CN115404179A - 一种含有无色杆菌和肠杆菌的复合菌剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于农业微生物应用技术领域，涉及一种含有无色杆菌和肠杆菌的复合菌剂及其应用。本发明证实：分离筛选自浏阳镉污染场地的无色杆菌(Achromobacter insuavis)SL8和肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)SL12的复合菌剂具有高效去除镉的能力，可以作为镉污染农业环境修复的微生物菌剂。
Description
技术领域
本发明属于农业微生物应用技术领域，涉及一种含有无色杆菌和肠杆菌的复合菌剂及其应用。
背景技术
镉是有广泛应用价值的有毒重金属，具有较大脂溶性，生物富集性和毒性，是一种剧毒物和致癌物。20世纪90年代以来，随着工业化和城市化进程的加快，污染物大量排放和不当处置，以及部分不合格化学品的农用，使得我国农田重金属积累超标等环境问题日益凸显。根据2014年《全国土壤污染状况调查公报》显示，镉作为我国最主要的土壤重金属污染物之一，耕地土壤点位超标率达到 19.4％。镉在环境中不能降解，只能发生转化、迁移等，重金属在土壤中的迁移、转化及表现出的生物毒性与其形态有着密切的关系。重金属镉元素进入土壤环境后，可与土壤中的某些物质发生氧化还原、吸附解吸、络合溶解、沉淀等反应，导致重金属元素形态、迁移等的变化。进入土壤中的镉按存在形态可分为：可交换态、碳酸盐结合态、铁锰氧化物结合态、有机物结合态、残渣晶格态。其中，可交换态镉是对环境变化敏感，容易发生迁移转化，可被植物吸收从而对植物产生污染的主要形态。
目前降低土壤重金属污染修复的主要方法有：物理法(如客土法、换土法、深耕翻土法)、化学法(淋溶法、施用改良剂)和生物法(植物修复和微生物修复)。其中物理法工程量大，化学法易造成二次污染，利用生物法来解决该问题不失为一种有效的方法。并且，生物修复法能保障土壤修复的长期有效性和维持土壤生态系统的长期稳定性。
近年来，通过安全可靠、环境友好、经济高效的微生物技术来控制或减少设施土壤的镉污染日益引起了人们极大的关注。土壤微生物包括与植物根部相关的自由微生物、共生根际细菌、菌根真菌，它们是根际生态区的完整组成部分。微生物在修复镉污染土壤方面具有独特的作用，其抗重金属机制包括生物吸附、胞外沉淀、外沉淀、生物转化、生物累积和外排作用。通过这些作用，微生物一方面可以减少土壤中重金属毒性，并可以吸附积累重金属，另一方面，可以改变根系微环境，从而提高植物对重金属的吸收、挥发或固定效率。
以往的许多研究报道了对土壤镉固化具有作用的相关微生物菌属。例如，研究人员发现硫酸盐还原菌可以将环境中的SO42-转化为S2-，并利用S2-与金属的沉淀作用达到去除重金属镉的目的。范文宏等发现，在硫酸盐还原菌的修复作用下，镉从可交换态向铁锰氧化物结合态转化，各组土壤中可交换态镉的含量明显降低，可交换态镉去除率达到55％～80％。铁还原菌能够在生长过程中以生长基质中的Fe3+作为电子受体，氧化有机物作为电子供体，将Fe3+还原为Fe2+的厌氧或兼性厌氧微生物。Lovley等发现微生物还原Fe3+矿物过程中形成的次生铁相有助于镉的固定，将镉从土壤的生物可利用部分转移出来。一项最新的研究表明，在Fe2+的生物化学氧化过程中，Cd2+和Fe2+可能产生共沉淀。例如酸杆菌门中的铁还原菌，它在还原铁的过程中产生了新的铁氧化物，导致了新的无定形或微晶形结构的产生，致使对土壤中的镉表现为极大的吸附容量，镉的溶解度下降。同时伴随着铁氧化物的形态转化，镉与其发生共沉淀，导致自身活性降低。此外，有研究表明，一些菌属也可能具有吸附、钝化重金属的能力。例如变形菌门中含有多种亲金属细菌，如耐重金属贪铜菌(Cupriavidus)，这种细菌不仅在金属含量高的环境中占优势，而且具有生物矿化金属元素的能力。这些研究显示出土壤微生物在生物沉淀镉技术中的巨大潜力。
虽然具有镉固化或镉修复功能的微生物已有许多研究报道，但是挖掘微生物资源或开发新的微生物利用技术对于镉修复领域仍然具有重要的意义。
发明内容
本发明通过以下技术方案实现：
本发明人从湖南省浏阳市分离、筛选了两株能高效去除镉(Cd2+)的微生物，根据生物信息学分类，对两株细菌进行分类和命名。其中一株为无色杆菌(Achromobacterinsuavis)SL8，另一株为肠杆菌(Enterobacter cancerogenus) SL12。肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)SL12的保藏号：CCTCCNO:M 2022288；无色杆菌(Achromobacterinsuavis)SL8的保藏号：CCTCCNO:M 2022286。上述2株微生物于2022年3月18号保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址:中国.武汉.武汉大学。
一种分离的土壤镉修复的无色杆菌(Achromobacterinsuavis)SL8，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2022286。
一种分离的土壤镉修复的肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)SL12，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2022288。
无色杆菌(Achromobacterinsuavis)SL8在制备钝化镉的菌剂的应用。
肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)SL12在制备钝化镉的菌剂的应用。
一种钝化镉的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂包括无色杆菌(Achromobacterinsuavis)SL8和肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)SL12。
优选地，复合菌剂包括无色杆菌(Achromobacterinsuavis)SL8和肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)SL12；所述无色杆菌(Achromobacterinsuavis)SL8，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2022286；所述肠杆菌(Enterobactercancerogenus)SL12，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2022288。
优选地，所述复合菌剂中无色杆菌(Achromobacterinsuavis)SL8和肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)SL12的菌液比为1:1。
复合菌剂在制备钝化镉的菌剂的应用。
本发明无色杆菌(Achromobacterinsuavis)SL8与肠杆菌(Enterobactercancerogenus)SL12的筛选方案：采集湖南省长沙市浏阳市某镉污染的农田土壤，加50mg/L浓度的镉(CdCl2)进行富集培养，将富集得到的土壤样品利用稀释涂布平板法涂布到含有一定浓度的LB固体培养基中，恒温培养待长出菌落后对不同形态的镉抗性菌落进行挑选，挑取需要的菌落于新的LB培养基中划线培养，重复多次得到纯化的菌落。分别对单一菌株，不同组合方式的菌株进行镉去除实验，筛选得到镉高效去除菌株或组合菌株。对高效镉去除菌株进行16S rRNA基因测序，并进行生物信息学分析鉴定，最终得到菌株无色杆菌(Achromobacterinsuavis)SL8和肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)SL12。
本发明的有益效果：
本发明的这种组合模式下的具有高效镉去除能力的无色杆菌和肠杆菌组合菌株在以往的研究中还未见报道，本发明对于农用微生物资源库起到了丰富补充的效果，且本发明涉及的菌剂具有绿色高效、经济适用的优点，对于环境镉污染的改善具有积极意义。
附图说明
图1：本发明的技术路线图。
图2：本发明无色杆菌SL8的系统发育进化树图。
图3：本发明无色杆菌肠杆菌SL12的系统发育进化树图。
图4：本发明无色杆菌SL8和肠杆菌SL12的扫描电镜图谱。图4A：无色杆菌SL8的的扫描电镜图谱；图4B：肠杆菌SL12的扫描电镜图谱。
图5：本发明无色杆菌SL8和肠杆菌SL12在LB培养基中对镉的去除效果图。
图6：本发明无色杆菌SL8和肠杆菌SL12在镉去除实验中的生长曲线图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1:无色杆菌SL8和肠杆菌SL12的分离鉴定。
样品采集：含微生物的镉污染土壤样品采集来自湖南省长沙市浏阳市某镉污染农田的5-20cm的表层土壤。
微生物富集：称取土壤样品10g，在无菌操作的条件下将其放入装有灭过菌的90mL液体LB培养基的三角瓶中，置于摇床，200rpm/min，28摄氏度振荡12小时。
镉抗性菌分离：吸取(2)中1mL土壤样品到9mL无菌生理盐水中按照逐步稀释法依次稀释至10-3，10-4，10-5，以上稀释浓度土壤样品分别取0.1mL涂布在含50mg/L CdCl2的筛选培养基上，每个稀释浓度涂3个重复平板，置于28 摄氏度恒温培养至长出需要的具有镉抗性的候选菌落。液体LB培养基配制组分：酵母提取物5g/L，胰化蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，NaOH调pH至7.0。在 121摄氏度高压蒸汽灭菌锅中灭菌30分钟。固体LB培养基配制同液体LB培养基，固体LB培养基中需另加2％琼脂。
划线分离纯化：再将步骤(3)中得到的不同菌落按照划线平板法进行划线分离，得到纯化的单一菌落。
镉抗性菌的筛选：将步骤(4)得到的单一菌落接种到含镉浓度为50mg/L 的LB固体培养基上进行初筛，每组设3个重复，平板置于28摄氏度恒温箱中倒置培养3天。将上述平板上长出的菌落依次划线接种于镉(Cd2+)浓度为50 mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L的LB固体培养基平板培养基上进行复筛，在30摄氏度恒温箱中倒置培养3天，重复3次操作，观察菌落生长情况。将有菌落生长的固体平板保存于4℃冰箱中保存。
镉去除菌的筛选：将步骤(5)中得到的菌株单克隆接种到含100mg/L镉 (Cd2+)浓度的液体LB培养基中，测定单一菌株、不同组合菌株，溶液中剩余的Cd2+含量。确定具有高效镉去除能力的菌株或菌株组合。
镉去除菌的分类鉴定：一、16S核糖体RNA鉴定：选择16S rRNA基因高变区序列进行细菌群落测序，测序引物为27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')-1492R(5'-TACCTTGTTACGACTT-3')，测序区域为V3～V4区。然后进行PCR扩增，合并引物接头并使用琼脂糖电泳对PCR产物进行纯化、定量和均一化并合成测序文库。扩增无色杆菌(Achromobacterinsuavis)SL8与肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)SL12的 16S核糖体RNA后，得到的序列扩増产物进行测序，无色杆菌 (Achromobacterinsuavis)SL8的16SrRNA的基因序列如SEQ ID NO:1所示；肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)SL12的16SrRNA的基因序列如SEQ ID NO:2所示。测序结果在GenBank核酸序列库中进行BLAST分析。利用Mega.7 对无色杆菌(Achromobacterinsuavis)SL8与肠杆菌(Enterobactercancerogenus) SL12菌株进行系统发育树构建，确定其分类。构建的系统发育树(图2-3)结果发现，无色杆菌(Achromobacterinsuavis)SL8与肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)SL12分别能与无色杆菌属与肠杆菌属的菌株聚类到一起，且其核苷酸序列同源性都为99.86％。因此将两种菌株分别鉴定为无色杆菌 (Achromobacterinsuavis)SL8，肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)SL12。二、利用电子扫描显微镜对镉去除菌株进行形态学观察(图4)。
实施例2:无色杆菌(Achromobacterinsuavis)SL8和肠杆菌(Enterobactercancerogenus)SL12的镉去除曲线。
将纯化后的无色杆菌(Achromobacterinsuavis)SL8和肠杆菌(Enterobactercancerogenus)SL12菌株接种于100mL LB液体培养基中，在200rpm/min，30 摄氏度的摇床中振荡培养。待振荡培养至菌液OD600值为0.8，取300uL于30mL 的100mg/L或50mg/L含Cd2+液体LB培养基中，在200rpm/min，30摄氏度摇床中振荡培养。分别在实验的第0，1，3，7天进行取样，每次取1mL于离心管，在12000rpm离心10min，取上清液1mL。用45um过滤器过滤，用原子光谱吸收仪(AAS)测定滤液中Cd2+浓度。
实验结果描述：当加入的镉的初始浓度为50mg/L时，7天后含无色杆菌(Achromobacterinsuavis)SL8的实验体系溶液中镉浓度下降到了8.7mg/L，镉去除率达到了82.6％。在加入了肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)SL12的体系中，7天后镉的去除率为63.4％。当加入的镉的初始浓度为100mg/L时，7天后含无色杆菌(Achromobacterinsuavis)SL8的实验体系溶液中镉浓度下降到了 30.45mg/L，镉去除率为69.55％。在加入了肠杆菌(Enterobacter cancerogenus) SL12的体系中，7天后镉的去除率为70.81％。然而，将无色杆菌 (Achromobacterinsuavis)SL8和肠杆菌(Enterobactercancerogenus)SL12按照菌液比1:1的加入到100mg/L的含镉实验体系，则七天后，其镉去除率达到了 80％以上。因此，无色杆菌(Achromobacterinsuavis)SL8和肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)SL12的共同使用在高浓度含镉环境中对镉的去除具有协同效果 (结果见图5)。此外，将无色杆菌(Achromobacterinsuavis)SL8和肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)SL12按照菌液比1:1配比后加入生物炭加入到100 mg/L的含镉实验体系，则七天后，其镉去除率达到了82％以上。
实施例3:无色杆菌(Achromobacterinsuavis)SL8和肠杆菌(Enterobactercancerogenus)SL12在镉溶液中的生长曲线。
将纯化后的无色杆菌(Achromobacterinsuavis)SL8和肠杆菌(Enterobactercancerogenus)SL12菌株接种于100mL LB液体培养基中，在200rpm/min，30 摄氏度的摇床中振荡培养。待振荡培养至菌液OD600值为0.8，取300uL于30mL 的0mg/L、50mg/L、100mg/L或含Cd2+液体LB培养基中，在200rpm/min， 30摄氏度摇床中振荡培养。分别在实验的第0，6，24，30，54，70小时进行取样，用光学显微镜进行观察，利用血球计数板法进行计数，记录实验过程中细菌浓度变化，绘出无色杆菌(Achromobacterinsuavis)SL8和肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)SL12在镉溶液中的生长曲线。
实验结果：无色杆菌(Achromobacterinsuavis)SL8和肠杆菌(Enterobactercancerogenus)SL12在镉溶液中的生长曲线表明，当添加50mg/L Cd2+时，对于无色杆菌(Achromobacterinsuavis)SL8的生长几乎不产生影响，但对于肠杆菌 (Enterobactercancerogenus)SL12，在实验前30个小时，镉的加入使细菌生长受到一定程度的抑制。实验表明，添加100mg/L Cd2+对于无色杆菌 (Achromobacterinsuavis)SL8和肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)SL12的生长都有影响，在此浓度下，细菌生长虽然受到抑制，但是其浓度也都能达到1011 cells/mL以上。因此，适当浓度的镉环境对于两种细菌的生存影响不大(结果见图6)。
序列表
<110> 湖南省蔬菜研究所
<120> 一种含有无色杆菌和肠杆菌的复合菌剂及其应用
<141> 2022-03-25
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1398
<212> DNA
<213> 无色杆菌(Achromobacter insuavis)
<400> 1
ggtatcgccc cccttgcggt taggctaact acttctggta aaacccactc ccatggtgtg 60
acgggcggtg tgtacaagac ccgggaacgt attcaccgcg acatgctgat ccgcgattac 120
tagcgattcc gacttcacgc agtcgagttg cagactgcga tccggactac gatcgggttt 180
ctgggattgg ctccccctcg cgggttggcg accctctgtc ccgaccattg tatgacgtgt 240
gaagccctac ccataagggc catgaggact tgacgtcatc cccaccttcc tccggtttgt 300
caccggcagt ctcattagag tgccctttcg tagcaactaa tgacaagggt tgcgctcgtt 360
gcgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac agccatgcag cacctgtgtt 420
ccggttctct tgcgagcact gccaaatctc ttcagcattc cagacatgtc aagggtaggt 480
aaggtttttc gcgttgcatc gaattaatcc acatcatcca ccgcttgtgc gggtccccgt 540
caattccttt gagttttaat cttgcgaccg tactccccag gcggtcaact tcacgcgtta 600
gctgcgctac caaggcccga aggccccaac agctagttga catcgtttag ggcgtggact 660
accagggtat ctaatcctgt ttgctcccca cgctttcgtg catgagcgtc agtgttatcc 720
caggaggctg ccttcgccat cggtgttcct ccgcatatct acgcatttca ctgctacacg 780
cggaattcca cctccctctg acacactcta gcccggtagt taaaaatgca gttccaaagt 840
taagctctgg gatttcacat ctttctttcc gaaccgcctg cgcacgcttt acgcccagta 900
attccgatta acgcttgcac cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta gttagccggt 960
gcttattctg caggtaccgt cagtttcgcg gggtattaac ccacgacgtt tctttcctgc 1020
caaaagtgct ttacaacccg aaggccttca tcgcacacgc gggatggctg gatcagggtt 1080
tcccccattg tccaaaattc cccactgctg cctcccgtag gagtctgggc cgtgtctcag 1140
tcccagtgtg gctggtcgtc ctctcaaacc agctacggat cgtcgccttg gtgagccgtt 1200
accccaccaa ctagctaatc cgatatcggc cgctccaata gtgcaaggtc ttgcgatccc 1260
ctgctttccc ccgtagggcg tatgcggtat tagctacgct ttcgcgtagt tatcccccgc 1320
tactgggcac gttccgatac attactcacc cgttcgccac tcgccaccag accgaagtcc 1380
gtgctgccgt tcgactgc 1398
<210> 2
<211> 1393
<212> DNA
<213> 肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)
<400> 2
ccctcccgaa ggttaagcta cctacttctt ttgcaaccca ctcccatggt gtgacgggcg 60
gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gtagcattct gatctacgat tactagcgat 120
tccgacttca tggagtcgag ttgcagactc caatccggac tacgacgcac tttatgaggt 180
ccgcttgctc tcgcgaggtc gcttctcttt gtatgcgcca ttgtagcacg tgtgtagccc 240
tactcgtaag ggccatgatg acttgacgtc atccccacct tcctccagtt tatcactggc 300
agtctccttt gagttcccgg ccggaccgct ggcaacaaag gataagggtt gcgctcgttg 360
cgggacttaa cccaacattt cacaacacga gctgacgaca gccatgcagc acctgtctca 420
gagttcccga aggcaccaat ccatctctgg aaagttctct ggatgtcaag agtaggtaag 480
gttcttcgcg ttgcatcgaa ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg cccccgtcaa 540
ttcatttgag ttttaacctt gcggccgtac tccccaggcg gtcgacttaa cgcgttagct 600
ccggaagcca cgcctcaagg gcacaacctc caagtcgaca tcgtttacgg cgtggactac 660
cagggtatct aatcctgttt gctccccacg ctttcgcacc tgagcgtcag tctttgtcca 720
gggggccgcc ttcgccaccg gtattcctcc agatctctac gcatttcacc gctacacctg 780
gaattctacc cccctctaca agactctagc ctgccagttt cgaatgcagt tcccaggttg 840
agcccgggga tttcacatcc gacttgacag accgcctgcg tgcgctttac gcccagtaat 900
tccgattaac gcttgcaccc tccgtattac cgcggctgct ggcacggagt tagccggtgc 960
ttcttctgcg ggtaacgtca atcgatgagg ttattaacct caccgccttc ctccccgctg 1020
aaagtacttt acaacccgaa ggccttcttc atacacgcgg catggctgca tcaggcttgc 1080
gcccattgtg caatattccc cactgctgcc tcccgtagga gtctggaccg tgtctcagtt 1140
ccagtgtggc tggtcatcct ctcagaccag ctagggatcg tcgcctaggt gagccgttac 1200
cccacctact agctaatccc atctgggcac atctgatggc aagaggcccg aaggtccccc 1260
tctttggtct tgcgacgtta tgcggtatta gctaccgttt ccagtagtta tccccctcca 1320
tcaggcagtt tcccagacat tactcacccg tccgccgctc gtcacccgag agcaagctct 1380
ctgtgctacc gct 1393
Claims (8)
1.一种分离的土壤镉修复的无色杆菌(Achromobacterinsuavis)SL8，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2022286。
2.一种分离的土壤镉修复的肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)SL12，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO:M 2022288。
3.权利要求1所述的无色杆菌(Achromobacterinsuavis)SL8在制备钝化镉的菌剂的应用。
4.权利要求2所述的肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)SL12在制备钝化镉的菌剂的应用。
5.一种钝化镉的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂包括无色杆菌(Achromobacterinsuavis)SL8和肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)SL12；所述无色杆菌(Achromobacterinsuavis)SL8，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO:M 2022286；所述肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)SL12，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO:M 2022288。
6.根据权利要求5所述的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂中无色杆菌(Achromobacterinsuavis)SL8和肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)SL12的菌液比为1:1。
7.根据权利要求5所述的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂还包含生物炭。
8.权利要求5-7任一所述的复合菌剂在制备钝化镉的菌剂的应用。
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Citations (4)
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| CN105062926A (zh) * | 2015-08-26 | 2015-11-18 | 华中农业大学 | 一种用于重金属镉污染治理的无色杆菌及其应用 |
| CN114107101A (zh) * | 2021-11-21 | 2022-03-01 | 华中农业大学 | 一种固定镉和铬的贪铜菌及其在镉和铬复合污染土壤共修复中的应用 |
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-
2022
- 2022-03-29 CN CN202210316760.8A patent/CN115404179A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104928207A (zh) * | 2015-04-30 | 2015-09-23 | 太原理工大学 | 霍氏肠杆菌cl2013及制备六价铬修复菌剂的方法 |
| CN105062926A (zh) * | 2015-08-26 | 2015-11-18 | 华中农业大学 | 一种用于重金属镉污染治理的无色杆菌及其应用 |
| CN114107101A (zh) * | 2021-11-21 | 2022-03-01 | 华中农业大学 | 一种固定镉和铬的贪铜菌及其在镉和铬复合污染土壤共修复中的应用 |
| CN115418326A (zh) * | 2022-03-28 | 2022-12-02 | 湖南省蔬菜研究所 | 一种复合菌剂及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JIEYI ZHOU 等: "Isolation, characterization and inoculation of Cd tolerant rice endophytes and their impacts on rice under Cd contaminated environment", ENVIRONMENTAL POLLUTION, pages 1 - 9 * |
| YINGJIE WU 等: "The plant-growth promoting bacteria promote cadmium uptake by inducing a hormonal crosstalk and lateral root formation in a hyperaccumulator plant Sedum alfredii", JOURNAL OF HAZARDOUS MATERIALS, vol. 395, pages 1 - 11 * |
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