CN115461325A - 制备n,n’-二乙酰基-l-胱氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

一种制备N,N’‑二乙酰基‑L‑胱氨酸(“NDAC”)的有效方法，该方法快速、绿色，不需要劳动密集型的产物分离或纯化，以所需比例得到产物，并具有提高了的收率和纯度。该方法包括以下步骤：形成反应混合物，从二盐酸盐形式的胱氨酸衍生物二叔丁基‑L‑胱氨酸开始；将所述二叔丁基‑L‑胱氨酸乙酰化，以得到N,N’‑二乙酰基‑二叔丁基‑L‑胱氨酸；接下来从所述N,N’‑二乙酰基‑二叔丁基‑L‑胱氨酸除去叔丁基，得到N,N’‑二乙酰基‑L‑胱氨酸产物；以及从所述反应混合物分离N,N’‑二乙酰基‑L‑胱氨酸产物；其中乙酰化试剂为乙酸酐。

Description

制备N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸的方法
技术领域
本发明涉及一种制备N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸(“NDAC”)的高效方法。
背景技术
健康的外表是消费者的普遍需求，个人护理是日常生活的一个方面。外表健康的皮肤可以根据外观属性(光泽(glow)、光彩(radiance)、肤色均匀性(evenness of hue)、色素沉着斑点)、质地属性(光滑、丝滑、无隆起和毛孔)和年龄属性(细纹、皱纹、弹性和下垂/松弛)来描述。虽然不同种类的化合物声称对皮肤外观有美容益处，但半胱氨酸和胱氨酸衍生物并未受到太多关注。
许多半胱氨酸/胱氨酸衍生物，包括β-取代的半胱氨酸/胱氨酸、胱氨酸二酰胺、胱氨酸二烷基酯和N-烷酰基半胱氨酸具有潜在的治疗益处，例如在肾结石预防方面(参见Zhu等的“Rational Design of Novel Crystal Growth Inhibitors for Treatment ofCystinuria Kidney Stones,”2013 ProQuest Dissertations and Theses；CrystEngComm,2016,18,8587)。然而，即使是最简单的胱氨酸衍生物，N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸(“NDAC”)也缺乏工业应用，特别是在美容和个人护理领域。
由于几乎没有已知用途，NDAC实际上不能以商业规模获得。现已发现，NDAC分解成胱氨酸，其在生物体的细胞中被还原成半胱氨酸，即半胱氨酸的细胞内形成。半胱氨酸及其二聚体胱氨酸是谷胱甘肽的前体。谷胱甘肽(GSH)是由谷氨酸盐、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽。其存在于所有哺乳动物组织中。其为生物体内主要的抗氧化剂，通过淬灭或清除活性氧(ROS)来保护细胞免受氧化。由日光照射和污染物引起的皮肤中过多的ROS与如肤色不均的临床表现有关。谷胱甘肽在减缓黑色素生成中的作用以前已有报道。随着年龄的增长和暴露于应力，谷胱甘肽减少；因此，非常需要增加皮肤中的谷胱甘肽以提供益处，诸如均匀的肤色。
已经描述了用于增强细胞内谷胱甘肽产生的组合物。参见，例如，Chiba等人的美国专利7,740,831，Crum等人(USRE37934、USRE42645、WO2016/033183和US20050271726)；Mammone的美国专利6,149,925和Perricone的US 20060063718。例如申请人的美国公开专利申请号US 20/9034、US20/16059和US19/328631中致力于解决局部组合物和增强皮肤中由其组成氨基酸(谷氨酸盐、半胱氨酸和/或甘氨酸，即谷胱甘肽前体)产生谷胱甘肽，以用于细胞摄取和GSH三肽的合成。
申请人现已发现，对于增强皮肤细胞内的谷胱甘肽合成，NDAC的性能与胱氨酸相当，但NDAC更易溶，与含半胱氨酸硫醇(SH)的衍生物或其它胱氨酸衍生物相比不会产生令人不快的硫磺气味，并且可以更好地递送至皮肤，从而产生更好的性能。体内的蛋白酶可以裂解(或水解)NDAC的N-乙酰键，最终生成胱氨酸，因此，NDAC也可以作为胱氨酸的控释替代来源。
因此，对NDAC材料有需求。
不如NDAC有利的其它胱氨酸衍生物的实例是含有硫醇基(SH)的N-乙酰基半胱氨酸(“NACys”)和不含SH基的L-胱氨酸二乙酯(“DEC”)。NACys是一种硫醇药物，通常用作祛痰剂(Cryst.Eng.Comm.,2016,18,8587，其中称为“NACe”)。NACys会产生令人不快的硫磺气味，这在化妆品中是不可接受的。此外，硫磺气味(监测为硫化氢或H2S)与NACys分解一致，这在市售化妆品中也是不可接受的。类似地，DEC也会产生强烈的令人讨厌的硫磺气味，并且在配制的化妆品中不稳定。
NDAC是一种酰胺，即胱氨酸的N,N’-二乙酰衍生物。出于本发明的目的，NDAC具有以下化学结构：
Figure BDA0003913574680000021
NDAC的分子量＝324.4。
本发明的NDAC立体异构体(指位于羧酸部分的氮原子和羰基之间的α-碳原子的立体异构)包括R,R(L-胱氨酸)、R,S、S,R和S,S(D-胱氨酸)。优选地，使用L立体异构体，这是在自然界中发现的最丰富和天然的异构体形式。
NDAC不容易在商业上获得，但可以在实验室规模上获得。可以直接由NACys合成，如Vandana Rathore等在Organic Letters,20(19),6274-6278；2018及Scott J.Pye等在Green Chemistry,20(1),118-124；2018中所述：
Figure BDA0003913574680000031
涉及NACys或其它含SH原料的氧化二聚以生成NDAC的这种化学方法具有显著的缺点。首先，任何未反应的NACys都难以从所需的NDAC产物中去除，并且需要专门的纯化方法，诸如使用极性溶剂系统的色谱法。其次，这种纯化方法在非常大的规模(例如，kg、吨)下是不切实际的。第三，即使最终NDAC产物中含有非常少量的NACys杂质，这也会使其无法用于化妆品，因为含SH的杂质诸如NACys在配制时会产生不良的硫磺气味。第四，在将NACys氧化成NDAC的过程中，可能会导致NACys的过早氧化和NDAC的过氧化，并使其成为不希望的和难以除去的次磺酸(sulfenic/sulfenic acid)、砜和/或亚砜杂质。因此，非常需要避免使用含硫醇原料和/或氧化条件的化学方法。
避免使用可能产生胱氨酸衍生物如NDAC的含硫醇原料的明智方法包括使用胱氨酸或胱氨酸衍生的原料。涉及将胱氨酸直接转化为NDAC的实用方法尚未报道，这主要是由于胱氨酸在水和有机溶剂中的溶解度极低(例如，在25℃下，胱氨酸在水中的溶解度为0.112mg/mL；胱氨酸在pH小于2或pH大于8的水溶液中更易溶解；胱氨酸几乎不溶于有机溶剂如醇、醚、酯、酮等中)。从胱氨酸衍生物开始的NDAC合成的替代方法很可能需要保护-脱保护序列。例如，L-胱氨酸二酯如L-胱氨酸二甲酯(DMC)、二乙酯(DEC)或二叔丁酯(DTBC)可容易地作为二盐酸盐获得；这些也是高水溶性的。然而，由于DMC和DEC部分歧化为具有不希望的硫磺气味的副产物，因此在碱性条件下未受阻的烷基酯如DMC和DEC的N,N’-二乙酰化生成N,N’-二烷酰基(dialkanoyl)二烷基胱氨酸酯是不实际的，而受阻烷基二酯如DTBC更稳定和有吸引力。此外，在温和酸性条件下叔丁基酯官能团的脱保护会生成N,N’-二烷酰基胱氨酸，NDAC是这类化合物中的代表。
N,N’-二烷酰基-二叔丁基-L-胱氨酸直接由二叔丁基-胱氨酸(1)和酰氯合成制备(参见例如Liebigs Annalen der Chemie(1987)895-9；Journal of InorganicBiochemistry(2011)105,880-886),羧酸(参见例如Bioconjugate Chemistry(2004)15,541-553；Journal of the American Chemical Society(2001)123,1023-1035；Biochemistry(2005),44,9971-9979；US20170342046)或活化的羧酸(参见例如WO2013002329)。此外，European Journal of Organic Chemistry(2008)26,4417-4425中描述了由二叔丁基-L-胱氨酸(1)和乙酸酐直接制备N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸(2)的化学方法。遗憾的是，这些方法使用不希望的有机溶剂如吡啶、氯仿、N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、乙腈和/或混合溶剂体系。此类有机溶剂是有毒的和/或易燃的，并且在商业规模上是不实用的，并且在任何情况下都需要复杂的纯化方法，例如酸-碱提取和色谱法。此外，这些方法中的一些需要较长的反应时间(例如2天)，并导致需要额外的纯化步骤，以达到成分鉴定所要求的高纯度(例如>99％)。因此，本领域需要一种实用、绿色的化学方法，由二叔丁基-L-胱氨酸(1)直接生成N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸(2)，即化学结构如下所示的试剂。
Figure BDA0003913574680000041
已报道了由N,N’-二烷酰基-二叔丁基-L-胱氨酸直接脱保护以生成N,N’-二烷酰基-胱氨酸(参见例如Journal of Inorganic Biochemistry(2011)105,880-886；WO2013002329；Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry(2018)33,1392-1404)。遗憾的是，这些方法使用在DCM中的TFA或在二噁烷中的HCl，这在商业规模上是不实用或不绿色的方法。因此，本领域需要一种直接由N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸(2)具体制备N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸(“NDAC”)的实用或绿色的化学方法。
Journal of Biological Chemistry(1931)243-252公开了在水中和以Ac2O作为乙酰化试剂由胱氨酸制备二乙酰基-L-胱氨酸(NDAC)。使用丙酮和水的混合物进行纯化，其中乙酰胱氨酸是可溶性的。
发明内容
本发明提供了一种由胱氨酸衍生物制备N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸(“NDAC”)的实用的两步骤方法。
首先，本发明通过提供一种制备N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸(2)的化学方法而消除了现有技术的需求，该方法使用水作为溶剂，需要少于16小时，不需要任何提取后处理或纯化，产物通过简单过滤分离并且收率高(大于88％)。有利的是，起始物料为二叔丁基-L-胱氨酸二盐酸盐，这是一种可商购得到的白色固体。
此外，本发明通过提供一种制备N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸(“NDAC”)的化学方法而消除了现有技术的需求，该方法使用甲酸既作为试剂又作为溶剂，并且可以循环使用，需要少于3小时，不需要任何提取后处理或纯化，产物在溶剂蒸发后分离，无需纯化，并且收率高(约97％)。与用于此目的的其它试剂(诸如TFA和HCl)相比，甲酸具有显著的优势，因为其无毒、可生物降解且可重复使用(参见Chinese Journal of Catalysis(2015)36,1461-1475)。
本发明包括一种制备N-N’-二乙酰基-L-胱氨酸(“NDAC”)的化学方法，该方法包括以下步骤：
形成反应混合物，从二盐酸盐形式的胱氨酸衍生物二叔丁基-L-胱氨酸酯(1)开始；
将所述二叔丁基-L-胱氨酸乙酰化以获得N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸(2)，接下来
从所述N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸中除去所述叔丁基基团，并分离N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸(“NDAC”)产物；其中所述乙酰化试剂为乙酸酐。
本发明的方法是快速的，使用绿色试剂(水和甲酸)，可以在单个反应容器中进行，不需要劳动密集型的产物NDAC分离或纯化，并且与其它报道的方法相比，具有提高的收率和纯度。此外，本发明的方法不使用导致具有不希望的硫磺气味的副产物的含硫醇半胱氨酸衍生物或胱氨酸衍生物。程序如下：
步骤1-N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸(2)
Figure BDA0003913574680000061
作为一般程序，本发明方法的步骤1为制备N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸(2)，这是一种用于NDAC生产的中间体。
步骤1开始于在5-50℃(优选5℃-35℃，最优选10-25℃)的温度下从二盐酸盐制备二叔丁基-L-胱氨酸(1)(1摩尔当量)在水中的溶液。
步骤1包括然后向溶液中添加乙酰化试剂乙酸酐(2-5摩尔当量)。
步骤1还包括向溶液中添加碱，优选无机碱(2-6摩尔当量)，以形成二叔丁基-L-胱氨酸(1)、乙酰化试剂和碱的混合物。无机碱包括例如碱金属或碱土金属的碳酸氢盐或碳酸盐，诸如碳酸钠或碳酸氢钠。也合适的是碱金属氢氧化物如氢氧化钠，或碱土金属氢氧化物或氧化物如氢氧化钙或氧化钙，及它们的混合物。优选碳酸氢钠。
通过在5-50℃(优选在5-35℃，最优选在10-25℃)的温度下继续搅拌混合物而发生反应。继续搅拌，直到所有的二叔丁基-L-胱氨酸(起始物料)被消耗(通常在1-24小时之间)，并且所需的N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸产物从溶液中沉淀出来。
通过过滤并用水洗涤，得到N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸(2)产物(用于NDAC的中间体)。
本发明方法的步骤2是制备N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸，即最终的NDAC产物。
步骤2包括提供合适的酸，包括但不限于例如甲酸、硫酸、磷酸或盐酸及它们的混合物(优选甲酸，因为其无毒、可生物降解和可重复使用的特性，以及作为溶剂和试剂两者的适用性)。适宜的浓度为0.5ml-10ml酸/毫摩尔的N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸。
步骤2包括将N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸(2)(1摩尔当量)悬浮于酸中以形成悬浮体。
步骤2包括在20℃至100℃(优选40-80℃，最优选50-70℃)的温度下)搅拌悬浮体，以生成澄清且无色的均匀溶液。继续搅拌，直到所有的N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸(步骤2的起始物料)被消耗(通常在1-24小时之间)，并生成所需产物N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸(“NDAC”)。
通过蒸发溶剂得到无定形固体的N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸(“NDAC”)。溶剂可以再循环并无限次地再用于步骤2。
此外，步骤2可以包括通过向无定形N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸(“NDAC”)中添加与水不混溶的有机溶剂如乙酸乙酯，剧烈搅拌以使其沉淀/固化成白色固体，从而将其纯化和分离为更高质量的白色结晶固体的N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸。该方法的最后一步可以包括通过离心或过滤，优选通过过滤来分离沉淀的N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸(“NDAC”)产物。
具体的优选的反应方案的实例如下所示。
Figure BDA0003913574680000071
步骤1-N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸(2)-向二叔丁基-L-胱氨酸(1)二盐酸盐(1g，2.4毫摩尔)在水(10ml)中的溶液中添加乙酸酐(0.55ml，5.9毫摩尔)，接下来添加碳酸氢钠(790mg，9.4毫摩尔)，并将混合物在室温(R.T.)下搅拌16小时，此时产物沉淀为白色固体。此时，TLC(100％乙酸乙酯洗脱)显示主要产物的清洁形成(clean formation)。滤出产物并用水(3×10ml)洗涤，并在真空下干燥，得到纯的白色固体的N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸，其纯度(905mg，88％收率)足以用于下一步骤。
步骤2-N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸(NDAC)-将N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸(2)(500mg，1.15毫摩尔)悬浮于甲酸(1mL)中，并在60℃下加热3小时，以生成澄清且无色的均匀溶液。此时，TLC(30∶40∶30的乙酸乙酯∶异丙醇∶水)显示单一产物的清洁形成，且无反应物/起始物料。在60℃下减压除去溶剂，得到无色玻璃状凝胶。任选地，通过添加乙酸乙酯来沉淀产物，过滤并在高真空下干燥，得到纯的白色固体的N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸(350mg，97％)。
在另一个优选的实施方案中，该方法在一个整体的步骤中在单个容器中进行，而无需分离中间体(2)。该方法包括添加所有试剂，使步骤1发生，加入步骤2试剂，加热，添加醇以沉淀盐，滤出盐，蒸发醇以分离NDAC。
发明详述
除了在实施例中或另外明确指出的地方，本说明书中表示材料的量或反应条件、材料的物理性质和/或用途的所有数字都应理解为由词语“约”修饰。
应当注意，在指定浓度或量的任何范围时，任何特定的上限浓度均可以与任何特定的下限浓度或量相关联。
为避免疑问，词语“包含(comprising)”意指“包括(including)”，但不一定是“由……组成”或“由……构成”。换言之，所列出的步骤或选项不必是穷尽的。
本发明提供了一种由胱氨酸衍生物制备N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸(“NDAC”)的两步骤方法。在一般方面，该方法包括以下步骤：
从胱氨酸衍生物二叔丁基-L-胱氨酸酯(1)的二盐酸盐形式开始，
乙酰化得到N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸(2)，接下来
除去叔丁基并分离N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸(“NDAC”)产物，其中所述乙酰化试剂为乙酸酐。
首先，本发明通过提供一种制备N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸(2)的化学方法而消除了现有技术的需求，该方法使用水作为溶剂，需要少于16小时，不需要任何提取后处理或纯化，产物通过简单过滤分离，并且收率高(大于88％)。起始物料为二叔丁基-L-胱氨酸(1)，一种可商购的白色固体。
此外，本发明通过提供一种制备N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸(NDAC)的化学方法而消除了现有技术的需求，该方法使用甲酸作为试剂和溶剂两者，甲酸可以循环。反应需要少于3小时，不需要任何提取后处理或纯化，产物在溶剂蒸发后分离，无需纯化，并且收率高(约97％)。
在另一方面，本发明包括一种制备N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸(“NDAC”)的化学方法，该方法包括以下步骤：
从L-胱氨酸衍生物二叔丁酯(1)的二盐酸盐开始，其是可商购获得的；
在乙酸酐和碳酸氢钠的存在下，在水性介质中乙酰化前体；
在加热条件下使用甲酸作为试剂和溶剂两者而除去叔丁基；
从反应混合物中分离N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸(“NDAC”)产物。
所有的氨基酸均为L立体异构体。L-胱氨酸(>98％)购自Sigma。N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸(95％)购自CombiBlocks。二叔丁基-L-胱氨酸二盐酸盐(DTBC；98％)购自Bachem。
二叔丁基-L-胱氨酸(“DTBC”)
作为本发明方法的起始物料，选择二叔丁基-L-胱氨酸酯(1或“DTBC”)，其可大量地以二盐酸盐形式的白色粉末固体商购得到。DTBC本身是一种谷胱甘肽前体。然而，与NDAC相比，DTBC具有增加的反应性及不稳定的伯游离胺官能团，这使其不太适合于化妆品用途，而更适合作为试剂。该起始试剂在本文中也称为二叔丁基-L-胱氨酸(1或“DTBC”)，或二叔丁基-L-胱氨酸二盐酸盐。
N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸(“NDAC”)
申请人发现N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸(也称为N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸或NDAC)和NDAC盐，诸如二钠盐，是个人护理组合物中有用的酰胺。NDAC结构如下所示(C10H16N2O6S2)：
Figure BDA0003913574680000101
NDAC的分子量＝324.4。
在皮肤化妆品组合物中，当施用于皮肤时，NDAC及其二钠盐在细胞内转化为胱氨酸和半胱氨酸。半胱氨酸又有许多美容用途，包括作为谷胱甘肽前体。NDAC具有卓越的功能优势，包括用于化妆品用途的半胱氨酸的最终递送。此外，NDAC比简单的替代胱氨酸酯如DMC或DEC更稳定，并且不会产生令人不快的硫磺气味。
N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸(“NDAC”)可以根据本发明的方法制备。
根据另一方面，在第一步骤中，DTBC(1)被二乙酰化，从而如上所述形成N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸(2)。在第二步骤中，将N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸(2)在同时作为溶剂和试剂的甲酸存在下加热，从而除去叔丁基并得到NDAC产物。
本发明的方法最适用于合成NDAC。使用DTBC(1)(其为常见且稳定的试剂，可以二盐酸盐的形式大量商购获得)作为通过其二叔丁基中间体制备NDAC的起始物料。通过使DTBC(1)与乙酰化试剂乙酸酐反应，得到N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸(2)。然后，N,N’-二乙酰基-二叔丁基-胱氨酸(2)在同时作为溶剂和试剂的甲酸的存在下被加热，从而除去叔丁基并得到NDAC产物。根据本发明方法制备的NDAC具有优异的功能益处。
本发明程序
作为一般程序，本发明方法的步骤1为制备N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸(2)，其为一种NDAC生产的中间体。
步骤1开始于在5-50℃(优选5℃-35℃，最优选10-25℃)的温度下，制备二叔丁基-L-胱氨酸(1)(1摩尔当量)作为二盐酸盐的在水中的溶液。
步骤1包括向溶液中添加乙酰化试剂乙酸酐(2-5摩尔当量)。
步骤1还包括向溶液中添加碱金属或碱土金属碳酸氢盐或碳酸盐(2-6摩尔当量)，以形成二叔丁基-L-胱氨酸(1)、乙酰化试剂和碱金属或碱土金属碳酸氢盐或碳酸盐的混合物。合适的是碳酸氢钠或碱金属氢氧化物如氢氧化钠(NaOH)，或碱土金属氢氧化物或氧化物，诸如氢氧化钙或氧化钙。优选碳酸氢钠。
通过在5-50℃(优选5-35℃，最优选10-25℃)的温度下继续搅拌混合物而发生反应。继续搅拌，直到所有的二叔丁基-L-胱氨酸(起始物料)被消耗(通常在1-24小时之间)，并且所需的N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸产物从溶液中沉淀出来。
将N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸(2)产物(用于NDAC的中间体)滤出并用水洗涤。
本发明方法的步骤2是制备N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸(“NDAC”)，即最终的NDAC产物。
步骤2包括提供合适的酸，包括但不限于例如甲酸、硫酸、磷酸或盐酸及它们的混合物(优选甲酸，因为其无毒、可生物降解和可重复使用的性质以及作为溶剂和试剂两者的适用性)。适宜的浓度为0.5ml-10ml酸/毫摩尔N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸(2)。
步骤2包括将N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸(2)(1摩尔当量)悬浮于酸中以形成悬浮体。
步骤2包括在20-100℃(优选40-80℃，最优选50-70℃)的温度下搅拌悬浮体以生成澄清且无色的均匀溶液。继续搅拌，直到所有的N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸(步骤2的起始物料)被消耗(通常在1-24小时之间)，并生成所需的产物N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸(“NDAC”)。
蒸发溶剂以得到无定形固体的N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸(“NDAC”)。
此外，步骤2可以包括通过向无定形N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸中添加与水不混溶的有机溶剂如乙酸乙酯，剧烈搅拌以使其沉淀/固化成白色固体，从而纯化和分离更高质量的白色结晶固体的N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸。该方法的最后一步可以包括通过离心或过滤，优选通过过滤分离沉淀的N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸(“NDAC”)产物。
适用于本发明方法的所有起始物料均可从商业来源获得，例如从Sigma-Aldrich、Bachem获得。
在步骤1中特别优选的是碳酸氢钠，因为它在溶液中生成无毒的氯化钠副产物，氯化钠易于通过过滤与产物分离。
试剂和溶剂的相对量应使得不具有剩余的起始成分，以使反应完成时废料的量最小化。
优选地，本发明方法还包含任选的步骤。例如任选的步骤(1-A)，其中在过滤中间体N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸(2)后产生的含有乙酸钠和氯化钠副产物的水滤液可以重复用于步骤1的额外循环，或者经处理以回收所述水，并独立地分离乙酸钠(或乙酸)和氯化钠而用于其它用途。任选的步骤(2-A)，其中收集步骤2中使用的甲酸，并将其循环用于步骤2的额外循环。这些任选步骤两者均使得能够提高产物周转率并减少废料。
本发明的方法是有利的，至少因为它不使用任何有毒的、危险的或易燃的有机溶剂，导致副产物(如果有的话)的形成最少，不会产生具有不希望的硫磺气味的产物，两个步骤均可在单个容器中进行，并且相对快速。其还使纯度提高到90％-99.9％，优选95-99.5％，最优选至少95％，并使总收率提高到85％-95％，优选90％，最优选至少90％-95％。
具体实施方式
实施例
实验方法
所有试剂和溶剂均从商业来源获得，使用时无需进一步纯化。所购氨基酸均为L立体异构体。L-胱氨酸(>98％)购自Sigma。N,N’-二乙酰基胱氨酸(NDAC；95％)购自CombiBlocks。二叔丁基-L-胱氨酸二盐酸盐(DTBC；98％)购自Bachem。
使用乙酸乙酯、异丙醇和水的混合物，在硅胶上用薄层色谱(TLC)进行反应监测。通过将TLC板置于乙醇中的2％茚三酮中，然后加热，进行TLC板的视觉化。使用1H核磁共振(1H NMR)和液相色谱质谱(LCMS)对反应产物进行定性分析和确认。通过使用TLC、1H NMR和LCMS方法的组合，与纯的可靠的标准品进行比较来评估反应产物的纯度。
实施例1
实施本发明范围内的方法的实例。
具体的非排他性代表性实验程序按如下两个步骤进行。
步骤1-N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸(2)–
将乙酸酐(0.55ml，5.9毫摩尔)添加到二叔丁基-L-胱氨酸(1)二盐酸盐(1g，2.4毫摩尔)在水(10ml)中的溶液中，然后添加碳酸氢钠(790mg，9.4毫摩尔)，并将混合物在室温下搅拌16小时，此时产物沉淀为白色固体。
此时，TLC(100％乙酸乙酯洗脱)显示主要产物的清洁形成。
滤出产物，用水(3×10ml)洗涤，并在真空下干燥，得到白色固体的纯的N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸，其纯度足以用于下一步(905mg，88％收率)。同一方法在不同规模上的其他试验仅在1.5小时内完成，且收率高达95％。通过1H NMR和LCMS确认产物的身份和纯度(>95％)。
步骤2-N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸(NDAC)–
将N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸(2)(500mg，1.15毫摩尔)悬浮于甲酸(1mL)中，并在60℃下加热3小时，得到澄清且无色的均匀溶液。
此时，TLC(30∶40∶30的乙酸乙酯∶异丙醇∶水)显示单一产物的清洁形成，且无反应物/起始物料。
在60℃下在减压除去溶剂，得到无色玻璃状凝胶。
任选地，通过添加乙酸乙酯使产物沉淀，过滤并在高真空下干燥，得到纯N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸(“NDAC”)，其为白色固体(350mg，97％的收率)。还测试了除甲酸以外的酸性试剂(硫酸、乙酸和
Figure BDA0003913574680000131
15氢形式)，成功转化了NDAC。通过1H NMR和LCMS，经由与NDAC(95％纯度)可靠标准品进行比较，确认了产物的身份和纯度(>95％)。
具体的实验程序总结在下面的化学反应式中：
Figure BDA0003913574680000141
实施例2
实施本发明范围内的方法的实例。
具体的非排他性代表实验程序在单个容器中在一个步骤中完成，如下所示。
Figure BDA0003913574680000142
N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸(NDAC)–
将乙酸酐(0.28ml，2.9毫摩尔)添加到二叔丁基-L-胱氨酸(1)二盐酸盐(0.5g，1.2毫摩尔)在水(5ml)中的溶液中，然后添加碳酸氢钠(395mg，4.7毫摩尔)，并将混合物在室温下搅拌1.5小时，此时产物沉淀为白色固体。
此时，TLC(100％乙酸乙酯洗脱)显示中间体N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸(2)的清洁形成。
添加甲酸(3mL)，并在80℃下加热5小时，生成澄清且无色的均匀溶液。
此时，TLC(30∶40∶30的乙酸乙酯∶异丙醇∶水)显示NDAC的清洁形成。
在70-80℃、在高真空下除去溶剂，并将固体残余物悬浮于乙醇(6ml)中，搅拌10分钟，过滤并用乙醇(2×3ml)洗涤。
将合并的乙醇滤液在50℃、在高真空下蒸发，得到纯NDAC的白色固体(270mg，71％收率)。通过TLC、1H NMR和LCMS方法确认产物身份和纯度(>95％)。
如上述程序所示，本发明的两步骤方法可进一步简化，并可方便地在单个容器中进行，无需分离中间体N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸(2)。在这种情况下，最终产物NDAC的分离可以通过加入醇(以沉淀NaCl和乙酸钠盐)和简单过滤来方便地进行。
对比例A
以下超出范围的实施例说明在本发明条件下乙酰化试剂的临界状态。在该实施例中，使用乙酰氯(酰基氯)代替乙酸酐，从而不会有中间体N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸产物的形成。
Figure BDA0003913574680000151
对比例A
将碳酸氢钠(158mg，1.9毫摩尔)添加到二叔丁基-L-胱氨酸(1)二盐酸盐(0.2g，0.5毫摩尔)在水(2ml)中的溶液中，然后添加乙酰氯(134μl，1.9毫摩尔)，并将混合物在室温下搅拌1.5小时，此时溶液仍保持为澄清且无色的均匀溶液。
此时，TLC(100％乙酸乙酯洗脱)未显示中间体N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸(2)的形成，仅存在二叔丁基-L-胱氨酸(1)二盐酸盐起始物料。
如上述实施例所示，乙酰化试剂的性质对于本发明方法的成功至关重要。同样重要的是，考虑到酰基氯已被用作乙酰化试剂，以从二叔丁基胱氨酸制备其它N,N’-二烷酰基-二叔丁基胱氨酸，该超出范围的实施例进一步说明了本发明方法的独特性(参见例如Liebigs Annalen der Chemie(1987)895-9；Journal of Inorganic Biochemistry(2011)105,880-886)。
对比例B
出于比较的目的，根据European Journal of Organic Chemistry(2008)26,4417-4425进行了一种方法。
对比例B-N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸(2)
将乙酸酐(2.7ml，29毫摩尔)添加到二叔丁基-L-胱氨酸二盐酸盐(2.48g，5.83毫摩尔)在吡啶(25ml；无水)中的悬浮体中，并冷却至0℃。在搅拌混合物以产生均匀溶液并使放热反应减弱后，将反应混合物置于4℃下2天。添加冰，然后分批添加盐酸(12.1M，25mL)，以保持温度低于20℃，并保持pH值在4-5。将反应混合物用乙醚(4X 100ml)提取，合并的有机层用硫酸水溶液(0.5M)洗涤，直至pH为2-3，然后用饱和碳酸氢钠洗涤。干燥有机层并除去溶剂后，将残余物溶于氯仿(20ml)中，并添加己烷直至持续混浊。使产物在4℃下结晶过夜，过滤并干燥，得到2.16g(85％)。
从以上程序可以看出，生成N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸(2)中间体的非水方法(总共3天)比本发明方法(1.5-16小时)耗时长得多，与本发明方法(使用水)相比，该方法涉及使用有毒且易燃的有机溶剂(吡啶、乙醚、氯仿和己烷)，导致的收率(85％)与本发明方法(88-95％)相比还略微降低，并且与本发明方法(过滤和用水洗涤)相比更难纯化(提取后处理和结晶)。

Claims (13)

1.一种制备N,N’-二乙酰基-胱氨酸(“NDAC”)的化学方法，所述方法包括以下步骤：
形成反应混合物，从二盐酸盐形式的胱氨酸衍生物二叔丁基-L-胱氨酸开始；
将所述二叔丁基-L-胱氨酸乙酰化，以得到N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸；接下来
从所述N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸中除去所述叔丁基，以得到N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸产物；以及
从所述反应混合物中分离所述N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸产物；其中所述乙酰化试剂为乙酸酐。
2.根据权利要求1所述的制备N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)通过以下步骤制备作为中间体的N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸：
在5至50℃，优选5至35℃，最优选10至25℃的温度下制备二盐酸盐形式的二叔丁基-L-胱氨酸的1摩尔当量的水溶液；
向所述溶液中添加2至5摩尔当量的乙酰化试剂；其中所述乙酰化试剂为乙酸酐；向所述溶液中添加2至6摩尔当量的碱，以形成二叔丁基-L-胱氨酸、乙酰化试剂和碱的混合物；
持续搅拌所述混合物，并使反应在5至50℃，优选5至35℃，最优选10至25℃的温度下发生，以使N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸中间产物从反应混合物中沉淀出来；
过滤出N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸，并用水洗涤；
(2)通过以下步骤制备N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸产物：
提供0.5ml-10ml的酸/毫摩尔的所述N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸，包括：
将1摩尔当量的N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸悬浮于所述酸中以形成悬浮体；
在20至100℃、优选40至80℃、最优选50至70℃的温度下搅拌所述悬浮体，以生成澄清且无色的均匀溶液；
蒸发溶液溶剂，以得到无定形固体的N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述碱为无机碱。
4.根据权利要求2-3中任一项所述的方法，其中所述碱选自由以下组成的组：(i)碱金属碳酸氢盐或碳酸盐，(ii)碱土金属碳酸氢盐或碳酸盐，(iv)碱金属氢氧化物，以及(iii)它们的混合物。
5.根据权利要求2-3中任一项所述的方法，其中所述碱选自由以下组成的组：碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钙、氧化钙及它们的混合物；优选为碳酸氢钠。
6.根据权利要求2(1)所述的方法，其中所述碱性混合物的所述搅拌持续1-24小时，直到所有的二叔丁基-L-胱氨酸(起始物料)被消耗，并且直到N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸产物从溶液中沉淀出来。
7.根据权利要求2所述的方法，其中所述酸选自由以下组成的组：甲酸、硫酸、磷酸或盐酸及它们的混合物；优选为甲酸。
8.根据权利要求2(2)所述的方法，其中所述酸混合物的所述搅拌持续1-24小时，直到所有的N,N’-二乙酰基-二叔丁基-L-胱氨酸被消耗，并生成所需的产物N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸。
9.根据权利要求2-8中任一项所述的方法，其还包括通过向无定形N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸中添加与水不混溶的有机溶剂并剧烈搅拌，以实施沉淀/固化成白色固体，将所述N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸纯化和分离为更高质量的白色结晶固体。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述有机溶剂为乙酸乙酯。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其进一步包括最后步骤，所述最后步骤包括通过离心或过滤，优选通过过滤，分离所述沉淀的N,N’-二乙酰基-L-胱氨酸产物。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述反应在单个容器中在一个步骤中进行，而不分离中间体(2)。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括：
添加所有试剂，使步骤1发生，添加步骤2试剂，加热，添加醇以沉淀盐，滤出盐，以及蒸发醇以分离NDAC。
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