CN115475284A - 一种具有三维多孔结构的微球及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及涉及生物医用材料制备领域，提供了一种具有三维多孔结构的微球及其制备方法。微球由聚合物形成球形主体，球形主体的表面和/或内部具有若干连通的孔结构，聚合物为聚左旋乳酸‑己内酯共聚物。制备方法包括：取致孔剂溶于易挥发有机溶剂中作为溶液A；取聚合物溶于易挥发有机溶剂中作为溶液B；将溶液A与B搅拌混合作为内通道油相流体O；取亲水性表面活性剂溶于去离子水中，所得溶液作为外通道水相流体W，同时再配置亲水性表面活性剂水溶液作为接收液；使油相流体O通入内通道，水相W通入外通道，得到水包油型乳液；将乳液接收于接收液中，水平旋转固化，洗涤、冷冻干燥。所制备的微球能促进细胞粘附/增殖、分化，实现细胞扩增。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料的制备领域，具体涉及一种具有三维多孔结构的微球及其制备方法。
背景技术
微球是指由高分子材料作为基质骨架的球形或类球形实体，按其结构主要分为实心微球、中空微球和多孔微球。其中，多孔微球内外丰富且互相连通的孔结构，使其拥有更大的比表面积和空间容量，比表面积的增加将会豁附更多的细胞，便于细胞的生长迁移；同时交互联通的多孔结构还有利于蛋白质的吸附、代谢废物的排除、营养物质的转运和生物因子的传递，因而在微吸附材料、药物缓释载体、细胞扩增和运送载体等方面应用更具独特优势。然而，目前微球在科学研究及临床应用中仍然存在诸多不足，如微球的粒径分布不均一，无法做到精确可控；再如微球球内的孔径形貌无法做到可控一致。
微球的传统制备方法主要有乳化/溶剂挥发法、喷雾干燥法、超临界CO2法等，制备方法的不同导致得到的微球的性能存在差异，包括形貌、内部结构、细胞粘附率、降解周期等，而这些性能的差异决定所得微球是否能够有效进行组织修复，药物递送以及促进细胞粘附/增殖等更进一步的生物医学效应。所以对微球制备方法的研发和操作参数优化至关重要。需要强调的是微球的直径和孔径越均一以及制备过程可控性越强，越能准确评估细胞对它们的反应，从而有利于优化得到最佳的生物学效应；此外，多孔微球相比致密微球更加具有研究前景，作为组织修复材料，多孔微球能够促进细胞的负载与生长，提高缺损部位的修复效果，同时它也能提高生物因子在材料表面及内部的固载率；作为药物递释系统，多孔微球能促进药物的负载，发挥缓释作用，多孔结构是微球表面形貌及内部结构精确调控的技术要求之一。如何通过控制工艺过程来实现对微球孔径大小和孔隙率的调整，是微球制备技术亟待克服的主要挑战之一。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种具有三维多孔结构的微球，可用于细胞扩增及组织再生。本发明优选符合生产需求、同时具有生物相容性的高分子聚合物成分，且具有易去除的致孔剂，并通过合理的组分配比和结构调控，使聚合物多孔微球能促进细胞粘附/增殖、分化，实现细胞扩增。
本发明的另一目的在于提供上述具有三维多孔结构的微球的制备方法。具体的，利用水包油乳液、溶剂挥发和冷冻干燥原理，通过不同管道组合、尺寸选择和流速控制，使聚合物多孔微球具备单一分散性以及可控的三维多孔结构。
第一方面，本申请提供一种具有三维多孔结构的微球，由聚合物形成球形主体，所述球形主体的表面和/或内部具有若干连通的孔结构，所述孔结构由致孔剂通过冷冻干燥、结晶升华等方法形成，所述聚合物为聚左旋乳酸-己内酯共聚物(PLCL)。
可选地，所述聚左旋乳酸-己内酯共聚物中LA和CL的单体摩尔比为90：10～10：90。
通过在过程中使用易于去除的致孔剂，并通过本文所述的可控制备方法，得到的微球具有良好的机械性能和多孔联通结构，以及可调的降解周期。此微球适宜作为组织工程支架、药物释放以及可植入型细胞载体，并可成为多功能的细胞扩增与组织修复的平台。
以微球的质量百分比来计算，高分子聚合物所占质量百分比为100％。
作为优选，高分子聚合物为医药级PLCL，LA/CL摩尔比为60/40。所述微球的粒径为40～300μm，孔径为3～30μm，孔隙率为10％～90％。
第二方面，本申请还提供一种具有三维多孔结构的微球的制备方法，所述制备方法为利用水包油乳液、溶剂挥发和冷冻干燥原理，通过不同尺寸或管道组合来控制油水相流动的方法，包括如下步骤：
步骤S1：取致孔剂溶于易挥发有机溶剂中，所得为溶液A；
步骤S2：取聚合物溶于易挥发有机溶剂中，所得为溶液B；
步骤S3：将所述溶液A与所述溶液B搅拌混合，所得混合溶液作为内通道油相流体O；
步骤S4：取亲水性表面活性剂溶于去离子水中，所得溶液作为外通道水相流体W，同时再配置亲水性表面活性剂水溶液作为接收液；
步骤S5：使所述油相流体O与所述水相流体W分别通过自行组装的两相微通道，且所述油相流体O通入内通道以及所述水相W通入外通道，得到水包油型乳液；
步骤S6：将所述步骤S5获得的乳液接收于所述接收液中，水平旋转固化，接着进行洗涤、冷冻干燥，得到所述具有三维多孔结构的微球。
在一个优选方案中，可以通过调控油相流体O和水相流体W的流量，来调控聚合物多孔微球的尺寸。作为优选，所述油相流体O的流量为1mL/h～20mL/h，所述水相流体W的流量为3mL/h～60mL/h。
在一个优选方案中，可以通过两相微通道的尺寸，来调控聚合物多孔微球的尺寸。作为优选，所述内通道的直径为50μm～500μm，所述外通道的直径为300μm～800μm。
在一个优选方案中，可以通过致孔剂和高分子聚合物的浓度、体积比，来调控聚合物多孔微球的表面形貌和内部结构。作为优选，所述致孔剂为异辛烷、莰烯或甲苯，所述溶液A的浓度为3wt％～15wt％；所述易挥发有机溶剂为二氯甲烷、氯仿或四氢呋喃，所述溶液B的浓度为0.5wt％～5wt％；所述溶液A与所述溶液B的体积比为1：1～3。
作为优选，所述亲水性表面活性剂为聚丙烯酸钠(ASAP)、聚乙烯醇(PVA)或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，所述水相流体W的浓度为0.5wt％～4wt％，所述接收液的浓度为0.5wt％～4wt％。
作为优选，所述两相微通道的形状为Y型、T型、十字型、同向流动型或流动聚焦型。
作为优选，所述步骤S6中进行水平旋转固化时，转速为100～500rpm，时间为24～72h。
在步骤S6中采用水平旋转方式，使得中间油相流体O中的有机溶剂充分挥发，聚合物复合微乳液滴逐步皱缩为聚合物复合微球；其中洗涤采用采用去离子水冲洗的方式，可去除残余在聚合物复合微球表面的亲水性表面活性剂；采用冷冻干燥的方式，使得聚合物复合微球在溶液中与去离子水预冷冻形成固态，冷冻干燥除去致孔剂，即可收集得到干燥的聚合物多孔微球，制得的聚合物多孔微球大小均匀一致，显著优于现有技术的方法。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
(1)本申请优选符合生产需求、同时具有生物相容性和可生物降解性能的高分子聚合物成分，且通过在过程中使用易于去除的致孔剂，并通过合理的组分配比和结构调控，使微球具有良好的机械性能和多孔联通结构，以及可调的降解周期。
(2)与常规的微球相比，本申请根据水包油乳液、溶剂挥发和冷冻干燥原理，通过制备过程所用的微尺度管道组合、管口尺寸选择和流速控制，使多孔微球具备单一分散性、适宜的开孔结构和力学强度。
(3)本申请所制备的多孔微球具有集中的粒径分布，适宜的开孔结构和生物可降解性。通过改变高分子聚合物与致孔剂的质量配比，可实现精确调控多孔微球的形貌与结构以及力学性能和降解周期的目的。同时，适当开孔结构的微球具有良好的可注射性、载药以及负载细胞的能力。
(4)本申请提供的具有三维多孔结构的微球的制备方法，在步骤S5中利用微流体间的剪切力及表面张力，制备出的微乳液滴(O/W)粒径均一、组成一致；并采用水平旋转方式，使得中间油相中的有机溶剂充分挥发，聚合物复合微乳液滴逐步皱缩为聚合物复合微球。
(5)本申请提供的具有三维多孔结构的微球，可用于细胞扩增及组织再生。能促进细胞粘附/增殖、分化，实现细胞扩增。
附图说明
图1为本申请实施例1所采用的两相微通道示意图；
图2为本申请实施例1所制备的具有三维多孔结构的微球的尺寸分布图；
图3为本申请实施例1所制备的具有三维多孔结构的微球的扫描电镜图；
图4为本申请实施例1所制备的具有三维多孔结构的微球的共聚焦显微镜图；
图5为本申请对比例1所制备的致密微球的尺寸分布图；
图6为本申请对比例1所制备的致密微球的扫描电镜图；
图7为实施例1和对比例1微球上细胞的CCK-8测试图。
具体实施方式
结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
【实施例1】
图1为本申请实施例1所采用的两相微通道示意图。参见图1，横向为油相O的内通道，竖向为水相W的外通道。通过这样的微通道可使得水相W包裹住油相O，形成水包油型乳液。
实施例1用于制备多孔PLCL微球，具体步骤为：
将1g的莰烯溶解到10mL的二氯甲烷中，作为溶液A；将聚左旋乳酸-己内酯共聚物(PLCL)溶解于二氯甲烷中，制备2wt％的PLCL的二氯甲烷溶液，作为溶液B；将聚乙烯醇溶解于去离子水中，制备得到2wt％的聚乙烯醇溶液，作为制备多孔微球的外通道水相流体W；将聚乙烯醇溶解于80℃的水，制备得到1wt％的聚乙烯醇溶液，作为微乳液滴的接收液。
将溶液A与溶液B以体积比1：1混合，并在300rpm的转速下混合1h，获得内通道油相流体O。
将油相流体O注入图1中两相微流控装置的横向的内通道，内通道的直径设置为450μm，注射速率为10mL/h；将水相流体W注入竖向的外通道，外相通道的直径设置为780μm，注射速率为30mL/h；利用流体的剪切作用，以1wt％的聚乙烯醇溶液为接收液，获得尺寸均一含有莰烯的微乳液滴，500rpm水平旋转24h，用去离子水洗涤五次，冷冻干燥24小时后得到含有多孔结构的PLCL多孔微球。
图2为本申请实施例1所制备的具有三维多孔结构的微球的尺寸分布图。参见图2，PLCL多孔微球直径约为175μm，尺寸呈现高度的单分散性。
图3为本申请实施例1所制备的具有三维多孔结构的微球的扫描电镜图。经扫描电子显微镜观察，PLCL多孔微球表面呈现粗糙多孔结构。
图4为本申请实施例1所制备的具有三维多孔结构的微球的共聚焦显微镜图。参见图4，经共聚焦显微镜观察，载体内部也呈现多孔结构。
【对比例1】
为了与实施例1制备的PLCL多孔微球进行比较，对比例1为制备PLCL致密微球，对比例1采用与实施例1一致的两相微通道，可参见图1。具体步骤为：
将聚左旋乳酸-己内酯共聚物(PLCL)溶解于二氯甲烷中，制备2wt％的PLCL的二氯甲烷溶液，作为内通道油相流体O；将聚乙烯醇溶解于去离子水中，制备得到2wt％的聚乙烯醇溶液，作为外通道水相流体W；将聚乙烯醇溶解于80℃的水，制备得到1wt％的聚乙烯醇溶液，作为微乳液滴的接收液。
将油相流体O注入图1中两相微流控装置的横向的内通道，内通道的直径设置为400μm，注射速率为10mL/h；将水相流体W注入竖向的外通道，外相通道的直径设置为780μm，注射速率为30mL/h；利用流体的剪切作用，以1wt％的聚乙烯醇溶液为接收液，获得尺寸均一的微乳液滴，静置固化24h，用去离子水洗涤五次，冷冻干燥24小时后得到含PLCL的致密微球。
图5为本申请对比例1所制备的致密微球的尺寸分布图。参见图5，PLCL致密微球直径约为172μm，尺寸呈现高度的单分散性。图6为本申请对比例1所制备的致密微球的扫描电镜图。致密微球表面致密且光滑。
【细胞转移实验】
分别往两个24孔板的每个孔中加入5mg多孔微球(实施例1制备)和5mg致密微球(对比例1制备)以覆盖底面，微球通过浸入75％乙醇(1mL/孔)0.5h、PBS缓冲液浸泡并紫外照射12小时灭菌，然后将小鼠成肌细胞(C2C12)以2×104个细胞/孔的密度接种到微载体上，将板放入培养箱中(5％CO2，37℃)，每2天更换一次生长培养基。
当C2C12培养3天和5天后，通过Cell Counting Kit-8对细胞增殖水平进行量化，使用酶标仪在450nm处测量每个孔的吸光度(ABS)值。
图7为实施例1和对比例1微球上细胞的CCK-8测试图。参见图7可以看出，PLCL多孔微球对细胞增殖具有显著的促进作用，培养5天后，细胞的数量是培养3天的5.84倍。PLCL致密微球对细胞增殖虽然也有促进作用，培养5天后，细胞的数量仅是培养3天的3.83倍。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种具有三维多孔结构的微球，其特征在于，由聚合物形成球形主体，所述球形主体的表面和/或内部具有若干连通的孔结构，所述聚合物为聚左旋乳酸-己内酯共聚物。
2.根据权利要求1所述的具有三维多孔结构的微球，其特征在于，所述聚左旋乳酸-己内酯共聚物中LA和CL的单体摩尔比为90：10～10：90。
3.根据权利要求1所述的具有三维多孔结构的微球，其特征在于，所述微球的粒径为40～300μm，孔径为3～30μm，孔隙率为10％～90％。
4.一种如权利要求1-3中任一项所述的具有三维多孔结构的微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1：取致孔剂溶于易挥发有机溶剂中，所得为溶液A；
步骤S2：取聚合物溶于易挥发有机溶剂中，所得为溶液B；
步骤S3：将所述溶液A与所述溶液B搅拌混合，所得混合溶液作为内通道油相流体O；
步骤S4：取亲水性表面活性剂溶于去离子水中，所得溶液作为外通道水相流体W，同时再配置亲水性表面活性剂水溶液作为接收液；
步骤S5：使所述油相流体O与所述水相流体W分别通过自行组装的两相微通道，且所述油相流体O通入内通道以及所述水相W通入外通道，得到水包油型乳液；
步骤S6：将所述步骤S5获得的乳液接收于所述接收液中，水平旋转固化，接着进行洗涤、冷冻干燥，得到所述具有三维多孔结构的微球。
5.根据权利要求4所述的具有三维多孔结构的微球的制备方法，其特征在于，
所述步骤S1中，所述致孔剂为异辛烷、莰烯或甲苯，所述易挥发有机溶剂为二氯甲烷、氯仿或四氢呋喃，所述溶液A的浓度为3wt％～15wt％；
所述步骤S2中，所述聚合物为聚左旋乳酸-己内酯共聚物，所述易挥发有机溶剂为二氯甲烷、氯仿或四氢呋喃，所述溶液B的浓度为0.5wt％～5wt％；
所述步骤S3中，所述溶液A与所述溶液B的体积比为1：1～3。
6.根据权利要求4所述的具有三维多孔结构的微球的制备方法，其特征在于，所述油相流体O的流量为1mL/h～20mL/h，所述水相流体W的流量为3mL/h～60mL/h。
7.根据权利要求4所述的具有三维多孔结构的微球的制备方法，其特征在于，所述内通道的直径为50μm～500μm，所述外通道的直径为300μm～800μm。
8.根据权利要求4所述的具有三维多孔结构的微球的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中，所述亲水性表面活性剂为聚丙烯酸钠、聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮，所述水相流体W的浓度为0.5wt％～4wt％，所述接收液的浓度为0.5wt％～4wt％。
9.根据权利要求4所述的具有三维多孔结构的微球的制备方法，其特征在于，所述两相微通道的形状为Y型、T型、十字型、同向流动型或流动聚焦型。
10.根据权利要求4所述的具有三维多孔结构的微球的制备方法，其特征在于，所述步骤S6中进行水平旋转固化时，转速为100～500rpm，时间为24～72h。
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