CN115466297B - L-岩藻糖的应用以及动物饲料 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种L‑岩藻糖的应用、功能性食品以及动物饲料；所述L‑岩藻糖的应用包括L‑岩藻糖在制备降低赭曲霉毒素A对于卵巢内生殖细胞的毒害作用的制剂上的应用；其中，通过构建体内研究模型，发现L‑岩藻糖能够有效地改善赭曲霉毒素A对于卵巢内生殖细胞的毒害作用，提高生物体卵巢内生殖细胞的质量，为研究人类生殖健康提供理论基础，同时，L‑岩藻属于六碳糖，是人体的八种必须糖之一，对人体几乎无副作用。

Description

L-岩藻糖的应用以及动物饲料
技术领域
本发明涉及生殖生物学技术领域，具体涉及一种L-岩藻糖的应用以及动物饲料。
背景技术
如今，研究发现动物及人类的生殖能力逐年下降，影响生殖健康的因素多种多样，其中霉菌毒素对人类生殖健康及动物繁殖力的影响已被证实。赭曲霉毒素A(OchratoxinA，OTA)是霉菌毒素中毒性较强的成员之一，其对雄性和雌性都有不同程度的生殖毒性，在雄性中OTA暴露会影响精子发生及精液质量，在雌性中OTA暴露影响卵泡发育，抑制卵母细胞成熟和受精。OTA存在于世界各地的各种农产品中，是一种食物和动物饲料污染物，经常在饲料和食源性产品中检测到。研究发现世界各地的饲料及食品中OTA的检出率普遍较高，OTA通过污染食物进入动物体及人体，威胁动物及人类的健康。
卵巢是雌性动物的生殖器官，由体细胞和卵母细胞组成，其最基本的功能单位是卵泡。研究发现雌性哺乳动物的生殖能力是有限的，其限度是由原始卵泡库决定的。原始卵泡库在哺乳动物出生时就已经确定，代表雌性哺乳动物的生殖潜力和生殖寿命。原始卵泡的组装是雌性哺乳动物生殖中至关重要的环节之一。原始卵泡由单层扁平的原始颗粒细胞和初级卵母细胞组成，原始卵泡形成后聚集在卵巢皮质部位，形成原始卵泡库。卵母细胞和颗粒细胞的相互作用是Cyst解聚和原始卵泡组装的必要条件。原始卵泡形成阶段易受到赭曲霉毒素A的影响，从而影响原始卵泡组装及卵巢储备，进而影响雌性的生殖能力。原始卵泡发育异常会进一步导致卵巢功能丧失、卵巢早衰和雌性不育等疾病。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种L-岩藻糖的应用以及动物饲料，旨在解决赭曲霉毒素A对于卵巢内生殖细胞的毒害作用大的问题。
为实现上述目的，本发明提出的一种L-岩藻糖在制备降低赭曲霉毒素A对于卵巢内生殖细胞的毒害作用的制剂上的应用。
可选地，在所述制剂中，所述L-岩藻糖的质量浓度为0.1～0.3g/kg。
可选地，所述L-岩藻糖用于修复赭曲霉毒素A引起的生物体卵巢内的生殖细胞异常机制。
可选地，所述修复赭曲霉毒素A引起的生物体卵巢内的生殖细胞异常机制为使得卵巢内生殖细胞总数目与原始卵泡的比例均向正常值靠近，并且修复由赭曲霉毒素A引起的基因表达异常。
可选地，所述L-岩藻糖用于修复赭曲霉毒素A引起的生物体卵巢内的生殖细胞的DNA双链断裂。
可选地，所述L-岩藻糖用于修复赭曲霉毒素A引起的生物体卵巢内的生殖细胞的氧化损伤。
可选地，所述生物体为哺乳动物。
可选地，所述制剂包括饲料添加剂和/或食品添加剂。
本发明还提出了一种，所述包括上所述的食品添加剂。
此外本发明提出了一种动物饲料，所述动物饲料包括上述的饲料添加剂。
本发明的技术方案中，通过体内研究模型，发现L-岩藻糖能够有效的降低赭曲霉毒素A对于卵巢内生殖细胞的毒害作用，提高生物体卵巢内生殖细胞的质量，通过体内研究模型发现，在赭曲霉毒素A暴露的同时灌胃L-岩藻糖，可以挽救赭曲霉毒素A对生殖细胞Cyst解聚和原始卵泡形成的抑制作用，减弱了赭曲霉毒素A诱导的卵巢细胞DNA双链断裂水平，使卵巢细胞的活性氧降低到正常水平，为研究人类生殖健康提供理论基础，同时，L-岩藻糖属于六碳糖，是人体的八种必须糖之一，也是人类母乳的重要成分，对人体几乎无副作用，不会对人体造成二次伤害，从而解决了食品和饲料中赭曲霉毒素A污染造成的生殖力下降问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本发明实施例1、对比例1至3中3dpp小鼠生殖细胞特异性表达蛋白(MVH)的荧光染色的示意图(生殖细胞特异性表达蛋白为红色，细胞核为蓝色，黄色箭头表示Cyst，白色箭头表示原始卵泡)；
图2为本发明实施例1、对比例1至3中Cyst和原始卵泡在生殖细胞中所占的百分比的示意图；
图3为本发明实施例1、对比例1至3中3dpp卵巢切面中生殖细胞总数示意图；
图4为本发明实施例1、对比例1至3中3dpp小鼠卵巢原始卵泡形成相关蛋白MVH和LHX8典型图；
图5为本发明实施例1、对比例1至3中3dpp小鼠卵巢原始卵泡形成相关蛋白MVH蛋白分析图；
图6为本发明实施例1、对比例1至3中3dpp小鼠卵巢原始卵泡形成相关蛋白LHX8蛋白分析图；
图7为本发明实施例1、对比例1至3中卵巢差异表达基因热图；
图8为本发明实施例1、对比例1至3差异基因韦恩图；
图9为本发明实施例1、对比例1至3中3dpp小鼠卵巢DNA损伤的改变(生殖细胞特异性表达蛋白为红色，DNA损伤标记物γH2AX为绿色)；
图10为本发明实施例1、对比例1至3中MVH和γH2AX双阳性细胞的统计结果的示意图；
图11为本发明实施例1、对比例1至3中DNA损伤标记物γH2AX和DNA修复蛋白RAD51的典型图；
图12为本发明实施例1、对比例1至3中RAD51和γH2AX蛋白表达水平分析结果；
图13为本发明实施例1、对比例1至3中3dpp小鼠卵巢活性氧水平染色；
图14为本发明实施例1、对比例1至3中3dpp小鼠卵巢DCF染色荧光分析结果。
需要说明的是，在图1至图14中，0μg/d指代的是对比例1，3.5μg/d指代的是对比例2，L-Fucose指代的是对比例3，3.5+L-Fucose指代的是实施例1。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
卵巢是雌性动物的生殖器官，由体细胞和卵母细胞组成，其最基本的功能单位是卵泡。研究发现雌性动物的生殖能力是有限的，其限度是由原始卵泡库决定的。原始卵泡库在哺乳动物出生时就已经确定，代表雌性的生殖潜力和生殖寿命。原始卵泡的组装是雌性生殖中至关重要的环节之一。原始卵泡由单层扁平的原始颗粒细胞和初级卵母细胞组成，原始卵泡形成后聚集在卵巢皮质部位，形成原始卵泡库。卵母细胞和颗粒细胞的相互作用是Cyst解聚和原始卵泡组装的必要条件。原始卵泡形成阶段易受到霉菌毒素A的影响，从而影响原始卵泡组装及卵巢储备，进而影响雌性的生殖能力。原始卵泡发育异常会进一步导致卵巢功能丧失、卵巢早衰和雌性不育等疾病。
鉴于此，本发明提供一种L-岩藻糖在制备降低赭曲霉毒素A对于卵巢内生殖细胞的毒害作用的制剂上的应用。
需要说明的是，L-岩藻糖是一种六碳糖，是人体八种必须糖之一；同时，L-岩藻糖在药品、食品、化妆品、保健品等重要领域有着越来越重要的影响，具有巨大的发展潜力。
在一些实施例中，L-岩藻糖被发现能够预防一些疾病的发生，对某些疾病具有改善作用，L-岩藻糖具有抑制癌细胞的增殖与扩散，抗炎、消炎，调节血脂、胆固醇，保持肠道益生菌平衡等作用。
在一些实施例中，L-岩藻糖可以有效抑制黑色素瘤的扩散，还可以影响肿瘤本身并改变肿瘤生长的微环境，对预防皮肤癌的研究十分有利。
在一些实施例中，L-岩藻糖对于癌症有诊断、预防的作用；L-岩藻糖对皮肤系统和呼吸系统还具有抗炎作用，L-岩藻糖可通过保护细胞表面蛋白质来阻止炎症的发生和转移。
在一些实施例中，L-岩藻糖对一些炎症细胞具有保护作用，能够减少炎症反应。
在一些实施例中，L-岩藻糖还具有调节血脂、胆固醇的功效，其可代替食物中的蔗糖加入到乳酸饮品中，既不影响食物味道，还可以起到降低血脂、胆固醇的功能。
在一些实施例中，L-岩藻糖具有保持肠道微生物平衡的功能，虽然L-岩藻糖不能被肠道细胞吸收，但却可以作为肠道内益生菌的能量来源，从而增加肠道内益生菌群数量。现今越来越多研究发现肠道菌群与动物的健康密切相关，L-岩藻糖通过增加肠道内益生菌群数量可以进一步改善动物健康。同时，L-岩藻糖还可以增强免疫力，改善睡眠不佳、食欲不振等问题。
因此，本发明中，采用L-岩藻糖来降低赭曲霉毒素A对于卵巢内生殖细胞的毒害作用，不仅能够很好的改善赭曲霉毒素A对生殖细胞造成的毒性，而且对哺乳动物，几乎无副作用，不会造成二次伤害。
需要说明的是，L-岩藻糖的添加量也会对改善赭曲霉毒素A对生殖细胞造成的毒性的效果造成影响，由于受到生物体的种类不同的影响、以及生物体自身的身体状况的不同，L-岩藻糖的添加量也会受到影响，因此，在一些实施例中，经过发明人反复研究测试得出，在所述制剂中，所述L-岩藻糖的质量浓度为0.1～0.3g/kg时最为合适，具体地，在实际应用时，可以根据生物体的不同状况进行选择，L-岩藻糖可以是0.3g/kg、可以是0.1g/kg、可以是0.15g/kg、可以是0.2g/kg，还可以是0.25g/kg，作为本实施例的一个优选实施例，当测试的生物体对象为哺乳动物时，L-岩藻糖的质量浓度优选为0.3g/kg，其中，哺乳动物优选为小鼠。
在一些实施例中，所述L-岩藻糖用于修复赭曲霉毒素A引起的生物体卵巢内的生殖细胞异常机制。
具体地，在测试过程中，将赭曲霉毒素A通过每日灌胃的方式，将3.5μg的赭曲霉毒素A灌入妊娠12.5天的小鼠胃中，一直持续到仔鼠出生，分离出雌性仔鼠的卵巢，进行石蜡切片，通过生殖系统特性性标记蛋白MVH免疫组化显示孕鼠3.5μg/d的赭曲霉毒素A处理，显著抑制了生殖细胞Cyst解聚和原始卵泡形成。按照上述方式在灌胃的同时灌入L-岩藻糖，再次测试发现，赭曲霉毒素A的抑制作用减弱；如此一来，表明L-岩藻糖能够修复赭曲霉毒素A引起的生物体卵巢内的生殖细胞异常机制。
进一步地，所述修复赭曲霉毒素A引起的生物体卵巢内的生殖细胞异常机制为使得卵巢内生殖细胞总数目与原始卵泡的比例均接近正常，并且修复由赭曲霉毒素A引起的基因表达异常。
在一些实施例中，所述L-岩藻糖用于修复赭曲霉毒素A引起的生物体卵巢内的生殖细胞的DNA双链断裂。
具体地，在测试过程中，将赭曲霉毒素A通过每日灌胃的方式，将3.5μg的赭曲霉毒素A灌入妊娠12.5天的小鼠胃中，一直持续到仔鼠出生，分离出雌性仔鼠的卵巢，测试发现原始卵泡形成相关基因的mRNA表达水平下降，通过石蜡切片和免疫荧光实验，发现原始卵泡形成相关基因的蛋白表达水平下降，γH2AX免疫荧光显示阳性细胞数显著上调，表明母源性OTA处理诱导了出生后3天小鼠卵巢细胞的DNA双链断裂；按照上述方式在灌胃的同时灌入L-岩藻糖，再次测试发现，赭曲霉毒素A诱导的卵巢的生殖细胞的DNA双链断裂水平降低，如此一来，表明L-岩藻糖能够挽救赭曲霉毒素A引起的生物体卵巢内的生殖细胞的DNA双链断裂。
在一些实施例中，所述L-岩藻糖用于修复赭曲霉毒素A引起的生物体卵巢内的生殖细胞的氧化损伤。
具体地，在测试过程中，将赭曲霉毒素A通过每日灌胃的方式，将3.5μg的赭曲霉毒素A灌入妊娠12.5天的小鼠胃中，一直持续到仔鼠出生，分离出雌性仔鼠的卵巢，进行石蜡切片，通过活性氧检测试剂盒对小鼠卵巢的活性氧水平进行了检测，结果表明母源性赭曲霉毒素A处理诱导了出生后3天小鼠卵巢细胞的活性氧水平明显升高；按照上述方式在灌胃的同时灌入L-岩藻糖，再次测试发现，卵巢内生殖细胞的活性氧降低到正常水平；如此一来，表明L-岩藻糖能够修复赭曲霉毒素A引起的卵巢内的生殖细胞的氧化损伤。
进一步地，在RNA-Seq结果中添加有L-岩藻糖的实验组与正常组聚类在一起，进一步表明了L-岩藻糖挽救赭曲霉毒素A损害卵巢发育的能力。
在一些实施例中，所述生物体为哺乳动物；例如，哺乳动物可以是小鼠、可以是兔子、可以是猪。
具体地，制剂的使用方式不做限定，可以根据不同的使用对象进行选择，例如：
当使用对象为猪时，可以通过将含有L-岩藻糖的制剂作为饲料添加剂添加到饲料中，喂养猪。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
(1)配置赭曲霉毒素A样品：将装有赭曲霉毒素A的粉末放置在离心机上，以4000rpm的转速离心处理10min，获得下层赭曲霉毒素A沉淀，取5mg的赭曲霉毒素A沉淀加入1547.8μL的DMSO溶液，搅拌直至赭曲霉毒素A沉淀完全溶解，获得浓储液(-20℃的条件下避光保存)，用生理盐水稀释浓缩液(稀释成每100μL的溶液中，赭曲霉毒素A的含量为3.5μg)，获得赭曲霉毒素A样品；
(2)配置L-岩藻糖工作液：将L-岩藻糖用超纯水溶解，配置成灌胃浓度为0.3g/mL的L-岩藻糖工作液；
(3)药物处理孕鼠：获得12.5dpc的孕鼠，每日以灌胃方式将3.5μg的赭曲霉毒素A样品灌入孕鼠的胃中，6～8h后称重，按照0.3g/kg体重，将跟体重克数相当的(μL)的L-岩藻糖工作液灌入孕鼠的胃中，重复上述处理直至仔鼠出生后三天，停止药物处理；
(4)获得样品切片：利用脱颈法处死3dpp(days post partum)的小鼠，从小鼠背部将卵巢分离出来并转移至生理盐水中，随后在体式镜下用镊子和1mL注射器的针头将卵巢其他组织剥离干净，将一侧卵巢用4％的多聚甲醛固定，获得样品切片。另一侧卵巢转移至用1.5mL的离心管，-80℃冻存；
(5)通过石蜡切片荧光免疫组化、Western blot、RNA-seq等方法获得生殖细胞总数目和原始卵泡的比例、DNA双链断裂情况、以及卵巢氧化损伤情况，测试结果如图1至图14所示。
对比例1
(1)配置灌胃生理盐水(生理盐水内添加有DMSO溶液，即每2967.3μL生理盐水中加入32.7μL的DMSO)；
(2)药物处理孕鼠：获得12.5dpc的孕鼠，每日以灌胃方式将100μL的生理盐水灌入孕鼠的胃中，6～8h后称重，按照重量再将跟体重克数相当的(μL)超纯水灌入孕鼠的胃中，重复上述处理直至仔鼠出生后三天，停止药物处理；
(3)获得样品切片：利用脱颈法处死3dpp(days post partum)的小鼠(生殖结束的孕鼠)，从小鼠背部将卵巢分离出来并转移至生理盐水中，随后在体式镜下用镊子和1mL注射器的针头将卵巢其他组织剥离干净，将一侧卵巢用4％的多聚甲醛固定，另一侧卵巢转移至用1.5mL的离心管，-80℃冻存，获得样品切片；
(4)通过石蜡切片荧光免疫组化、Western blot、RNA-seq等方法获得生殖细胞总数目和原始卵泡的比例、DNA双链断裂情况、以及卵巢氧化损伤损伤情况，测试结果如图1至图14所示。
对比例2
(1)配置赭曲霉毒素A样品：将装有赭曲霉毒素A的粉末放置在离心机上，以4000rpm的转速离心处理10min，获得下层赭曲霉毒素A沉淀，取5mg的赭曲霉毒素A沉淀加入1547.8μL的DMSO溶液，搅拌直至赭曲霉毒素A沉淀完全溶解，获得浓储液(-20℃的条件下避光保存)，用生理盐水稀释浓缩液浓储液(稀释成每100μL的溶液中，赭曲霉毒素A的含量为3.5μg)，获得赭曲霉毒素A样品；
(2)药物处理孕鼠：获得12.5dpc的孕鼠，每日以灌胃方式将3.5μg的赭曲霉毒素A样品灌入孕鼠的胃中，6～8h后称重，按照重量再将跟体重克数相当(μL)的超纯水灌入孕鼠的胃中，重复上述处理直至仔鼠出生后三天，停止药物处理；
(3)获得样品切片：利用脱颈法处死3dpp(days post partum)的小鼠(生殖结束的孕鼠)，从小鼠背部将卵巢分离出来并转移至生理盐水中，随后在体式镜下用镊子和1mL注射器的针头将卵巢其他组织剥离干净，将一侧卵巢用4％的多聚甲醛固定，另一侧卵巢转移至用1.5mL的离心管，-80℃冻存，获得样品切片；
(4)通过石蜡切片荧光免疫组化、Western blot、RNA-seq等方法获得生殖细胞总数目和原始卵泡的比例、DNA双链断裂情况、以及卵巢氧化损伤损伤情况，测试结果如图1至图14所示。
对比例3
(1)配置灌胃生理盐水(生理盐水内添加有DMSO溶液，即每2967.3μL生理盐水中加入32.7μL的DMSO)；
(2)配置L-岩藻糖工作液：将L-岩藻糖用超纯水溶解，配置成灌胃浓度为0.3g/mL的L-岩藻糖工作液；
(3)药物处理孕鼠：获得12.5dpc的孕鼠，每日以灌胃方式将100μL的生理盐水灌入孕鼠的胃中，6～8h后称重，按照0.3g/kg体重将跟体重克数相当的(μL)L-岩藻糖工作液灌入孕鼠的胃中，重复上述处理直至仔鼠出生后三天，停止药物处理；
(4)获得样品切片：利用脱颈法处死3dpp(days post partum)的小鼠，从小鼠背部将卵巢分离出来并转移至生理盐水中，随后在体式镜下用镊子和1mL注射器的针头将卵巢其他组织剥离干净，将一侧卵巢用4％的多聚甲醛固定，另一侧卵巢转移至用1.5mL的离心管，-80℃冻存，获得样品切片；
(5)通过石蜡切片荧光免疫组化、Western blot、RNA-seq等方法获得生殖细胞总数目和原始卵泡的比例、DNA双链断裂情况、以及卵巢氧化损伤损伤情况，测试结果如图1至图14所示。
实验实施例1
本实施例将验证L-岩藻糖对降低赭曲霉毒素A对于卵巢内生殖细胞毒害作用的直接效果，操作方法如下：
(1)3dpp小鼠卵巢分离、固定、脱水和切片：
将3dpp小鼠颈椎处死后从小鼠背部将卵巢分离出来并转移至生理盐水中，随后在体式镜下用镊子和1mL注射器的针头将卵巢其他组织剥离干净，将一侧卵巢用4％的多聚甲醛固定8-12h，固定结束后将卵巢转移至自制的口罩包中，包裹严实后将包裹置于流水下冲洗2-4h，水流速度不能太快，以确保固定液能从组织中冲出。
冲水结束后将包裹及卵巢按酒精梯度脱水的方法进行脱水和透明：50％酒精处理15min→70％酒精处理15min→80％酒精处理20min→90％酒精处理20min→95％酒精I处理10min→95％酒精II处理20min→无水酒精I处理30min→无水酒精II处理30min→酒精-二甲苯混合溶液(酒精和二甲苯的体积比为1:1)处理20min→二甲苯I处理15min→二甲苯II处理15min；透明结束后将包裹拆开把卵巢转移至蜡杯I中蜡箱浸蜡1.5h，随后将卵巢转移至蜡杯II中浸蜡过夜，准备自制的蜡盒，将卵巢及液蜡倒入蜡盒，室温凝固保存。
将蜡块修整成规则的正方形，将其放在切片机上进行切片5μm/刀，确保卵巢所有切面都不丢失的情况下将蜡条完整的转移至铺满超纯水的载玻片上，使切片在超纯水的张力下在载玻片上完全铺展，等超纯水完全烘干后，将片子进行免疫荧光组织化学染色或者4℃保存备用。
(2)3dpp小鼠卵巢石蜡切片荧光免疫组化：
a、取出切好的石蜡切片即白片，将白片放入60℃烘箱烘2h，需要注意的是烘箱的温度不能过分高于蜡的熔点。
b、经二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ每步15min将石蜡脱净。
c、脱蜡后经无水酒精及各级酒精下行复水，测试条件如表1所示。
d、提前将抗原修复液煮沸到96℃备用，片子复水结束后将载玻片转移到煮沸的抗原修复液中继续煮沸10min，结束后将装有抗原修复液和片子的缸子冷却至室温，一定注意冷却过程中，不能打开缸子。
e、冷却后将载玻片转移至TBS中浸泡5min，随后转移到TBST中洗5min。
f、将载玻片取出放入水平湿盒中，在载玻片样品区加50μL的封闭液(10％的山羊血清和3％BSA(索莱宝公司)的TBS溶液)，盖上封口膜，室温封闭30min。
g、期间配置一抗(Abcam公司)稀释液(封闭液稀释，稀释比例为1:200)，封闭结束后用镊子轻轻去除封口膜，用微量移液器在样品区加50μL一抗，随后盖上封口膜，将水平湿盒用封口袋密封后4℃孵育过夜。
h、一抗孵育结束后，将水平湿盒取出室温平衡30min，将载玻片的封口膜去掉放入洗杯中TBST清洗三次，10min/次。
i、以下步骤在暗室完成；在避光条件下，配置二抗(Abcam公司)稀释液(封闭液稀释，稀释比例为1:200)，将片子从洗杯取出后在吸水纸上吸去多余水分，在样品区加50μL的二抗稀释液，盖上封口膜后放入水平湿盒中37℃烘箱中孵育45min。
j、二抗孵育结束后，从水平湿盒中取出载玻片并转移到装有TBST的洗杯中洗三次，每次10min。
k、TBST清洗结束后在载玻片上的样品区加入50μLHoechst33342染液(索莱宝公司)并盖上封口膜，室温孵育5min进行染核。
l、染核结束后将载玻片转移到装有PBS的洗杯中洗三遍，每次2min。最后在滤纸上将多余的液体吸掉，用枪头在载玻片上的样品区加一滴抗荧光衰减封片剂(Vector公司)封片，盖上盖玻片。将片子放入水平干盒中，4℃避光存放或者直接镜检观察。
表1测试条件
酒精浓度(％) 时间(min)
100 5
95 5
90 5
80 5
70 5
50 5
PBS 10(开始煮抗原修复液)
(3)3dpp小鼠卵巢切片荧光拍照及统计：
将经过荧光染色的3dpp卵巢切片用荧光显微镜(Olympus BX51)进行拍照，在卵巢连续切片中，每4个切片中选取1个切片进行拍照，用于统计3dpp卵巢生殖细胞总数及生殖细胞在Cyst和原始卵泡中的比例，测试结果如图1至图3所示。
(4)Western blot验证L-岩藻糖能够挽救OTA抑制的原始卵泡形成相关蛋白的表达：
卵巢分离剥净后，每个1.5mL的离心管放入6-8个卵巢。将离心管置于冰上，按照每个卵巢加5μL的剂量加入蛋白裂解液，使用1mL注射器的针头在冰上搅拌每隔5min用涡旋仪进行涡旋，将卵巢全部裂解后14000rpm，离心3min，将上清液转移至预冷的离心管中，加入上清液体积1/4的5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，充分混匀后，煮沸5min，取出后立即转置冰盒上，将样品离心后-20℃储存，用于蛋白免疫印迹。
WB步骤：将所需玻璃板取出用洗洁精及超纯水刷洗干净，并将玻璃板组装固定在胶架上。对玻璃板进行捡漏并配置12％分离胶和5％的浓缩胶，待胶凝固后进行上样和电泳，电泳结束后，将分离胶取下放入转膜缓冲液中进行30min的平衡，同时PVDF膜(Millipore公司)用甲醇处理至透明，大约10s左右，再用超纯水浸泡5min，最后将PVDF膜转入转膜缓冲液中，将转膜夹板按照白板-双层滤纸-PVDF膜-分离胶-双层滤纸-黑板的顺序放置，其中PVDF膜和分离胶之间一定不能有气泡，随后将转膜夹板转移至湿转的架子和转膜槽中，200mA恒流转膜90min，湿转结束后，将PVDF膜取出，用TBST将膜在摇床上洗3次，每次5min，配置的BSA(5％)封闭液并将膜转移至封闭液中，4℃过夜封闭，封闭结束后将PVDF膜取出用TBST在摇床上洗3次，每次5min，在杂交袋中配置一抗(Abcam公司和Affnity公司)(封闭液稀释)，并将PVDF膜放入有一抗的杂交袋中，4℃孵育7-8h，一抗孵育结束后将PVDF膜取出用TBST在摇床上洗3次，每次5min，将PVDF膜和配置的二抗(TBST稀释)在摇床上室温孵育90min。使用TBST将PVDF膜清洗3次，每次5min，在PVDF膜上加上ECL溶液(化学发光试剂，A:B＝1:1，现配现用)，最后将其放在曝光仪上进行曝光，并使用软件进行灰度分析，测试结果如图4至图6所示。
(5)RNA-seq分析显示L-岩藻糖能够改变OTA暴露引起的卵巢基因表达：
从3dpp的小鼠体内取出卵巢分离剥净后用生理盐水清洗3次，并立即转移到离心管中保存在液氮中速冻30min，随后转移到-80℃冰箱保存，用于RNA-seq，将测序样品放在干冰中送往天津诺禾致源生物信息科技有限公司进行RNA的提取及测序分析。测序完成后下载原始数据并进行质控，对测序数据进行基因组比对和基因表达分析，获得差异基因，最后使用R对差异基因进行数据分析及可视化分析，测试结果如图7和图8所示。
(6)L-岩藻糖能够缓解OTA暴露引起的卵巢DNA损伤和修复：
利用石蜡切片免疫荧光染色共染DNA损伤标记物γH2AX和生殖细胞特异性标记MVH，用以标记发生DNA损伤的生殖细胞。同时利用Westernblot对DNA损伤蛋白γH2AX和DNA修复蛋白RAD51的表达水平进行了检测测试结果如图9至图12所示。
(7)L-岩藻糖能够降低OTA暴露引起的卵巢活性氧水平升高：
按照1:1000用无血清DMEM/F12(1:1)稀释DCFH-DA，使终浓度为10μmol/L。将100μL/孔的DCFH-DA培养液加入到96孔细胞培养板中，随后将培养板预热到37℃，同时预热10mL的DMEM/F12(1:1)。从3dpp的小鼠体内取出卵巢，剥离其他组织用预热的DMEM/F12(1:1)清洗3次，结束后立即转移到DCFH-DA培养液中，在37℃细胞培养箱内孵育16min。孵育结束后立即弃掉DCFH-DA培养液，用预热的DMEM/F12(1:1)清洗使用荧光显微镜进行观察，拍照后对荧光强度进行分析，测试结果如图13至图14所示。
结论
由图1、图2和图3可以得出：与对比例1相比，对比例2中的小鼠卵巢显示赭曲霉毒素A具有严重的毒害作用，致使3dpp小鼠卵巢中生殖细胞数目严重丢失，Cyst比例显著升高，同时原始卵泡比例显著下降，说明赭曲霉毒素A抑制了小鼠卵巢的Cyst解聚和原始卵泡的形成。对比例1和对比例3在生殖细胞总数及Cyst和原始卵泡的比例上比较接近且没有显著差异，说明L-岩藻糖对于3dpp小鼠卵巢没有毒性作用。对比例1、对比例3和实施例1相比较发现，这三组实施例在生殖细胞总数及Cyst和follicles的比例上没有差异，但是对比例1、对比例3、实施例1这三组实施例与对比例2在生殖细胞总数及Cyst和原始卵泡的比例上具有显著差异，说明添加L-岩藻糖能够修复赭曲霉毒素A引起的生物体卵巢内的生殖细胞异常机制为使得卵巢内生殖细胞总数目与原始卵泡的比例均接近正常，并且修复由赭曲霉毒素A引起的基因表达异常，从而挽救赭曲霉毒素A暴露引起的生殖毒性。
由图4、图5和图6可以得出：对比例1、对比例3和实施例1在蛋白表达水平上没有显著差异，但与对比例2相比，对比例1、对比例3、实施例1这三组在蛋白水平具有明显差异，说明赭曲霉毒素A抑制了MVH和LHX8的表达，添加L-岩藻糖使赭曲霉毒素A抑制的蛋白表达水平得到挽救，进一步说明了L-岩藻糖能够挽救赭曲霉毒素A抑制的原始卵泡形成相关蛋白的表达。
由图7和图8可以得出：对比例1和实施例1在基因表达谱上相似，同时这两组与对比例2在基因表达上有明显差异。
由图9和图10可以得出：对比例1、对比例2和实施例1与对比例3相比，γH2AX阳性率显著下降，说明添加L-岩藻糖能缓解赭曲霉毒素A暴露诱导的DNA损伤；同时γH2AX蛋白表达趋势也证明的L-岩藻糖能减缓DNA损伤的这一作用。
由图11和图12可以得出：我们对DNA修复蛋白RAD51进行了检测，发现赭曲霉毒素A暴露导致RAD51表达水平下降，DNA修复受到抑制，添加L-岩藻糖后RAD51水平较赭曲霉毒素A组明显上升，说明L-岩藻糖促进了DNA修复水平的升高，用以抵抗赭曲霉毒素A造成的DNA损伤的增加。
由图13和图14可以得出：与对比例1、对比例3和实施例1三组相比较，对比例2中的卵巢活性氧水平显著升高，说明L-岩藻糖的添加可以降低赭曲霉毒素A诱导的卵巢活性氧水平，使之与正常卵巢活性氧水平接近。
综上所述，L-岩藻糖能够有效的降低赭曲霉毒素A对于卵巢内生殖细胞的毒害作用，提高生物体卵巢内生殖细胞的质量，在赭曲霉毒素A暴露的同时灌胃L-岩藻糖，可以挽救赭曲霉毒素A对生殖细胞Cyst解聚和原始卵泡形成的抑制作用，减弱了赭曲霉毒素A诱导的卵巢细胞DNA双链断裂水平，使卵巢细胞的活性氧降低到正常水平。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (7)

1.一种L-岩藻糖在制备降低赭曲霉毒素A对于卵巢内生殖细胞的毒害作用的制剂上的应用，其特征在于，所述制剂包括饲料添加剂，所述L-岩藻糖的质量浓度为0.1～0.3g/kg。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述L-岩藻糖用于修复赭曲霉毒素A引起的生物体卵巢内的生殖细胞异常机制。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述修复赭曲霉毒素A引起的生物体卵巢内的生殖细胞异常机制为使得卵巢内生殖细胞总数目与原始卵泡的比例均向正常值靠近，并且修复由赭曲霉毒素A引起的基因表达异常。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述L-岩藻糖用于修复赭曲霉毒素A引起的生物体卵巢内的生殖细胞的DNA双链断裂。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述L-岩藻糖用于修复赭曲霉毒素A引起的生物体卵巢内的生殖细胞的氧化损伤。
6.如权利要求2或4或5所述的应用，其特征在于，所述生物体为哺乳动物。
7.一种动物饲料，其特征在于，包括如权利要求1所述的应用中的饲料添加剂。
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