与直链淀粉葡萄糖单元的摩尔比为16:1。
具体的，步骤1c)中，透析膜的截留分子量为3500kDa。
步骤2)的具体步骤如下：
2a)以羟乙基直链淀粉的量计，将30mg羟乙基直链淀粉溶于2mL无水DMSO，再投入11.75-188mg羰基二咪唑，室温搅拌反应1-3小时，得到羟基活化的乙基直链淀粉；
2b)向羟基活化的乙基直链淀粉中加入14.7-234.6mg的精胺，34-36℃搅拌反应18-30小时，进行反应；
2c)反应结束后，用去离子水透析，冷冻干燥，得到所述的精胺修饰羟乙基直链淀粉基因转染材。
更具体的，步骤2)的具体步骤如下：分别称取30mg HEA，溶于2mL无水DMSO，分别投入11.75mg、23.5mg、47mg、94mg和188mg羰基二咪唑，室温搅拌反应2小时以活化HEA的羟基，活化后分别加入14.7mg、29.3mg、58.6mg、117.3mg和234.6mg精胺，35℃搅拌反应24小时。反应结束后，用去离子水透析72小时，冷冻干燥。
优选的，步骤2b)中，加入的精胺与步骤1)得到的所述的羟乙基直链淀粉的葡糖糖单元的摩尔投料比为(0.5-8):1，具体可为0.5:1，1:1，2:1，4:1和8:1。
基于上述技术方案，精胺修饰羟乙基直链淀粉基因转染材料本身的转染效率最高。
步骤2b)中，透析膜的截留分子量为3500kDa。
本发明还提供了精胺修饰羟乙基直链淀粉基因转染材料的应用，用于制备基因转染材料。
具体的，用于制备HEK-293T细胞的pEGFP-N1质粒转染材料。
优选的，精胺修饰羟乙基直链淀粉基因转染材料与DNA的w/w比例为16。
基于上述技术方案，对HEK293T的转染效率最高，可达到19.34％。
附图说明
图1是本发明所提供的羟乙基直链淀粉的摩尔取代度测定相关数据图。
图2是本发明所提供的精胺修饰羟乙基直链淀粉的红外图谱。
图3是本发明所提供的精胺修饰羟乙基直链淀粉的核磁图谱。
图4是本发明所提供的激光粒度仪分析HEA-SP/DNA复合物的粒径图。
图5是本发明所提供的激光粒度仪分析HEA-SP/DNA复合物的电位图。
图6是本发明所提供的HEA-SP复合质粒DNA的凝胶阻滞实验分析图。
图7是本发明所提供的HEA-SP系列材料转染HEK293T细胞的效果图。
图8是HEA-SP对HEK-293T细胞的24h毒性数据图。
图9是HEA-SP/DNA对HEK-293T细胞的24h毒性数据图。
图10是HEA-SP/DNA复合物的TEM图。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
1、羟乙基直链淀粉(HEA)的制备与摩尔取代度测定
HEA的制备方法：在100mL1.0 mol/L氢氧化钾溶液中加入2％的直链淀粉，沸水浴中搅拌15min使直链淀粉充分溶解。然后将直链淀粉溶液置于厚壁耐压瓶中，冷却至2℃，搅拌和氮气保护下加入预冷至2℃的环氧乙烷液体(4～32mol/mol直链淀粉葡萄糖单元)，耐压瓶封口，40℃持续搅拌反应16h，反应结束后，冷却至2℃，打开耐压瓶，用1.0mol/L盐酸将溶液调节至中性，将溶液用超纯水透析72h，冷冻干燥得到HEA。反应方程式如下：
Figure BDA0003800566660000061
HEA的摩尔取代度(MS)采用气相色谱(GC)法，以己二酸为催化剂，氢碘酸水解取代糖链上的羟乙基，生成碘乙烷，以甲苯为内标，GC法检测碘乙烷的量，从而推算出羟乙基的摩尔取代度。以相同条件分别处理碘乙烷标准品10、20、40、60和80mg并GC检测。色谱条件：采用Agilent HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)毛细管柱，载气为氮气，流速1mL/min，顶空进样，进样体积1μL，分流比20∶1，进样口温度200℃，柱温为程序升温(50℃，维持4min，以15℃/min的速率升温至230℃，维持4min)，FID检测器温度280℃。
图1中，A、B部分分别是碘乙烷标准品和HEA的羟乙基被氢碘酸水解后产生的碘乙烷的GC图谱，3.1min左右处是甲苯内标的峰，3.5min左右处是碘乙烷的峰；2个图谱中甲苯内标和碘乙烷及杂质的峰分离良好，没有干扰。以碘乙烷标准品质量为横坐标，碘乙烷与内标的峰面积之比为纵坐标，绘制标准曲线，见图1中C部分。线性回归方程为Y＝0.6489X+0.1179，R2＝0.9999，表明体系中碘乙烷含量在10～80mg范围内时，碘乙烷和内标的峰面积之比与碘乙烷含量之间呈良好的线性关系。由标准曲线可计算出HEA样品中碘乙烷的质量，并很容易得出样品中碘乙烷的百分含量，进而推算出摩尔取代度，计算公式如下：
Figure BDA0003800566660000071
Figure BDA0003800566660000072
计算得出的环氧乙烷/直链淀粉葡萄糖单元(mol/mol)投料比与HEA羟乙基摩尔取代度的关系如下表1所示。
环氧乙烷投料量与HEA羟乙基摩尔取代度的关系
Figure BDA0003800566660000073
2精胺修饰羟乙基直链淀粉(HEA-SP)的制备与表征
2.1制备选取上述羟乙基摩尔取代度为1.00的HEA进行精胺修饰，摩尔投料比按照HEA葡糖糖单元：精胺＝1:0.5、1:1、1:2、1:4和1:8，所制备的HEA-SP分别标记为HEA-SP-0.5、HEA-SP-1、HEA-SP-2、HEA-SP-4和HEA-SP-8。具体方法如下：分别称取30mg HEA，溶于2mL无水DMSO，分别投入11.75mg、23.5mg、47mg、94mg和188mg羰基二咪唑，室温搅拌反应2小时以活化HEA的羟基，活化后分别加入14.7mg、29.3mg、58.6mg、117.3mg和234.6mg精胺，35℃搅拌反应24小时。反应结束后，用去离子水透析72小时，冷冻干燥。产物进行红外、核磁表征，并采用TNBS法检测伯氨基含量。
Figure BDA0003800566660000081
2.2红外图谱
如图2所示，FTIR谱图中，羟乙基直链淀粉在3500–3000cm-1处宽而强的峰归属于O-H的伸缩振动，3000-2800cm-1处的峰归属于C-H的伸缩振动，1000cm-1处的峰归属于C-O的伸缩振动。精胺修饰以后，1696cm-1处出现了强吸收峰，归属于C＝O的伸缩振动，1544cm-1和1267cm-1出现的吸收峰分别归属于精胺N-H和C-N的伸缩振动，且这三个峰均随着精胺投料比的增加而增强，表明精胺通过酰胺键成功偶联到了羟乙基直链淀粉上。
2.3核磁图谱
如图3所示，1H NMR图谱中，未修饰的羟乙基直链淀粉在化学位移δ＝5.2-5.8ppm之间是糖环上的OH和C1氢的峰，δ＝3.2-4.0ppm之间的多重峰归属于羟乙基直链淀粉C2-C6上的氢，偶联精胺后，化学位移δ＝2.5–3.0ppm(a)、1.7ppm(b)和1.5ppm(c)处新出现的峰归属于精胺链上不同化学环境的CH2中的氢，表明精胺成功偶联到了HEA上。HEA-SP-8的图谱中未出现明显的峰，是因为此聚合物难溶于重水，沉淀于核磁管底部，无法检测出信号。可能是由于精胺投料过多，聚合物交联度太高而难溶于水。
2.4、TNBS法测定HEA-SP系列聚合物中精胺含量
HEA-SP系列聚合物中伯精胺含量采用TNBS(三硝基苯磺酸)显色法，首先配制0.1M的NaHCO3溶液(pH8.5)用作反应缓冲液，用该反应缓冲液配制0.02，0.05，0.1，0.25，0.5和1.0mg/mL的精胺标准品和2.0mg/mL的HEA-SP系列聚合物，分别取100μL精胺标准品和HEA-SP系列聚合物置于酶标板中，加入50μL新配制的浓度为0.015％的TNBS工作液，混匀，37℃反应2h，加入25μL浓度为10％的SDS和12.5μL浓度为1N的HCl以终止反应，用酶标仪测定410nm处的吸光值。由精胺标准曲线y＝0.01183x+0.4743，R2＝0.998计算得出HEA-SP-0.5、HEA-SP-1、HEA-SP-2、HEA-SP-4和HEA-SP-8聚合物中每100个葡萄糖单元偶联的精胺数量分别为0.6、2.9、3.6、5.3和6.1。
3、HEA-SP复合质粒DNA的能力检测
3.1、HEA-SP/DNA复合物的制备
取0.8μg pEGFP-N1质粒，加入50μL opti-MEM(减血清培养基)，混匀。分别用50μLopti-MEM稀释不同体积的HEA-SP聚合物，再与上述50μL pEGFP-N1质粒溶液混合，得到体积为100μL的w/w比值分别为0、2、4、8、16和32的HEA-SP/DNA复合物。
3.2、激光粒度仪分析HEA-SP/DNA复合物的粒径和电位
使用丹东百特BT-zeta100型粒径/电位/分子量分析仪检测HEA-SP/DNA复合物的粒径和电位。结果如图所示，除了w/w比例为2时，HEA-SP聚合物和DNA形成的复合物粒径较大以外，其他HEA-SP/DNA复合物粒径均在100-200nm之间，表明HEA-SP能将DNA压缩至利于细胞摄取的纳米尺寸。电位分析的结果表明，随着HEA-SP投入的比例增加，HEA-SP/DNA复合物的电位由负转正，且正电位呈上升趋势，表明HEA-SP结合DNA后形成了阳离子纳米颗粒，有利于细胞的吸附和摄取。具体如图4、5所示。
3.3、凝胶阻滞实验分析HEA-SP复合质粒DNA的能力
按上述方法制备HEA-SP/DNA复合物，以1％琼脂糖凝胶100v电泳30分钟，溴化乙锭染色，凝胶成像结果如下，各组中，除了HEA-SP-8不能阻滞DNA，HEA-SP-0.5、HEA-SP-1和HEA-SP-4均能在w/w增加至2时完全阻滞DNA，HEA-SP-2在w/w增加至4时完全阻滞DNA，说明HEA-SP与DNA形成了紧密的复合物，无法穿过琼脂糖凝胶网络而泳动。具体如图6所示。
4.HEA-SP转染HEK-293T细胞
4.1、培养HEK-293T细胞至对数生长期，消化细胞并接种至24孔板，培养16小时，使细胞的汇合度在80％-90％。
4.2、按上述方法制备100μL的w/w比值分别为0、2、4、8、16和32的HEA-SP/DNA复合物。
4.3、吸出24孔板中的培养基，换成500μL opti-MEM培养基，将HEA-SP/DNA复合物均匀滴加到孔中，轻轻晃动孔板混匀。继续培养4h后，更换成完全培养基。
4.4、继续培养24h后，用olympus IX51倒置荧光显微镜观察EGFP蛋白表达情况并拍照。消化细胞，洗涤，分散成单细胞悬液，上Agilent NovoCyte2060R型流式细胞仪分析EGFP蛋白阳性细胞的比例，即为转染效率(transfection efficiency,TF)。
由图7可以看出，HEA-SP系列材料转染HEK293T细胞后，不同材料转染效率有很大差异，且w/w比值也会影响转染效率。其中，HEA-SP-2转染效率最高，且在w/w＝16时，转染效率最高，达到19.34％。
细胞毒性试验
采用CCK-8细胞毒性试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)检测HEA-SP和HEA-SP/DNA对HEK-293T细胞的毒性。方法如下：培养HEK-293T细胞至对数生长期，消化细胞，接种至96孔板，培养16小时，使细胞的汇合度在80％-90％。按上述方法制备w/w比值分别为0、2、4、8、16和32的HEA-SP/DNA复合物，以及相应浓度的HEA-SP。吸出培养基，每孔加入各组不同浓度的100μL HEA-SP/DNA复合物和HEA-SP，每组4个复孔。继续培养24h后，每孔加入10μLCCK-8溶液，置于培养箱中继续孵育1h，采用酶标仪检测450nm处的吸光值，以各组吸光值除以对照组吸光值即得出各组的细胞存活率。
HEA-SP和HEA-SP/DNA对HEK-293T细胞的24h毒性分别如图8和图9所示，精胺接枝度的增加并未增加细胞毒性，且HEA-SP浓度的增加和DNA比例的增加也未影响细胞毒性，且各组细胞的存活率均高于90％，表明HEA-SP对HEK-293T细胞未显示明显的细胞毒性。
亲水试验
称取冷冻干燥后的HEA-SP样品各0.050g，置于2mL样品瓶中，加入1mL超纯水，每隔5分钟强力振荡30秒钟，30分钟后观察溶解情况，如看不见溶质颗粒视为溶解。未溶解的部分通过12000r·min-1离心10min分离，真空干燥后称重，计算出溶解度。结果如表1所示，HEA-SP-0.5、HEA-SP-1、HEA-SP-2、HEA-SP-4易溶于水、HEA-SP-8难溶于水，可能是由于随着精胺投料量的增加，HEA和精胺接枝度太高，形成了交联物。
表1不同接枝度HEA-SP的溶解度试验结果
Figure BDA0003800566660000121
TEM图
采用Tecnai G2 20型透射电子显微镜观察HEA-SP/DNA复合物的形貌。按上述方法制备系列HEA-SP/DNA复合物，HEA-SP和DNA的质量比w/w＝16。滴加10μL复合物样品于覆碳膜铜网上，吸附10min后，用滤纸吸去多余的样品，用1％的磷钨酸负染，去离子水洗去多余的磷钨酸，晾干后上机观察并拍照。
如图10所示，HEA-SP-2和DNA形成的复合物尺寸均匀且尺寸在100nm左右，较其他接枝度的HEA-SP与DNA形成的复合物尺寸更小，更利于细胞摄取。因此HEA-SP-2能获得更高的转染效率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种精胺修饰羟乙基直链淀粉基因转染材料，其特征在于，其结构通式如下：
Figure FDA0003800566650000011
其中，n为18000-20000，m为112-1138。
2.一种根据权利要求1所述的精胺修饰羟乙基直链淀粉基因转染材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)向氢氧化钾溶液中加入直链淀粉，再与环氧乙烷反应，制备得到羟乙基直链淀粉，其反应式如下：
Figure FDA0003800566650000012
2)选取步骤1)制备得到的羟乙基摩尔取代度为1.00的羟乙基直链淀粉与羰基二咪唑反应，制备得到酯基咪唑，再与精胺反应，得到所述的精胺修饰羟乙基直链淀粉基因转染材料，其反应式如下：
Figure FDA0003800566650000021
3.根据权利要求2所述的精胺修饰羟乙基直链淀粉基因转染材料的制备方法，其特征在于，步骤1)的具体步骤如下：
1a)在0.9-1.1mol/L氢氧化钾溶液中加入其1.8-2.2wt％的直链淀粉，沸水浴中搅拌，使直链淀粉充分溶解；
1b)将直链淀粉溶液置于厚壁耐压瓶中，冷却至1-3℃，搅拌和氮气保护下加入预冷至1-3℃的环氧乙烷液体，耐压瓶封口，35-45℃持续搅拌反应12-20h，其中，环氧乙烷与直链淀粉葡萄糖单元的摩尔比为(4～32):1；
1c)反应结束后，冷却至1-3℃，打开耐压瓶，用0.9-1.1mol/L盐酸将溶液调节至中性，将溶液用超纯水透析，冷冻干燥，得到所述的羟乙基直链淀粉。
4.根据权利要求3所述的精胺修饰羟乙基直链淀粉基因转染材料的制备方法，其特征在于：
步骤1b)中，环氧乙烷与直链淀粉葡萄糖单元的摩尔比为16:1；
步骤1c)中，透析膜的截留分子量为3500kDa。
5.根据权利要求2所述的精胺修饰羟乙基直链淀粉基因转染材料的制备方法，其特征在于，步骤2)的具体步骤如下：
2a)以羟乙基直链淀粉的量计，将30mg羟乙基直链淀粉溶于2mL无水DMSO，再投入11.75-188mg羰基二咪唑，室温搅拌反应1-3小时，得到羟基活化的乙基直链淀粉；
2b)向羟基活化的乙基直链淀粉中加入14.7-234.6mg的精胺，34-36℃搅拌反应18-30小时，进行反应；
2c)反应结束后，用去离子水透析，冷冻干燥，得到所述的精胺修饰羟乙基直链淀粉基因转染材。
6.根据权利要求5所述的精胺修饰羟乙基直链淀粉基因转染材料的制备方法，其特征在于：
步骤2b)中，加入的精胺与步骤1)得到的所述的羟乙基直链淀粉的葡糖糖单元的摩尔投料比为(0.5-8):1；
步骤2b)中，透析膜的截留分子量为3500kDa。
7.一种根据权利要求1所述的精胺修饰羟乙基直链淀粉基因转染材料的应用，其特征在于：用于制备基因转染材料。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：用于制备HEK-293T细胞的转染材料。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：精胺修饰羟乙基直链淀粉基因转染材料与DNA的w/w比例为16。
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