CN115413713A - 一种以乳清水为原料的多功能活性乳酸菌饮料的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种乳清水活性乳酸菌功能型饮料的制备方法，利用云南乳饼加工产生的副产物‑乳清水为原料，先通过β‑半乳糖苷酶水解乳清水以除去其中乳糖转化成还原糖和半乳糖或低聚半乳糖，再利用胰蛋白酶和胃蛋白酶水解乳清水中的乳清蛋白和残留的酪蛋白以提高蛋白的消化吸收率且产生了降压肽、降糖肽和抗氧化肽，接着结合美拉德反应技术和益生菌发酵生产出一款风味独特，活菌数达到2‑4×1010CFU/mL，蛋白含量1.18％，乳糖含量0.6％的低乳糖多功能活性乳酸菌饮料。

Description

一种以乳清水为原料的多功能活性乳酸菌饮料的制备方法
技术领域
本发明属于食品加工领域，涉及乳清饮料制备领域，具体的涉及一种以乳清水为原料的多功能活性乳酸菌饮料的制备方法。
技术背景
近年来，由于云南民族特色乳制品—乳饼和乳扇受到越来越多人的喜爱，产量增加，其副产物乳清水也随着增加，乳清水当中的营养存在潜在的开发价值，例如，乳清水中含有丰富的营养物质和矿物质等微量元素。为了提高产品的加工附加值和利用率，所以需要对乳清水进行加工利用。而随着人们生活品质的不断提高，人们对乳清水的利用也有了新的突破。目前市面上出售的以乳清水为原料的产品主要通过对乳清进行纯化，超滤等技术得到乳清蛋白产品。
乳清水具有原料产量大、价格低廉，且含有益于人体需求的营养物质的优势，同时对乳清水进行再利用，可减少资源的浪费及对环境的污染。但是开发乳清水活性乳酸菌功能型饮料也存在一定的局限性；且目前市面上的乳酸菌饮料乳糖含量大多在1％-4％之间，乳酸菌活菌数1×106cfu/mL到2×109cfu/mL之间。
随着社会经济水平的日益发展，消费者对于饮食方面的关注点已经从美味、珍贵、稀有等饮食观念向健康、营养一方偏移，对于营养、健康、美味的产品需求量也越来越大。人们更愿意通过食物本身来补充营养而不是简单的通过简单的保健品来进行补充，通过食物带来的保健效果受到更多的重视。
故而需研发一种以乳清水为原料，生产制备低乳糖、高活菌型的活性乳酸菌功能饮料的方法，该方法不仅可以实现乳清水的再利用，减少资源的浪费及对环境的污染，还更符合人们对低乳糖、高活菌型乳酸菌饮料的期望。
发明内容
为实现上述目的，本发明提供了一种利用乳清水生产含有降压肽、降糖肽和抗氧化肽的活性乳酸菌功能饮料的方法。
本发明的技术方案为：一种以乳清水为原料的多功能活性乳酸菌饮料的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，非酶褐变：将3％的葡萄糖与3％的脱脂奶粉按照1：1比例溶解于水中，126℃高压灭菌3h得到溶液A；
步骤二，水解反应：超声波辅助进行预处理后的乳清水中加入β-半乳糖苷酶，40℃下恒温水解4h后得到的乳清水解液，95℃条件下灭酶5-10min；
步骤三，向步骤二的乳清水解液中分别添加胰蛋白酶和胃蛋白酶，37-42℃下水解2.5-4.5h，95℃条件下灭酶5-10min得到溶液B；
步骤四，混合：将步骤一得到的溶液A与步骤三得到的溶液B按照1:2混合后加入3％的蔗糖；
步骤五，添加稳定剂：将上述混合溶液加热至70℃，加入0.5％的稳定剂并充分搅拌；
步骤六，均质：将加有稳定剂的溶液用胶体磨研磨至少三次；
步骤七，灭菌后待混合溶液冷却至40℃，加入发酵剂，接种量为0.02％，静止发酵8h，无菌灌装，在4℃存放12～24h即为成品。
进一步地，所述步骤二超声预处理的超声波功率300-500w，处理时间为10-15min。
进一步地，所述步骤七中灭菌条件为高压灭菌锅灭菌95℃、30min。
进一步地，所述步骤二中β-半乳糖苷酶的添加量为0.3-0.5％。
进一步地，所述步骤三中胰蛋白酶和胃蛋白酶的添加量0.1-0.3％。
进一步地，所述胰蛋白酶：胃蛋白酶添加的质量比例为胰蛋白酶：胃蛋白酶＝1：1。
进一步地，所述步骤五中稳定剂为羧甲基纤维素钠。
进一步地，所述发酵剂为保加利亚乳杆菌、嗜热乳杆菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌按照1:1:2:1的质量比例配置而得。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、很大程度上能够完全去除乳清水中的乳糖，部分转化成具有一定生理功能的低聚半乳糖；
2、利用胰蛋白酶和胃蛋白酶水解乳清水中的乳清蛋白和残留的酪蛋白以提高蛋白的消化吸收率且产生了具有生物活性的降压肽、降糖肽和抗氧化肽产物；
3、现有的乳清饮料中乳酸菌活菌数为大于等于1×106cfu/mL，而本发明的活性乳酸菌饮料活菌数达可达2-4×1010CFU/mL，其中含大量肠道有益微生物双歧杆菌；
4、将本来作为废弃物的乳饼副产物-乳清水加以利用，变废为宝，提升乳饼副产物综合利用率。
附图说明
图1为活菌型乳酸菌饮料工艺流程；
图2为稳定剂的添加量对饮料感官评分的影响；
图3为β-半乳糖苷酶的添加量对饮料感官评分的影响；
图4为酶解时间对饮料的感官评分的影响；
图5为发酵时间对饮料的感官评分的影响；
图6本发明制备的饮料产品中肽成分的LC-MS/MS鉴定总离子图；
图7饮料产品中鉴定到的5种生物活性肽的二级质谱图；
图8饮料产品中鉴定到的5种生物活性肽的肽浓度-活性关系图；
图7和图8中的所述5种生物活性肽分别表示为A-E,其中：A-降压肽GPLRPFF；B-降压肽LNYIFFK；C-降糖肽PFPGPIPN；D-降糖肽NGYWAL；E-抗氧化肽YPFPGPIH；
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式并参照附图，对本发明进一步详细发明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下发明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
实施例1：活菌型乳酸菌饮料工艺优化
一、单因素实验
(1)稳定剂的添加量
乳清水与水的比例2:1,脱脂奶粉和葡萄糖的添加量1:1,蔗糖添加量为3％，发酵时间8h，β半乳糖酶的添加量0.3％,酶解时间4h,通过改变其稳定剂的添加量，在不同添加量的条件下进行试验，以产品的感官评分为依据，选择最合适的添加量。
由2图可知，稳定剂的添加量为0.5％时，状态稳定，颜色均一。由0.3％的添加量增加到0.5％的添加量，折线图呈现持续上升，感官评定数值趋于较高的分值，当稳定剂增加到0.6％时，感官评定折线图呈下降趋势，正是因为稳定剂添加量增加，产品的口感过于浓稠，导致口感不佳，影响感官；当添加量过少，饮料的组织状态不稳定，易分层影响产品的色泽，组织状态。因此，选择稳定剂的最适添加量为0.5％。
(2)β-半乳糖苷酶的添加量
当乳清水与水的比例为2:1，脱脂奶粉和葡萄糖按比例添加,蔗糖添加量确定为3％，发酵时间达到8h，稳定剂添加量0.3％,酶解时间4h,通过确定半乳糖的添加量，在添加量为0.075％，0.15％，0,3％进行试验，以活性乳酸菌饮料的综合感官评价来确定半乳糖酶的最佳添加量。
由图3可见，β半乳糖的添加量对饮料的感官评分影响较大，添加量为0.3％时，酸甜适宜，组织状态，气味的感官评分值均为最高增加了产品的整体味道。由0.075％增加到0.3％时，感官评分呈一个上升趋势，当添加量由0.3％增加0.45％，由于半乳糖酶的添加量过多，产品的酸度过高，影响产品的口感和风味，当添量过少时口感和风味与为添加之前无明显差异，因此，选择半乳糖酶的最适添加量为0.3％。
(3)酶解时间
乳清水与水的比例2:1,脱脂奶粉和葡萄糖的添加量1:1,蔗糖添加量为3％，发酵时间8h，β半乳糖酶的添加量0.3％,稳定剂的添加量0.5％，将酶解时间添加量为3h,3.5h,4h进行试验，以活性乳酸菌饮料的综合感官评价来确定酶解的最佳时间。
由4图可知，酶解是影响饮料感官评价的重要因素，酶解时间为4h时感官评值达到最佳。随着酶解时间由3h增长到4h，发酵的独特风味更佳明显,产品的酸度有所提高，乳香为明显。当时间从4小时增加到4.5小时，产品呈过酸的口感，口感和状态有所感官评价呈一个下降的趋势，时间过短对产品的风味没有产生较明显的影响。
(4)发酵时间
乳清水与水的比例2:1,脱脂奶粉和葡萄糖的添加量1:1,蔗糖添加量为3％,β半乳糖酶的添加量0.3％,酶解时间4h,稳定剂的添加量0.5％，在发酵时间为8h,10h,12h。以活性乳酸菌饮料的综合感官评价来确定最佳发酵时间。
由图5可知，发酵时间是决定饮料感观评价的重要因素，影响饮料的品质，当发酵时间由6h增加到8h随着发酵的时间增加，有特殊的发酵风味，状态稳定无分层的现象。当发酵时间有8h增加到12h,随着时间的增加感官评价有所下降当发酵时间为12h时，饮料整体风味下降，出现异味过酸味道且饮料整体的状态不稳定。发酵时间过短时间，饮料的风味与未发前无明显变化。
二、正交试验
采用L9(34)的正交试验通过稳定剂的添加量，β半乳糖酶的添加量，酶解时间，发酵时间对活性乳酸菌饮料的感官评价的影响，最终得到活性乳酸菌饮料的最佳制作工艺。
(1)正交试验设计
在单因素试验结果的基础上，综合各个因素对感官评价的影响，以感官评价为指标，如表1以发酵时间、稳定剂添加量％、半乳糖添加量、酶解时间进行4因素3水平的正交试验(L934)设计，确定活菌型乳酸菌饮料的最优组合；正交试验方案及结果见表2：
表1正交试验因素与水平
Figure BDA0003818536680000061
(2)正交试验结果分析
由表2可知，酶解时间(D)的极差最大，半乳糖的添加量(C)次之，发酵时间(A)最小。活菌型乳酸菌饮料优化组合为A2B2C3D3，即酶解时间4h，稳定剂的添加量0.5％，半乳糖的添加量为0.3％，发酵时间为8h，根据优化组合做出的产品呈淡乳黄色，有发酵的特殊风味，酸甜可口、口感润滑、无气泡、散发着淡淡的乳酸菌风味。
表2正交试验结果与分析
Figure BDA0003818536680000071
根据各因素R值的大小分析可知，四个因素影响感官评分的主次顺序依次为A>B>C>D，最佳条件参数为A2B2C3D3，即发酵时间为8h，稳定剂的添加量为0.5％，半乳糖的添加量为0.3％，酶解时间为4h,根据优化组合做出的产品呈淡乳黄色，有发酵的特殊风味，酸甜可口、口感润滑、无气泡、散发着淡淡的乳酸菌风味。
(5)感官评价
通过感官评定对活菌型乳酸菌饮料进行打分，以15人为感官评定小组，平均分作为评判的基础，从其颜色、香味、口味、外观对活菌型乳酸菌饮料进行打分，保证客观，真实并记录其数据，总分为100分。感官评定小组依据表3感官评定方法进行打分，得到该活菌型乳酸菌饮料的平均感官评分为89.10分。
表3感官评定方法
Figure BDA0003818536680000081
实施例2：乳清水活性乳酸菌功能型饮料的制备
操作步骤
(1)褐变反应：分别称取3％葡萄糖与3％脱脂奶粉各3克总计6克，按照1：1的比例倒入装有100mL水的烧杯中混合溶解。溶解后将其置于高压灭菌锅灭菌(126℃、3h)，目的是增加产品风味和颜色。
(2)乳清水过滤：通过2-3层纱布去除残留在乳清水当中的一些固体杂质(酪蛋白沉淀、乳脂肪等)，得到200mL乳清水。
(3)超声预处理：超声波功率500w，处理10-15min，提高后续水解效率。
(4)水解：先加β-半乳糖苷酶0.6-1.0克在40℃下恒温水解4h后95℃条件下灭酶5-10min，目的是将乳清水中的乳糖转化为半乳糖或低聚半乳糖，可以作为益生元促进后续乳酸菌发酵，提高发酵物中的乳酸菌活菌数，尤其是双歧杆菌含量。接着乳清水解液按照1:1添加胰蛋白酶和胃蛋白酶各0.2-0.6克，在37-45℃下水解2.5-4.5h后95℃条件下灭酶5-10min，促使乳清蛋白酶解产生具有生理活性的功能性肽类物质，增加产品的功能性。
(5)加稳定剂：上述步骤完成后，将水解液和褐变反应产物混合后加入3克蔗糖，加热至70℃时加入1.5克羧甲基纤维素钠并充分搅拌。
(6)胶体磨：将(5)中混合溶液用胶体磨研磨三次，使溶液质地细腻、均匀。
(7)灭菌：溶液装入烧杯中置于高压灭菌锅灭菌(95℃、30min)
(8)冷却：灭菌完成后用冷水对烧杯表面冲刷并用玻璃棒搅拌溶液，以达到快速散热降温的目的。
(9)发酵：待溶液温度降到40℃时加入0.06克由保加利亚乳杆菌、嗜热乳杆菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌按照1:1:2:1的比例配比制得的发酵剂，置于发酵机中进行发酵(42℃、8h)。
(10)灌装：发酵完成后用消毒过的瓶子分装溶液，于4℃密封保存，得到300mL的多功能活性乳酸菌饮料。
实施例3：乳清水活性乳酸菌功能型饮料的指标检验
(1)理化指标检测方法：
1)蛋白质的含量：采用考马斯亮蓝的方法来测定蛋白质的含量。
2)乳糖含量值：接用碘量法滴定法(GB5009.7-2016)测定乳糖含量。
3)持水度：取10mL酸奶放入离心管，离心管质量记W1,加入酸奶后的质量记为W2,离心速度为6000r/min,离心10min,静置10min,吸去上清液，此时质量记为W3，持水性计算公式:
Figure BDA0003818536680000091
4)酸度(0T)测定：依据食品安全国家标准GB5009.239-2016。
5)粘度的测定：
将所需待测样品放入小烧杯中25ml玻璃烧杯中，用NDJ-4型旋转粘度计进行粘度测定，待数值稳定后进行读值并记录数据，进行重复试验取平均值。
6)pH值的测定：用pH计直接测定。
检测结果见表4：与市售的两种乳酸菌饮料进行相关指标比较，乳清水活性乳酸菌功能型饮料的蛋白质含量相对偏低，持水度和pH与市售成品值相似，酸度和粘度值相对偏低，乳糖几乎被完全转化，更适合乳糖不耐受人群食用。
表4乳酸菌饮料的理化特性
Figure BDA0003818536680000101
(2)微生物检测
1)大肠杆菌的测定
采用大肠杆菌平板计数法来检测饮料中的大肠杆菌数。将稀释液、培养皿、枪头等实验所需原材料用报纸包好后置于高压灭菌锅中灭菌(121℃、15min)。称取一定量结晶紫中性红胆盐琼脂溶于蒸馏水中，静置几分钟后充分搅拌均匀，调pH值至7.4±0.1，加热煮沸2分钟。超净工作台开紫外灯消毒30min。选择10-2、10-3、10-4三个梯度，用移液枪各吸取1ml接入冷却凝固的培养皿中并摇匀。做两个平行，每个稀释度接种两个无菌培养皿，并作空白组对照。接种完成后，倒置平板放入恒温培养箱36℃±1℃，18-24h培养。选取可疑、典型群落用BGLB肉汤验证是否为大肠杆菌。并按相关标准计算出每毫升样品中大肠杆菌群数。
2)乳酸菌数检验
用MRS琼脂培养基检测乳酸菌饮料中乳酸菌数。MRS培养基：将称取好培养基倒入蒸馏水中加热溶解，调节pH值至6.2±0.2。将实验材料和培养基前处理后，取稀释倍数为10-4、10-5、10-6各1mL接入培养基中并摇匀，每个稀释度接种两个无菌培养皿，作两个平行样品。接种完成后，在厌氧条件下培养(36℃±1℃，72h±2h)。选取菌落数在30CFU-300CFU之间进行计数。
经测定，产品中未检测到大肠杆菌，乳酸菌活菌数达到2-4×1010CFU/mL，高于同类产品，符合《乳酸菌饮料卫生标准》要求标准要求。
综上，通过单因素和正交试验确定乳酸菌饮料的最佳工艺参数为：酶解温度46℃，添加量0.3％,酶解时间4h，乳清水与水的比例为2:1，蔗糖添加量为3％，脱脂奶粉与葡萄糖添加量为3％，β-半乳糖酶的添加量为0.3％,稳定剂的添加量0.5％，水解温度46℃,水解时间4h,发酵时间为8h时，确定最佳工艺，得到的产品状态稳定、色泽呈浅褐色、口感酸甜，其中蛋白质含量1.18％,乳糖含量0.6％，持水度7.56，酸度4.22，粘度14.30，pH值3.70，乳酸菌数达到2-4×1010CFU/mL，符合《乳酸菌饮料卫生标准》要求。该研究开发出的活菌型乳酸菌饮料具有较好的市场应用前景，进一步提高了乳清水资源的综合利用率。
实施例4：乳清水活性乳酸菌功能型饮料中功能性肽鉴定
如图6所示，采用LC-MS/MS鉴定乳清水活性乳酸菌功能型饮料中所含的肽序列。高效液相色谱的流动相A为1％甲酸水溶液，B为1％甲酸乙腈溶液，梯度洗脱时间为0-50min，A相线性梯度为7-90％；50-57分钟，B相线性梯度保持在7％；57-60分钟，A相从7％到90％。捕集器柱的尺寸为100μm×20mm，流速为300nL min-1。通过毛细管HPLC分离水解产物，并使用Orbitrap融合质谱仪进行分析。母离子的扫描范围为350-1950m/z，每次全扫描后收集最强的10个片段(MS2扫描)。
乳清水活性乳酸菌功能型饮料中共鉴定到57种肽序列，说明产品中肽成分丰富。通过将乳清水活性乳酸菌功能型饮料中获得的所有的肽序列与在线数据库BIOPEP-UWM和AHTPDB中已被报道的肽进行比对，筛选出未被报道的肽进行研究。将所有未被报道的新型肽在PeptideRanker预测网站中进行潜在生物活性评分。使用在线网站Pepdraw预测肽的净电荷和疏水性，并根据ACE特征性氨基酸(C-末端三肽氨基酸分别为疏水性氨基酸如Y、F、L、V和M或者带正电的氨基酸如G、K、A该肽能很好地与ACE结合；N-端为脂肪族氨基酸，如A、V、L和I时，能有效与ACE结合)、降糖肽特征性氨基酸(序列中含有L、R、E、F、P、A)和抗氧化肽特征性氨基酸(N-端为疏水氨基酸如VL，并且序列中含有P、H、Y、W、C，若序列中含有芳香族氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸抗氧化活性会相应增强)筛选获得潜在的ACE抑制肽和降糖肽、抗氧化肽序列，确定了肽YPFPGPIH为抗氧化肽，肽PFPGPIPN和NGYWAL为降糖肽，肽GPLRPFF和LNYIFFK为降压肽，且这些肽成分是前期利用胰蛋白酶和胃蛋白酶水解乳清水中的乳清蛋白或残留的酪蛋白所得到的。乳清水活性乳酸菌功能型饮料中鉴定的肽序列如表5所示，在所有57种肽中，经鉴定后得到该乳清水活性乳酸菌功能型饮料中的功能肽如表6所示。
表5乳清水活性乳酸菌功能型饮料中肽序列
Figure BDA0003818536680000121
Figure BDA0003818536680000131
表6乳清水活性乳酸菌功能型饮料中的功能肽
Figure BDA0003818536680000132
如图7和图8所示，通过固相合成法制备5种肽，测定其体外生物活性得到：降压肽GPLRPFF和LNYIFFK的ACE抑制率的IC50值分别为0.67mg/mL、0.75mg/mL，降糖肽PFPGPIPN和NGYWAL的α-葡萄糖苷酶抑制率的IC50值分别为4.13mg/mL、4.17mg/mL，抗氧化肽YPFPGPIH的DPPH清除率的IC50值为0.41mg/mL，5种肽都具有显著的生物活性。
应当理解的是，本发明的上述具体实施方式仅仅用于示例性发明或解释本发明的原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改例。

Claims (8)

1.一种以乳清水为原料的多功能活性乳酸菌饮料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，非酶褐变：将3％的葡萄糖与3％的脱脂奶粉按照1：1比例溶解于水中，126℃高压灭菌3h得到溶液A；
步骤二，水解反应：超声波辅助进行预处理后的乳清水中加入β-半乳糖苷酶，40℃下恒温水解4h后得到的乳清水解液，95℃条件下灭酶5-10min；
步骤三，向步骤二的乳清水解液中分别添加胰蛋白酶和胃蛋白酶，37-42℃下水解2.5-4.5h，95℃条件下灭酶5-10min得到溶液B；
步骤四，混合：将步骤一得到的溶液A与步骤三得到的溶液B按照1:2混合后加入3％的蔗糖；
步骤五，添加稳定剂：将上述混合溶液加热至70℃，加入0.5％的稳定剂并充分搅拌；
步骤六，均质：将加有稳定剂的溶液用胶体磨研磨至少三次；
步骤七，灭菌后待混合溶液冷却至40℃，加入发酵剂，接种量为0.02％，静止发酵8h，无菌灌装，在4℃存放12～24h即为成品。
2.根据权利要求1所述的一种以乳清水为原料的多功能活性乳酸菌饮料的制备方法，其特征在于，所述步骤二超声预处理的超声波功率300-500w，处理时间为10-15min。
3.根据权利要求1所述的一种以乳清水为原料的多功能活性乳酸菌饮料的制备方法，其特征在于，所述步骤七中灭菌条件为高压灭菌锅灭菌95℃、30min。
4.根据权利要求1所述的一种以乳清水为原料的多功能活性乳酸菌饮料的制备方法，其特征在于，所述步骤二中β-半乳糖苷酶的添加量为0.3-0.5％。
5.根据权利要求1所述的一种以乳清水为原料的多功能活性乳酸菌饮料的制备方法，其特征在于，所述步骤三中胰蛋白酶和胃蛋白酶的添加量分别为0.1-0.3％。
6.根据权利要求5所述的一种以乳清水为原料的多功能活性乳酸菌饮料的制备方法，其特征在于，所述胰蛋白酶：胃蛋白酶添加的质量比例为胰蛋白酶：胃蛋白酶＝1：1。
7.根据权利要求1所述的一种以乳清水为原料的多功能活性乳酸菌饮料的制备方法，其特征在于，所述步骤五中稳定剂为羧甲基纤维素钠。
8.根据权利要求1-7任一项所述的一种以乳清水为原料的多功能活性乳酸菌饮料的制备方法，其特征在于，所述发酵剂为保加利亚乳杆菌、嗜热乳杆菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌按照1:1:2:1的质量比例配置而得。
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