CN115487315A

CN115487315A - 治疗亨廷顿病的药物

Info

Publication number: CN115487315A
Application number: CN202210417707.7A
Authority: CN
Inventors: 闫森; 李晓江; 李世华; 赖良学; 郑潇; 李彩娟; 林颖琪; 涂著池
Original assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS; Jinan University
Current assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS; Jinan University
Priority date: 2022-04-20
Filing date: 2022-04-20
Publication date: 2022-12-20
Anticipated expiration: 2042-04-20
Also published as: CN115487315B

Abstract

本发明涉及一种治疗亨廷顿病的药物。该药物利用CRISPR/Cas基因编辑技术将人突变的HTT基因第一外显子替换为人正常HTT基因第一外显子，该药物包括供体AAV载体和Cas蛋白AAV载体，供体AAV载体包括人正常HTT基因第一外显子和用于表达sgRNA的gRNA表达元件，Cas蛋白AAV载体，包括用于表达Cas蛋白的Cas蛋白表达元件。该药物能从基因组中对突变的HTT基因进行修复，与传统治疗亨廷顿病的药物相比效果更好且作用时间长。

Description

治疗亨廷顿病的药物

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种治疗亨廷顿病的药物。

背景技术

随着老龄化社会的到来，神经退行性疾病成为了影响人民生活水平及健康的一项重要因素。因此治疗及缓解此类疾病十分重要。

亨廷顿病(Huntington's disease，HD)，又称大舞蹈病或亨廷顿舞蹈症(Huntington's chorea)，是一种常染色体显性遗传性神经退行性疾病。亨廷顿病的发病原因十分清晰。HTT基因上有一个多聚谷氨酰胺(Poly Q)的部分，这一部分是由重复CAG三核苷酸重复序列所编码。正常人群中这一重复序列的长度为6～35个重复，如果扩增超过37个重复序列，则会导致发病，出现运动症状。而如果重复在36～39之间，一部分患者会发病，一些患者会继续保持无症状状态。而亨廷顿病、老年痴呆症、帕金森等神经退行性疾病均可产生错误折叠的蛋白并且难以清除，从而形成聚集体，因此他们具有类似的病理特征。

由于亨廷顿病主要是突变亨廷顿蛋白所导致，因此如何消除和/或抑制突变亨廷顿蛋白表达是治疗此疾病的关键。有研究曾采用RNA干扰(RNAi)和反义寡核苷酸技术(ASOs)在细胞或小动物HD模型上进行尝试，然而药物半衰期短，需鞘内反复给药及临床上没有确定治疗效果，III期HD疾病的临床研究不得不停止。

发明内容

基于此，有必要提供一种治疗亨廷顿病的药物，该药物能高效准确地修复HTT基因以改善传统治疗亨廷顿病的药物半衰期短需反复使用且效率不够的问题。

一种药物，所述药物利用CRISPR/Cas基因编辑技术将人突变的HTT基因第一外显子替换为人正常HTT基因第一外显子，所述药物包括：

供体AAV载体，包括人正常HTT基因第一外显子和用于表达sgRNA的gRNA表达元件；及

Cas蛋白AAV载体，包括用于表达Cas蛋白的Cas蛋白表达元件。

上述治疗亨廷顿病的药物利用CRISPR/Cas基因编辑技术，通过AAV的方式将CRISPR-Cas系统中发挥作用的元件导入体内，使其在体内表达形成sgRNA和Cas蛋白，并提供人正常的HTT基因第一外显子以替换人突变的HTT基因第一外显子。一方面，上述药物利用CRISPR/Cas基因编辑技术直接将突变的基因精准修复，从根本上对遗传疾病进行修复治疗，修复后的性状可以稳定遗传，其后代不容易再患病。另一方面，上述药物采用AAV作为载体，AAV在神经系统内应用具有安全、高效和毒性低等优势。此外，上述药物采用CRISPR/Cas基因编辑技术对基因组DNA进行剪切而发挥作用，与RNAi相比，效率高切无需反复给药。

在其中一个实施例中，所述供体AAV载体还包括分别位于所述人正常HTT基因第一外显子上游和下游的同源臂，所述同源臂用于与人突变的HTT基因第一外显子的上游和下游发生同源重组，以将所述人突变HTT基因第一外显子替换为所述人正常HTT基因第一外显子。

在其中一个实施例中，所述Cas蛋白为Cas9、Cas12a、Cas12b或Cas12c。

在其中一个实施例中，所述gRNA表达元件能够表达两个sgRNA，两个所述sgRNA的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1～2所示。

在其中一个实施例中，所述人正常HTT基因第一外显子中CAG重复序列的数量为6个～35个。

在其中一个实施例中，所述人正常HTT基因第一外显子中的CAG重复序列的数量为18个或20个。

在其中一个实施例中，所述供体AAV载体和所述Cas蛋白AAV载体的空载体分别独立地为AAV9。

在其中一个实施例中，在使用时，所述供体AAV载体与所述Cas蛋白AAV载体的病毒滴度比为1：(1～3)；所述供体AAV载体和所述Cas蛋白AAV载体的总量为5×10¹⁰GC～1×10¹³GC。

在其中一个实施例中，所述供体AAV载体上还包括标记蛋白表达元件。

在其中一个实施例中，所述人突变的HTT基因第一外显子中CAG重复序列的数量超过36个。

附图说明

图1为一实施例的基因修复方法的示意图；

图2为一实施例的供体AAV载体(AAV-gRNA-Donor)和Cas蛋白AAV载体(AAV-Cas9)的结构示意图；

图3为实施例2的HD-KI猪治疗组的大脑皮层和纹状体的PCR结果；

图4为实施例2中对HD-KI猪脑立体定位注射AAV-gRNADonor病毒和AAV-Cas9病毒(治疗组)到纹状体3个月后其纹状体和大脑皮层的荧光显微图像；

图5为实施例2中脑立体定位注射后对照组和治疗组在跑步机上的运动行为表现；

图6为实施例2中脑立定位注射后对照组和治疗组在沙地上的步态情况；

图7为实施例2中静脉注射后各个脑区和全身其他器官中标记蛋白RFP的分布情况；

图8为实施例2中静脉注射后对各个脑区及其他器官中HTT蛋白、神经元及胶质细胞的情况。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。在本文中，如无特别说明，“AAV”、“AAV载体”或“AAV病毒载体”均是指腺相关病毒(Adreno-Associated Virus，AAV)，其作为一种基因导入的载体。

本申请一实施方式提供了一种治疗亨廷顿病的药物，该药物利用CRISPR/Cas基因编辑技术将人突变的HTT基因第一外显子替换为人正常HTT基因第一外显子，该药物包括供体AAV载体和Cas蛋白AAV载体，供体AAV载体包括人正常HTT基因第一外显子和用于表达sgRNA的gRNA表达元件，Cas蛋白AAV载体包括用于表达Cas蛋白的Cas蛋白表达元件。

上述药物利用CRISPR/Cas基因编辑技术，通过以AAV病毒为载体将CRISPR-Cas系统中发挥作用的元件导入体内，使其在体内表达形成sgRNA和Cas蛋白，并提供人正常的HTT基因第一外显子，从而可以将人突变的HTT基因第一外显子替换为人正常HTT基因第一外显子。一方面，上述药物利用CRISPR-Cas系统直接将突变的基因精准修复，从根本上对遗传疾病进行修复治疗，修复后的性状可以稳定遗传，其后代不容易再患病。另一方面，上述药物采用AAV病毒作为载体，在神经系统内应用具有安全、高效和毒性低等优势。此外，上述药物因为采用CRISPR/Cas基因编辑技术发挥作用，与RNAi或ASO相比，其效率高，不需反复使用。需要说明的是，本文中人HTT基因在NCBI数据库中的Gene ID:3064。

具体地，Cas蛋白(CRISPR Associated Protein)是具有反式切割(transcleavage)或附带切割(collateral cleavage)活性的通过向导RNA介导的核酸内切酶。在一些实施例中，Cas蛋白为Cas9、Cas12a、Cas12b或Cas12c。可以理解的是，在其他实施例中，Cas蛋白不限于上述。

具体地，gRNA表达元件用于在体内表达sgRNA，从而引导Cas蛋白在特定的位置进行剪切。在一些实施例中，RNA表达元件表达两个sgRNA。通过两个sgRNA的设置可以提高定点替换核酸片段的效率和准确性。在一个可选地具体示例中，两个sgRNA的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～2所示。具体地，如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为：GGCCTTCATCAGCTTTTCCA(gRNA1)；如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为：GGCTGAGGAAGCTGAGGAGG(gRNA2)。

人正常HTT基因第一外显子中CAG重复序列的数量为6个～35个。在人HTT基因第一外显子中CAG重复序列的数量在36个以上时会表现出不同程度的亨廷顿病的症状。也即是，在本实施方式中，人突变的HTT基因第一外显子中CAG重复序列的数量在36个以上；用于替换人突变HTT基因第一外显子的人正常HTT基因第一外显子中的CAG重复序列的数量为6个～35个。在一个可选地具体示例中，人突变的HTT基因第一外显子中CAG重复序列的数量为150个。在一个可选地具体示例中，用于替换人突变HTT基因第一外显子的人正常HTT基因第一外显子中的CAG重复序列的数量为15个、18个、20个或25个。在本文中“以上”在与数字联用以描述数量时包括本数。

在一个可选地具体示例中，人正常HTT基因第一外显子的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。具体地，如SEQ ID NO.3所示的序列为：GCATGGCGACCCTGGAAAAGCTGATGAAGGCCACTCTGGAGAAGCTGATGAAGGCTTTCGAGTCCCTCAAGTCCTTCCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAACAGCCGCCACCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCACCACAACCTCCACAGCCGCCGCCGCAGGCACAGCCGCTGCTGCCTCAGCCGCAGCCGCCCCCGCCGCCGCCCCCGCCGCCACCCGGCCCGGCTGTGGCTGAGGAGCCGCTGCACCGACCGTGA。

传统的基因治疗时跨血脑屏障效率低。腺相关病毒(AAV)是一个常见的人细小病毒，自然缺陷、无包被和无致病原性。AAV复制周期由两个明显的阶段构成：潜伏期和增殖期。在缺少辅助病毒诸如腺病毒、疱疹病毒、牛痘病毒或者在基因毒条件下，AAV能复制产生子代病毒颗粒。因此，通过AAV与基因编辑技术的结合，大大提高精准替换的效率。在一些实施例中，供体AAV载体和Cas蛋白AAV载体的空载体分别独立地选自AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9中的一种。在一个可选地具体示例中，供体AAV载体和Cas蛋白AAV载体的空载体均为AAV9。AAV9病毒具有跨血脑屏障的特性，AAV9病毒作为载体，通过静脉注射就可以实现基因修复和治疗。

进一步地，在一些实施例中，供体AAV载体还包括位于人正常HTT基因第一外显子上游和下游的同源臂，同源臂用于与受体中人突变的HTT基因第一外显子的上游和下游发生同源重组，以将人突变HTT基因第一外显子替换为人正常HTT基因第一外显子。通过在人正常HTT基因第一外显子上游和下游设置同源臂，利用同源重组，可以使得人正常HTT基因第一外显子能够快速且正确地替换掉突变的核酸片段。在一个可选地具体示例中，同源臂的长度为1000bp。可以理解的是，在其他实施例中，同源臂的长度不限于此。

在使用时，Cas蛋白AAV载体与供体AAV载体的病毒滴度(简称滴度)比为(1～3)：1；供体AAV载体和Cas蛋白AAV载体的总量为1.5×10¹⁰GC～1×10¹³GC。在一个可选地具体示例中，供体AAV载体与Cas9蛋白AAV载体的滴度比为1：1、1：1.5、1：2、1：2.5或1：3。可以理解的是，在上述药物在包装用于售卖时，供体AAV载体与Cas9蛋白AAV载体可以单独包装，也可以混合后一起包装。在供体AAV载体与Cas9蛋白AAV载体混合一起包装时，供体AAV载体与Cas9蛋白AAV载体的数量或者浓度可以是其工作浓度的倍数，在使用时稀释成工作剂量。

进一步地，在一些实施例中，供体AAV载体上还包括标记蛋白表达元件。通过标记蛋白表达元件表达标记蛋白，从而可以定位病毒作用的位置及表达效果。可选地，标记蛋白为荧光蛋白。在一个可选地具体示例中，标记蛋白为RFP。也即是，在供体AAV载体上包括的是表达RFP蛋白的表达元件。可以理解的是，标记蛋白不限于RFP，还可以是其他物质。

基于上述，本申请一实施方式还提供了一种亨廷顿病的治疗方法，该治疗方法包括以下步骤：将上述任一实施例的药物配制成工作浓度后注射到患者体内。

在一些实施例中，通过脑立体定位注射技术将上述任一实施例的药物注射到纹状体中。可选地，注射的速度为800nL/min。

在另一些实施例中，可以通过静脉注射的方式将上述任一实施例的药物注射到患者体内。可选地，此时患者为血脑屏障未完全形成的个体。

上述亨廷顿病的治疗方法利用CRISPR/Cas基因编辑技术与AAV病毒相结合的上述药物将人突变的HTT基因第一外显子替换为人正常HTT基因第一外显子，从根本上对HTT基因进行修复，不容易脱靶，作用时间长至终身。

具体实施例

以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。以下实施例中，hHTT指人亨廷顿基因，在NCBI数据库中的Gene ID：3064；pHTT指猪亨廷顿基因，在NCBI数据库中的Gene ID：397014。另外，以下实施例中的猪为融水小型猪和巴马小型猪的杂交后代。

实施例1

建立亨廷顿模型

利用CRISPR/Cas9技术定点敲入致病基因人突变的亨廷顿第一外显子基因(HTT基因)，获得了具有四肢运动障碍、呼吸障碍、MRI及病理水平可以明显看到纹状体萎缩及脑神经细胞变性的HD基因敲入猪模型，通过体细胞核移植方式建立了HD-KI猪模型，并且建立了可稳定遗传的HD-KI猪品系，成功繁育了F1代和F2代小型猪模型(HD KI猪的具体构建方法可参见中国专利CN107988256A的实施例)。

1.基因敲入克隆猪的鉴定

1)克隆模型猪基因型鉴定：HD KI新生克隆猪出生后打耳号，并取下小块耳组织采用天根生物科技的组织基因组DNA提取试剂盒提取基因组后进行PCR鉴定。具体包括但不限于下述步骤：

A.耳组织剪碎，加入200μL GA溶液与20μL(20mg/mL)蛋白酶K，置于56度消化3小时。

B.在步骤A的基础上加入200μL GB溶液，70℃水浴10分钟至澄清。

C.在步骤B的基础上加入200μL乙醇，混匀。

D.将步骤C混匀后的液体移入吸附柱CB3中，12000转/分钟，离心30～60秒。

E.在步骤D的基础上用500μL GD清洗柱子，再用600μL PW洗柱子两遍。

F.最后在柱子中间滴加100μl 65℃水浴预热的洗脱液1×TE，静置3分钟，12000转，离心2分钟。以提取的基因组为模板，进行PCR，跑胶观察到条带后送测序。其中，PCR引物以扩增含有同源臂和突变CAG的DNA。PCR产物使用S1和A1引物(S1引物：5'-GGCTTTCGAGTCCCATCAAGTCTCCCATCCCA-3'(SEQ ID NO.4)；A1primer:5'-GCTTCTTGAAGCCGTCCTCATGAATGCCTTCCGT-3'(SEQ ID NO.5))。PCR条件为94℃5min；94℃30s，65℃30s，72℃1min 30s，循环35次；72℃保温5分钟，12℃保温。

2)基因敲入猪蛋白表达的鉴定分为染色及免疫印迹法：

(1)染色法：分别取出HD KI猪(简称HD KI)和WT野生型猪的大脑，通过4％的多聚甲醇的固定、组织块脱水、石蜡包埋、切片等。具体步骤包括但不限于如下：

A.取材：首先切下2cm×1.5cm，厚度不超过3mm的经4％的多聚甲醇的固定的组织块，置于浸泡盒中。

B.脱水(提前配制好梯度酒精)：70％乙醇，80％乙醇，90％乙醇，95％乙醇I，95％乙醇II各2小时；无水乙醇I，无水乙醇II中1小时；无水乙醇：二甲苯(体积比1：1)中30min。

C.组织透明：

二甲苯I，30min；

二甲苯II中30min；

D.浸蜡：石蜡I 58℃1h，59℃1h，60℃1h。

D.包埋：将烘箱温度升至63度，将组织放于包埋盒中。

F.免疫组化和免疫荧光染色步骤包括：a.熔蜡；b.脱蜡；c.水化；d.修复；e.封闭；f.一抗孵育；g.清洗；h.二抗孵育。

(2)免疫印迹法：蛋白的提取和Western blotting：按比例配置6％的分离胶，待分离胶凝固后，弃去水层，加入浓缩胶。上样后。放入bio-rad转膜仪中，200mA，Huntingtin蛋白转移150min，选用0.4um的PVDF膜。转膜后用TBST(即含0.05％的tween 20)清洗，加入5％的脱脂牛奶，室温封闭1h，加mHTT(EM48)或1C2抗体4℃过夜，用TBST清洗3次，加入2抗室温孵育1h，清洗3次，即可检测。

经测序鉴定，HD KI猪的HTT基因第一外显子替换为了人HTT基因第一外显子，且该人HTT基因的第一外显子具有150个CAG；并且Western blotting显示，HD KI猪的猪脑中有突变的亨廷顿蛋白表达。

2.基因敲入猪行为学建立

随机抽取6只同年龄同性别野生型小猪作为对照组，6只体重接近、年龄相当的HDKI猪作为实验组。通过观察基因敲入猪HD KI的发病时间，体重变化，死亡时间，与肌肉相关的行为学改变例如肌肉张力障碍、肌肉强直、行动迟缓，舞蹈症状、步态改变；以及由神经退行性疾病所引发的精神障碍：痛苦、焦虑和抑郁等来进行比较分析。

舞蹈症：通过视频监测观察HD KI猪有无舞蹈现象及运动障碍。

肌肉运动障碍：实验开始前需让实验动物以2.0km/h在跑步机上连续训练3天。采用两种方式进行实验：(i)动物以加速度1.0～6.0km/h加速在跑步机上跑，每10s逐渐递增直至6km/h，直至猪不能流畅的跑步为止。(ii)恒定速度模式：以3km/h，1min，记录有效时间。在猪出生后每隔1个月进行一次跑步机训练。如若存在不能跑动、坐立、前后步伐不一致等均被认为存在肌肉运动障碍。

精神障碍：来回走动，静立，慢行，走动，头探寻食槽和进食，头探栏杆探食槽，睡；后腿挠前腿；后腿挠耳朵；伸展后肢；前肢倚靠墙壁后肢站立；甩动(身体不移动)；身体蹭食槽壁/墙壁；臀部蹭墙，通过观察这些行为表现来判断猪有无情绪变化是否产生焦虑、抑郁、痛苦等精神问题。

同时分别将对照组的野生型小猪及实验组HD KI猪进行沙地步态实验，通过观察猪在沙地上的脚印及步间距来评价疾病状态及恢复情况。步伐均一为正常步态，步态有脱步及步伐大小不一说明出现了运动障碍。

体重与生长：每2周测量HD KI猪体重，观察体重增长曲线及变化并与野生型对照组比较。

经过3～24个月的时间观察发现，HD KI猪的亨廷顿病模型建立成功。

实施例2

HD-KI猪中的人HTT基因的修复的流程图大致如图1所示。使用两个带有Cas9的HTT-gRNAs(T1和T2)促进含有人HTT基因(hHHT)第一外显子(外显子1或Exon1)和20个CAG的供体DNA和猪HTT(pHTT)序列的纯合重组，以取代HD-KI猪中含有150个CAG的HTT。具体步骤包括但不限于：

1)构建AAV-gRNA-Donor病毒作为表达sgRNA1、sgRNA2和替换含150个CAG重复序列的第一外显子为含20个CAG重复序列的第一外显子(简称替换片段)的载体，AAV-gRNA-Donor载体的结构示意图如图2所示：将针对HTT基因进行靶向设计的特异性sgRNA1和sgRNA2和替换片段构建在AAV9病毒载体上，构建得到的AAV-gRNA-Donor病毒记为“AAV-20Q-sgRNA-HTT-Cherry”。其中一个与Cas9对应的sgRNA(T1)的核苷酸序列为：GGCCTTCATCAGCTTTTCCA(SEQ ID NO.1)，另一个与Cas9对应的sgRNA(T2)的核苷酸序列为：GGCTGAGGAAGCTGAGGAGG(SEQ ID NO.2)。替换片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；AAV-gRNA Donor中的人HTT基因(hHTT)第一外显子的两端具有长度为500bp且能与KD KI pHTT进行同源重组的同源臂。

2)构建AAV-Cas9病毒作为表达Cas9的载体：AAV-Cas9载体的结构示意图如图2所示。AAV-Cas9载体为派真生物(Packgene,Guangzhou,China)的AAV-mini-cmv-spCas9载体。

2.猪脑立体定位病毒注射

用1.5％异氟醚吸入麻醉3个月大的HD-KI猪，并将其置于立体定位仪(RWD仪器)中。所有手术均按照中国科学院广州生物医学与健康研究所的《实验动物护理和使用指南》和《生物安全程序》进行。以1:2的滴度比例混合AAV-gRNA Donor病毒和AAV-Cas9病毒。调整至平顶颅骨位置的以下坐标，将30微升混合病毒(1×10¹³GC/mL)分别注入猪纹状体两侧(15/侧)：根据MRI影像定位，在头骨上钻孔，使用26号汉密尔顿注射器和syringe输液泵以800nL/min的速度输送病毒。美洛昔康(2mg/kg)作为止痛剂，术后将猪放在温暖的垫子上以从麻醉中恢复。同时，以AAV-gRNA-control和AAV-Cas9病毒组作为对照组。

3.新生猪静脉病毒注射

HD-KI猪产仔产后新生HD-KI猪。15日龄仔猪耳静脉注射AAV-sgRNA(AAV-sgRNA与AAV-gRNA-Donor的差别之处在于，AAV-sgRNA不具有20个CAG的正常人hHTT外显子1和位于其两侧的同源臂)作为对照组，AAV-mini-cmv-spCas9、AAV-20Q-sgRNA-HTT-Cherry以3：1的滴度比进行注射作为治疗组，注射剂量为1×10¹³GC，将病毒用PBS混合至1mL通过仔猪耳静脉注射到小型猪体内。

4.结果

1)采用实施例1的方法，从治疗后的HD-KI猪的F2代和F3代的猪纹状体核大脑分离的基因组DNA用于基因分型和测序，结果如图3所示。

2)AAV脑定位注射基因治疗后HTT聚集体减少

将AAV-gRNA-Donor病毒及AAV-Cas9病毒按照1：2的比例(滴度比)通过立体定位技术注射到大脑纹状体中，在4个月后对其进行安乐死，并应用HTT特异抗体(mEM48)抗体检测猪纹状体mHTT聚集体的表达量。结果如图4所示，其中图4中a为注射AAV-gRNA-Donor病毒及AAV-Cas9病毒的治疗组猪纹状体和大脑皮层的荧光显微图像，图4中b的第一排为对照组猪纹状体的荧光显微图像，第二排为治疗组猪纹状体的荧光显微图像。

由图4中的a和b可以看出，与对照组相比，注射AAV-gRNA-Donor病毒及AAV-Cas9病毒的治疗组亨廷顿聚集体的表达量明显地降低。由此可知，通过立体定位注射，可以实现非常好的纹状体的治疗元件扩散及高表达。

3)行为学分析

在注射AV-gRNA-Donor病毒及AAV-Cas9病毒4个月后，采用实施例1的第二部分关于基因敲入猪行为学建立中有关亨廷顿病的行为评估标准对对照组和实验组进行评估，其中部分结果如图5和图6所示，其中图5为对照组与治疗组在跑步机上的运动行为表现；图6为对照组与治疗组在沙地上的步态情况。

通过对治疗组和对照组的行为学分析可以看出，治疗组在跑步机及沙地上的步态均有所恢复，而未治疗组(对照组)出现明显地运动障碍。

4)新生猪静脉病毒注射结果

对15日龄猪静脉按照1:2的滴度比静脉注射AAV-gRNA-Donor及AAV-Cas9病毒3个月后检测药物在全身及脑部的分布情况。结果如图6所示，图7中，“Cortex”指大脑皮层；“Striatum”指纹状体；“Hippocampus”指海马体；“Cerebellum”指小脑；“Brain stem”指脑干；“Spinal cord”指脊髓；“WT”指野生型；“Heart”指心脏；“Liver”指肝脏；“Spleen”指脾脏；“Lung”指肺脏；“Kidney”指肾脏；“Testis”睾丸。

因为静脉注射的AAV药物(AAV-gRNA-Donor病毒与AAV-Cas9病毒以1:2的滴度比制成的混合物)所构建的Donor载体带有RFP标记，因此对其进行各个脑区及外周的westernblot检测以验证通过此方法是否可以在全身表达、是否可以跨血脑屏障并在大脑中表达良好。由图7可知，RFP在大脑皮层、纹状体、海马体、小脑、脑干、心脏、肝脏、肾脏和睾丸中均有不同程度的表达，这说明AAV病毒将治疗元件送至全身表达，可以跨血脑屏障并在大脑中表达良好，同时也可以实现了对生殖细胞即睾丸组织的传递及修复，可避免遗传HD给后代。

5)静脉注射后的各个脑区的治疗效果

采用免疫印迹(Western blotting)分别检测了静脉注射3个月后的治疗组猪的大脑皮层、纹状体、海马、小脑、脑干和脊髓中的亨廷顿蛋白、神经元(NeuN)和GFAP。结果如图8所示，图8中“Treated”指治疗组；“Un-treat”指未治疗组，“WT”指野生型猪(也即是正常猪)其他与前文相同。

由图8可知，在治疗组中，变异的HTT蛋白明显降低，且神经元有所恢复，胶质细胞增生减弱，产生了很好的治疗效果。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解的是，在本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

序列表

<110> 暨南大学

中国科学院广州生物医药与健康研究院

<120> 治疗亨廷顿病的药物

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggccttcatc agcttttcca 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggctgaggaa gctgaggagg 20

<210> 3

<211> 293

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcatggcgac cctggaaaag ctgatgaagg ccactctgga gaagctgatg aaggctttcg 60

agtccctcaa gtccttccag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc 120

agcagcagca gcaacagccg ccaccgccgc cgccgccgcc gccgccgcca ccacaacctc 180

cacagccgcc gccgcaggca cagccgctgc tgcctcagcc gcagccgccc ccgccgccgc 240

ccccgccgcc acccggcccg gctgtggctg aggagccgct gcaccgaccg tga 293

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggctttcgag tcccatcaag tctcccatcc ca 32

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcttcttgaa gccgtcctca tgaatgcctt ccgt 34

Claims

1.一种治疗亨廷顿病的药物，其特征在于，所述药物利用CRISPR/Cas基因编辑技术将人突变的HTT基因第一外显子替换为人正常HTT基因第一外显子，所述药物包括：

供体AAV载体，包括人正常HTT基因第一外显子和用于表达sgRNA的sgRNA表达元件；及

Cas蛋白AAV载体，包括用于表达Cas蛋白的Cas蛋白表达元件。

2.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，所述供体AAV载体还包括分别位于所述人正常HTT基因第一外显子上游和下游的同源臂，所述同源臂用于与人突变的HTT基因第一外显子的上游和下游发生同源重组，以将所述人突变HTT基因第一外显子替换为所述人正常HTT基因第一外显子。

3.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，所述Cas蛋白为Cas9、Cas12a、Cas12b或Cas12c。

4.根据权利要求1～3任一项所述的药物，其特征在于，所述gRNA表达元件能够表达两个sgRNA，两个所述sgRNA的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～2所示。

5.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，所述人正常HTT基因第一外显子中CAG重复序列的数量为6个～35个。

6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述人正常HTT基因第一外显子中的CAG重复序列的数量为18个或20个。

7.根据权利要求1项所述的药物，其特征在于，所述供体AAV载体和所述Cas蛋白AAV载体的空载体分别独立地为AAV9。

8.根据权利要求1项所述的药物，其特征在于，在使用时，所述供体AAV载体与所述Cas蛋白AAV载体的病毒滴度比为1：(1～3)；所述供体AAV载体和所述Cas蛋白AAV载体的总量为1.5×10¹⁰GC～1×10¹³GC。

9.根据权利要求1项所述的药物，其特征在于，所述供体AAV载体上还包括标记蛋白表达元件。

10.根据权利要求1～3和5～9中任一项所述的药物，其特征在于，所述人突变的HTT基因第一外显子中CAG重复序列的数量超过36个。