CN115466683A - 一种低内毒素酵母浸出物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种低内毒素酵母浸出物及其制备方法和应用。以干基重量百分比计，所述低内毒素酵母浸出物中总氮含量10‑13％，氨基酸态氮的含量4‑6％，内毒素含量≤20EU/g。本发明制得低内毒素酵母浸出物应用于细胞培养，不会给细胞带来毒性，有利于目标产物的纯化及质量控制，可以代替血清，有效提高细胞增殖速率。
Description
技术领域
本发明涉及生物制品技术领域，具体涉及一种低内毒素酵母浸出物及其制备方法和应用。
背景技术
酵母浸出物(yeast extract)，是采用新鲜酵母为原料，利用现代生物技术手段或通过改变介质环境来诱导酵母自身体内多种酶系，外加(不加)某些外源酶类在适宜的条件下促使胞内蛋白质、核酸类物质进行降解，再经过一些精制工序得到的粉状、膏状或液体状的产品。富含蛋白质、氨基酸类、肽类、核苷酸、B族维生素、微量元素，主要作用是补充氮源和提供微生物生长的各种维生素及氨基酸及生长因子，广泛用于发酵培养基行业，是一种促生长能力强的培养基原料。
内毒素(endotoxin)是革兰氏阴性菌细胞膜中的一种成分，主要成分是脂多糖也称LPS，其主要毒性成分为类脂A。革兰氏阴性菌细胞壁外膜全部由内毒素分子组成，一个大肠杆菌细胞约含有200万个LPS分子构成。细菌在活跃或者大量死亡时将内毒素分泌到周围环境中。内毒素引起的毒性反应主要包括发热、微循环障碍、播散性血管内凝血等症状，严重时会引发内毒素休克。
酵母浸出物中的内毒素通常是由于革兰氏阴性菌因高温等因素死亡而释放至产品中的。酵母浸出物常常作为添加物应用于动物细胞的培养，动物细胞培养基除需满足细胞生长需要外，也要求培养基各类原料内毒素含量必须控制在规定范围内。
内毒素热稳定性和化学稳定性好，目前去除内毒素的方法主要包括基于强酸、碱、氧化剂的化学破坏法，基于高温的干热法，以及基于各各种分离设备的离子交换法、分子筛法等，目前各类方法对设备要求高，成本高，当前未见有酵母浸出物生产过程中去除或降低内毒素的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题：现有技术中酵母浸出物中内毒素含量较高，不利于细胞生长，同时也不利于下游产品纯化，带来安全风险。
针对现有技术存在的不足，本发明的目的之一提供一种低内毒素酵母浸出物，本发明的目的之二是提供上述低内毒素酵母浸出物的制备方法，本发明的目的之三是提供上述低内毒素酵母浸出物在生物医药和细胞培养中的应用。
本发明的技术方案：
本发明提供一种低内毒素酵母浸出物，以干基重量百分比计，所述低内毒酵母浸出物中总氮含量10-13％，氨基酸态氮的含量≥5％，内毒素含量≤20EU/g。
优选的是，上述低内毒素酵母浸出物中内毒素含量≤10EU/g。
优选的是，重量百分比浓度为2-5％的上述低内毒素酵母浸出物水溶液pH为4.5-7.0。
优选的是，上述低内毒素酵母浸出物为液状或粉状。
本发明还提供上述低内毒素酵母浸出物的制备方法，包括如下步骤：
(1)自溶酶解：将酵母浆在40-60℃，pH 4.5-6.0条件下，自溶，然后加入蛋白酶，酶解；
(2)分离纯化：将上述自溶酶解液依次经离心分离，膜分离和蒸发工艺得到液状低内毒素酵母浸出物，其中，所述膜分离为微滤、超滤或纳滤中的一种或两种以上，所述微滤膜的孔径为0.1-0.2μm，所述超滤膜的孔径为10-90nm，所述纳滤膜的孔径为0.1-1nm。
优选的是，上述制备方法中，酵母浆的制备方法如下：
A.用酵母制备酵母种子液；
B.配制培养基，调节培养基pH＝4.5-5.0，加入酵母种子液，在30-35℃发酵得到酵母发酵液；
C.用水洗涤酵母发酵液，离心分离得到酵母乳；
D.将酵母乳加水调配成干物质重量含量为10-15％的浆料。
优选的是，步骤A中所述酵母为酿酒酵母、毕赤酵母或假丝酵母中的一种。
优选的是，上述低内毒素酵母浸出物制备方法中，以酵母浆干物质重量计，所述蛋白酶的添加量为0.02-0.08％。
优选的是，上述低内毒素酵母浸出物制备方法中，步骤(2)所述离心分离转速为4000-8000rpm，时间为10-30min。通过离心分离，将自溶酶解产物中的不溶部分与可溶部分分离开，收集上清液用于后续分离操作。
优选的是，上述低内毒素酵母浸出物制备方法中，步骤(1)中，所述自溶过程进行6-10h，并且优选酶解进行10-14h。
优选的是，上述低内毒素酵母浸出物制备方法中，制备过程所用工艺水均为超纯水或注射用水。
具体来说，制备过程所用工艺水包括酵母浆制备过程中培养基配制所用水、酵母发酵液洗涤用水、调制酵母浆浓度用水和离心分离洗涤用水。
优选的是，上述低内毒素酵母浸出物制备方法中，步骤(2)所述蒸发工艺为多效蒸发工艺，优选的，所述蒸发工艺得到的浓缩液重量百分比浓度为20-60％，进一步优选的，蒸发温度为65-80℃。
优选的是，上述制备方法，还包括干燥过程，得到粉状低内毒素酵母浸出物。
优选的是，所述干燥为喷雾干燥，优选地，干燥进风温度为200-300℃，出风温度为100-150℃。
本发明还提供上述低内毒素酵母浸出物或上述低内毒素酵母浸出物制备方法制得的低内毒素酵母浸出物在生物医药和细胞培养中的应用。
本发明的有益效果：
本发明采用酵母自溶酶解和分离纯化得到一种低内毒素酵母浸出物，其内毒素含量不高于20EU/g，采用高温干燥，可以进一步提升产品质量，控制最终产品中内毒素含量≤10EU/g。本发明制得低内毒素酵母浸出物应用于细胞培养，不会给细胞带来毒性，有利于目标产物的纯化及质量控制，可以代替血清，有效提高细胞增殖速率。
具体实施方式
本发明的目的之一在于提供一种低内毒素酵母浸出物。
具体而言，一种低内毒素酵母浸出物，以干基重量百分比计，所述低内毒酵母浸出物中总氮含量10-13％，氨基酸态氮的含量≥5％，内毒素含量≤20EU/g。
优选的是，上述低内毒素酵母浸出物中内毒素含量≤10EU/g。
优选的是，重量百分比浓度为2-5％的上述低内毒素酵母浸出物水溶液pH为4.5-7.0。
优选的是，上述低内毒素酵母浸出物为液状或粉状。
本发明的目的之二是提供上述低内毒素酵母浸出物的制备方法，包括如下步骤：
(1)自溶酶解：将酵母浆在40-60℃，pH 4.5-6.0条件下，自溶，然后加入蛋白酶，酶解；
(2)分离纯化：将上述自溶酶解液依次经离心分离，蒸发工艺和膜分离得到液状低内毒素酵母浸出物，其中，所述膜分离为微滤、超滤或纳滤中的一种或两种以上，所述微滤膜的孔径为0.1-0.2μm，所述超滤膜的孔径为10-90nm，所述纳滤膜的孔径为0.1-1nm。采用膜对分子的截留作用，可以去除酵母浸出物中的内毒素。
优选的是，上述制备方法中，酵母浆的制备方法如下：
A.用酵母制备酵母种子液；
B.配制培养基，调节培养基pH＝4.5-5.0，加入酵母种子液，在30-35℃发酵得到酵母发酵液；
C.用水洗涤酵母发酵液，离心分离得到酵母乳；
D.将酵母乳加水调配成干物质重量含量为10-15％的浆料。
优选的是，步骤A中所述酵母为酿酒酵母、毕赤酵母或假丝酵母中的一种。
优选的是，上述低内毒素酵母浸出物制备方法中，以酵母浆干物质重量计，所述蛋白酶的添加量为0.02-0.08％。
优选的是，上述低内毒素酵母浸出物制备方法中，步骤(2)所述离心分离转速为4000-8000rpm，时间为10-30min。通过离心分离，将自溶酶解产物中的不溶部分与可溶部分分离开，收集上清液用于后续分离操作。
优选的是，上述低内毒素酵母浸出物制备方法中，步骤(1)中，所述自溶过程进行6-10h，并且优选酶解进行10-14h。
优选的是，上述低内毒素酵母浸出物制备方法中，制备过程所用工艺水均为超纯水或注射用水。由于超纯水或注射用水中内毒素含量很低，减少了工艺用水对内毒素含量的影响，进一步保证最终产品中内毒素含量≤20EU/g。
具体来说，制备过程所用工艺水包括酵母浆制备过程中培养基配制所用水、酵母发酵液洗涤用水、调制酵母浆浓度用水和离心分离洗涤用水。
优选的是，上述低内毒素酵母浸出物制备方法中，步骤(2)所述蒸发工艺为多效蒸发工艺，优选的，所述蒸发工艺得到的浓缩液浓度为20-60％，进一步优选的，蒸发温度为65-80℃。一方面，经过蒸发浓缩后，物料浓度提升，可以有效降低微生物繁殖速率，从而减少内毒素的产生；另一方面，在酵母浸出物生产过程中，每个工艺环节均有微生物污染风险，由于膜分离可以除去产品中的内毒素，将膜分离放在蒸发工艺后，可以减少膜分离之前操作中因微生物污染对最终产品内毒素含量的影响，也有利于降低最终产品中内毒素的含量。
优选的是，上述制备方法，还包括干燥过程，得到粉状低内毒素酵母浸出物。
优选的是，所述干燥为喷雾干燥，优选地，干燥进风温度为200-300℃，出风温度为100-150℃。酵母浸出物营养很丰富，很容易滋生微生物，在制备浸出物过程中，由于生产波动可能导致最终产品内毒素含量的波动，如果干燥进风温度为200-300℃，出风温度为100-150℃，可以进一步提升产品质量，控制最终产品中内毒素含量≤10EU/g。
本发明的目的之三是提供上述低内毒素酵母浸出物或上述低内毒素酵母浸出物制备方法制得的低内毒素酵母浸出物在生物医药和细胞培养中的应用。
菌种保藏信息：
本发明所采用酿酒酵母FX-2(Saccharomyces cerevisiae FX-2)于2016年8月1日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2016418。该菌株在公开号为CN108220175A的专利公开文本中已有记载。
本发明所采用假丝酵母C1.7(Wickerhamomyces anomalus C1.7)于2017年12月11日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2017782。该菌株在公开号为CN110959853A的专利公开文本中已有记载。
本发明所采用毕赤酵母C1.8(Cyberlindnerafabianii C1.8)于2017年12月11日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2017780。该菌株在公开号为CN110959853A的专利公开文本中已有记载。
经过检测，通过本发明所述制备方法制备得到的内毒素酵母浸出物的理化指标如表1所述：
表1 内毒素酵母浸出物理化指标
本发明经过了严格的前期试验，证明该方法切实可行。
由此可知，本方明所述制备方法可有效降低酵母浸出物中内毒素水平，制得的低内毒素酵母浸出物产品中内毒素含量≤20EU/g，可应用于细胞培养，代替血清，提高细胞培养领域的生产效率。
下面将通过具体的实施例、实验例对本发明进行具体说明。
下述实施例和对比例中酵母浸出物各项指标检测方法如下：
(1)水分的测定
采用国家标准GB/T 23530-2009中6.2的方法，取一定质量的样品，在103℃下烘干4小时至恒重，称重计算水分的含量。
(2)总氮的测定
采用国家标准GB/T 23530-2009中6.4的凯式定氮法：取样品(相当于总氮30-440mg)，在混合催化剂a(硫酸钾与污水硫酸铜按97:3比例混合)5g和催化剂b(硒粉与硫酸钾按0.1:100比例混合)2.5g作用下，加入20mL浓硫酸进行消煮；再进行蒸馏，用硼酸吸收产物氨；再用0.1mol/L的盐酸滴定，读取数据，计算总氮含量。
(3)氨基酸态氮的测定
采用国家标准GB/T 23530-2009中6.5所述的氨基酸态氮的检测方法：取5g样品，稀释后用0.5mol/L的氢氧化钠溶液滴定至pH为8.2，并保持1min。缓慢加入36％的甲醛溶液10mL，与中性氨基酸中的非解离型氨基反应，生成单羟甲基和二羟甲基诱导体，此反应完全定量进行。此时放出的氢离子用上述氢氧化钠滴定，根据碱液的消耗量，计算出氨基酸态氮的含量。
(4)pH的测定
采用国家标准GB/T 35536-2017中7.2.1所述的pH的检测方法：配置一定重量百分比浓度水溶液，采用玻璃电极测定灭菌后的pH值。同一样品两次测定值之差应不应超过0.04。
(5)内毒素的测定
称取0.01～0.05g左右的样品至去热源的试管中，加入适量的细菌内毒素检查用水溶解，使浓度刚好配制成10mg/ml。再分别用细菌内毒素检查用水稀释成所需要检测的倍数，最大稀释倍数不可超过20倍。用pH试纸检测酸碱性，如偏酸性，可用0.1N的氢氧化钠调节。推荐每次用移液器吸取5μl添加，少量多次，以免调节偏离。此处添加的试剂量可忽略不计。取无热源试管，分别加入100μl细菌内毒素检查用水、内毒素标准溶液、稀释好的样液，快速加入100μl鲎试剂溶液；轻轻摇晃试管架，混匀，用去热源的锡箔纸整张盖住所有试管，于37℃水浴锅温育T1分钟；温育结束后，快速加入100μl显色基质溶液；轻轻摇晃试管架，混匀，用去热源的锡箔纸整张盖住所有试管，于37℃水浴锅温育T2分钟；温育结束后，加入500μl偶氮化试剂1溶液，轻缓混匀；加入500μl偶氮化试剂2溶液，轻缓混匀；加入500μl偶氮化试剂3溶液，轻缓混匀，静置5分钟，于545nm波长处读取吸光度值。
注：T1和T2的时间见该批鲎试剂的出厂检验报告。
本发明实施例、对比例和实验例使用原料和设备来源见表2。
表2 本发明实施例和对比例使用原料和设备来源
实施例1
低内毒素酵母浸出物的制备方法，步骤如下：
1.酵母浆的制备
取5g酿酒酵母，加入50mL2wt％的葡萄糖溶液，在28℃活化30min，得到酿酒酵母种子液。然后发酵罐中加入5kg糖蜜、0.5kg酵母浸粉、2kg硫酸铵、0.5kg硫酸镁、0.3kg磷酸二氢钾、0.1kg硫酸锌为和91.6kg超纯水，搅拌溶解，调节pH为4.5，配成培养基，然后向发酵罐中加入1500ml酿酒酵母种子液，30℃发酵18h得到酵母发酵液。然后用去离子水洗涤酵母发酵液，离心分离，重复2次，得到酵母乳。向酵母乳中加入去离子水配成酵母干物质重量含量为15％的酵母浆。
2.自溶酶解
调节步骤1中制得酵母浆的pH为5.0，升温至40℃，自溶10h，然后加入0.02％(以酵母浆干物质重量计)的蛋白酶，酶解14h得到酶解液。
3.分离纯化
(1)离心分离：将步骤2中得到的酶解液在8000rpm条件离心10min，收集上清液，并用超纯水洗涤沉淀，然后再次在8000rpm条件下离心10min，收集上清液，并将两次得到的上清液混合。
(2)蒸发浓缩：采用多效蒸发工艺将步骤(1)得到的上清液浓缩至干物质重量百分比浓度为20％，蒸发温度为65℃。
(3)微滤膜分离：将步骤(2)得到浓缩液采用孔径为0.2μm的微滤膜进行过滤，得到滤液，其中：微滤时流量4-5L/h，运行温度50-65℃。
(4)干燥：将步骤(3)得到的滤液在喷雾干燥机中干燥，进风温度200℃，出风温度100℃，得到水分含量小于6％的粉状低内毒素酵母浸出物。
实施例2
低内毒素酵母浸出物的制备方法，步骤如下：
1.酵母浆的制备
采用毕赤酵母替代酿酒酵母，其它和实施例1中相同。
2.自溶酶解
调节步骤1中制得酵母浆的pH为5.5，升温至50℃，自溶8h，然后加入0.04％(以酵母浆干物质重量计)的蛋白酶，酶解12h得到酶解液。
2.分离纯化
(1)离心分离：将步骤2中得到的酶解液在6000rpm条件离心20min，收集上清液，并用注射用水洗涤沉淀，然后再次在6000rpm条件下离心20min，收集上清液，并将两次得到的上清液混合。
(2)蒸发浓缩：采用多效蒸发工艺将步骤(1)得到的上清液浓缩至干物质重量百分比浓度为30％，蒸发温度为75℃。
(3)微滤膜分离：将步骤(1)得到浓缩液采用孔径为0.1μm的微滤膜进行过滤微，得到滤液，微滤时流量4-5L/h，运行温度50-65℃。
(4)干燥：将步骤(3)得到的滤液在喷雾干燥机中干燥，进风温度300℃，出风温度150℃，得到水分含量小于6％的粉状低内毒素酵母浸出物。
实施例3
低内毒素酵母浸出物的制备方法，步骤如下：
1.酵母浆的制备
采用假丝酵母替代酿酒酵母，其它和实施例1中相同。
2.自溶酶解
调节步骤1中制得酵母浆的pH为6.0，升温至60℃，自溶6h，然后加入0.08％(以酵母浆干物质重量计)的蛋白酶，酶解10h得到酶解液。
3.分离纯化
(1)离心分离：将步骤2中得到的酶解液在4000rpm条件离心30min，收集上清液，并用超纯水洗涤沉淀，然后再次在4000rpm条件下离心30min，收集上清液，并将两次得到的上清液混合。
(2)蒸发浓缩：采用多效蒸发工艺将步骤(1)得到的上清液浓缩至干物质重量百分比浓度为40％，蒸发温度为80℃。
(3)膜分离：将步骤(2)得到浓缩液依次采用孔径为0.2μm的微滤膜和孔径为90nm的超滤膜进行过滤，得到滤液，其中，微滤时流量4-5L/h，运行温度50-65℃；超滤时流量4-5L/h，运行温度50-65℃。
(4)干燥：将步骤(3)得到的滤液在喷雾干燥机中干燥，进风温度250℃，出风温度125℃，得到水分含量小于6％的粉状低内毒素酵母浸出物。
实施例4
低内毒素酵母浸出物的制备方法，步骤如下：
1.酵母浆的制备
和实施例1中相同。
2.自溶酶解
调节步骤1中制得酵母浆的pH为6.0，升温至40℃，自溶6h，然后加入0.05％(以酵母浆干物质重量计)的蛋白酶，酶解10h得到酶解液。
3.分离纯化
(1)离心分离：将步骤2中得到的酶解液在5000rpm条件离心30min，收集上清液，并用注射用水洗涤沉淀，然后再次在5000rpm条件下离心30min，收集上清液，并将两次得到的上清液混合。
(2)蒸发浓缩：采用多效蒸发工艺将步骤(1)得到的上清液浓缩至干物质重量百分比浓度为50％，蒸发温度为65℃。
(3)超滤膜分离：将步骤(2)得到浓缩液采用孔径为10nm的超滤膜进行过滤，得到滤液，超滤时流量4-5L/h，运行温度50-65℃。
(4)干燥：将步骤(3)得到的滤液在喷雾干燥机中干燥，进风温度250℃，出风温度125℃，得到水分含量小于6％的粉状低内毒素酵母浸出物。
实施例5
低内毒素酵母浸出物的制备方法，步骤如下：
1.酵母浆的制备
和实施例1中相同。
2.自溶酶解
调节步骤1中制得酵母浆的pH为6.0，升温至40℃，自溶6h，然后加入0.05％(以酵母浆干物质重量计)的蛋白酶，酶解10h得到酶解液。
3.分离纯化
(1)离心分离：将步骤2中得到的酶解液在5000rpm条件离心30min，收集上清液，并用注射用水洗涤沉淀，然后再次在5000rpm条件下离心30min，收集上清液，并将两次得到的上清液混合。
(2)蒸发浓缩：采用多效蒸发工艺将步骤(1)得到的上清液浓缩至干物质重量百分比浓度为50％，蒸发温度为65℃。
(3)超滤膜分离：将步骤(2)得到浓缩液采用孔径为10nm的超滤膜进行过滤，得到滤液，超滤时流量4-5L/h，运行温度50-65℃。
实施例6
低内毒素酵母浸出物的制备方法，步骤如下：
1.酵母浆的制备
和实施例1中相同。
2.自溶酶解
调节步骤1中制得酵母浆的pH为6.0，升温至40℃，自溶6h，然后加入0.05％(以酵母浆干物质重量计)的蛋白酶，酶解10h得到酶解液。
3.分离纯化
(1)离心分离：将步骤2中得到的酶解液在5000rpm条件离心30min，收集上清液，并用超纯水洗涤沉淀，然后再次在5000rpm条件下离心30min，收集上清液，并将两次得到的上清液混合。
(2)蒸发浓缩：采用多效蒸发工艺将步骤(1)得到的上清液浓缩至干物质重量百分比浓度为50％，蒸发温度为65℃。
(3)膜分离：将步骤(2)得到浓缩液采用孔径为1nm的纳滤膜进行过滤，得到滤液，其中，纳滤时流量4-5L/h，运行温度50-65℃。
(4)干燥：将步骤(3)得到的滤液在喷雾干燥机中干燥，进风温度250℃，出风温度125℃，得到水分含量小于6％的粉状低内毒素酵母浸出物。
实施例7
低内毒素酵母浸出物的制备方法，步骤如下：
1.酵母浆的制备
和实施例1中相同。
2.自溶酶解
调节步骤1中制得酵母浆的pH为6.0，升温至40℃，自溶6h，然后加入0.05％(以酵母浆干物质重量计)的蛋白酶，酶解10h得到酶解液。
3.分离纯化
(1)离心分离：将步骤2中得到的酶解液在5000rpm条件离心30min，收集上清液，并用超纯水洗涤沉淀，然后再次在5000rpm条件下离心30min，收集上清液，并将两次得到的上清液混合。
(2)蒸发浓缩：采用多效蒸发工艺将步骤(1)得到的上清液浓缩至干物质重量百分比浓度为50％，蒸发温度为65℃。
(3)膜分离：将步骤(2)得到浓缩液采用孔径为10nm的超滤膜进行过滤，得到滤液，超滤时流量4-5L/h，运行温度50-65℃。
(4)干燥：将步骤(3)得到的滤液在喷雾干燥机中干燥，进风温度130℃，出风温度80℃，得到水分含量小于6％的粉状低内毒素酵母浸出物。
对比例1
常规酵母浸出物的制备方法，步骤如下：
1、酵母浆的制备
取5g酿酒酵母，加入50mL2wt％的葡萄糖溶液，在28℃活化30min，得到酿酒酵母种子液。然后发酵罐中加入5kg糖蜜、0.5kg酵母浸粉、2kg硫酸铵、0.5kg硫酸镁、0.3kg磷酸二氢钾、0.1kg硫酸锌为和91.6kg去离子水，搅拌溶解，调节pH为4.5，配成培养基，然后向发酵罐中加入1500ml酿酒酵母种子液，30℃发酵18h得到酵母发酵液。然后用去离子水洗涤酵母发酵液，离心分离，重复2次，得到酵母乳。向酵母乳中加入去离子水配成酵母干物质重量含量为15％的酵母浆。
2、自溶酶解
调节步骤1中制得酵母浆的pH为6.0，升温至40℃，自溶6h，然后加入0.05％(以酵母浆干物质重量计)蛋白酶，酶解10h得到酶解液。
3、分离纯化
(1)离心分离：将步骤2中得到的酶解液在5000rpm条件离心30min，收集上清液，并用去离子水洗涤沉淀，然后再次在5000rpm条件下离心30min，收集上清液，并将两次得到的上清液混合。
(2)用平均孔径为10μm的膜过滤器过滤步骤(1)上清液，得到滤液。
(3)蒸发浓缩：采用多效蒸发工艺将步骤(2)得到的滤液浓缩至干物质重量百分比浓度为50％，蒸发温度为65℃。
(4)干燥：将步骤(3)得到的浓缩液在喷雾干燥机中干燥，进风温度130℃，出风温度80℃，得到水分含量小于6％的粉状酵母浸出物。
检测实施例1-7和对比例1的理化指标，其中，总氮、氨基酸态氮和内毒素均以干物质重量计，结果如表3所示。
表3 实施例1-7和对比例1的理化指标检测结果
实验例1
将实施例1-7所制备的低内毒素酵母浸出物和对比例1常规酵母浸出物以及血清进行细胞培养试验，测试细胞增殖速率。
细胞增殖速率测试方法如下：
取指数生长期的CHO-K1悬浮细胞，经1000r/min离心5min，弃上清，用新鲜商用CHO培养基进行重悬。以8.0×105cells/ml的活细胞密度接种于12孔板中，每孔接种3ml的商用CHO细胞培养基，5％CO2培养6d，每24h取100μL与台盼蓝1:1混匀，采用细胞计数仪计数并确定细胞活性。
以不加水解物为空白对照，各实施例和对比例酵母浸出物的添加浓度为1g/L，血清组血清添加量为10％。每组实验设置了三个平行，表4为3个平行的平均值结果。
实验结果如表4所示：
表4 实施例1-7和对比例1以及血清的细胞增殖测试结果，单位：Cells/ml
由表3可以看出，本发明实施例1-7制得的酵母浸出物内毒素含量均≤20EU/g，采用较高的干燥温度，其内毒素含量可达到10EU/g以下，远远低于对比例1酵母浸出物内毒素水平。由表4可以看出，细胞增殖培养4天后，本发明细胞增殖速率明显高于空白和对比例1，和血清水平相当，说明本发明应用于细胞培养，不会给细胞带来毒性，有利于目标产物的纯化及质量控制，可以代替血清，有效提高细胞增殖速率。
以上所述，仅是本发明实施的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均需要包含在本发明的保护范围之内。
Claims (13)
1.一种低内毒素酵母浸出物，其特征在于，以干基重量百分比计，所述低内毒素酵母浸出物中总氮含量10-13％，氨基酸态氮的含量4-6％，内毒素含量≤20EU/g。
2.根据权利要求1所述低内毒素酵母浸出物，其特征在于，所述内毒素含量≤10EU/g。
3.根据权利要求1或2所述低内毒素酵母浸出物，其特征在于，重量百分比浓度为2-5％的所述低内毒素酵母浸出物水溶液pH为4.5-7.0。
4.根据权利要求1-3任一项所述低内毒素酵母浸出物，其特征在于，所述低内毒素酵母浸出物为液状或粉状。
5.权利要求1-4任一项所述低内毒素酵母浸出物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)自溶酶解：将酵母浆在40-60℃，pH 4.5-6.0条件下，自溶，然后加入蛋白酶，酶解；
(2)分离纯化：将上述自溶酶解液依次经离心分离，蒸发工艺和膜分离得到液状低内毒素酵母浸出物，其中，所述膜分离为微滤、超滤或纳滤中的一种或两种以上，所述微滤膜的孔径为0.1-0.2μm，所述超滤膜的孔径为10-90nm，所述纳滤膜的孔径为0.1-1nm。
6.根据权利要求5所述低内毒素酵母浸出物，其特征在于，所述低内毒素酵母浸出物的原料来源于酿酒酵母、毕赤酵母或假丝酵母中的一种。
7.根据权利要求5或6所述制备方法，其特征在于，以酵母浆干物质重量计，所述蛋白酶的添加量为0.02-0.08％。
8.根据权利要求5-7任一项所述制备方法，其特征在于，步骤(2)所述离心分离转速为4000-8000rpm，时间为10-30min。
9.根据权利要求5-8任一项所述制备方法，其特征在于，其中，步骤(1)中，所述自溶过程进行6-10h，并且优选酶解进行10-14h。
10.根据权利要求5-9任一项所述制备方法，其特征在于，所述蒸发工艺为多效蒸发工艺，优选的，所述蒸发工艺得到的浓缩液重量百分比浓度为20-60％。
11.根据权利要求5-10任一项所述制备方法，其特征在于，还包括干燥过程，得到粉状低内毒素级酵母浸出物。
12.根据权利要求11所述制备方法，其特征在于，所述干燥为喷雾干燥，优选地，干燥进风温度为200-300℃，出风温度为100-150℃。
13.权利要求1-4任一项所述低内毒素酵母浸出物或权利要求5-12任一项所述制备方法制得的低内毒素酵母浸出物在生物医药和细胞培养中的应用。
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| Title |
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| 唐剑茂，宫学源，郑咏梅编；魏炳波，韩雅芳总主编: "《中国战略性新兴产业 前沿新材料概论》", 中国铁道出版社, pages: 146 * |
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