CN115466617B - 长寿命硼/氮/磷共掺杂液相磷光碳点及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种长寿命硼/氮/磷共掺杂液相磷光碳点，是将硼酸、磷酸和乙二胺按照摩尔比1～3∶1～3∶1溶于水中，密闭下进行水热反应得到硼/氮/磷共掺杂磷光碳点，再置于正硅酸乙酯的氨水溶液中混合搅拌，在磷光碳点表面包覆二氧化硅基体后得到的硼/氮/磷共掺杂磷光碳点@二氧化硅溶液，其能够发射绿色磷光，可以作为磷光探针应用于生物医学成像中，获得长达4s的长寿命磷光。
Description
技术领域
本发明属于生物成像技术领域，涉及一种基于液相磷光碳点的探针，以及该液相磷光碳点的制备方法。以该液相磷光碳点作为探针，能够应用于区分背景荧光干扰的磷光成像。
背景技术
磷光成像相比荧光成像具有能够消除生物自荧光影响及不需要实时激发等优点，能有效提高成像的精准度，并且拥有高灵敏度和更高的分辨率，在生物成像领域具有广阔的应用前景。
磷光碳点作为尺寸小于10nm的新型磷光材料，具有发射波长可调、大斯托克斯位移等优异的光学性能。磷光碳点主要由C、H、O等元素组成，而且表面具有氨基、羧基等丰富的官能团，具有低的生物毒性和良好的生物相容性，作为磷光探针，在磷光生物成像领域中吸引了更多研究者的关注。
已报道的室温磷光碳点多基于无水固态体系。由于水中存在溶解氧以及溶剂辅助弛豫现象，极易使磷光在水中猝灭，长寿命水相磷光碳点的开发仍然存在困难。
目前，根据组成结构的不同，可以将固态磷光碳点分为基质磷光碳点和无基质磷光碳点两种。基质磷光碳点是将碳点嵌在基质中，借助基质的刚性结构抑制非辐射跃迁以稳定磷光发射，而一旦溶于水，磷光可能会随着基质的破坏而消失。无基质磷光碳点利用表面的链状分子在水中形成高度缠绕的刚性交联网络，碳点与交联网状结构间具有大量分子间氢键作用，限制发光基团的转动，抑制三线态激子的非辐射跃迁，保护并稳定三线态激子，最终形成稳定的水相磷光。
长寿命的磷光可以在肿瘤成像中具有高的穿透性和分辨能力，从而提升成像监测的灵敏度。
Liang等（Ultralong and efficient phosphorescence from silica confinedcarbon nanodots in aqueous solution[J]. Nano Today, 2020, 34: 100900.）以乙二胺和磷酸为原料，通过微波法制备了固态磷光碳点，并在其表面修饰功能层以保护碳点在水中的磷光发射，获得了磷光量子产率11.6%，磷光寿命1.86s的复合碳点，在活体组织中观测到了长时间的磷光信号。
Liu等（Si-assisted N, P Co-doped room temperature phosphorescentcarbonized polymer Dots: Information Encryption, graphic Anti-counterfeitingand biological imaging[J]. Journal of Colloid and Interface Science, 2022,609: 279-288.）利用易于聚合交联的原料，先合成具有磷光发射的碳点，然后采用溶胶凝胶法将磷光碳点包覆在二氧化硅基体里面，得到能在水中发射磷光的碳点二氧化硅复合物。以其用于小鼠骨髓来源树突状细胞DC2.4、人宫颈癌细胞HeLa以及小鼠进行磷光成像或余辉成像。
以上磷光碳点的共同点是杂原子掺杂，利用在碳点中掺杂氮、磷等杂原子来增强碳点体系的自旋轨道耦合，从而降低单重态到三重态之间的能级差，促进系间窜越，实现磷光发射；再通过二氧化硅基体的共价网络来抑制磷光碳点的非辐射跃迁与隔绝水中的三态氧，最终实现液相磷光。
因此，采用杂原子掺杂策略开发固态无基质磷光碳点，并进一步提升其在液相中的磷光性能，加长对生物的观测，对其生物成像应用具有重要的研究意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种长寿命硼/氮/磷共掺杂液相磷光碳点，以及该液相磷光碳点的制备方法，以实现对小鼠的生物磷光成像。
为实现上述发明目的，本发明的长寿命硼/氮/磷共掺杂液相磷光碳点是以硼酸，磷酸和乙二胺为原料，按照硼酸，磷酸和乙二胺的摩尔比为1～3∶1～3∶1溶于水中，密闭下进行水热反应，反应产物提纯得到硼/氮/磷共掺杂磷光碳点，再置于正硅酸乙酯的氨水溶液中混合搅拌，在磷光碳点表面包覆二氧化硅基体后得到的硼/氮/磷共掺杂磷光碳点@二氧化硅溶液。
本发明制备的硼/氮/磷共掺杂磷光碳点为淡黄色固体粉末，粒径小于5nm，在固态下具有蓝色荧光以及绿色磷光。在其基础上制备的硼/氮/磷共掺杂磷光碳点@二氧化硅溶液能够在345nm激发下发射502nm的磷光，属于绿色磷光发射，且具有激发独立性。
进而，本发明还提供了一种快速制备所述长寿命硼/氮/磷共掺杂液相磷光碳点的制备方法，是将硼酸，磷酸和乙二胺以摩尔比1～3∶1～3∶1溶于水中得到反应溶液，超声分散均匀，于密闭反应釜中加热至200～280℃进行水热反应，反应产物经提纯、干燥得到淡黄色的硼/氮/磷共掺杂磷光碳点粉末，再将得到的硼/氮/磷共掺杂磷光碳点粉末溶于水中，与正硅酸乙酯和氨水混合搅拌，得到长寿命硼/氮/磷共掺杂液相磷光碳点（硼/氮/磷共掺杂磷光碳点@二氧化硅溶液）。
进一步地，所述硼酸，磷酸和乙二胺的摩尔比优选为1∶2∶1。
其中，优选地，是将反应溶液以频率60kHz的超声波超声分散10～30min，以使原料充分混合均匀。
更进一步地，所述水热反应时间优选为6～10h。
进一步地，本发明是将水热反应产物先以0.22μm亲水性微孔滤膜进行过滤，再以截留分子量500～1000Da的透析袋透析，以将反应产物进行提纯处理。
提纯后的反应产物浓缩后，经真空冷冻干燥，即可制备得到硼/氮/磷共掺杂磷光碳点粉末。
具体地，所述真空冷冻干燥是在真空度2Pa、冷冻温度-80℃下冷冻干燥12～24h。
进一步地，所述硼/氮/磷共掺杂磷光碳点粉末与正硅酸乙酯和氨水的质量比为1∶1～9∶1～5。
更进一步地，是将所述硼/氮/磷共掺杂磷光碳点粉末的水溶液与正硅酸乙酯和氨水在室温下混合搅拌得到硼/氮/磷共掺杂磷光碳点@二氧化硅溶液，所述搅拌时间为8～24h。
进一步地，本发明是将反应产物先以0.22μm亲水性微孔滤膜进行过滤，再以截留分子量500～1000Da的透析袋透析，即可得到本发明硼，氮，磷共掺杂磷光碳点@二氧化硅溶液。
本发明制备的硼/氮/磷共掺杂磷光碳点@二氧化硅溶液可以作为磷光探针，应用于生物的医学成像中。
以本发明制备的硼/氮/磷共掺杂磷光碳点@二氧化硅溶液作为磷光探针，用于小鼠皮下成像，能够在激发光去除后获得长达4s的长寿命磷光。
附图说明
图1是硼/氮/磷共掺杂磷光碳点粉末的透射电子显微镜像，其中插图分别为碳点粉末的粒径分布图和自然光下、紫外光下及移除紫外光后的碳点粉末发光状态。
图2是硼/氮/磷共掺杂磷光碳点粉末的傅里叶红外吸收光谱图。
图3是硼/氮/磷共掺杂磷光碳点粉末的X射线光电子能谱图。
图4是硼/氮/磷共掺杂磷光碳点粉末的紫外吸收光谱图、磷光激发与发射光谱图。
图5是硼/氮/磷共掺杂磷光碳点@二氧化硅溶液的透射电子显微镜像，插图为自然光下、紫外光下及移除紫外光后溶液的发光状态。
图6是硼/氮/磷共掺杂磷光碳点@二氧化硅溶液的傅里叶红外吸收光谱图。
图7是硼/氮/磷共掺杂磷光碳点@二氧化硅溶液的紫外吸收光谱图和磷光发射光谱图。
图8是硼/氮/磷共掺杂磷光碳点@二氧化硅溶液的磷光寿命图。
图9是氮/磷共掺杂荧光碳点溶液的荧光光谱图。
图10是硼/氮/磷共掺杂磷光碳点@二氧化硅溶液用于小鼠的磷光成像图。
图11是氮/磷共掺杂荧光碳点溶液用于小鼠的荧光成像图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步的详细描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，从而使本领域技术人员能很好地理解和利用本发明，而不是限制本发明的保护范围。
本发明实施例中涉及到的生产工艺、实验方法或检测方法，若无特别说明，均为现有技术中的常规方法，且其名称和/或简称均属于本领域内的常规名称，在相关用途领域内均非常清楚明确，本领域技术人员能够根据该名称理解常规工艺步骤并应用相应的设备，按照常规条件或制造商建议的条件进行实施。
本发明实施例使用的各种仪器、设备、原料或试剂，并没有来源上的特殊限制，均为可以通过正规商业途径购买获得的常规产品，也可以按照本领域技术人员熟知的常规方法进行制备。
实施例1
在20mL去离子水中加入硼酸1.0000g，磷酸0.4mL，乙二胺0.5mL溶解均匀，转移至100mL烧杯中，封口膜密封，于超声波分散仪上以频率60kHz超声分散15min，得到混合溶液。
将混合溶液置于带有聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，密封下升温至280℃反应10h，获得黄色溶液产物。
采用0.22μm亲水性微孔滤膜过滤溶液产物，滤液装入截留分子量500～1000Da的透析袋中，于去离子水中透析24h后，透析液于旋蒸瓶中旋蒸除去溶液，冷却至室温，置于-80℃冰箱冷冻，然后于真空冷冻干燥箱中真空度2Pa、温度-80℃下冷冻干燥24h，制备得到淡黄色的硼/氮/磷共掺杂磷光碳点粉末。
取少许制备的硼/氮/磷共掺杂磷光碳点粉末溶于无水乙醇中，滴于透射电子显微镜专用铜网上，干燥后以高分辨透射电子显微镜观察其形貌，结果如图1所示，可以看出碳点分散均匀，尺寸均一，没有明显的晶格条纹，呈无定形结构。进而，根据图1中右上角的粒径分布统计插图可知，其平均粒径约为3.07nm。
取少量硼/氮/磷共掺杂磷光碳点粉末，分别测定其在自然光与365nm紫外光照射下以及紫外灯关闭后的粉末状态，结果见图1中右下角插图。碳点在自然光下为淡黄色的固体粉末，紫外光激发下呈现出蓝色荧光，紫外灯关闭后呈绿色磷光。
图2是所制备硼/氮/磷共掺杂磷光碳点的傅里叶红外吸收光谱图。其中碳点的吸收范围从2500−3650cm-1，这归因于羟基(−OH)、氨基(−NH2)和亚甲基(−CH2)基团的伸缩振动；而在1645、1473和1390cm-1处观察到三个吸收峰，则分别与C=C键、N−H键和C−N键的伸缩振动有关；特征峰位于1190、1001和817cm-1，分别来自P=O、N−P和B−O键的伸缩振动，证明了硼、氮、磷等原子掺杂在碳点表面。
使用Thermo Fisher ESCALAB 250Xi型X射线电子能谱仪测定得到了图3所示的所制备硼/氮/磷共掺杂磷光碳点的X射线光电子能谱图，以此来确定碳点中所含元素及其相应价态。其中，a）为碳点总体的X射线光电子能谱，b）、c）、d）、e）和f）分别为C ls、N 1s、Ols、B 1s和P 2p的X射线光电子能谱。
各图谱中，a）表示碳点主要由C、N、O、B、P和H组成；b）中在284.8、286.2和288.1eV显示三个峰，键能284.8eV的峰归属于C=C，286.2eV的峰归属于C−C，288.1eV的峰归属于C=O；c）的N 1s能谱图中，位于398.9、399.7和401.3eV的峰分别归因于N−P、C−N和N−H键；d）的Ols能谱图中，531.1、532.0和532.8eV的特征峰分别归因于C−O、P−O和B−O键；在e）的B 1s能谱图中确认了可以分别得到B−N和B−O键的存在，分别位于190.6和192.3eV，这也验证了B不属于三氧化二硼的化合价态；f）的P 2p能谱图中确认分别在133.1和133.9eV的结合能处拟合出两个峰，分别属于P−O/P=O和P−N键。
利用紫外可见分光光度计测得硼/氮/磷共掺杂磷光碳点的吸收光谱如图4a所示，可知碳点在280和355nm处显示出两个吸收峰，表明分别存在C=C的π−π*跃迁和C=N的n−π*跃迁。
图4中b和c还分别提供了利用荧光光谱仪测得的硼/氮/磷共掺杂磷光碳点的磷光激发与发射光谱图，可以看出，碳点的磷光激发发射光谱有两个激发峰，分别位于289nm和345nm波长处；不同激发波长下，碳点的磷光发射峰均位于502nm处，而在345nm激发波长下的磷光强度最高。
实施例2
称取所制备硼/氮/磷共掺杂磷光碳点100mg，溶于50mL去离子水中，以封口膜密封，置于超声波分散仪上，以频率60kHz超声分散5min，得到碳点溶液。
将碳点溶液置于100mL三口烧瓶内，量取1mL正硅酸乙酯和0.5mL氨水加入到三口烧瓶中，室温搅拌24h，得到透明溶液产物。
采用0.22μm亲水性微孔滤膜对产物进行过滤，再将滤液装入截留分子量1000Da的透析袋中，于去离子水中透析24h后，得到长寿命硼/氮/磷共掺杂液相磷光碳点（硼/氮/磷共掺杂磷光碳点@二氧化硅）溶液。
取少许制备好的硼/氮/磷共掺杂磷光碳点@二氧化硅溶液，滴于透射电子显微镜专用铜网上，干燥后以高分辨透射电子显微镜观察其形貌，结果如图5所示，可以看出碳点被包覆在二氧化硅基体里面。
取少量硼/氮/磷共掺杂磷光碳点@二氧化硅溶液，分别测定其在自然光与365nm紫外光照射下以及紫外灯关闭后的状态，结果见图5中右下角插图，在自然光下为透明无色的溶液，紫外光激发下呈现出蓝色荧光，紫外灯关闭后呈绿色磷光。
图6是所制备硼/氮/磷共掺杂磷光碳点@二氧化硅溶液的傅里叶红外吸收光谱图，其中位于3450cm−1处的吸收带可归因于磷光碳点与二氧化硅Si−OH的O−H伸缩振动。当磷光碳点包覆在二氧化硅基体中，Si−O−Si(1080−1357cm-1)和Si−O−C(871cm-1)出现了进一步的特征振动。此外，Si−OH的存在可以从800cm-1峰看出。
利用紫外可见分光光度计测得硼/氮/磷共掺杂磷光碳点@二氧化硅溶液的吸收光谱如图7a所示，可知碳点在280和355nm处显示出两个吸收峰，表明分别存在C=C的π−π*跃迁和C=N的n−π*跃迁，与磷光碳点一样。
图7b还提供了利用荧光光谱仪测得的硼/氮/磷共掺杂磷光碳点@二氧化硅溶液的磷光发射光谱图，可以看出，其中在345nm激发波长下的磷光强度最大，且其最大发射峰位于502nm处。
图8中提供了利用瞬态稳态光谱仪测得的硼/氮/磷共掺杂磷光碳点@二氧化硅溶液的磷光寿命衰减曲线，可以看出，硼/氮/磷共掺杂磷光碳点@二氧化硅溶液的磷光寿命达到了1.97s，对比荧光具有很大的提高。
实施例3
为了体现磷光探针与荧光探针的区别，制备了氮磷共掺杂荧光碳点用作荧光探针。
量取磷酸0.4mL，乙二胺0.5mL，溶于20mL去离子水中，转移至100mL烧杯中，以封口膜密封，置于超声波分散仪上，以频率60kHz超声分散15min，得到混合溶液。
将混合溶液置于带有聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，密封下升温至280℃反应10h，获得黄色溶液产物。
采用0.22μm亲水性微孔滤膜过滤溶液产物，滤液装入截留分子量500～1000Da的透析袋中，于去离子水中透析24h后，透析液于旋蒸瓶中旋蒸除去溶液，冷却至室温，置于-80℃冰箱冷冻，然后于真空冷冻干燥箱中真空度2Pa、温度-80℃下冷冻干燥24h，制备得到淡黄色的氮磷共掺杂荧光碳点粉末。
图9提供了利用荧光光谱仪测得的氮/磷共掺杂荧光碳点的荧光发射光谱图，可以看出其中325nm激发波长下的荧光强度最大，而最大发射峰位于399nm处，属于蓝光发射。
应用例1：磷光碳点探针成像能力测试
为了进一步测试磷光碳点探针的成像能力，选用6～8周龄SPF级雌性BALB/c裸鼠进行小鼠皮下磷光成像。
量取2mL硼/氮/磷共掺杂磷光碳点@二氧化硅溶液，溶于18mL去离子水中，配置成200μg/mL磷光碳点探针溶液。用2.5mL注射器抽取2mL磷光碳点探针溶液，注射于小鼠皮下，以紫外灯进行照射，并对小鼠皮下进行拍摄。
从图10提供的小鼠磷光成像图可以看出，小鼠身体具有明显的生物自荧光现象，在紫外灯激发下发射与碳点颜色一样的蓝色荧光，碳点发射的荧光被小鼠自身荧光所干扰而无法观察到。在关闭紫外灯后，荧光消失，能够明显看到小鼠皮下的绿色磷光，且时间长达4s，表现出优异的磷光成像能力。
应用例2：荧光碳点探针成像能力测试
为了对比磷光成像的能力，选用6～8周龄SPF级雌性BALB/c裸鼠进行小鼠皮下荧光成像。
量取2mL氮磷共掺杂荧光碳点溶液，溶于18mL去离子水中，配置成200μg/mL荧光碳点探针溶液。用2.5mL注射器抽取2mL荧光碳点探针溶液，注射于小鼠皮下，以紫外灯照射，并对小鼠皮下进行拍摄。
从图11提供的小鼠荧光成像图看出，小鼠身体有明显的生物自荧光影响，紫外灯激发下干扰碳点荧光的观测，而在关闭紫外灯后，观察不到任何光发射，不具备不需要实时激发的成像能力。
通过上述制备荧光探针和磷光探针的成像对比可以看出，短波长的荧光探针具有组织穿透差，生物自荧光以及需要实时激发等问题，而磷光探针能够解决这一问题。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种长寿命硼/氮/磷共掺杂液相磷光碳点的制备方法，是在20mL去离子水中加入硼酸1.0000g，磷酸0.4mL，乙二胺0.5mL溶解均匀，转移至100mL烧杯中，封口膜密封，于超声波分散仪上以频率60kHz超声分散15min，得到混合溶液，将混合溶液置于带有聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，密封下升温至280℃反应10h，获得黄色溶液产物，采用0.22μm亲水性微孔滤膜过滤溶液产物，滤液装入截留分子量500～1000Da的透析袋中，于去离子水中透析24h后，透析液于旋蒸瓶中旋蒸除去溶液，冷却至室温，置于-80℃冰箱冷冻，然后于真空冷冻干燥箱中真空度2Pa、温度-80℃下冷冻干燥24h，制备得到淡黄色的硼/氮/磷共掺杂磷光碳点粉末，称取所制备硼/氮/磷共掺杂磷光碳点100mg，溶于50mL去离子水中，以封口膜密封，置于超声波分散仪上，以频率60kHz超声分散5min，得到碳点溶液，将碳点溶液置于100mL三口烧瓶内，量取1mL正硅酸乙酯和0.5mL氨水加入到三口烧瓶中，室温搅拌24h，得到透明溶液产物，采用0.22μm亲水性微孔滤膜对产物进行过滤，再将滤液装入截留分子量1000Da的透析袋中，于去离子水中透析24h后，得到长寿命硼/氮/磷共掺杂液相磷光碳点溶液。
2.采用权利要求1所述制备方法制备得到的长寿命硼/氮/磷共掺杂液相磷光碳点。
3.权利要求2所述长寿命硼/氮/磷共掺杂液相磷光碳点在制备生物医学成像用磷光探针上的应用。
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