CN115427579A - 增强和加速抗体表达的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请描述使用CRISPR/Cas复合体用于靶向激活内源性主转录调控元件(MTRE)比如PRDM1、XBP1和IRF4，以在生产细胞系(比如CHO和NSO细胞)中产生高产抗体生产的细胞、系统和分子工程方法。这些包括包含Cas辅助蛋白、设计多个引导RNA(gRNA)以及使用例如慢病毒转染对这些组件的独特多重复用以诱导MTRE控制下抗体基因的转录和翻译增加。这些方法产生协同作用，增加这些修饰细胞系的单克隆抗体产生。尽管这种激活方法证明了生产力显著提高，但生产力的进一步提高可通过基因转移另外的MTRE拷贝来实现。
Description
发明领域
使用这种描述的方法，工程改造的元件可掺入具有已知生产水平的主生产细胞系中，并表达限定的单克隆抗体(mAb)成分，所述方法促进重链和轻链基因或互补决定区(CDR)结构域的交换以在生成表达由交换基因产物指定的抗体的新生产细胞系中利用主细胞系改进的抗体生产能力。这些描述的增加抗体生产的方法将尤其包括内源性主转录调控元件的三链体激活和基因扩增。在转录、转录后、翻译和翻译后水平上同时整合多个元件结合位点特异性基因产物交换，在生产细胞系中提供协同抗体表达增强，同时减少制造工艺开发的可变性。
发明背景
需要快速生产高滴度的mAb用于临床和商业应用。一种用于生产单克隆抗体(mAb)的方法为生成本领域众所周知的杂交瘤细胞。用于生产单克隆抗体的方法由Kohler和Milstein在Nature 256, 495-497 (1975)中以及由Donillard和Hoffman在Schwartz编辑的Compendium of Immunology V. II, 1981中的"Basic Facts about Hybridomas"中公开。人类杂交瘤为通过人类B细胞与骨髓瘤或异源骨髓瘤细胞的融合获得。生产过程包括在使得抗体能够分泌的条件下培养杂交瘤，并从培养上清液中纯化抗体。用于治疗用途的mAb的产生需要使用具有关键制造特性(包括生产稳定性和高滴度生产力)的细胞大规模制造和生产mAb。
杂交瘤技术的替代方法为在哺乳动物细胞系中重组表达编码抗体轻链和重链的核酸。哺乳动物细胞系为优选的，因为它们提供产生与人类细胞最相似的转录、翻译和翻译后修饰的优势。最常用的哺乳动物细胞系为中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、鼠骨髓瘤细胞系NS0(European Collection of Animal Cell Cultures，ECACC编号85110503)和人胚肾293细胞(HEK293)。然而，由于每个细胞系的可变性，生成用于有效抗体制造和生产的这种细胞系需要花费1.5-2年。
细胞系工程改造为改进细胞系的方法，并且最近在基因编辑技术比如ZFN (锌指核酸酶)、TALEN (转录激活因子样效应核酸酶)和CRISPR/Cas系统方面的发现和进展使得可实现有效和定向的细胞工程改造。目前的方法已用于调控细胞凋亡、代谢工程、工程改造用于在较低温度下生长的细胞、伴侣蛋白工程和糖工程(Dangi等人, 2018)。
特别感兴趣的为发现为细菌中用于控制病原体的自然防御机制的CRISPR/Cas基因的使用。最近的研究扩展了其作为用于工程改造真核细胞的工具的应用。
鉴于上述，需要消除在抗体生产过程的开发和验证中涉及的多余工作。可通过提高培养中宿主细胞的抗体分泌量的方法来实现益处。本发明提供这些和其他特征，其在阅读以下内容后将为显而易见的。
发明概述
本发明涉及用于增强和简化抗体表达的细胞、系统和方法，例如通过新增强元件与表达宿主细胞系的内源性特征的协同相互作用。
宿主细胞最初可表达(例如转录、翻译和分泌)给定的抗体。可将非内源性工具引入到细胞中以协同合作，提供抗体产生相对于标准宿主细胞表达增加许多倍。进一步地，可快速修饰产生一种抗体产物的表征良好的宿主细胞系以产生针对不同靶标的抗体，同时保留熟悉的经过验证的属性。
本文描述了与能够获得高于内源性表达水平的转录激活因子连接的CRISPR/dCas9。在许多实施方案中，转录激活因子连接于dCas9的C-末端并激活转录因子的表达，进而刺激与来自培养的宿主细胞的抗体产生和分泌相关的蛋白表达。这种增强令人意外地具有协同作用，例如当靶向激活因子的组合被引导至沿着一种或多种转录因子的启动子区域的多个位置时。例如，产生丰富的目标抗体的细胞系可包括与转录激活因子连接的CRISPR/dCas9、具有与第一转录因子的启动子区域互补的间隔序列的第一引导RNA (gRNA)和具有与第二转录因子的启动子区域互补的间隔序列的第二gRNA。第一和第二gRNA彼此不同，并且第一和第二转录因子也彼此不同。进一步地，细胞可包括具有与同第一和第二转录因子不同的第三转录因子的启动子区域互补的间隔序列的第三gRNA。转录因子优选地为增加目标抗体表达的那些因子。
在另一方面，通过将两个或更多个gRNA引导至同一启动子的不同位置，可令人意外地和协同地增强转录激活因子的活性和产生(例如大于单纯的相加结果)。例如，许多gRNA间隔序列的长度为约20 bp，而许多启动子区域的范围为约200 bp或更多。例如，通过将具有不同间隔序列的3个gRNA引导至不同的启动子位置(例如朝向200 bp区域的末端和中心)，可获得超过相加表达增加。任选地，可获得期望的表达改善，例如使用分别针对转录因子PRDM1、XBP1 或IRF4的启动子的单个gRNA。
在某些实施方案中，细胞系基于CHO、NS0、Sp2/0或鼠骨髓瘤细胞系X63Ag8.653。通常细胞为先前表达期望的抗体但如本文所述进行调整以增强表达的那些细胞。在备选实施方案中，初始细胞可表达不同的抗体，仅如本文所述进行修饰以产生不同的目标抗体。
表达增强系统的转录激活因子可为与目标蛋白产物相关的任何功能。在涉及抗体的许多情况下，激活因子可选自VP64、VP16和激活辅助蛋白复合体MS2-p65-HSF1 (MPH)中的一种或多种。例如，一种或多种不同的CRISPR/Cas9-激活因子(和/或CRISPR/Cas12a-激活因子)复合体可配置为增加转录因子的表达，所述转录因子比如参与XBP1、IRF4、PRDM1、ELL2、SPI1、pTEFb、AFF4、AFF1、SUPT5HM、DOT1L、IRE1、PERK、BIP、SRP9、SRP14和/或SRP54表达的那些转录因子。特别可用于增强抗体表达的优选的转录因子包括例如PRDM1、XBP1和IRF4。编码核酸可为宿主细胞内源性的或重组的。转录因子和/或其编码核酸可为宿主细胞内源性的和/或通过例如转导、转染、电穿孔等掺入。
在本发明的另外方面，系统和细胞可包括备选或互补因子以提供增强的表达。例如，细胞进一步包括可能干扰表达的蛋白表达的抑制因子，比如AICDA、SIAH1和HNRNP F。任选地，宿主细胞可适于降低MLL2蛋白与IgH启动子或Eμ增强子的结合。在另一选项中，细胞可适于在IgH启动子或 Eμ增强子处增加H3K4甲基化或增加H3K79甲基化。
在一个优选的实施方案中，抗体生产系统包括以下选项中的一种或多种。产生目标抗体的细胞系可具有含有与包含VP64、激活辅助蛋白复合体MPH和/或类似物的转录激活因子连接的CRISPR/dCas9 (丧失切割活性的dCas9)的一个或多个细胞。一个或多个第一gRNA具有与PRDM1的启动子区域或自PRDM1通路下游肽的启动子区域互补的间隔序列。一个或多个第二gRNA具有与XBP1的启动子区域互补的间隔序列。并且，一个或多个第三gRNA具有与IRF4的转录起始位点互补的间隔序列。细胞系为例如CHO、NS0、Sp2/0、Vero、HEK 293或293T和鼠骨髓瘤细胞系X63Ag8.653，和转录激活因子在增强PRDM1、XBP1或IRF4的表达方面具有活性。转录因子在增加目标抗体中重链和/或轻链的表达方面起作用。细胞可具有存在于细胞基因组和/或基因组外序列中的编码抗体的核酸。
所述方法可增强目标抗体的表达。例如，表达方法可包括提供给细胞具有编码抗体重链的序列的核酸和具有编码抗体轻链的序列的核酸。提供给细胞作为复合体连接于转录激活因子的CRISPR/Cas (例如CRISPR/Cas9或CRISPR/Cas12)。这一复合体通过与转录因子启动子互补的第一引导RNA (gRNA)间隔序列被导向至转录因子编码序列。提供给细胞具有与第二转录因子的启动子区域互补的间隔序列的第二gRNA。第一和第二gRNA彼此不同，并且第一和第二转录因子彼此不同。转录因子的表达由与Cas蛋白连接的转录激活因子促进，并由gRNA间隔序列引导以增加抗体重链和/或轻链的表达。当提供与第一和/或第二启动子互补但在启动子区域的不同部分互补的一个或多个另外的gRNA时，这些方法可体验到特殊益处。例如，CRISPR/dCas9-激活因子或gRNA可通过任何适当的技术比如通过电穿孔、通过慢病毒转染或通过编码的转座子序列提供于细胞中。
在一个优选的实施方案中，可从以下条件预期在抗体生产中的特殊益处。优选的是CRISPR/dCas9与VP64、VP16或激活因子辅助复合体MS2-P65-HSF1 (MPH)转录激活因子连接。当与第一gRNA互补的启动子控制PRDM1或自PRDM1通路下游肽的表达，与第二gRNA互补的启动子为控制XBP1表达的启动子，和/或提供给细胞与控制IRF4表达的启动子互补的gRNA时，呈现有力的组合。在许多实施方案中，使用至少3种gRNA，或使用全部3种。特征的组合在宿主细胞系(比如CHO、NS0、Sp2/0和鼠骨髓瘤细胞系X63Ag8.653)的背景下为有用的。
本发明工程改造的宿主细胞的特殊生产力可传递给目标备选抗体的生产，例如通过交换提供特异性的抗体区域。例如，所述方法可进一步包括向表达宿主细胞提供抗体重链和/或轻链(或CDR)的修饰形式。具有编码抗体重链的序列的核酸和具有编码抗体轻链的序列的核酸可如下定制。细胞提供有CRISPR/Cas12或CRISPR/Cas9 (Cas9核酸酶活性无缺陷)。gRNA提供有与细胞内源性的重链序列和/或重链CDR靶序列互补的间隔序列。gRNA提供有与细胞内源性的轻链序列或轻链CDR靶序列互补的间隔序列。在细胞中提供具有期望的重链序列、轻链序列、重链CDR序列或轻链CDR序列的编辑模板核酸；编辑模板还包括与待交换出细胞的不期望的靶序列(例如先前表达的抗体的CDR3，不再是目标)侧翼的序列互补的相邻同源区域。gRNA与其互补的靶序列杂交。用CRISPR/Cas在gRNA杂交位点处切割靶向的内源性序列。当在细胞中通过同源定向修复(HDR)来修复切割时，将细胞的内源性靶序列替换为来自编辑模板的期望的重链序列、轻链序列、重链CDR序列或轻链CDR序列。因此，细胞的抗体表达从先前的内源性表达转变为目标抗体的表达。
本发明的表达系统包括gRNA多重表达系统，其包含编码两个或更多个gRNA序列的核酸链，每个gRNA序列包含针对与抗体表达功能相关的相同转录因子的不同启动子区域的不同间隔序列。转录因子(TF)可为适合于抗体表达的那些，例如由XBP1、IRF4、PRDM1、ELL2、SPI1、pTEFb、AFF4、AFF1、SUPT5HM、DOT1L、IRE1、PERK、BIP、SRP9、SRP14和/或SRP54组成的TF。
增强目标靶蛋白表达的方法包括提供给细胞一种或多种核酸，核酸编码两个或更多个gRNA序列，每个gRNA序列包含针对相同转录因子启动子的启动子的不同区域的不同间隔序列，并且提供例如与细胞的转录激活因子连接的CRISPR/dCas9。这种方法可导致靶蛋白表达为天然内源性表达水平的4倍或更多(图4)。
在一方面，gRNA多重表达系统可包含编码3个或更多个gRNA序列的核酸链，每个gRNA序列包含针对相同转录因子的启动子的不同区域的不同间隔序列。对于抗体生产，优选的转录因子组合包括XBP1、IRF4和PRDM1或PRDM1下游蛋白的转录因子。例如，在这种系统中，第一核酸链可编码3个或更多个gRNA序列，每个序列包含针对转录因子PRDM1的启动子的不同区域的不同间隔序列，并且第二核酸链编码3个或更多个gRNA序列，每个序列包含针对转录因子IRF4启动子的不同区域的不同间隔序列。
定义
在详细描述本发明之前，应当理解本发明不限于特定装置或生物系统，其当然可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不旨在为限制性的。如本说明书中使用的，单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”可包括复数指涉，除非内容另外明确规定。因此，例如提及“细胞”可包括两个或更多个细胞的组合；提及“细菌”包括细菌的混合物等。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管基于本公开可在没有过度实验的情况下实施与本文描述的那些相似或等效的任何方法和材料，但本文描述优选的材料和方法。在描述和要求保护本发明时，将根据以下列出的定义使用以下术语。
如本文使用的术语CRISPR是指成簇的规律间隔的短回文重复序列。 CRISPR/Cas9为众所周知的Cas9蛋白(具有核酸酶活性)和引导RNA (gRNA)的复合体。这一组合可将核酸酶活性靶向于DNA链上的精确位置。dCas9 (死亡或失能的Cas9)缺乏核酸酶活性，但与gRNA组合保留特异性靶向能力。CRISPR/Cas12a (Cpf1)为Cas12蛋白(具有核酸酶活性)和引导RNA的复合体。
如本文使用的gRNA为本领域通常已知的。gRNA为一种短RNA，由Cas蛋白结合相互作用所必需的支架序列和定义待修饰的DNA靶标的间隔序列(~20个核苷酸)组成。
如本文所用的术语“启动子”为本领域通常已知的。启动子序列为促进RNA聚合酶结合的DNA序列(一般地为100-1000个碱基对)，例如在转录起始位点5’末端上游的位置。
如本文使用的转录因子为本领域通常已知的。在本方法和系统中有用的转录因子一般地为与增强子或启动子序列结合以影响相关基因的转录速率的多肽。在本发明的许多实施方案中，与转录激活因子连接的CRISPR-dCas9靶向于已知刺激参与抗体表达的基因表达的转录因子的启动子。可用于本细胞、方法和系统的特定转录因子为参与增强抗体表达和/或分泌的那些转录因子。例如，这种有用的转录因子至少包括XBP1、IRF4、PRDM1、ELL2、SPI1、pTEFb、AFF4、AFF1、SUPT5HM、DOT1L、IRE1、PERK、BIP、SRP9、SRP14和SRP54；针对PRDM1功能性下游蛋白的转录因子；并且更具体地讲为PRDM1、XBP1和IRF4。
如本文使用的转录激活因子为例如与Cas (例如dCas9或Cas12a)的C-末端连接以增加本发明转录因子的表达的激活因子。转录激活因子可增加功能为增强细胞中目标抗体的表达和/或分泌的转录因子的转录。例如，本细胞和方法中常用的转录激活因子可包括VP64、VP16和/或激活辅助蛋白复合体MPH。
如本文使用的术语“内源性的”是指与外源性部分相比较，细胞天然的那些部分。例如，内源性基因为在通过接受外来核酸(例如通过电穿孔、基因工程、转染和/或类似方法)对其进行修饰之前最初存在于宿主细胞中的基因。
附图简述
图1A显示通过从亲代LA55至FP21的融合伴侣细胞系的依序发展来生成含有主转录因子调控元件的工程改造的融合伴侣细胞系。基于CD138表达(FP19)克隆选择源于亲代LA55细胞系的单细胞克隆。用dCas9-VP64转染FP19细胞，并选择稳定的FP19-dCas9-VP64表达细胞(FP19-dCAS9-复合体)用于进一步开发。随后，MPH (MS2-p65-HSF1)稳定整合到FP19-dCas9-VP64细胞中，以生成FP19c。FP20和FP21为通过稳定整合具有和不具有金黄色葡萄球菌(S. aureus) HLA特异性重链和轻链基因(分别为FP21和FP20)的多重gRNA产生的。
图1B显示工程改造的CHO细胞系的生成，展示BREATH CHO细胞系的来源和依序发展。用含有dCas9-VP64和MS2-p65-HSF1的慢病毒转导源于CHO细胞系的单细胞克隆，并稳定选择(CHO-dCas9复合体)用于进一步开发。在CHO-dCas9复合细胞中转导多重引导RNA(gRNA)，并使用Zeocin进行选择。稳定的细胞系命名为CHO-MTRE。最后，用表达抗金黄色葡萄球菌HLA的单克隆抗体(AR-301)的重链和轻链基因的哺乳动物表达载体转染CHO-MTRE，以生成BREATH CHO细胞系。
图2显示用于在融合伴侣细胞系中转导主转录因子调控元件(MTRE)的多重CRISPR的慢病毒构建体的示意图。
在图2A中，慢病毒转移载体表达dCas9-VP64以及杀稻瘟菌素(Blast)抗性基因(左)或辅助蛋白MPH (MS2-p65-HSF1)和潮霉素(Hygro)抗性基因(右)在EF1a启动子的控制下。缩写：Psi+RRE+cPPT：psi信号，rev反应元件，中央多嘌呤束；T2A：明脉扁刺蛾(Thoseaasigna)病毒2A肽；WPRE：土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调控元件；来自明脉扁刺蛾病毒(T2A)的自切割肽用于多顺反子表达。
在图2B中，用于在融合伴侣细胞中表达的含有带有(顶部)或不带有(底部)人类密码子优化的免疫球蛋白重链和轻链基因的多重构建体的慢病毒转移载体。来自明脉扁刺蛾病毒(T2A)、猪捷申病毒-1 (P2A)和马鼻炎A病毒(E2A)的自切割肽用于多顺反子表达。Zeocin为哺乳动物细胞的Zeocin抗性基因。缩写：Psi+RRE+cPPT：psi信号，rev反应元件，中央多嘌呤束；U6：U6启动子；HC 重链；LC轻链；Cys4 Cys4基因。
图2C显示多重构建体(图2B中的虚线)的扩展描绘，显示3 x 3个模块以创建一串9个gRNA (SEQ ID NO: 6-14)。gRNA包含20 bp的靶向区域以及含有结构特异性四环和茎环模块及两个MS2结合位点的gRNA支架。
在图2D中，慢病毒转移载体显示在CHO细胞中包含多重构建体。下图显示多重构建体(虚线)的扩展描绘，显示3 x 3个模块以创建一串9个gRNA。gRNA包含20 bp的靶向区域以及含有结构特异性四环和茎环模块及两个MS2结合位点的gRNA支架(SEQ ID NO: 15-25)。与图2C形成对比，CHO细胞中的多重构建体在同一载体中没有重链和轻链基因的表达盒。
图2E显示在用于转染和稳定整合AR301单克隆抗体(mAb)的重链和轻链基因的强大普遍存在的启动子下，在具有MTRE 激活的CHO宿主细胞系中表达AR301 HC (上图)和AR301 LC (下图)的高拷贝质粒DNA载体的示意图。两个重链和轻链盒在高拷贝质粒骨架pUC19中克隆。缩写：CAG杂合启动子，由与鸡β-肌动蛋白启动子融合的巨细胞病毒(CMV)增强子组成；EF1A延伸因子1α；Blast杀稻瘟菌素抗性基因；Hygro潮霉素抗性基因；SV40 pA猿猴病毒40的多聚A尾；bGH pA 牛生长激素的多聚A尾。AR301为一种结合金黄色葡萄球菌HLA的抗体。
图3：FP19-dCas9复合体中转基因的稳定表达。CRISPR介导的人类-小鼠异源骨髓瘤融合伴侣(FP19)细胞的基因转导导致转基因dCas9-VP64和MPH的稳定mRNA表达。通过随着时间的推移测量每个转基因来证实转基因经60代细胞的稳定mRNA表达。FP19细胞在第1、10和20代(G1、G10和G20)评估dCas9-VP64和MPH (MS2-p65-HSF1)转基因的mRNA表达，并通过RT-qPCR证实在每个时间点具有相似水平的每种mRNA转录物，与稳定表达一致。
在图4中，单个和多重基因转录物的激活通过FP19融合伴侣细胞中每种转录物的mRNA水平在CRISPR介导的激活前后的倍数变化并与使用杂乱gRNA的模拟激活相比较得到证明。含有稳定整合的dCas9-VP64和MS2-p65-HSF1转基因(FP19-dCas9复合体)的细胞用慢病毒转导，慢病毒含有在多重构建体(多重)中的所有9个gRNA，或如对每个基因(PRDM1、IRF4、XBP1)标记的单个gRNA或模拟转导(杂乱gRNA)。与单基因转导相比较，当使用多重组合激活时，每个基因的转录水平显著增加，这与协同基因激活一致。通过RT-qPCR测量PRDM1、XBP1和IRF4的转录物水平。
图5A和B显示经通过RT-qPCR测量的CRISPR介导的MTRE激活，在融合伴侣细胞(FP-AR301 MTRE)中MTRE、IgH和IgL基因的转录增强。在图5A中，通过RT-qPCR测量FP21 (或FP-AR301 MTRE)中PRDM1、IRF4和XBP1的增强mRNA表达。与非激活细胞中每种转录调控元件的基线表达(白条)相比较，表达AR-301的稳定细胞系在FP21细胞中表现出MTRE mRNA表达(灰条)增加至高达20倍。在图5B中，在通过RT-qPCR测量的MTRE激活后显示出AR-301在稳定的融合伴侣细胞(FP21或FP-AR301 MTRE)中增强的免疫球蛋白mRNA表达。与非激活细胞中的基线表达(白条)相比较，表达AR-301的稳定细胞系表现出IgH和IgL mRNA表达增加，在MTRE激活之后FP-AR301 MTRE细胞中的IgL mRNA表达(灰条)增加至高达1000倍。
图6显示通过人类免疫球蛋白(IgG)夹心ELISA测量的MTRE激活的FP21融合伴侣细胞中增强的分泌抗体生产力(分泌蛋白)。图表显示使用本发明的特征在MTRE激活后增强的分泌抗体生产力。对于表达金黄色葡萄球菌HLA特异性mAb (AR-301)的融合伴侣细胞，显示没有(虚线，FP AR-301)和具有(实线，FP AR-301 MTRE)按照所公开的多重方法的MTRE激活的稳定细胞系。通过人类免疫球蛋白(IgG)夹心ELISA测量来自连续培养的细胞的第0 天、第4天和第7天的抗体滴度。
在图7A中，CRISPR介导的CHO-DG44 (CHO MTRE)细胞系中MTRE的激活表现出如通过RT-qPCR测量的mRNA转录物水平的显著倍数变化。显示出dCas9复合体和MPH的mRNA转录物增加。通过RT-qPCR证明MTRE PRDM1、XBP1和IRF4的mRNA转录物增加。基于2-△△Ct计算相对于没有AR-301抗体表达基因的CHO DG44宿主细胞系的mRNA倍数变化表达。将mRNA转录物水平针对GAPDH标准化。
图7B显示CRISPR介导的CHO-DG44宿主细胞系(BREATH CHO)中MTRE的激活增强如通过RT-qPCR测量的IgH和IgL的mRNA转录物水平。将转录物水平针对普遍存在的管家基因EIF3I标准化。
图8显示在含有激活的MTRE表达的CHO-DG44宿主细胞系中分泌的AR-301 mAb蛋白产生。如图7中通过RT-qPCR所示的dCas9复合体、MPH、MTRE和IgH及IgL的mRNA表达增加，反映在以摇瓶规模分泌的免疫球蛋白水平的增加。通过IgG夹心ELISA在9天内连续生产的第0、2、5、7 和 9 天的不同时间点针对AR-301 mAb滴度测量摇瓶表达的分泌蛋白产生。测量了累积抗体滴度。
图9显示在MTRE激活的表达mAb的CHO细胞系CHO-A AR105中增强的抗体产生。AR105为一种人类单克隆抗体，其与铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)的胞外粘液多糖(MEP)结合。
图9A显示在MTRE激活后CHO细胞系中的PRDM1、XBP1和IRF4 mRNA表达增加。在图9A中，呈现非激活(CHO-AR-105)和CRISPR多重激活的CHO-AR105 (CHO-A AR105)细胞中mRNA转录物水平的比较，表明激活后如通过RT-qPCR测量的每种mRNA转录物的产生显著增加。对CHO-AR105 (没有MTRE激活)和CHO-A AR-105 (具有MTRE激活)显示PRDM1、XBP1和IRF4的mRNA转录物水平。
在图9B中，CRISPR介导的多重激活导致IgG滴度的产生显著增加，如通过纳米孔阵列上单细胞的荧光平均信号强度的增加测量的。在CRISPR非激活或激活的CHO-AR105生产细胞系接种后24小时测量每个含有单细胞的纳米孔的荧光强度。数据代表来自每个细胞系约500,000个细胞的平均荧光信号(*** p<0.0001)。
图9C显示CHO AR105和CHO-A AR105克隆的代表性图像，表明在具有和没有MTRE激活的情况下如通过孔荧光强度测量的分泌抗体水平的明显视觉差异。左图显示在没有(CHOAR105，左上图)和具有MTRE激活(左下图，CHO-A AR105)的纳米孔上的500,000个CHO AR105单细胞克隆群。右图显示8个单独的纳米孔，表明在没有MTRE激活(右上图)和具有MTRE激活(CHO-A AR105，右下图)的CHO AR105单个克隆群中的荧光信号。
在图10A中，如通过平均荧光信号强度的增加测量的，CRISPR介导的MTRE激活导致分泌的IgG蛋白的产生显著增加。平均荧光强度(MFI)与细胞沿纳米孔阵列壁沉积的分泌抗体的量相关(Bobo等人, 2014)。在CRISPR非激活(CHO-AR301)或激活的CHO-A AR301生产细胞系接种后24小时测量每个含有单细胞的纳米孔的荧光强度(以平均强度单位或MFI测量)。数据代表每个细胞系约10,000个细胞的平均荧光信号(**** p<0.0001)。
图10B显示了通过RT-qPCR测量的MTRE激活后CHO细胞系中PRDM1、XBP1和IRF4mRNA表达的增加。图10B中，呈现非激活(CHO AR-301)和CRISPR多重激活的CHO AR-301(CHO-A AR301)克隆细胞系中MTRE mRNA转录物水平的比较，表明激活后如通过RT-qPCR测量的每种mRNA转录物的产生显著增加。对CHO AR-301 (没有MTRE激活)和CHO-A AR-301(具有MTRE激活；克隆F4、B5和E2)显示PRDM1、XBP1和IRF4的mRNA转录物水平。
图10C显示在MTRE激活后CHO细胞系中的免疫球蛋白重链(IgH)和轻链(IgL) mRNA转录物增加。通过RT-qPCR测量MTRE的mRNA转录物。呈现非激活(CHO AR-301)和3种不同的CRISPR多重激活的CHO AR-301 (CHO-A AR301)细胞系(F4、B5和E2)中IgH和IgL的mRNA转录物水平的比较，表明每种MTRE转录物的mRNA水平显著增加。
图10D为MTRE激活的(CHO-A AR301)和亲代细胞系(CHO_AR301)的分泌蛋白(Ig滴度)的比较。在纳米孔上进行先导克隆选择和单细胞克隆后，将CHO-A-AR301扩增并接种以进行摇瓶生产(批量生产)。在接种后第7天，通过人类IgG夹心ELISA测量累积终点IgG滴度。
图11显示用于增强IgG转录(图11A; SEQ ID NO: 1-5)和诱导型UPR激活(图11B-D)的增强子和绝缘子元件的示意性载体构建体。
图11A呈现用于增强IgG表达的构建体。在上图含有嵌合HS4绝缘子的APEX-PX-MAR-HC-LC假增强子中，将支架/基质附着区(SAR)增强子(HS4-SAR-Top1-MAR)分别置于CAG启动子和AR301 HC基因以及EF1α启动子和AR301 LC基因之间。假增强子含有鼠PRDM1和鼠XBP1蛋白的共有结合位点。为进一步稳定基因表达，将Top1-MAR增强子置于重链和轻链基因的3’末端。
在图11B-11D中，显示UPR激活构建体。3种诱导型构建体可用于评估UPR激活的抗体产生增加。Ire (I642G)允许通过使用三磷酸腺苷(ATP)类似物1NM-PP1激活UPR。1NM-PPI可经选择性结合于Ire1 (I642G)激酶结构域的ATP袋来减弱Ire1 RNA酶活性而不影响细胞存活。Fv2E-PERK与AP20187处理组合具有与Ire1 (I642G)相似的效果。在图11B中，CHOIre1 (I642G)和Fv2E-PERK在使用T2A肽双顺反子表达的EF1a启动子的表达下组合在一起。图11C和图11D为在EF1α启动子控制下单独表达的单独的Ire (I642G)和Fv2E-PERK。缩写：CAG，鸡肌动蛋白启动子和β-球蛋白增强子元件；2A来自明脉扁刺蛾病毒(T2A)和猪捷申病毒-1 (P2A)的自切割肽；Hygro，赋予潮霉素抗性的基因；Bsd，赋予杀稻瘟菌素抗性的基因。
在图12A中，药物诱导型UPR通路激活以剂量依赖性方式促进ER扩增信号传导通路。该图显示用含有单独或组合表达Ire1-I642G或Fv2E-PERK的组成型启动子的质粒转染的CHO-K1细胞系中的药物诱导型UPR通路激活。在转染后24小时，用不同浓度的1NM-PP1(0、10或50 µM)处理细胞。通过未剪接的Xbp1 (Xbp1u)、剪接的Xbp1 (Xbp1s)、Chop、Gadd34和Atf4的RT-qPCR测量UPR基因的mRNA转录物。缩写：I642G-0NMPP，没有1NM-PP1的单独的IRE1 (I642G)组成型表达；I642G-10NMPP，具有10 µM 1NM-PP1的单独的IRE1 (I642G)组成型表达；I642G-10NMPP，具有50 µM 1NM-PP1的单独的IRE1 (I642G)组成型表达；I642G+F2VE-0NMPP，没有1NM-PP1的IRE1 (I642G)和Fv2E-PERK一起组成型表达；I642G+F2VE-10NMPP，具有10 µM 1NM-PP1的IRE1 (I642G)和Fv2E-PERK一起组成型表达；I642G+F2VE-50NMPP，具有50 µM 1NM-PP1的IRE1 (I642G)和Fv2E-PERK一起组成型表达。
在图12B中，药物诱导型UPR通路激活提高分泌的AR-301免疫球蛋白产生水平。该图显示通过共转染含有表达Ire1-I642G和Fv2E-PERK (+UPR)或模拟(-UPR；图12B)的组成型启动子的质粒在表达AR-301 mAb的稳定细胞系中的药物诱导型UPR通路激活。在转染后24小时，用10 µM的1NM-PP1处理细胞。在1NM-PP1处理之后24小时后，将具有和不具有UPR激活的CHO-AR301细胞以相同的细胞密度(3E5个活细胞/ml)接种于20 ml接种体积中进行摇瓶生产运行7天。通过IgG夹心ELISA测量在具有和不具有UPR激活的情况下第7天时AR-301mAb的分泌的IgG蛋白水平。
图13A-13E展示一种编辑CHO宿主细胞系CDR结构域以将抗体特异性从一种mAb改变为不同mAb的方法。图13A显示使用CRISPR定向同源重组以使CDR3能够位点特异性地整合到工程改造的宿主细胞系中。使用前间区序列邻近基序(PAM)和设计以精确靶向CDR3位点的gRNA实现特异性CDR3靶向和替换。通过经使用腺相关病毒2 (AAV2)引入含有新CDR3的单链供体DNA来转换CDR3结构域。相同的方法用于交换出重链和轻链基因。DSB：双链断裂。
图13B呈现通过CRISPR定向同源重组将CDR3重链和轻链基因交换到CHO宿主细胞系中。示意图展示一种用转基因比如Zsgreen1荧光蛋白替换BREATH CHO宿主细胞系的重链和轻链基因的互补决定区3 (CDR3)的方法。在体外组装了由Cas9和sgRNA组成的核糖核蛋白(RNP)复合体。sgRNA靶向AR-301 CDR-H3和CDR-L3 (SEQ ID NO: 36-37, SEQ ID NO.:48-49)的5’和3’末端。在RNP通过电穿孔进入到细胞中后，经同源定向重组(HDR)进行编辑。选择存在ZsGreen1荧光和不存在IgG分泌的经编辑的CHO细胞。
在图13C中，IgH和IgL基因通过CRISPR定向同源重组交换到CHO宿主细胞系中。示意图展示分别含有稳定整合的IgH和IgL (HC和LC)基因mAb、AR-301 HC-Bsd和AR-301-LC-Hygro的CHO宿主细胞系以及用外源性转基因比如Zsgreen1替换IgH和IgL的方法。在体外组装由Cas9和sgRNA组成的核糖核蛋白(RNP)复合体。sgRNA靶向AR-301 HC和LC (SEQ ID NO:26-35, SEQ ID NO.: 38-47)的5’和3’末端。在RNP通过电穿孔进入到细胞中后，经同源定向重组(HDR)进行编辑。选择存在ZsGreen1荧光和不存在IgG分泌的经编辑的CHO细胞。
在图13D中，CDR-H3和CDR-L3通过CRISPR定向同源重组交换到CHO宿主细胞系中。上图显示交换Zsgreen1盒(含有终止密码子TGA，然后是含有CMV启动子、Zsgreen1荧光蛋白的编码区和SV40多聚A尾的Zsgreen1盒)的示意图。将CDR3交换至Zsgreen1盒的细胞显示为存在绿色荧光信号但没有分泌抗体信号(通过红色荧光测量，红色)。在RNP递送后72小时进行成功基因交换的检测。将经编辑的CHO细胞接种于包被有抗人类IgG捕获抗体的纳米孔中。添加与Cy3缀合的第二检测抗体来检测分泌AR-301的亲代全长重链和轻链抗体基因的克隆。在接种后24小时获取图像。左下图显示60,000个纳米孔，而右下图为放大的插图，显示CDR-H3和CDR-L3成功交换成Zsgreen1盒。
在图13E中，CHO宿主细胞系中的重链和轻链通过CRISPR定向同源重组进行交换。上图显示交换Zsgreen1盒(仅含有Zsgreen1荧光蛋白的编码区和SV40多聚A尾)的示意图。IgH (重链)和IgL (轻链)交换成Zsgreen1盒的细胞通过存在绿色荧光信号但没有分泌抗体信号(通过红色荧光测量，红色)来检测。在RNP递送后72小时进行成功基因交换的检测。将经编辑的CHO细胞接种于包被有抗人类IgG捕获抗体的纳米孔中。添加与Cy3缀合的第二检测抗体来检测分泌AR-301的亲代全长重链和轻链抗体基因的克隆。在接种后24小时获取图像。左下图显示60,000个纳米孔，而右下图为插图，显示重链和轻链基因成功交换成Zsgreen1盒。
详述
本发明涉及例如一种模块化和可定制的多重CRISPR/Cas系统，用于开发用于高水平生产单克隆抗体的克隆细胞系，其具有已证明的稳定性和高水平生产力，同时缩短了工艺开发时间线。该系统基于通过利用新生增强子和染色质状态组合位点特异性基因编辑和精确的分子控制进行细胞系优化。此外，还描述了用于改变在宿主细胞中表达的抗体靶标的新系统。进一步地，表达增强和抗体靶标交换技术的组合可大幅度地加快新抗体的生产和生产力。
本发明包括产生优越量抗体的细胞、细胞系和系统，例如与目前典型的抗体表达系统相比较。例如，协同互补元件的新组合被描述为在其对例如标准传统表达细胞系的修饰中大幅度地增加抗体产生。在许多实施方案中，与CRISPR/dCas9或CRISPR/Cas12a连接的转录激活因子通过引导RNA (gRNA)被引导至转录因子转录起始位点(TSS)附近的启动子区域。转录因子与抗体表达和/或分泌相关。因此，通过gRNA使CRISPR/Cas转录激活因子引导至转录因子TSS导致与抗体产生相关的转录因子过度产生。通过使转录激活因子引导几个不同的转录因子启动子区域，可进一步增强抗体产生。进一步地，作为令人意外协同的结果，可通过使转录激活因子的gRNA引导至同一启动子上的多个位置来提供比相加更好的表达增加。
在一项互补技术中，定点CRISPR/Cas同源定向修复(HDR)可用于快速转化有效产生一种抗体的宿主细胞，从而产生不同期望的抗体。这可大大地加快不同抗体的生产和验证。
本方法采用本文所述的细胞和系统。例如，用已表达抗体的表达宿主细胞开始，放置元件以加速抗体的表达和/或分泌。可通过例如电穿孔将必需的元件引入到宿主细胞中。引入的gRNA可引导CRISPR/Cas (一般地采用dCas9或Cas 12a)靶向与已知影响对抗体产生的控制的转录因子相关的启动子区域。通过靶向多个转录因子的启动子区域和通过靶向单个转录因子启动子区域上的多个位置可获得另外的益处。
在发明概述中讨论了许多方法和组合物，并且在本文和实施例部分中提供进一步的细节。如技术人员易于意识到的，可组合阅读这些公开。
通过激活内源性主转录调控元件(MTRE) (包括(但不限于) PRDM1、XBP1和IRF4)来增加抗体生产的方法。
为工程改造产生高滴度mAb的遗传稳定的细胞，我们首先考虑了浆细胞中抗体产生的天然机器。抗体分泌细胞(ASC)隔室在由短寿命增殖浆母细胞(PB)和长寿命有丝分裂后浆细胞(PC)组成的鼠模型中得到了很好研究。
背景：浆细胞中极高的免疫球蛋白分泌速率(高达300 pg/细胞/天)为由具有扩大的细胞质和紧密排列的内质网(ER)的高度特化形态实现。浆细胞(PC)为主要的抗体分泌细胞，源于B淋巴母细胞，为B细胞谱系的最终效应物。活化B细胞和浆细胞的功能所需要的转录机制不同并且似乎相互排斥。在活化B细胞中，BCL-6 (B细胞淋巴瘤因子6)、MTA3 (转移相关基因1家族，成员3)、PAX5 (配对盒蛋白5)和MITF (小眼畸形相关转录因子)对于诱导B细胞基因表达程序为重要的，但也抑制浆细胞的形成。PC也组成性激活未折叠蛋白反应(UPR)，其为一种特化传感机制，用于检测和处理大量通过ER的蛋白(Tellier, 2016)。活化B细胞向PC的确定发育程序需要三个一组PC特异性基因：IRF4、BLIMP-1 (由PRDM1编码)和XBP1。这种发育程序需要高度协同地激活和沉默数百个靶基因，包括B细胞命运因子。在原代人类B细胞中，这些基因的缺失会导致抗体分泌水平急剧下降。在鼠科动物中，这种三个一组为以生发水平进行抗体分泌所需要和足够的(Shapiro-Shelef, M.,等人 2005)。
PRDM1和IRF4经增强子元件HS1、HS2和HS4调控IgH基因的转录，并间接地降低E3泛素连接酶Siah1的水平，Siah1为经ERAD通路降解免疫球蛋白的关键因素(Tellier 2016;Swaminathan 2015)。同样重要的是要注意，如前所述，MAR增强子元件的功能为增强浆细胞的天然Eμ增强子，这是调控Igh/Igl转录的关键。
PRDM1和XBP1为浆细胞分泌免疫球蛋白所需要的。PRDM1调控μM (μ免疫球蛋白重链的跨膜形式)至μS (分泌形式) mRNA转换。通过阻遏PAX5，其可去阻遏编码免疫球蛋白重链、免疫球蛋白轻链和XBP1的基因的转录，这些基因为细胞器生物发生、内质网功能以及蛋白折叠和蛋白分泌所需要的。
除PRDM1和IRF4之外，IGH基因转录和转录后加工受到浆细胞中的延伸因子ELL2调控。IGH转录促进多聚腺苷酸化因子CSTF和CPSF加载到磷酸化RNA聚合酶II (RNAP-II)的羧基末端结构域的Ser-2上。ELL2转录由PRDM1和IRF4激活(Sciamma 2004; Shaffer 2004)。ELL2经多聚腺苷酸化因子CSTF-64促进分泌的IGH (Martincic 2009)，而ELL2或其上游激活因子异源性核糖核蛋白F (HNRNP F)的耗竭降低免疫球蛋白重链mRNA的分泌特异性形式。在IGH启动子处，ELL2诱导H3K79和H3K4的甲基化、DOT1L的结合，并降低在IGH启动子处结合的MLL以及E3泛素连接酶SIAH1的水平。SIAH1可经ERAD通路促进未折叠免疫球蛋白的翻译后降解(Swaminathan 2015)。
在IGH基因座内，Eμ内含子型增强子控制IGH转录。Eμ由220 bp的小核心元件组成，两个侧翼为核基质附着区(MAR)。已证明MAR通过促进转录进一步增强Eμ。IGL转录的调控通过PU.1进行调控。
在浆细胞中，内质网(ER)为免疫球蛋白合成、折叠和修饰的关键细胞器。ER功能失调导致错误折叠或未折叠蛋白在ER腔中的积累，并且这会触发未折叠蛋白反应(UPR)，从而恢复分泌抗体的浆细胞中正常免疫球蛋白合成和分泌所必需的ER稳态。
XBP1在浆细胞内质网(ER)扩张中也起不可或缺的作用。XBP1上调浆细胞中UFBP1和UFMylation通路基因的表达，而UFBP1缺乏会损害浆细胞中的ER扩张并延缓免疫球蛋白产生。结构和功能分析表明，UFBP1为IRE1α缺陷型浆母细胞中免疫球蛋白产生和刺激ER扩张所需要的，并调控UPR通路的不同分支以促进浆细胞发育和功能(Zhu, H等人, 2019)。
本发明利用浆细胞机器的核心成分进一步增强生产细胞系中的抗体分泌。例如，生产力益处可通过以下实现：(1) 增加PRDM1、IRF4和XBP1转录；(2) 增强IGH和IGL转录；和/或(3) 激活分泌和未折叠蛋白反应(UPR)以促进抗体生物合成。
CRISPR/Cas技术. 用于基因工程和控制基因表达的方法利用了天然存在的转录因子(TF)和对所靶向基因调控元件的操纵。尽管已经使用工程改造的核酸酶，比如转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)，但其合成和设计标准的复杂性限制了其使用。这些挑战已使用RNA引导的成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)结合Cas核酸内切酶(比如CRISPR-Cas9和CRISPR/Cas 12a)来解决。CRISPR Cas酶的功能已扩展至超出基因编辑之外。Cas9的主流应用包括经诱导位点特异性双链断裂(DSB)然后通过同源定向修复(HDR)或非同源末端连接(NHEJ)进行修复来生成缺失和插入。Cas9工具包已进一步扩展至基因激活(CRISPRa)和基因阻遏(CRISPRi) (Cho等人, 2018)。关于CRISPR/Cas 12a，使得能够实现类似的功能，但是，例如由于交错的靶标切割，例如一般地更精确靶向于靶DNA。
目前存在几种Cas9变体，并且包括(1) 野生型Cas9；(2) HDR特异性Cas9 (D10A突变)；和(3) 死亡Cas9。死亡Cas9 (dCas9)含有HNH和RuvC结构域中的突变(H850A、D10A)，从而消除其核酸酶活性。当与各种效应结构域(反式激活、阻遏物或染色质重塑蛋白)融合时，这种变体可增强或阻遏转录。
为实现精确的CRISPR-Cas介导的基因编辑，例如需要单引导RNA (gRNA)的20个核苷酸的靶序列。序列特异性为CRISPR-Cas9基因编辑复合体提供特定靶标和切割位点。这种复合体可由融合于反式激活结构域(tracrRNA)的CRISPR RNA (crRNA)、2-5个核苷酸共有序列、紧跟crRNA互补序列(例如靶DNA) 3’的物种特异性前间区序列邻近基序(PAM)组成。将特定结构域作为DNA结合蛋白靶向的能力使得Cas9可募集阻遏物或激活因子结构域，从而导致转录修饰。
我们在本文描述了一种用于转录激活方法，其超出先前描述的技术并具有令人意外协同的结果。例如，本发明允许通过利用以位点特异性方式处理RNA的Csy4核糖核酸内切酶同时结合和处理9个独特的gRNA。Csy4通过茎3’末端处的28-nt发夹序列切割RNA。独特的结构模式允许同时转录激活而不是阻遏。
gRNA/RNA支架
生成适当gRNA支架的工程改造为应用依赖性的。与其中sgRNA支架含有tracrRNA的编辑所需要的相比较，gRNA的结构以及用于转录激活的递送方法明显不同。
使用Csy4对gRNA进行多重处理
多重CRISPR技术方法利用独特的和模块化gRNA支架设计，在含有多达9个gRNA的单个载体中对gRNA进行多种处理。这促进样品分子通路中多个基因的协同激活，优于单个gRNA激活，例如如图4所示。
我们的CRISPR激活(CRISPRa)方法采用例如由单个U6启动子驱动的3个gRNA，并含有28nt发夹序列(CSY4结合)、四环和两个茎环结构。另外，MS2适体结合位点(一个连接在茎环2上和一个连接在四环上)用于进一步增强转录激活。最后，每3个gRNA之后包含RNA PolIII终止序列(图2)。
关键转录因子：我们发明的特征利用了原代人类浆细胞中与抗体产生相关的关键浆细胞转录因子来增加非B细胞来源的细胞系中的抗体产生。增加的免疫球蛋白转录和蛋白合成与随后选择的主转录因子PRDM1、IRF4和XBP1的上调相关。
使用的启动子：选择EF1α启动子来驱动dCas9-VP64、MS2-p65-HSF1的表达以串联工作来放大抗体生产。启动子激活为通用的，并且可应用于任何宿主细胞而与B细胞谱系无关。
前导20 bp靶MTRE为基于与其各自转录起始序列(TSS)的距离来选择。已经证明，这个最佳距离在TSS的200 bp以内 (Konermann等人, 2015)。我们选择使用核酸酶死亡Cas9用于融合于VP64的反式激活结构域的化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)dCas9 (D10A/H840A)。另外，我们使用异源效应物融合蛋白：MS2-p65-HSF1生成类似于Konermann等人, 2015的融合蛋白。p65募集AP-1、ATF/CREB和SP117，而VP64募集PC418、CBP/p300和SWI/SNF复合体。将HSF1添加至三链体会导致数百个靶标的协同转录激活(Konermann等人, 2015)。我们设计了具有四环和茎环2及两个MS2结合位点的sgRNA支架。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及CRISPR-Cas9基因激活结构用于通过同时激活PRDM1、XBP1、IRF4转录因子(TF) (多重激活)来激活生产细胞系中的mAb H&L基因以增加细胞系比如CHO和骨髓瘤融合伴侣细胞系的抗体生产的具体应用。本发明包括以下用于抗体增强的关键特征：
• 模块化系统，其中激活的启动子设计为串联工作以放大抗体生产；3个U6启动子(Pol III)串联放置，并且每个U6启动子可驱动3个不同gRNA的表达。
• 为每个靶向的TF设计3个特定的gRNA，其位于转录起始位点(TSS; SEQ ID 6-25)的5’、中间和3’区域的侧翼。
• 双启动子系统：通过U6启动子和EF1a启动子稳定表达gRNA三链体阵列，以驱动Csy4和LC/HC的稳定表达(见图11C)；修饰的复制起点用于质粒DNA的高拷贝扩增。
• 启动子激活为通用的，并且可应用于任何宿主细胞而与B细胞谱系无关。
• 使用慢病毒载体系统将成分(Cas-9、辅助蛋白、gRNA)转导到mAb生产细胞中的顺序。
一般方法
慢病毒包装和滴度. 使用Lenti-X Packaging Single Shots (VSV-G)和含有大SV40抗原的293FT (Invitrogen)包装慢病毒。293FT在根据制造商说明推荐的培养基中生长。转染之前1天，在不使用抗生素的情况下，将293FT重新接种以在第二天于T175烧瓶中达到70-80%的汇合。在600 μl反应混合物中，将20 μg慢病毒转移质粒DNA用Lenti-XPackaging Single Shots (VSV-G)加入到293FT中。在转染后48或72小时收获病毒，并通过标准方案经p24 ELISA (Takara)确定滴度。
工程改造的融合伴侣和CHO细胞系的7天杀灭曲线. FP19的7天杀灭曲线为使用具有杀稻瘟菌素(Blast)、潮霉素(Hygro)、Zeocin (Zeo)和嘌呤霉素(Puro)作为单一物质的培养条件进行。20,000个细胞/孔在第0天接种于0.4 ml Hybridoma-SFM 培养基中。在第0、4和7天进行细胞计数。用于选择的每种抗生素的浓度通过最低杀灭浓度确定。还确定blast+hygro的双重抗生素组合和Blast+Hygro+Zeocin的三重选择。为确定用于CHO DG44衍生细胞系的抗生素选择浓度，20,000个细胞/孔在第0天接种于6 mM L-谷氨酰胺、1%次黄嘌呤和胸腺嘧啶(HT)中的0.4 ml EX-Cell CD CHO Fed-Batch中。在第0、4和7天进行细胞计数。通过最低杀灭浓度确定使用杀稻瘟菌素和潮霉素的抗生素选择浓度。
源于FP19和CHO的工程改造的细胞的转导. FP19衍生细胞(1x106)在MOI为5和10下进行转导，添加8 µg/ml聚凝胺以提高转导效率。在转导之后48小时，以7天杀灭曲线中较低杀灭浓度的0.1x添加抗生素选择。在4周的过程中，抗生素选择缓慢增加至20 µg/ml的最终浓度，以进行稳定选择。CHO DG44衍生细胞(1x106)在MOI为10和存在8 µg/ml聚凝胺的情况下进行转导。
CHO衍生细胞的质粒DNA转染. 通过按照制造商的指南(Mirus Bio)，使用MirusTrans-IT Pro转染试剂，每次反应将20 µg含有AR301 HC和AR301 LC的质粒DNA转染到1x107个细胞中。
具有多重Cas9定向MTRE激活的构建体的载体构建：通过修改pLenti6.2/V5-DESTGateway (参考)生成主慢病毒转移载体，其中CMV启动子和增强子、氯霉素、attP停泊位点和V5标签被移除。载体经过重新工程改造以包括高拷贝复制起点、多个克隆位点、驱动抗生素抗性标志物杀稻瘟菌素、Zeomycin、潮霉素或嘌呤霉素的EF1α启动子。所有载体元件均通过Gibson组装进行重新组装。
pLV-EF1α-dCas9-VP64-Blast和pLV-EF1α-MS2-p65-HSF1 (MPH)-Hygro的载体构建：人类密码子优化的dCas9-VP64和MS2-p65-HSF1从头合成，含有BsiWI/EcoRI克隆位点并框内克隆至T2A肽和杀稻瘟菌素或潮霉素抗性基因(图2A)。
含有U6启动子、28-nt Csy4结合位点、BbsI克隆位点、在茎环2和四环结构处含有MS2结合位点的gRNA支架以及由EFα启动子驱动的zeomycin抗性基因的多重gRNA载体(pLV-sgRNA MS2-Zeo)通过每个模块的golden gate组装生成。然后使用pLV-sgRNA-Zeo中的BbsI位点克隆单个gRNA。所有9个单独的gRNA也通过Golden Gate组装方法组装。用于GoldenGate组装的引物序列(Engler 2009)使用BsmBI位点，并且亚克隆到亲代pLV-sgRNA-Zeo中以生成pLV-multi gRNA-Zeo。人类密码子优化的AR301 LC-T2A-AR301 HC-P2A-Csy4-Zeocin或Csy4-T2A-Zeocin从头合成并在pLV-multi gRNA-Zeo中亚克隆以生成含有pLV-AR301-Csy4-multi gRNA-Zeo (图2B，顶部)或pLV-Csy4-multi gRNA-Zeo (图2B，底部)的多重构建体。
含有HDR供体模板的ssAAV2的产生和滴度. 通过共转染AAV HDR质粒和AAV包装辅助质粒(Takara Bio)在快速生长的293FT细胞(Invitrogen)中产生ssAAV2。使用AAVpro纯化试剂盒(Takara Bio)收获和纯化AAV2，并通过实时PCR进行滴定。
逆转录实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR). 从1x106个细胞中分离总mRNA，并通过Zymo的Quick-RNA miniprep试剂盒(Zymo Research)或Trizol进行纯化和按照制造商的说明(Invitrogen)使用PureLink RNA Mini Kit进行纯化。使用One-step PrimeScript RT-PCR试剂盒用于Applied Biosciences HT7500实时PCR机器上的实时RT-PCR (Takara Bio)进行一步RT-qPCR。每次反应使用100 ng总RNA并针对管家基因GAPDH或EIF3I的mRNA表达标准化。通过标准ddCt方法进行量化。
工程改造具有MTRE激活的骨髓瘤融合伴侣细胞系以生成杂交瘤的方法(骨髓瘤融合伴侣细胞系与原代B细胞融合以生成产生目标抗体的永生化细胞)。
融合伴侣细胞有几个优势：
• 利用人类原代产生抗体的B细胞
• 绕过重组步骤
• 几乎不需要对所得杂交瘤进行工艺开发
• 对临床制备的最快速途径
在图1A和以下表1中概述了在没有天然mAb重链和轻链基因(FP20)和具有天然mAb重链和轻链基因(FP21)的情况下工程改造含有MTRE激活的稳定融合伴侣细胞系的方法：
表1. 具有MTRE激活的融合伴侣细胞系的生成
| 名称 | 世代 | 方法 |
| LA55 | 亲代细胞系 | 亲代细胞系。 |
| FP19 | 源于亲代细胞系 | 使用单细胞克隆的有限稀释方法进行单细胞克隆和使用CD138 筛选生长和生产力。 |
| FP19-dCas复合体 | 使用慢病毒载体进行dCas9-VP64转导和使用Blast进行稳定选择。 | |
| FP19c | dCas9-VP64复合体用支持转录激活的剩余辅助成分进行转导：MS2-p65-HSF1(MPH)。使用BLAST/Hygro进行稳定选择。 使用纳米孔通过单细胞克隆选择稳定整合的细胞，并适于无血清培养基条件。 | |
| FP20 | 慢病毒介导的多重gRNA (总共9个gRNA)转导，使用 Blast/Hygro/Zeocin进行稳定选择。 | |
| FP21 | 融合伴侣细胞系 | 慢病毒介导的目标蛋白的转导。对于抗体生产，进行了IgGH/IgGL链基因的转导。 |
一种鼠-人异源骨髓瘤细胞系LA55的生成：异源骨髓瘤细胞系LA55为在健康供体的外周血淋巴细胞(PBL)与次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶(HAT)敏感的鼠骨髓瘤细胞系X63Ag8.653 (ATCC目录号CRL1580)融合之后获得的。不同物种的体细胞融合产生杂种，其通常随长时间的继代培养失去亲代物种的染色体成分。已知人-鼠杂交细胞亲代的人类细胞染色体经连续世代逐渐失去。因此，细胞系的产生涉及照射鼠骨髓瘤细胞以在融合之前破坏一些鼠染色体。
X63-Ag8.653鼠骨髓瘤细胞通过暴露于131拉德照射1分钟(在Hanks平衡盐溶液中，浓度为1x107个细胞/ml)，之后与人类B细胞融合。通过梯度离心从外周血样品中分离人类B细胞。根据标准程序进行细胞融合。简言之，骨髓瘤细胞(4x107)和B细胞(1x107)用50%(wt/vol)聚乙二醇4000融合，并在存在HAT和哇巴因的情况下进行选择。基于人类免疫球蛋白重链和轻链的生长速率和稳定分泌选择所得克隆用于进一步研究。这些克隆包括称为LA55 (最初产生人类IgM/λ)的HAT敏感、非分泌型克隆，为通过以8-氮杂鸟嘌呤选择并在有限稀释下克隆得到。在测试融合中，与其他杂交克隆和与亲代鼠骨髓瘤细胞系相比较，LA55细胞始终表现出高融合效率。LA55通常在补充有10%胎牛血清的Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)中培养。LA55证实对外来因子呈阴性并用于生成工程改造的融合伴侣细胞系(图1A)。
依序转导FP19以产生FP20-具有高表达CD138的LA55细胞的克隆选择：
LA55的单细胞克隆为通过经流式细胞术基于鼠CD138的表达进行选择，然后进行有限稀释来生成。基于以下标准选择先导克隆：
• 倍增时间更长：16-18小时，与初始12小时相比较。
• 鼠CD138的同源表达。
• 融合效率高。
在先导克隆选择后通过有限稀释进行了两轮另外的单细胞克隆(LA55K)。对于有限稀释克隆，LA55以0.7个细胞/孔接种于96孔板中。通过针对同源鼠CD138表达的流式细胞术表征单细胞克隆。然后按照制造商的说明，使用杂交瘤-SFM培养基使LA55K细胞适于无血清条件，并更名为FP19。
通过转导dCas9-VP64的慢病毒表达生成FP19-dCas9复合细胞，并使用Blast选择稳定池。FP19c通过将MPH转导和稳定选择到FP19-dCas9细胞中生成。FP19-dCas9使用与上述使用Blast和Hygro选择相同的转导和选择程序进行转导。使用的最终Blast和Hygro浓度分别为20 µg/ml和400 µg/ml。dCas9-VP64和MPH的稳定表达得到证实，并且证明了在20代内的表达(图3)。
向FP19c细胞中慢病毒介导的转导和稳定选择激活转录因子PRDM1、IRF4和XBP1(SEQ ID 6-14)的多引导gRNA：使用上述方法将含有靶向TSS 200 bp内的区域的gRNA的多重构建体转导到FP19c中，以生成FP20细胞系，并针对20 µg/ml、400 µg/ml和200 µg/ml下的Blast、Hygro和Zeocin选择。因此，FP20细胞系含有多引导CRISPRa的所有元件，并代表工程改造的融合伴侣细胞系。多重转导被证明诱导每个转录因子的协同激活，其中每个转录因子的表达在组合时大于单个转基因(图4)。
含有靶向MTRE转录起始位点(TSS)的200 bp内区域的gRNA和对金黄色葡萄球菌的α-毒素具有特异性的单克隆抗体(mAb) AR-301的重链(HC)/轻链(LC)表达的多重构建体(图2B，上图)被转导至FP19c中以生成FP21宿主细胞系。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种工程改造稳定宿主CHO或NS0细胞系的方法，该细胞系包含含有Cas9驱动的MTRE基因Prdm1、Irf4和Xbp1的转录激活的天然mAb H&L链基因，以及Cas9编辑用于内源性抗体CDR基因的位点特异性替换的用途。
BREATH CHO为一种用Cas9驱动的MTRE基因转录激活工程改造的CHO宿主细胞系，Prdm1、Irf4和Xbp1按如图1B和以下表2所述的顺序生成。转导和稳定细胞系选择的方法类似于FP19衍生细胞系的生成。我们使用CHO DG44宿主细胞系。
CHO DG44细胞系来源：CHO-DG44，其中CHO细胞用伽马辐射诱变以产生其中完全消除DHFR基因座的两个等位基因的细胞系，称为CHO-DG44。这些DHFR缺陷型品系需要甘氨酸、次黄嘌呤和胸腺嘧啶用于生长(Urlaub等人, 1983)。作为最后步骤，通过转染表达AR301mAb重链和轻链基因(AR301 HC; AR301 LC)的质粒DNA生成BREATH CHO宿主细胞系。
表2. BREATH CHO宿主细胞系的生成.
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及在已经表达单克隆抗体的CHO (CHO-A)或NS0细胞系中通过Cas9介导的MTRE基因Prdm1、Xbp1和Irf4的转录激活来增强mAb产生的方法。
用MTRE激活工程改造CHO细胞系的方法
表达单克隆抗体AR-301或AR-105的稳定CHO细胞系通过如下生成：用如上所述的含有dCas9-VP64、辅助蛋白(MS2-p65-HSF1)和多重引导RNA (SEQ ID 15-25)的慢病毒构建体转导，以增加CHO细胞系中的抗体产生用于分别在20 µg/ml、200 µg/ml和20 µg/ml下的Blast、Hygro和Zeo。
CHO细胞系中UPR激活的方法
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及一种在CHO或NS0细胞系中使用小分子临时诱导UPR激活的方法。
背景：UPR由控制不同机制的3种单独激酶激活：IRE1、ATF6和PERK (Walter和Ron,2011)。UPR的激活会有害地影响细胞存活。由于细胞活力在重组抗体生产的制造过程中至关重要，我们使用了不激活凋亡信号传导通路的IRE1和PERK形式，分别为IRE1 (I642G)和FV2E-PERK。XBP1以翻译后水平发挥调控未折叠蛋白反应(UPR)的作用，从而扩张ER用于蛋白生物合成。在CHO中，XBP1的激活可增加重组抗体的产生。
评估1NM-PP1处理引起的药物诱导型假激酶IRE1 (I642G)突变。使用三磷酸腺苷(ATP)类似物1NM-PP1经选择性结合于IRE1 (I642G)激酶结构域的ATP袋来减弱Ire1 RNA酶活性而不影响细胞存活(Lin等人, 2007)。FV2E-PERK为人工PERK等位基因，其可与CHO细胞中的小分子AP20187二聚化以激活PERK信号传导(Lu等人, 2004)。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及通过小分子药物1NM-PP1的剂量依赖性UPR激活，其中当于在组成型启动子的控制下表达Ire1-I642G与Fv2E-PERK组合的稳定CHO细胞系中诱导时。
载体构建：人源化Ire1α I642G的编码区针对中国仓鼠卵巢(CHO)进行了密码子优化，从头合成并在pLV-dCas9-VP64-Bsd载体的BsiWI/EcoRI克隆位点处亚克隆。为构建Fv2E-PERK，PERK的激酶结构域与两个修饰的FK506结合结构域融合，并针对CHO细胞表达优化密码子。含有Ire1α I642G和Fv2E-PERK的慢病毒载体如图12所示。
表达Ire1 (I642G)和Fv2E-PERK的慢病毒载体：Ire1 (I642G)和Fv2E-PERK的编码区置于框内，侧翼为来自明脉扁刺蛾病毒的2A自切割肽。将组合片段克隆于含有EF1A启动子和潮霉素抗性基因的慢病毒载体中。
通过慢病毒转导和选择Blast或Hygro抗性细胞系(见上文)工程改造了单独或组合表达Ire1α I642G或Fv2E-PERK的稳定细胞系。
CHO细胞中的1NM-PP1药物诱导：用10或50 μM的1NM-PP1诱导单独或组合表达Ire1α I642G或Fv2E-PERK的稳定CHO细胞系。通过RT-qPCR测量的基因表达在药物诱导后24小时进行。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及通过对含有MTRE基因PRDM1、XBP1、IRF4的Cas9或Cpf1基因激活的单克隆抗体生产CHO宿主细胞系进行CRISPR酶编辑而对内源性抗体CDR基因进行位点特异性替换。CRISPR酶包括Cas9、Cpf1、CasX、CasY、Cas13或Cas14。
使用CRISPR对mAb生产细胞系中重链和轻链基因进行基因交换的方法
背景：在生物制造中，每种mAb均需要工艺开发，其包括上游和下游工艺开发两者(Gronemeyer, 2014)以生产抗体产物。用于提高抗体产量的领域可包括工艺效率或高细胞生产密度以提高细胞培养工艺的效率。在分批补料工艺中，抗体浓度已达到高达10-13 g/L(Li, 2010)。
抗体(Ab)通过由恒定和可变区组成的重链和轻链形成，其中它们使用高度多样化的环(称为互补决定区(CDR))结合其靶标，每个重排的VH和VL基因中有3个CDR。CDR 1和2由生殖系V基因编码，而VH和VL两者中的CDR3为基因重组的产物。重链和轻链互补决定区3(CDR-H3和CDR-L3)的不同长度和生化特性有助于增强序列多样性(D’Angelo, 2018)。理论上的CDR-H3多样性可超过1015个变体。人类抗体库为高度多样化的，掺入的CDR-H3源于56个VH、23个DH和6个JH基因的依序组装。显然CDR-H3和CDR-L3为抗体结合特异性的主要决定簇(Mahon等人, 2013; Shirai 1996)，使得从含有人类mAb天然框架区的细胞系中交换CDR3区足以生成由CHO或NS0产生的新mAb，因为抗原特异性由其CDR-H3和CDR-L3结构域决定。此处描述的方法利用Cas9技术交换主生产细胞系的CDR3，以产生具有备选抗体特异性的新细胞系，并具有利用生产主细胞系的既定工艺开发和减少广泛的工艺开发的益处。
核糖核蛋白复合体的形成. Synthego设计并合成了没有PAM位点的用于化脓性链球菌Cas9 (SpCas9)的单引导RNA (sgRNA)。这些sgRNA靶向AR-301 CDR-H3和CDR-L3的5’和3’末端处的20 nt DNA序列。对于CDR3交换，5个靶向FR3的末端和FR4区域的开头的sgRNA候选物用于CDR-H3交换；和类似的方法用于选择用于CDR-L3交换的gRNA。sgRNA结合纯化的SpCas9蛋白允许通过在95℃下加热然后冷却至室温来复合，之后通过电穿孔进行RNP递送。
用于CDR3交换的同源定向修复(HDR)供体模板的载体构建. Zsgreen1盒(含有终止密码子TGA，然后是含有CMV启动子的Zsgreen1盒，Zsgreen1荧光蛋白的编码区和SV40多聚A尾)通过从头合成生成，并使用In-Fusion snap assembly (Takara Bio)进一步亚克隆到高拷贝pUC19质粒(NEB)中。从头合成靶向CDR-H3和CDR-L3的5’和3’区域处的750 bp DNA区域的5’和3’同源臂(HA) (参见图13B)。最终的HDR供体模板通过将以下片段从5’至3’In-Fusion snap assembly组装到单链AAV (ssAAV)载体的CMV启动子下游进行构建：750bp 5’ HA、Zsgreen1编码区和750 bp 3’ HA。上文描述了含有HDR供体模板的ssAAV2的产生和滴度。
RNP递送. 根据制造商的建议(参见上文)，使用Neon转染系统通过电穿孔将RNP递送到CHO DG44细胞中。在RNP递送后，使用ssAAV2以1x105病毒基因组/细胞的MOI转导细胞。转导后48小时，将细胞接种到纳米阵列上，并使用IgG扩散测定测量荧光和分泌水平(Bobo等人, 2014)。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及构建含有MTRE基因PRDM1、XBP1、IRF4的dCas9或dCpf1基因激活的高产单克隆抗体生产鼠异源骨髓瘤融合伴侣细胞系的方法，以及Cas9编辑用于内源性抗体H&L基因的位点特异性替换的用途，其与在如上所述的CDR交换中的相同，但如下文所述对HDR供体和sgRNA靶向区域的载体构建进行修改。
核糖核蛋白复合体的形成. Synthego设计并合成了没有PAM位点的用于化脓性链球菌Cas9 (SpCas9)的单引导RNA (sgRNA)。这些sgRNA靶向pCAG-AR301 HC-pA载体的CAG启动子下游(SEQ ID 26-31)及AR-301 H&L-H3和CDR-L3的SV40 多聚A尾5’和 3’末端上游(SEQ ID 32-49)的20 nt DNA序列。sgRNA结合纯化的SpCas9蛋白允许通过在95℃下加热然后冷却至室温来复合，之后通过电穿孔进行RNP递送。
用于H&L交换的同源定向修复(HDR)供体模板的载体构建. 从头合成靶向pCAG-AR301 HC-pA载体的CAG启动子下游和SV40 多聚A尾(3’HA)上游的750 bp DNA区域的5’和3’同源臂(HA)。最终的HDR供体模板通过将以下片段从5’至3’ In-Fusion snap assembly组装到单链AAV (ssAAV)载体的CMV启动子下游进行构建：750 bp 5’ HA、Zsgreen1编码区和750 bp 3’ HA。
RNP递送. 根据制造商的建议(参见上文)，使用Neon转染系统通过电穿孔将RNP递送到CHO DG44细胞中。在RNP递送后，使用ssAAV2以1x105病毒基因组/细胞的MOI转导细胞。转导后48小时，将细胞接种到纳米阵列上，并使用IgG扩散测定测量荧光和分泌水平(Bobo等人, 2014)。
实施例
提供以下实施例以说明而非限制要求保护的发明。应当理解，本文描述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且将向本领域的技术人员建议根据其的各种修改或改变，并且它们将被包括在本申请的精神和范围内以及所附权利要求的范围内。
实施例1. 融合伴侣细胞(FP19c)中转基因的稳定表达
通过RT-qPCR分析FP19、FP19-dCas9和FP19c的稳定细胞系中dCas9-VP64和MS2-p65-HSF1的表达。如上所述，在第1、10和20代与FP19相比较，测量dCas9-VP64和MS2-p65-HSF1转基因的表达。评估FP19c细胞的dCas9-VP64和MPH转基因的表达，并通过qRT-PCR证实每种转录物的水平相似。证实CRISPR介导的FP19c细胞基因转导在20代内具有转基因dCas9-VP64和MPH的稳定表达(图3)。
实施例2. 使用多重sgRNA方法协同激活MTRE
FP19和FP19c用含有PRDM1、IRF4和XBP1启动子区域的靶序列的pLV-Csy4-multigRNA-Zeo或pLV-sgRNA-Zeo转染。使用人类PRDM1、IRF4和XBP1的引物进行RT-qPCR，如上所述。与单一gRNA激活相比较，TF激活的多重方法显示转录因子的转录激活更高，这与协同作用一致，如图4所示。
实施例3. 在稳定的融合伴侣细胞系FP21中证明使用多重sgRNA方法的MTRE激活和IgH和IgL转录增强.
FP21为一种稳定细胞，其表达dCas9-VP64、MPH和多重gRNA，所述gRNA靶向人类PRDM1、IRF4和XBP1启动子区域的启动子区域。FP-AR301通过慢病毒转导和稳定选择表达AR-301重链和AR-301轻链基因的盒生成。使用人类PRDM1、IRF4和XBP1的引物进行RT-qPCR，如上所述。与FP-AR301细胞系相比较，FP-AR301 MTRE显示PRDM1、IRF4和XBP1的转录增强(图5A)。通过RT-qPCR测量FP-AR301和FP-AR301 MTRE的免疫球蛋白重链和轻链基因(分别为IgH和IgL)的mRNA转录物(图5B)。与FP-AR301相比较，FP-AR301 MTRE显示IgH和IgL转录物的表达增强(图5B)。
实施例4. 在融合伴侣宿主细胞系中激活MTRE后抗体产生增加.
通过在T75烧瓶中进行10天的分批研究，测量在FP-AR301 (没有MTRE激活)和FP-AR301 MTRE (具有MTRE 激活)中的抗体产生。在第0天和第10天收集上清液，并通过人类IgG夹心ELISA测量IgG滴度(图6)。
实施例5. 在CHO宿主细胞系中CRISPR介导的MTRE激活后MTRE表达增加.
CRISPR介导的CHO-DG44 (CHO MTRE)细胞系中MTRE的激活表现出如通过qPCR测量的转录物水平的显著倍数变化。显示出dCas9复合体和MPH的mRNA转录物增加。通过RT-qPCR证明MTRE PRDM1、XBP1和IRF4的转录物增加。基于2-△△Ct计算相对于没有AR-301抗体表达基因的CHO DG44宿主细胞系的倍数变化表达(图7A)。将转录物水平针对EIF3I标准化。在本实施例中，BREATH CHO DG44细胞系中的IgH和IgL转录显著增加(图7B)。
实施例6. 工程改造的BREATH CHO宿主细胞系的抗体生产.
通过在摇瓶中进行10天的分批研究，测量在BREATH CHO中的AR-301 mAb抗体产生。在第0、2、5、7和9天收集上清液，并通过人类IgG夹心ELISA测量累积和IgG滴度。第10天BREATH CHO DG44的终点滴度确定为0.3 g/L (图8)。
实施例7. 在表达AR-105的CHO细胞系中MTRE激活后抗体产生增加.
通过RT-qPCR观察中国仓鼠卵巢细胞中Prdm1、Xbp1和Irf4的mRNA转录物，测量表达AR-105 mAb (CHO-A AR105)的稳定细胞系中的MTRE激活。与初始CHO-AR105 (没有MTRE激活)相比较，CHO-A AR105显示每种MTRE (Prdm1、Xbp1和Irf4，图9A)的转录增强。在比较CHO-A AR105和CHO-AR105中的MTRE转录后，我们检查了10,000个CHO-A AR105和CHO-AR105单细胞克隆在纳米孔上的IgG分泌水平。在群体水平上，CHO-A AR105显示出两倍的增强荧光水平(图9B-C)，表明与CHO-AR105相比较的分泌水平。AR 105为一种人类单克隆抗体，其与铜绿假单胞菌的胞外粘液多糖(MEP)结合。
实施例8. 在表达AR-301的CHO细胞系中MTRE激活后抗体产生增加.
通过RT-qPCR观察中国仓鼠卵巢细胞中Prdm1、剪接Xbp1 (Xbp1s)和Irf4的mRNA转录物，测量表达AR-301 mAb (CHO-A AR301)的多个稳定细胞系中的MTRE激活。Xbp1s为对Xbp1活性的更准确度量。与初始CHO-AR105 (没有MTRE激活)相比较，通过RT-qPCR测量，CHO-AR301显示每种MTRE (Prdm1、Xbp1s和Irf4，图10A)的转录增强以及IgH和IgL的转录增强(图10B)。在比较CHO-A AR301和CHO-AR301中的MTRE、IgH和IgL转录后，我们检查了T75烧瓶中两个克隆的IgG分泌水平(图10C)。与没有MTRE激活(CHO-AR301)相比较，在CHO-AR301(CHO-A AR301)中CRISPR介导的MTRE激活显示分泌增强。
实施例9. 通过Ire1-I642G和Fv2E-PERK的组成型表达结合1NM-PP1对CHO细胞系的药物诱导型UPR激活.
在用含有单独或组合表达Ire1-I642G或Fv2E-PERK的组成型启动子的质粒转染的CHO-K1细胞系中构建了药物诱导型UPR激活通路。在转染后24小时，用不同浓度的1NM-PP1(0、10或50 µM)处理细胞。通过未剪接的Xbp1 (Xbp1u)、剪接的Xbp1 (Xbp1s)、Chop、Gadd34和Atf4的RT-qPCR测量UPR基因的mRNA转录物。当Ire1-I642G和Fv2E-PERK以剂量依赖性方式组合表达时观察到协同作用，其中Xbp1u、CHOP、Gadd34和Atf4的转录物在较高浓度的1NM-PP1下增加(图12A)。
通过共转染含有表达Ire1-I642G和Fv2E-PERK (+UPR)或模拟(-UPR；图12B)的组成型启动子的质粒在表达AR-301 mAb的稳定细胞系中产生诱导型UPR通路激活。在转染后24小时，用10 µM的1NM-PP1处理细胞。在1NM-PP1处理之后24小时后，将具有和不具有UPR激活的CHO-AR301细胞以相同的细胞密度(3E5个活细胞/ml)接种于20 ml接种体积中进行摇瓶生产运行7天。通过IgG夹心ELISA测量在具有和不具有UPR激活的情况下第7天时AR-301mAb的分泌的IgG蛋白水平。
实施例10. 通过CRISPR定向同源重组将CDR-H3和CDR-L3交换至CHO宿主细胞系.
在体外组装由Cas9和sgRNA组成的核糖核蛋白(RNP)复合体。sgRNA靶向AR-301CDR-H3和CDR-L3的5’和3’末端。在RNP通过电穿孔进入到细胞中并递送HDR供体模板的ssDNA后，经同源定向重组(HDR)进行编辑。将CDR3交换至Zsgreen1盒的细胞通过存在绿色荧光信号但没有分泌抗体信号显示(图13D，通过红色荧光测量，红色)。在RNP递送后72小时进行成功基因交换的检测。将经编辑的CHO细胞接种于包被有抗人类IgG捕获抗体的纳米孔中。添加与Cy3缀合的第二检测抗体来检测分泌AR-301的亲代全长重链和轻链抗体基因的克隆。在接种后24小时获取图像。左下图显示60,000个纳米孔，而右下图为放大的插图，显示CDR-H3和CDR-L3成功交换至Zsgreen1盒。
实施例11. 通过CRISPR定向同源重组交换CHO宿主细胞系中的重链和轻链.
在体外组装了由Cas9和sgRNA组成的核糖核蛋白(RNP)复合体。sgRNA靶向AR-301HC和LC的5’和3’末端。在RNP通过电穿孔进入到细胞中并递送HDR供体模板的ssDNA后，经同源定向重组(HDR)进行编辑。选择存在ZsGreen1荧光和不存在IgG分泌的经编辑的CHO细胞(图11E，通过红色荧光测量，红色)。左下图显示60,000个纳米孔，而右下图为放大的插图，显示AR-301 mAb H&L成功交换至Zsgreen1盒。
参考文献：
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尽管出于清楚和理解的目的已对前述发明进行了相当详细描述，但是本领域技术人员通过阅读本公开将清楚，可对形式和细节进行各种改变而不背离本发明的真实范围。例如，以上描述的所有技术和设备可以各种组合使用。本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和/或其他文件出于所有目的通过参考以其全部结合至好像每个单个出版物、专利、专利申请和/或其他文件单独表明出于所有目的通过参考结合的相同程度。
序列表
Seq ID No. 1-5
Seq ID No. 1和2分别含有鼠和人Prdm1的保守结合基序的DNA序列。
Seq ID No. 3和4分别含有鼠和人Irf4的保守结合基序的DNA序列。
Seq ID No. 5分别含有人类Xbp1的保守结合基序的DNA序列。
Seq ID No. 1 GAAAACCTGGA
Seq ID No. 2 AGAAAGTGAAGTGA
Seq ID No. 3 CGTATCGAAAC
Seq ID No. 4 CCGAAACCGAAACTA
Seq ID No. 5 AATGCCACGTCATCATC
Seq ID No. 6
人类Prdm1 gRNA1 GGAAAGCCCUGGGCUCGGCC
Seq ID No. 7
人类Prdm1 gRNA2 CCCCACUUCGCGCAGCCGAG
Seq ID No. 8
人类Prdm1 gRNA3 AUGCGAAGAGAGGAAGCUCU
Seq ID No. 9
人类Irf4 gRNA1 CGGGAACCCCACCCCGGCCG
Seq ID No. 10
人类Irf4 gRNA2 CCTCTCCCCAGTCCAACCCC
Seq ID No. 11
人类Irf4 gRNA3 GCAGCCCCCAGCCUUCACGC
Seq ID No. 12
人类Xbp1 gRNA1 GGCGUGGCAGCGGCAAUCCC
Seq ID No. 13
人类Xbp1 gRNA2 AGGACCGUGGCUAUGGAGUC
Seq ID No. 14
人类Xbp1 gRNA3 CGGCCGAGCUCGGCGUCCAU
Seq ID No. 15
CHO Prdm1 gRNA1 AUAGUUGGAAGUGUGCUGAC
Seq ID No. 16
CHO Prdm1 gRNA2 CUUUCUCUAACUAGGCAAUG
Seq ID No. 17
CHO Prdm1 gRNA3 UUGCCUGUGUUUGUUCUGAG
Seq ID No. 18
CHO Irf4 gRNA1 UGCAGAGUUCGGCAUGAGCG
Seq ID No. 19
CHO Irf4 gRNA2 CUGAUCGACCAGAUCGACAG
Seq ID No. 20
CHO Irf4 gRNA3 GAUUACACAAACAGACAACC
Seq ID No. 21
CHO Irf4 gRNA4 UUCAGUGAGCCAACUCUCUG
Seq ID No. 22
CHO Xbp1 gRNA1 GGUGGCAGCGUCGCCGAGCG
Seq ID No. 23
CHO Xbp1 gRNA2 CGAUAGAAGCAGUACUUUCG
Seq ID No. 24
CHO Xbp1 gRNA3 UUCCAGGCUCGCGGGCAGCA
Seq ID No. 25
CHO Xbp1 gRNA4 CCUCACGCACCUGAGCCCGG
Seq ID No. 26
CHO AR301 HC 5’ gRNA1 GCGUUACUCCCACAGGUGAG
Seq ID No. 27
CHO AR301 HC 5’ gRNA2 AACGCGGUCAGUCAGAGCCG
Seq ID No. 28
CHO AR301 HC 5’ gRNA3 GGCUUCUGGCGUGUGACCGG
Seq ID No. 29
CHO AR301 HC 5’ gRNA4 CGAAGGCAGCCGUCCCCCCG
Seq ID No. 30
CHO AR301 HC 5’ gRNA5 GGCUGCGUGAAAGCCUUGAG
Seq ID No. 31
CHO AR301 HC 5’ gRNA6 AAGCGCUAAUUACAGCCCGG
Seq ID No. 32
CHO AR301 3’ gRNA1 CUUAUCAUGUCUGCUCGAAG
Seq ID No. 33
CHO AR301 3’ gRNA2 UCAUGUCUGCUCGAAGCGGC
Seq ID No. 34
CHO AR301 3’ gRNA3 CCACUUUGUACAAGAAAGCU
Seq ID No. 35
CHO AR301 3’ gRNA4 UUUUAUGUUUCAGGUUCAGG
Seq ID No. 36
CHO AR301 CDR-H3 gRNA1 CUCCUCCUCUUGGUACGCCC
Seq ID No. 37
CHO AR301 CDR-H3 gRNA2 AGAGGAGGAGCCGGAUCUUC
Seq ID No. 38
CHO AR301 LC 5’ gRNA1 GGUGCCACCAGAUUCGCACG
Seq ID No. 39
CHO AR301 LC 5’ gRNA2 AAUCACGUACUGCAGCCAGG
Seq ID No. 40
CHO AR301 LC 5’ gRNA3 GGCCACCGAGAAUCGGACGG
Seq ID No. 41
CHO AR301 LC 5’ gRNA4 ACACAGGUAAGUGCCGUGUG
Seq ID No. 42
CHO AR301 LC 5’ gRNA5 GCGGGCCAAGAUCUGCACAC
Seq ID No. 43
CHO AR301 LC 5’ gRNA6 AAAAGCUCGAGAACUAAUCG
Seq ID No. 44
CHO AR301 LC 5’ gRNA7 GCCACCAGAUUCGCACGCGG
Seq ID No. 45
CHO AR301 LC 5’ gRNA8 UACCCCCGUCCGAUUCUCGG
Seq ID No. 46
CHO AR301 LC 5’ gRNA9 GGACGGCGCCCGGUACUCCG
Seq ID No. 47
CHO AR301 LC 5’ gRNA10 CCCAGCGCACAUGUUCGGCG
Seq ID No. 48
CHO AR301 CDR-L3 gRNA1 ACCUGGGACGACUCCCUGAA
Seq ID No. 49
CHO AR301 CDR-L3 gRNA2 GCCGUUCAGGGAGUCGUCCC。
序列表
Seq ID No. 1-5
Seq ID No. 1和2分别含有鼠和人Prdm1的保守结合基序的DNA序列。
Seq ID No. 3和4分别含有鼠和人Irf4的保守结合基序的DNA序列。
Seq ID No. 5分别含有人类Xbp1的保守结合基序的DNA序列。
Seq ID No. 1 GAAAACCTGGA
Seq ID No. 2 AGAAAGTGAAGTGA
Seq ID No. 3 CGTATCGAAAC
Seq ID No. 4 CCGAAACCGAAACTA
Seq ID No. 5 AATGCCACGTCATCATC
Seq ID No. 6
人类Prdm1 gRNA1 GGAAAGCCCUGGGCUCGGCC
Seq ID No. 7
人类Prdm1 gRNA2 CCCCACUUCGCGCAGCCGAG
Seq ID No. 8
人类Prdm1 gRNA3 AUGCGAAGAGAGGAAGCUCU
Seq ID No. 9
人类Irf4 gRNA1 CGGGAACCCCACCCCGGCCG
Seq ID No. 10
人类Irf4 gRNA2 CCTCTCCCCAGTCCAACCCC
Seq ID No. 11
人类Irf4 gRNA3 GCAGCCCCCAGCCUUCACGC
Seq ID No. 12
人类Xbp1 gRNA1 GGCGUGGCAGCGGCAAUCCC
Seq ID No. 13
人类Xbp1 gRNA2 AGGACCGUGGCUAUGGAGUC
Seq ID No. 14
人类Xbp1 gRNA3 CGGCCGAGCUCGGCGUCCAU
Seq ID No. 15
CHO Prdm1 gRNA1 AUAGUUGGAAGUGUGCUGAC
Seq ID No. 16
CHO Prdm1 gRNA2 CUUUCUCUAACUAGGCAAUG
Seq ID No. 17
CHO Prdm1 gRNA3 UUGCCUGUGUUUGUUCUGAG
Seq ID No. 18
CHO Irf4 gRNA1 UGCAGAGUUCGGCAUGAGCG
Seq ID No. 19
CHO Irf4 gRNA2 CUGAUCGACCAGAUCGACAG
Seq ID No. 20
CHO Irf4 gRNA3 GAUUACACAAACAGACAACC
Seq ID No. 21
CHO Irf4 gRNA4 UUCAGUGAGCCAACUCUCUG
Seq ID No. 22
CHO Xbp1 gRNA1 GGUGGCAGCGUCGCCGAGCG
Seq ID No. 23
CHO Xbp1 gRNA2 CGAUAGAAGCAGUACUUUCG
Seq ID No. 24
CHO Xbp1 gRNA3 UUCCAGGCUCGCGGGCAGCA
Seq ID No. 25
CHO Xbp1 gRNA4 CCUCACGCACCUGAGCCCGG
Seq ID No. 26
CHO AR301 HC 5’ gRNA1 GCGUUACUCCCACAGGUGAG
Seq ID No. 27
CHO AR301 HC 5’ gRNA2 AACGCGGUCAGUCAGAGCCG
Seq ID No. 28
CHO AR301 HC 5’ gRNA3 GGCUUCUGGCGUGUGACCGG
Seq ID No. 29
CHO AR301 HC 5’ gRNA4 CGAAGGCAGCCGUCCCCCCG
Seq ID No. 30
CHO AR301 HC 5’ gRNA5 GGCUGCGUGAAAGCCUUGAG
Seq ID No. 31
CHO AR301 HC 5’ gRNA6 AAGCGCUAAUUACAGCCCGG
Seq ID No. 32
CHO AR301 3’ gRNA1 CUUAUCAUGUCUGCUCGAAG
Seq ID No. 33
CHO AR301 3’ gRNA2 UCAUGUCUGCUCGAAGCGGC
Seq ID No. 34
CHO AR301 3’ gRNA3 CCACUUUGUACAAGAAAGCU
Seq ID No. 35
CHO AR301 3’ gRNA4 UUUUAUGUUUCAGGUUCAGG
Seq ID No. 36
CHO AR301 CDR-H3 gRNA1 CUCCUCCUCUUGGUACGCCC
Seq ID No. 37
CHO AR301 CDR-H3 gRNA2 AGAGGAGGAGCCGGAUCUUC
Seq ID No. 38
CHO AR301 LC 5’ gRNA1 GGUGCCACCAGAUUCGCACG
Seq ID No. 39
CHO AR301 LC 5’ gRNA2 AAUCACGUACUGCAGCCAGG
Seq ID No. 40
CHO AR301 LC 5’ gRNA3 GGCCACCGAGAAUCGGACGG
Seq ID No. 41
CHO AR301 LC 5’ gRNA4 ACACAGGUAAGUGCCGUGUG
Seq ID No. 42
CHO AR301 LC 5’ gRNA5 GCGGGCCAAGAUCUGCACAC
Seq ID No. 43
CHO AR301 LC 5’ gRNA6 AAAAGCUCGAGAACUAAUCG
Seq ID No. 44
CHO AR301 LC 5’ gRNA7 GCCACCAGAUUCGCACGCGG
Seq ID No. 45
CHO AR301 LC 5’ gRNA8 UACCCCCGUCCGAUUCUCGG
Seq ID No. 46
CHO AR301 LC 5’ gRNA9 GGACGGCGCCCGGUACUCCG
Seq ID No. 47
CHO AR301 LC 5’ gRNA10 CCCAGCGCACAUGUUCGGCG
Seq ID No. 48
CHO AR301 CDR-L3 gRNA1 ACCUGGGACGACUCCCUGAA
Seq ID No. 49
CHO AR301 CDR-L3 gRNA2 GCCGUUCAGGGAGUCGUCCC。
Claims (23)
1.一种抗体生产系统，其包含：
产生目标抗体的细胞系，其中所述细胞系的一个或多个细胞包含：
与转录激活因子连接的CRISPR/dCas9或CRISPR/Cas12a；
具有与第一转录因子的启动子互补的间隔序列的第一引导RNA (gRNA)；和，
具有与第二转录因子的启动子互补的间隔序列的第二gRNA；
其中第一和第二gRNA彼此不同，并且第一和第二转录因子彼此不同； 和，
其中所述转录因子与目标抗体的表达相关。
2.权利要求1的系统，其中所述细胞系选自：CHO、NS0、Sp2/0、Vero、HEK 293或293T以及鼠骨髓瘤细胞系X63Ag8.653。
3.权利要求1的系统，其中所述转录激活因子选自：VP64、VP16和激活辅助蛋白复合体MS2-P65-HSF1 (MPH.)。
4.权利要求1的系统，其中第一和第二转录因子选自PRDM1 (Blimp1)、XBP1和IRF4。
5.权利要求1的系统，其中所述一个或多个细胞进一步包含第三gRNA，第三gRNA具有与不同于第一和第二转录因子的第三转录因子的启动子互补的间隔序列。
6.权利要求5的系统，其中第一和第二转录因子选自XBP1、IRF4、PRDM1、ELL2、SPI1、pTEFb、AFF4、AFF1、SUPT5HM、DOT1L、IRE1、PERK、BIP、SRP9、SRP14和SRP54。
7.权利要求1的系统，其中所述一个或多个细胞进一步包含选自以下的蛋白表达的抑制剂：AICDA、SIAH1和HNRNP F。
8.权利要求1的系统，其中所述抗体生产系统转录因子对于所述一个或多个细胞为内源性的。
9.权利要求1的系统，其中一种或多种所述抗体生产系统转录因子由存在于所述一个或多个细胞内的重组核酸编码。
10.权利要求1的系统，其进一步包含与第一或第二转录因子的启动子在不同于第一或第二gRNA的位置处互补的一个或多个另外的gRNA。
11.权利要求10的系统，其中存在两个或更多个具有不同间隔序列的gRNA，所述间隔序列针对相同启动子或下游启动子元件(DPE)。
12.权利要求1的系统，其中表达增强使用针对PRDM1、IRF4或XBP1的启动子的单个gRNA来实现。
13.一种抗体生产系统，其包含：
产生目标抗体的细胞系，其中所述细胞系的一个或多个细胞包含：
与选自VP64、VP16和激活辅助蛋白复合体MS2-P65-HSF1 (MPH)的转录激活因子连接的CRISPR/dCas9；
一个或多个具有与PRDM1的启动子或自PRDM1通路下游肽的启动子互补的间隔序列的第一gRNA；
一个或多个具有与XBP1的启动子互补的间隔序列的第二gRNA；和，
一个或多个具有与IRF4的启动子互补的间隔序列的第三gRNA；
其中所述细胞系选自CHO、NS0、Sp2/0和鼠骨髓瘤细胞系X63Ag8.653；
其中所述转录激活因子在增强PRDM1、XBP1或IRF4的表达方面具有活性；和，
其中所述转录因子被引导至增强所述目标抗体的表达。
14.权利要求13的系统，其中所述细胞包含基因组整合的和作为基因组外核酸两者的转录因子序列。
15.权利要求13的系统，其中所述细胞包含编码所述目标抗体的基因组外核酸。
16.一种增强目标抗体表达的方法，所述方法包括：
提供包含具有编码抗体重链的序列的核酸和具有编码抗体轻链的序列的核酸的细胞；
在所述细胞中提供与转录激活因子连接的CRISPR/dCas9；
在所述细胞中提供具有与第一转录因子的启动子或DPE互补的间隔序列的第一引导RNA (gRNA)；和
在所述细胞中提供具有与第二转录因子的启动子互补的间隔序列的第二gRNA；
其中第一和第二gRNA彼此不同，并且第一和第二转录因子彼此不同；和，
其中所述转录因子与目标抗体重链和轻链的表达增强相关。
17.权利要求16的方法，其进一步包含与第一或第二启动子互补但在所述启动子的不同部分处互补的一个或多个另外的gRNA。
18.权利要求16的方法，其中：
所述CRISPR/dCas9连接的转录激活因子选自VP64、VP16和激活因子辅助复合体MS2-P65-HSF1 (MPH)；
与第一gRNA互补的启动子或DPE控制PRDM1的表达或自PRDM1通路下游肽的表达；
所述启动子或下游启动子元件(DPE)控制XBP1表达；或，
所述细胞提供有与控制IRF4表达的启动子或下游启动子元件(DPE)互补的gRNA；和，
所述细胞系选自CHO、NS0、Sp2/0、Vero、HEK 293或293T和鼠骨髓瘤细胞系X63Ag8.653。
19.权利要求16的方法，其进一步包括：
通过电穿孔、通过慢病毒转染或通过编码的转座子序列提供CRISPR/dCas9-激活因子或gRNA。
20.权利要求16的方法，其进一步包括如下向所述细胞提供具有所述编码抗体重链的序列的核酸和具有所述编码抗体轻链的序列的核酸：
提供CRISPR/Cas9；
提供具有与细胞内源性的重链序列或重链CDR靶序列互补的间隔序列的第三gRNA；
提供具有与细胞内源性的轻链序列或轻链CDR靶序列互补的间隔序列的第四gRNA；
在所述细胞中提供具有期望的重链序列、轻链序列、重链CDR序列或轻链CDR序列的核酸编辑模板；所述编辑模板还具有与所述靶序列侧翼的序列互补的相邻同源区域；
使所述gRNA与其互补的靶序列杂交；
用CRISPR/Cas9在gRNA杂交位点处切割所靶向的内源性序列；
通过同源定向修复(HDR)修复所述切割，从而将所述细胞的内源性靶序列替换为所期望的重链序列、轻链序列、重链CDR序列或轻链CDR序列；
藉此所述细胞的抗体表达从先前的内源性表达转变为所述目标抗体的表达。
21.权利要求20的方法，其中所述CDR为CDR3。
22.一种gRNA多重表达系统，其包含：
编码两个或更多个gRNA序列的核酸链，每个gRNA序列包含针对相同转录因子的启动子或DPE中的不同区域的不同间隔序列，
其中所述启动子或DPE与抗体的表达相关。
23.权利要求22的系统，其中所述转录因子选自XBP1、IRF4、PRDM1、ELL2、SPI1、pTEFb、AFF4、AFF1、SUPT5HM、DOT1L、IRE1、PERK、BIP、SRP9、SRP14和SRP54。
Applications Claiming Priority (3)
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|---|---|---|---|
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| US62/949422 | 2019-12-17 | ||
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| CN202080087611.8A Pending CN115427579A (zh) | 2019-12-17 | 2020-12-15 | 增强和加速抗体表达的方法 |
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