CN115453109A - 一种检测水产品中四环素、氯霉素的荧光免疫层析试纸条及其制备方法 - Google Patents

一种检测水产品中四环素、氯霉素的荧光免疫层析试纸条及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本申请提供的一种检测水产品中四环素、氯霉素的荧光免疫层析试纸条，可同步检测水产品中的四环素以及氯霉素的残留，检测准确性高，荧光信号稳定，具有良好的抗有机溶剂的能力，且检测具有高灵敏度、高特异性的特点，能够实现简单快速检测，操作简便，适合于大规模筛选。

Description

一种检测水产品中四环素、氯霉素的荧光免疫层析试纸条及 其制备方法
技术领域
本发明属于医学免疫学中荧光免疫层析技术领域，尤其是涉及一种检测水产品中四环素、氯霉素的荧光免疫层析试纸条及其制备方法。
背景技术
抗生素是我国目前规模化、集约化水产品养殖模式下防治病害的主要方式。目前农业部已批准的水产养殖用药包括抗微生物药、中草药、抗寄生虫药、消毒剂、环境改良剂、疫苗、生殖及代谢调节药等7类，并明确了在水产养殖中应用的对象。
其中，四环素类和氯霉素类抗生素药物因其价格低廉、抗菌谱广、抗菌能力强，被广泛地应用于畜禽和鱼虾类的药物、饲料添加剂和生长促进剂而大量使用。据了解，中国每年生产抗生素原料大约21万吨，其中有9.7万吨抗生素用于畜牧水产养殖业，占年总产量的46.1％。人长期摄入含抗生素残留的水产品后，药物不断在体内蓄积，当浓度达到一定量后，就会对人体产生毒性作用，四环素类药物的毒性反应主要表现为对胃、肠、肝脏的损害及牙齿的染色等。还会造成过敏反应，二重感染，致畸胎作用。而氯霉素有严重的副作用，它能抑制人体骨髓造血功能而引起再生障碍性贫血和粒状白细胞缺乏症等疾病，对人类的健康构成潜在的危害，世界各国对此两类广谱抗生素药物残留的检测十分关注。因此，能准确有效检测水产品中的抗生素是十分必要的。
因此，亟需一种简单快速、准确度高的检测水产品中四环素、氯霉素的荧光免疫层析试纸条及其制备方法。
发明内容
本发明为了解决现有技术难以同步检测水产品中四环素、氯霉素，且检测时间长的技术问题，提供一种操作简单，准确度高的检测水产品中四环素、氯霉素的荧光免疫层析试纸条。
本发明的第二个目的是提供检测水产品中四环素、氯霉素的荧光免疫层析试纸条的制备方法。
为实现上述第一个目的，本发明采用的技术方案是：
一种检测水产品中四环素、氯霉素的荧光免疫层析试纸条，包括PVC底板，所述PVC底板上沿长度方向依次黏贴有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸，所述硝酸纤维素膜上靠近所述结合垫侧设有第一检测线和第二检测线，所述硝酸纤维素膜上靠近所述吸水纸侧设有质控线，所述结合垫含有稀土荧光微球标记的四环素类单克隆抗体和氯霉素类单克隆抗体；
所述第一检测线上包被有四环素类抗生素半抗原载体蛋白偶联物，所述第二检测线上包被有氯霉素类抗生素半抗原载体蛋白偶联物；所述质控线上包被有羊抗鼠IgG抗体。
如上所述的检测水产品中四环素、氯霉素的荧光免疫层析试纸条，所述稀土荧光微球为稀土铕掺杂聚苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯共聚物。
如上所述的检测水产品中四环素、氯霉素的荧光免疫层析试纸条，所述稀土荧光微球标记的四环素类单克隆抗体和氯霉素类单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
在0.1mol/L的NHS和EDC的PBS缓冲溶液中加入100μL的稀土荧光微球，然后分别加入四环素类单克隆抗体和氯霉素类单克隆抗体，室温下搅拌4小时，加入BSA至其终浓度为1％，静置10min，用0.01M pH 7.5的PBS溶液重悬，4℃避光保存备用，即得。
如上所述的检测水产品中四环素、氯霉素的荧光免疫层析试纸条，所述四环素类抗生素半抗原载体蛋白偶联物和所述氯霉素类抗生素半抗原载体蛋白偶联物的浓度均为0.4-0.8mg/mL；所述羊抗鼠IgG的浓度为0.6-0.8mg/mL。
如上所述的检测水产品中四环素、氯霉素的荧光免疫层析试纸条，所述稀土荧光微球的直径为200-280nm，在基态下稳定，于365nm的激发光源作用下发射出波长范围在605-615nm的荧光。
如上所述的检测水产品中四环素、氯霉素的荧光免疫层析试纸条，所述稀土荧光微球的荧光寿命为0.72-0.78ms。
如上所述的检测水产品中四环素、氯霉素的荧光免疫层析试纸条，所述第一检测线与第二检测线之间的距离为3-5mm。
如上所述的检测水产品中四环素、氯霉素的荧光免疫层析试纸条，所述第二检测线与质控线之间的距离为4mm。
为了实现上述第二个目的，本发明采用的技术方案是：
一种如上任一项所述的检测水产品中四环素、氯霉素的荧光免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、在结合垫上喷涂稀土荧光微球标记的四环素类单克隆抗体和氯霉素类单克隆抗体，于室温真空干燥12h；
S2、将样片垫浸泡于20mmol/LpH为7.4，含1.0％BSA，0.25％Tween-20、1％PVP K-40、0.5％PEG 40000和0.1％NaN3的磷酸缓冲液中，于60℃干燥2h；
S3、在硝酸纤维素膜上的第一检测线上包被四环素类抗生素半抗原载体蛋白偶联物；在第二检测线上包被氯霉素类抗生素半抗原载体蛋白偶联物和在质控线上包被羊抗鼠IgG抗体，于37℃真空干燥12h；
S4、将吸水纸、步骤S3中得到的硝酸纤维素膜、步骤S1中得到的结合垫和经过步骤S3预处理的样本垫按顺序粘贴在PVC底板上，用自动切条机切成4mm宽的试纸条，于室温条件下真空干燥。
如上所述的检测水产品中四环素、氯霉素的荧光免疫层析试纸条的制备方法，所述四环素类抗生素半抗原载体蛋白偶联物和所述氯霉素类抗生素半抗原载体蛋白偶联物的包被量为2.1-3.1μL；所述羊抗鼠IgG抗体的包被量为2.0μL。
本发明相对于现有技术，有以下优点：
1、本申请提供的一种检测水产品中四环素、氯霉素的荧光免疫层析试纸条，可同步检测水产品中的四环素以及氯霉素的残留，检测准确性高，荧光信号稳定，具有良好的抗有机溶剂的能力，且检测具有高灵敏度、高特异性的特点，能够实现简单快速检测，操作简便，适合于大规模筛选。
2、本申请提供的一种检测水产品中四环素、氯霉素的荧光免疫层析试纸条的制备方法，操作简单，且制备方便，制备所得的试纸条便于携带，可在现场快速检测水产品中的四环素以及氯霉素，检测过程时间短，可弥补水产品中广谱抗生素残留的现场快速检测技术的短板。
具体实施方式
根据本发明的实施方式，提供了以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。另外，本发明中的术语“包被”为免疫领域的术语，包含吸附、固定之意。下面结合具体实施例说明本发明的具体技术方案：
实施例1：
(1)制备含有稀土荧光微球标记的四环素类单克隆抗体和氯霉素类单克隆抗体：
在0.1mol/L的NHS和EDC的PBS缓冲溶液中加入100μL的稀土荧光微球，然后分别加入四环素类单克隆抗体和氯霉素类单克隆抗体，室温下搅拌4小时，加入BSA至其终浓度为1％，静置10min，用0.01M pH 7.5的PBS溶液重悬，4℃避光保存备用，即得含有稀土荧光微球标记的四环素类单克隆抗体和氯霉素类单克隆抗体。
(2)制备检测水产品中四环素、氯霉素的荧光免疫层析试纸条：
S1、在结合垫上喷涂步骤(1)中稀土荧光微球标记的四环素类单克隆抗体和氯霉素类单克隆抗体，于室温真空干燥12h；
S2、将样片垫浸泡于20mmol/LpH为7.4，含1.0％BSA，0.25％Tween-20、1％PVP K-40、0.5％PEG 40000和0.1％NaN3的磷酸缓冲液中，于60℃干燥2h；
S3、在硝酸纤维素膜上的第一检测线上包被2μL的四环素类抗生素半抗原载体蛋白偶联物；在第二检测线上包被2μL的氯霉素类抗生素半抗原载体蛋白偶联物和在质控线上包被2μL的羊抗鼠IgG抗体，于37℃真空干燥12h；
S4、将吸水纸、步骤S3中得到的硝酸纤维素膜、步骤S1中得到的结合垫和经过步骤S3预处理的样本垫按顺序粘贴在PVC底板上，用自动切条机切成4mm宽的试纸条，于室温条件下真空干燥。
实施例2：样品检测和结果分析
上述制备所得的试剂盒的性能指标：
1、线性范围：
1.1四环素类抗生素在0.3μg/mL-54.3μg/mL范围内，相关系数r≥0.9900；
1.2氯霉素类抗生素在0.05mg/mL-6.32mg/mL范围内，相关系数r≥0.9900；
2、重复性：
2.1四环素类抗生素变异系数(CV)≤15％；
2.2氯霉素类抗生素变异系数(CV)≤15％。
3、批间差：
3.1四环素类抗生素≤20％；
3.2氯霉素类抗生素≤20％。
4、准确度：
4.1四环素类抗生素以参考品为检测样本，测定结果与标示值相对偏差应在±15％范围之内；
4.2氯霉素类抗生素以参考品为检测样本，测定结果与标示值相对偏差应在±15％范围之内。
5、最低检测限：
5.1四环素类抗生素：不高于0.3μg/mL；
5.2氯霉素类抗生素：不高于0.05mg/mL。
本申请提供的一种检测水产品中四环素、氯霉素的荧光免疫层析试纸条，可同步检测水产品中的四环素以及氯霉素的残留，检测准确性高，荧光信号稳定，具有良好的抗有机溶剂的能力，且检测具有高灵敏度、高特异性的特点，能够实现简单快速检测，操作简便，适合于大规模筛选；提供的制备方法，操作简单，且制备方便，制备所得的试纸条便于携带，可在现场快速检测水产品中的四环素以及氯霉素，检测过程时间短，可弥补水产品中广谱抗生素残留的现场快速检测技术的短板。
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测水产品中四环素、氯霉素的荧光免疫层析试纸条，包括PVC底板，所述PVC底板上沿长度方向依次黏贴有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸，其特征在于：所述硝酸纤维素膜上靠近所述结合垫侧设有第一检测线和第二检测线，所述硝酸纤维素膜上靠近所述吸水纸侧设有质控线，所述结合垫含有稀土荧光微球标记的四环素类单克隆抗体和氯霉素类单克隆抗体；
所述第一检测线上包被有四环素类抗生素半抗原载体蛋白偶联物，所述第二检测线上包被有氯霉素类抗生素半抗原载体蛋白偶联物；所述质控线上包被有羊抗鼠IgG抗体。
2.根据权利要求1所述的检测水产品中四环素、氯霉素的荧光免疫层析试纸条，其特征在于：所述稀土荧光微球为稀土铕掺杂聚苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯共聚物。
3.根据权利要求1所述的检测水产品中四环素、氯霉素的荧光免疫层析试纸条，其特征在于：所述稀土荧光微球标记的四环素类单克隆抗体和氯霉素类单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
在0.1mol/L的NHS和EDC的PBS缓冲溶液中加入100μL的稀土荧光微球，然后分别加入四环素类单克隆抗体和氯霉素类单克隆抗体，室温下搅拌4小时，加入BSA至其终浓度为1％，静置10min，用0.01M pH 7.5的PBS溶液重悬，4℃避光保存备用，即得。
4.根据权利要求1所述的检测水产品中四环素、氯霉素的荧光免疫层析试纸条，其特征在于：所述四环素类抗生素半抗原载体蛋白偶联物和所述氯霉素类抗生素半抗原载体蛋白偶联物的浓度均为0.4-0.8mg/mL；所述羊抗鼠IgG的浓度为0.6-0.8mg/mL。
5.根据权利要求1所述的检测水产品中四环素、氯霉素的荧光免疫层析试纸条，其特征在于：所述稀土荧光微球的直径为200-280nm，在基态下稳定，于365nm的激发光源作用下发射出波长范围在605-615nm的荧光。
6.根据权利要求1所述的检测水产品中四环素、氯霉素的荧光免疫层析试纸条，其特征在于：所述稀土荧光微球的荧光寿命为0.72-0.78ms。
7.根据权利要求1所述的检测水产品中四环素、氯霉素的荧光免疫层析试纸条，其特征在于：所述第一检测线与第二检测线之间的距离为3-5mm。
8.根据权利要求1所述的检测水产品中四环素、氯霉素的荧光免疫层析试纸条，其特征在于：所述第二检测线与质控线之间的距离为4mm。
9.一种如权利要求1-8任一项所述的检测水产品中四环素、氯霉素的荧光免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、在结合垫上喷涂稀土荧光微球标记的四环素类单克隆抗体和氯霉素类单克隆抗体，于室温真空干燥12h；
S2、将样片垫浸泡于20mmol/LpH为7.4，含1.0％BSA，0.25％Tween-20、1％PVP K-40、0.5％PEG 40000和0.1％NaN3的磷酸缓冲液中，于60℃干燥2h；
S3、在硝酸纤维素膜上的第一检测线上包被四环素类抗生素半抗原载体蛋白偶联物；在第二检测线上包被氯霉素类抗生素半抗原载体蛋白偶联物和在质控线上包被羊抗鼠IgG抗体，于37℃真空干燥12h；
S4、将吸水纸、步骤S3中得到的硝酸纤维素膜、步骤S1中得到的结合垫和经过步骤S3预处理的样本垫按顺序粘贴在PVC底板上，用自动切条机切成4mm宽的试纸条，于室温条件下真空干燥。
10.根据权利要求9所述的检测水产品中四环素、氯霉素的荧光免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：所述四环素类抗生素半抗原载体蛋白偶联物和所述氯霉素类抗生素半抗原载体蛋白偶联物的包被量为2μL；所述羊抗鼠IgG抗体的包被量为2μL。
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