CN115466727B - 一种用于培养腹水来源肿瘤类器官的添加剂、培养基及培养方法 - Google Patents
一种用于培养腹水来源肿瘤类器官的添加剂、培养基及培养方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于培养腹水来源肿瘤类器官的添加剂、培养基及培养方法，添加剂包括以下终浓度的组分：APX‑115，0.5‑10μM；透明质酸，0.1‑2.5mg/mL；R‑spondin，200‑800ng/mL；Noggin，5‑200ng/mL；A83‑01，300‑800nM；Y‑27632，5‑15μM；HEPES，5‑20mM等。该添加剂能抑制成纤维细胞，刺激肿瘤类器官的生长，能够有效的提高腹水来源肿瘤类器官的构建效率和成功率。此外，本发明在培养腹水来源的肿瘤类器官应用广泛，适用于多种癌种，包括肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌及结直肠癌等。
Description
技术领域
本发明涉及类器官培养技术领域，具体涉及一种用于培养腹水来源肿瘤类器官的添加剂、培养基及培养方法。
背景技术
恶性腹水是指发生在全身或腹腔的恶性肿瘤或癌性病变引起腹腔脏壁层腹膜发生弥漫性病变而导致体腔液体异常增多的现象。恶性腹水是肺癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌及卵巢癌等癌症病患因肿瘤腹腔转移而出现的常见临床病征。
肿瘤类器官又称为“癌症替身”、“类肿瘤”等，主要是利用患者的肿瘤组织进行体外的三维培养用于模拟体内肿瘤组织的生物学特征。肿瘤类器官能在较高程度上模拟肿瘤细胞生长的微环境，保存了肿瘤细胞的异质性、组织特异性及基因突变信息，可以在体外模拟癌症的发生、发展过程，用于肿瘤发病机制研究及肿瘤药物研发。目前，对于从恶性腹水中培养肿瘤类器官的报道较少，并且参照以往肿瘤类器官培养条件，腹水来源的肿瘤类器官生长速度缓慢，产量较低。因此，研究用于培养腹水来源肿瘤类器官的培养基添加剂、培养基及培养方法具有重要意义。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种用于培养腹水来源肿瘤类器官的添加剂、培养基及培养方法，以解决现有腹水来源的肿瘤类器官生长速度缓慢，产量较低的问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种用于培养腹水来源肿瘤类器官的添加剂，包括以下终浓度的组分：APX-115，0.5-10μM；透明质酸，0.1-2.5mg/mL；R-spondin，200-800ng/mL；Noggin，5-200ng/mL；A83-01，300-800nM；Y-27632，5-15μM；HEPES，5-20mM；Penicillin-Streptomycin Solution，1X。
进一步地，添加剂包括以下终浓度的组分：APX-115，5μM；透明质酸，0.5mg/mL；R-spondin，500ng/mL；Noggin，150ng/mL；A83-01，500nM；Y-27632，10μM；HEPES，10mM；Penicillin-Streptomycin Solution，1X。
一种用于培养腹水来源肿瘤类器官的培养基，包括基础培养基和上述添加剂；添加剂重量占基础培养基重量的8-15％；优选10％。
进一步地，基础培养基为DMEM/F12(1:1)。
采用上述培养基培养腹水来源肿瘤类器官的方法，包括以下步骤：
(1)将恶性腹水离心，重悬清洗；
(2)清洗完成后，收集沉淀，向沉淀中加入红细胞裂解液进行裂解，待裂解完成后，终止裂解反应并去除上清；
(3)对步骤(2)所得物进行重悬，将细胞悬液与Matrigel混合，凝固后，加入上述含有添加剂的培养基对其覆盖，然后培养，制得腹水来源的肿瘤类器官。
进一步，步骤(1)中将恶性腹水在400-600xg条件下离心2-5min，优选在500xg条件下离心3min。
进一步地，步骤(1)中采用DPBS进行重悬清洗2-5次。
进一步地，步骤(2)中加入DPBS终止裂解反应。
进一步地，步骤(3)中于37℃，5％CO2浓度下培养。
进一步地，肿瘤类器官包括肺癌类器官、乳腺癌类器官、胰腺癌类器官、胃癌类器官、结直肠癌类器官。
本发明具有以下有益效果：
恶性腹水中含有大量的成纤维细胞和肿瘤细胞，在构建肿瘤细胞类器官的过程中，成纤维细胞和肿瘤细胞同时混杂生长，并且成纤维细胞通常比肿瘤细胞生长的更快，并且能抑制肿瘤细胞的生长，进而培养的肿瘤细胞类器官生长速度较慢，产量较低。
现有技术通常借助胶原酶或胰蛋白酶对成纤维细胞进行消化，但这往往会影响肿瘤细胞的增殖，并且容易使其分化成其他细胞形态。另外，通过细胞自然沉降的方式来去除成纤维细胞，往往造成肿瘤细胞的损失，影响类器官的产率和构建效率。
本发明提出一种用于培养腹水来源肿瘤类器官的添加剂，该添加剂适配于各类肿瘤类器官培养基。NADPH氧化酶(NOX)是细胞内一种具有氧化活性的蛋白，受到刺激后会迅速磷酸化，与细胞膜上GP91等形成酶复合体，并将NADPH两个电子传递给氧分子形成超氧化物。在肿瘤中NOX是高表达的，NOX的表达水平与肿瘤的表型变化以及肿瘤的迁徙有关。APX-115作为一种NOX抑制剂，可在NOX过表达的细胞中抑制过氧化氢的产生，从而在调节肿瘤微环境中起着比较重要的作用。另外，透明质酸钠具有良好的生物相容性和抑制成纤维细胞作用，且水溶性强，有助于腹水来源肿瘤类器官的建立。本发明提供的添加剂中各组分之间相互协调作用，能有效抑制成纤维细胞，刺激肿瘤类器官的生长，提高肿瘤细胞占比，进而有效的提高腹水来源肿瘤类器官的构建效率和成功率。此外，本发明在培养腹水来源的肿瘤类器官应用广泛，适用于多种癌种，包括肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌及结直肠癌等。
附图说明
图1为本发明实施例1中腹水来源构建的肺癌类器官形态图。
图2为本发明实施例2中腹水来源构建的肺癌类器官形态图。
图3为本发明实施例3中腹水来源构建的肺癌类器官形态图。
图4为本发明实施例4中腹水来源构建的乳腺癌类器官形态图。
图5为本发明实施例5中腹水来源构建的胰腺癌类器官形态图。
图6为本发明对比例1中腹水来源构建的肺癌类器官形态图。
图7为本发明对比例2中腹水来源构建的肺癌类器官形态图。
图8为本发明对比例3中腹水来源构建的肺癌类器官形态图。
图9为本发明对比例4中腹水来源构建的肺癌类器官形态图。
图10为本发明对比例5中腹水来源构建的肺癌类器官形态图。
图11为实施例1和对比例1-5中制得的类器官数量比较。
具体实施方式
以下所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：
一种用于培养腹水来源肿瘤类器官的添加剂，包括以下终浓度的组分：APX-115，5μM；透明质酸，0.5mg/mL；R-spondin，500ng/mL；Noggin，150ng/mL；A83-01，500nM；Y-27632，10μM；HEPES，10mM；Penicillin-Streptomycin Solution，1X。
将上述添加剂以10％(体积百分数)的比例加入到基础培养基DMEM/F12(1:1)中，用于培养腹水来源的肺癌类器官，具体过程如下：
(1)将收集得到的肺癌恶性腹水在500xg条件下离心3min，并使用DPBS进行重悬清洗3次；
(2)清洗完成后，向收集得到的细胞沉淀中加入红细胞裂解液，置于冰上裂解10min，去除红细胞，待裂解完成后加入DPBS终止并去除上清；
(3)将步骤(2)收集得到的细胞使用培养基重悬并进行细胞计数，细胞数量为2×105个/mL，然后将细胞悬液与Matrigel按体积比为1:2混合后进行滴胶接种，每个胶滴50μL，约含2000个细胞。待Matrigel胶凝固后，加入上述含添加剂的培养基500μL，覆盖Matrigel胶，于37℃，5％CO2条件下培养7天，制得腹水来源的肺癌类器官。
将上述添加剂加入到基础培养基中用以培养腹水来源的肺癌类器官，其形态结果见图1。由图1可知，培养得到的腹水来源的肺癌类器官中成纤维细胞较少，肺癌类器官数量较多，活性较好。
实施例2：
一种用于培养腹水来源肿瘤类器官的添加剂，包括以下终浓度的组分：APX-115，1μM；透明质酸，0.2mg/mL；R-spondin，200ng/mL；Noggin，50ng/mL；A83-01，350nM；Y-27632，5μM；HEPES，5mM；Penicillin-Streptomycin Solution，1X。
将上述添加剂以10％(体积百分数)的比例加入到基础培养基DMEM/F12(1:1)中，用于培养腹水来源的肺癌类器官，具体过程如下：
(1)将收集得到的肺癌恶性腹水在500xg条件下离心3min，并使用DPBS进行重悬清洗3次；
(2)清洗完成后，向收集得到的细胞沉淀中加入红细胞裂解液，置于冰上裂解10min，去除红细胞，待裂解完成后加入DPBS终止并去除上清；
(3)将步骤(2)收集得到的细胞使用培养基重悬并进行细胞计数，细胞数量为2×105个/mL，然后将细胞悬液与Matrigel按体积比为1:2混合后进行滴胶接种，每个胶滴50μL，约含2000个细胞。待Matrigel胶凝固后，加入上述含添加剂的培养基500μL，覆盖Matrigel胶，于37℃，5％CO2条件下培养7天，制得腹水来源的肺癌类器官。
将上述添加剂加入到基础培养基中用以培养腹水来源的肺癌类器官，其形态结果见图2。由图2可知，由于添加剂中组分浓度较低，仍可见少量的成纤维细胞发生贴壁，但肺癌类器官长势良好。
实施例3：
一种用于培养腹水来源肿瘤类器官的添加剂，包括以下终浓度的组分：APX-115，10μM；透明质酸，1.0mg/mL；R-spondin，800ng/mL；Noggin，200ng/mL；A83-01，800nM；Y-27632，15μM；HEPES，20mM；Penicillin-Streptomycin Solution，1X。
将上述添加剂以10％(体积百分数)的比例加入到基础培养基DMEM/F12(1:1)中，用于培养腹水来源的肺癌类器官，具体过程如下：
(1)将收集得到的肺癌恶性腹水在500xg条件下离心3min，并使用DPBS进行重悬清洗3次；
(2)清洗完成后，向收集得到的细胞沉淀中加入红细胞裂解液，置于冰上裂解10min，去除红细胞，待裂解完成后加入DPBS终止并去除上清；
(3)将步骤(2)收集得到的细胞使用培养基重悬并进行细胞计数，细胞数量为2×105个/mL，然后将细胞悬液与Matrigel按体积比为1:2混合后进行滴胶接种，每个胶滴50μL，约含2000个细胞。待Matrigel胶凝固后，加入上述含添加剂的培养基500μL，覆盖Matrigel胶，于37℃，5％CO2条件下培养7天，制得腹水来源的肺癌类器官。
将上述添加剂加入到基础培养基中用以培养腹水来源的肺癌类器官，其形态结果见图3。由图3可知，视野中无明显的细胞贴壁，背景干净，类器官数量较多，体积较大。
实施例4：
采用实施例1中的添加剂及培养方法培养乳腺癌恶性腹水用以制备腹水来源的乳腺癌类器官，其形态结果见图4。由图4可知，所培养的乳腺癌类器官数量较多，未见明显的成纤维贴壁细胞。
实施例5：
采用实施例1中的添加剂及培养方法培养胰腺癌恶性腹水用以制备腹水来源的胰腺癌类器官，其形态结果见图5。由图5可知，贴壁的成纤维细胞较少，所培养的类器官活性较好。
对比例1：
对比例1与实施例1不同之处在于：未加入添加剂，其余均相同。采用该方法培养的腹水来源的肺癌类器官，其形态结果见图6。由图6可知，观察到成纤维细胞贴壁现象，严重影响了肺癌类器官的生长，所培养的肺癌类器官数量较少，活力较差。
对比例2：
对比例2与实施例1不同之处在于：所加入的添加剂中缺少APX-115，其余均相同。采用该方法培养的腹水来源的肺癌类器官，其形态结果见图7。由图7可知，当缺少APX-115，对成纤维细胞的抑制作用下降，视野中观察到仍有大部分的成纤维细胞发生贴壁现象，对肺癌类器官的生长产生干扰。
对比例3：
对比例3与实施例1不同之处在于：将添加剂中的APX-115替换为Fulvene 5，其余均相同。采用该方法培养的腹水来源的肺癌类器官，其形态结果见图8。由图8可知，加入Fulvene 5对成纤维细胞的抑制作用相较于APX-115的效果要差，视野下仍观察到有部分的成纤维细胞发生贴壁现象。
对比例4：
对比例4与实施例1不同之处在于：所加入的添加剂中缺少透明质酸，其余均相同。采用该方法培养的腹水来源的肺癌类器官，其形态结果见图9。由图9可知，视野中发生成纤维细胞贴壁现象，类器官数量较少。
对比例5：
对比例5与实施例1不同之处在于：将添加剂中的透明质酸替换为几丁糖，其余均相同。采用该方法培养的腹水来源的肺癌类器官，其形态结果见图10。由图10可知，视野中仍有成纤维细胞贴壁，这说明APX-115与透明质酸的组合能有效抑制成纤维细胞的生长，提高腹水来源肿瘤类器官的构建，而将透明质酸替换为几丁糖后，对成纤维细胞的抑制作用降低。
实施例1和对比例1-5中制得的类器官数量，每个胶滴50μL，约含2000个细胞，统计每个胶滴所有类器官数量，具体见图11，类器官活率和细胞数量见表1。
表1实施例1和对比例制得的类器官活率结果
由实施例和对比例所得到的肿瘤类器官形态图和细胞活率可知，当添加剂中组分含量偏低时，会影响对成纤维细胞的抑制作用；当添加剂中缺少APX-115时，对成纤维细胞的抑制作用明显下降，对肿瘤类器官的生长产生很大干扰，细胞活率也明显变低；当将APX-115替换为同为NOX抑制剂Fulvene 5时，对成纤维细胞的抑制作用明显变差，细胞活率也降低；而当添加剂中缺少透明质酸时，也影响对成纤维细胞的抑制作用，当细胞活率也明显降低，当将透明质酸替换为几丁糖后，抑制作用也降低，细胞活率降低，此外还说明添加剂各组分之间是相互协同配合才能有效抑制成纤维细胞的生长，提高腹水来源肿瘤类器官的构建效率和成功率，尤其是APX-115和透明质酸的协同作用更为明显。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种用于培养腹水来源肿瘤类器官的组合物，其特征在于，由以下终浓度的组分组成：APX-115，0.5-10 μM；透明质酸，0.1-2.5 mg/mL；R-spondin，200-800 ng/mL；Noggin，5-200 ng/mL；A83-01，300-800 nM；Y-27632，5-15 μM；HEPES，5-20 mM；Penicillin-Streptomycin Solution，1X；所述肿瘤类器官为肺癌类器官。
2.根据权利要求1所述的用于培养腹水来源肿瘤类器官的组合物，其特征在于，由以下终浓度的组分组成：APX-115，5 μM；透明质酸，0.5 mg/mL；R-spondin，500 ng/mL；Noggin，150 ng/mL；A83-01，500 nM；Y-27632，10 μM；HEPES，10 mM；Penicillin-StreptomycinSolution，1X。
3.一种用于培养腹水来源肿瘤类器官的培养基，其特征在于，培养基为基础培养基和权利要求1或2所述的组合物；所述肿瘤类器官为肺癌类器官。
4.根据权利要求3所述的用于培养腹水来源肿瘤类器官的培养基，其特征在于，组合物体积占基础培养基体积的8-15%。
5.根据权利要求4所述的用于培养腹水来源肿瘤类器官的培养基，其特征在于，组合物体积占基础培养基体积的10%。
6.一种腹水来源肿瘤类器官的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将恶性腹水离心，重悬清洗；
（2）清洗完成后，收集沉淀，向沉淀中加入红细胞裂解液进行裂解，待裂解完成后，终止裂解反应并去除上清；
（3）对步骤（2）所得物进行重悬，将细胞悬液与Matrigel混合，凝固后，加入权利要求3-5任一项所述的培养基进行培养，制得腹水来源的肿瘤类器官；所述肿瘤类器官为肺癌类器官。
7.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，步骤（1）中将恶性腹水在400-600xg条件下离心2-5min，然后采用DPBS进行重悬清洗。
8.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，步骤（2）中加入DPBS终止裂解反应。
9.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，步骤（3）中于37℃，5%CO2浓度下培养。
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