CN115397988A - 用于治疗疾病的反义寡聚体 - Google Patents
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Abstract
一种分离或纯化的反义寡聚体,用于修饰血管紧张素转换酶2(ACE2)中的前mRNA剪接,以调节ACE2基因转录物或其部分的剪接,所述分离或纯化的反义寡聚体具有修饰的主链结构;以及与此类反义寡聚体具有至少75%序列同一性且具有修饰的主链结构的序列。
Description
发明领域
本发明涉及用于调节编码血管紧张素转换酶2(ACE2)或其部分的前mRNA的剪接的方法,所述方法使用剪接转换反义寡核苷酸(AON)来诱导新的编码可溶性ACE2同工型(isoform)的ACE2剪接变体产生,以及本发明涉及使用所述调节剂(modulators)治疗ACE2相关疾病的方法。
背景技术
血管紧张素转化酶2(ACE2;EC3.4.17.23)是属于外肽酶超家族的92-kDA 1型整合膜糖蛋白。ACE2在大多数组织中表达且是有活性的。
人ACE2基因存在于人X染色体的Xp22.2区域中。它包含18个外显子和17个内含子,以及一个调节其转录的5'侧翼区域。
人ACE2蛋白包含球状胞外结构域(残基18-740)、单次跨膜结构域(残基741-761)和短胞质尾(残基762-805)。ACE2在Asn53、Asn90、Asn103、Asn322、Asn432、Asn546和Asn690处是N-糖基化的。
严重急性呼吸综合征相关的冠状病毒(包括SARS-CoV和SARS-CoV-2)、HNL63-CoV(NL63-S)和SARS样WIV1-CoV,在独特的且离开ACE2深陷的催化结构域的位点处结合ACE2的胞外结构域。SARS-CoV-2对ACE2的亲和力似乎高于包括SARS-CoV在内的其他CoV,这可能对其在人类中的更高的传播性有贡献。
ACE2的胞外结构域包含单个金属肽酶结构域,其作为末端羧肽酶起作用,例如,从Ang II(1-8)切割C末端苯丙氨酸以产生Ang(1-7)。ACE2的遗传缺失导致Ang II水平升高,而Ang-(1-7)水平降低。因此,认为ACE2是肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)中的关键调节酶。
RAAS是涉及许多常见疾病和疾病过程的发生和进展的稳态途径。广泛使用血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂或血管紧张素II受体1型(AT1R)阻滞剂(抑制剂)抑制RAAS治疗许多疾病和/或病症,包括高血压、心血管疾病(CVD)、心脏衰竭、慢性肾病(CKD)和糖尿病并发症。也已显示RAAS抑制在预防糖尿病、神经保护、改变某些癌症的生长甚至衰老方面具有益处,AT1R的遗传缺失(geneticdeletion)赋予小鼠长寿。已知RAAS的激活是动脉粥样硬化、慢性心脏病、慢性肾病、高血压、肺病和冠状病毒感染的重要介质。
ACE2的C端并入了残基614-805,覆盖了ACE2的非催化性细胞外、跨膜和细胞内结构域,显示出与集合管蛋白(collectrin)47.8%的序列同一性,所述集合管蛋白是一种没有酶活性的蛋白质,其参与囊泡运输和膜融合过程。因此,认为ACE2是一种融合蛋白,其中19-613位是ACE样的,且614-805位是集合管蛋白样的。
ACE2的胞质尾还含有整联蛋白和钙调蛋白(calmodulin)结合位点。该胞质结构域充当大氨基酸转运蛋白B(O)AT1的转运衔接头(trafficking adaptor),将其转移到肠道上皮细胞的顶膜。将冠状病毒摄入细胞也依赖于由ACE2的胞质尾介导的内化。
大多数ACE2是膜锚定的。但是,在脱落酶(sheddase)的影响下,可以发生胞外结构域的组成型和诱导型自膜脱落。由脱落产生的低水平C端截短的ACE2同工型天然存在于血液、尿液、支气管肺泡液和唾液中。ACE2的这种可溶性同工型缺乏膜锚和胞质尾。
ACE2与肺病的发生和进展有关。Ace2 KO小鼠显示出对各种肺病模型应答的肺损伤增强,并且可以通过重新引入ACE2来挽救损伤表型。特别地,在缺乏ACE2的情况下,急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的病理学被放大,而肺ACE2的下降预示着不良的临床结果。重组可溶性ACE2在急性和慢性肺损伤的实验模型中具有有益作用,并且已经在ARDS患者的临床试验中进行了研究。
ACE2在动脉粥样硬化斑块发展中起重要作用。我们之前已经表明,Ace2的遗传缺陷与斑块积聚增加有关,与血管紧张素II输注后观察到的相当。在已形成的动脉粥样硬化斑块和在促动脉粥样硬化状态(如糖尿病)中,ACE2的表达降低。增加循环的可溶性ACE2的方法减少该模型中的动脉粥样硬化。
已知RAAS的激活是高血压的关键介质,阻断RAAS激活的干预措施是所有降血压剂中最广泛使用的。这些药物的抗高血压功效部分是由它们降低Ang II或其信号传导的能力介导的。然而,常规RAS阻断的抗高血压作用也部分取决于ACE抑制剂和血管紧张素受体阻滞剂(ARB)增加循环Ang(1-7)水平的能力。鉴于血管系统中Ang(1-7)的主要来源是ACE2,该数据表明ACE2不仅影响高血压的发展,而且潜在地影响对高血压治疗的反应。ACE2和RAAS也与中枢性高血压的发病机制有关。在自发性高血压大鼠中,延髓头端腹外侧区(rostralventrolateral medulla,RVLM)中ACE2的表达降低,而RVLM中ACE2的持续过量表达导致高血压显著减弱。
在心脏中,ACE2代表Ang II代谢的主要途径。小鼠ACE2缺陷导致早期心脏肥大并加速心肌梗死后不良心室重构。在一些模型中,ACE2缺陷也导致随着年龄增长和/或心脏压力超负荷所致的进行性心脏纤维化。又,在用重组ACE2、ACE抑制剂或AT1R阻滞剂治疗后,这些变化被逆转,这表明心脏中RAAS的平衡是进行性心脏病的重要驱动因素。
在糖尿病肾和其他与肾损伤和激活相关的状态中,ACE2起着重要作用,因为ACE2缺陷小鼠加速了肾损伤。通过增加循环的可溶性ACE2的发明减少实验性糖尿病的肾损伤
RAAS还具有许多代谢功能。ACE2缺陷与胰岛素抵抗和葡萄糖稳态受损有关,在高脂肪饮食下加剧这种情况。ACE2缺陷与骨骼肌和肝脏中脂质积累的增加有关。
正是在此背景下,描述了使用跳读外显子的AON(exon-skipping AON)来调节ACE2剪接的本方法,以相对于全长ACE2优选地产生可溶性ACE2。
对背景技术的上述讨论仅旨在促进对本发明的理解。该讨论不是认可或承认所提及的任何材料在本申请的优先权日是或曾经是公知常识的一部分。
发明概述
广义地说,根据本发明的一种形式,提供了分离或纯化的一种AON或多种AON的组合,用于调节编码血管紧张素转换酶2(ACE2)或其部分的前mRNA基因转录物的备选剪接。纯化的AON优选地具有经修饰的主链(backbone)结构。还提供了与此类反义寡聚体具有至少75%、80%、85%、90%或至少95%序列同一性并且具有修饰的主链结构的序列。
在本发明的一个方面,提供了10-50个核苷酸的AON,其包含与在ACE2前mRNA内含子附近或内部的区域互补的靶向序列。
在本发明的一个方面,提供了10-50个核苷酸的AON,其包含与ACE2前mRNA的剪接位点互补或相邻的靶向序列。
因为诸如RNA二级结构、AON与SR蛋白之间的竞争、核内不均一核糖核蛋白(hnRNP)和/或构成剪接体的其他元件等因素可影响AON的作用,所以针对关键受体或供体剪接位点的AON将不总是会改变剪接。因此,在本发明的一个方面,提供了10至50个核苷酸的AON,其包含与ACE2前mRNA中充当增强子或沉默子的顺式作用RNA元件互补或相邻的靶向序列,当被剪接体元件(例如蛋白剪接因子、uRNA、lncRNA)结合时,该靶向序列调节附近外显子的剪接。
在本发明的一个方面,提供了10至50个核苷酸的AON,其包含与ACE2前mRNA互补的靶向序列,该靶向序列调节所述mRNA的二级结构以影响剪接位点选择。
在本发明的一种形式中,提供了用于诱导ACE2基因转录物或其部分中的一个或多个外显子序列的排除(也称为跳读)的经分离或纯化的AON。
在本发明的一种形式中,AON经化学修饰以防止前mRNA-AON复合物的降解,包括但不限于磷酰二胺吗啉代寡聚体(PMO)、硫代吗啉代寡核苷酸(TMO)、2’-O-甲基(2’-O-Me)硫代磷酸(PTO)寡核苷酸和2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE)PTO寡核苷酸、锁核酸(LNA)修饰的AON、热稳定扭曲插入核酸(TINA)和肽核酸(PNA)。
在本发明的一种形式中,AON与部分缀合以增加它们的递送。所述部分包括但不限于细胞穿透肽(CPP)、体内吗啉代寡聚体(vivo-morpholino,VMO)或肽磷酰二胺吗啉代寡聚体(PPMO)。
优选地,AON选自包含表3中列出的序列及其组合、衍生物或混合物(cocktails)。优选地,AON选自包含:SEQ ID NO:1-31,更优选SEQ ID NO:5、6、9或11的列表。更优选地,AON是SEQ ID NO:6和9或SEQ ID NO:6和11。
本发明的AON可以是能够与靶位点结合的AON,其中该靶位点是推定的mRNA剪接位点,其选自剪接供体位点、剪接受体位点、剪接增强子序列、剪接沉默子序列或调节前mRNA二级结构的位点。当靶向供体或受体剪接位点时,靶位点也可包括一些侧翼内含子序列。
更具体地,AON可以选自包含SEQ ID NO:1-31中的任何一个或多个,更优选地SEQID NO:5、6、9或11,和/或表3中的任何一个所示的序列,及其组合、衍生物或混合物的组。更优选地,所述AON是多个AON的组合;优选地SEQ ID NO:6和9的组合或SEQ ID NO:6和11的组合。这包括可以在严格杂交条件下与此类序列杂交的序列,与其互补的序列,含有经修饰的碱基的序列,经修饰的主链(backbone),以及调节ACE2基因转录物中前mRNA加工活性的其功能性截短物或延伸物。
在某些实施方案中,AON可以与靶序列100%互补,或者可以包括错配,例如以适应变体,只要在寡核苷酸与靶序列之间形成的异源双链体足够稳定以承受细胞核酸酶的作用和可能在体内发生的其他降解模式。因此,某些寡核苷酸可以在寡核苷酸与靶序列之间具有约或至少约70%的序列互补性,例如70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列互补性。
本发明还扩展到能够与选定靶标结合以调节ACE2前mRNA的备选剪接的两种或更多种AON的组合,包括包含两种或更多种此类AON的构建体。这些构建体可一起用于基于AON的联合疗法。AON的组合优选地是SEQ ID NO:6和9的组合或SEQ ID NO:6和11的组合。
根据本发明的另一方面,本发明扩展到本发明的AON序列的cDNA或克隆拷贝,以及含有本发明的AON序列的载体。本发明还进一步扩展到含有此类序列和/或载体的细胞。
还提供了一种用于操纵ACE2基因转录物的剪接的方法,该方法包括以下步骤:
a)提供一种或多种如本文所述的AON,并且使所述一种或多种寡聚体与靶核酸位点结合。
还提供了一种用于治疗、预防或缓解受试者中与ACE2表达有关的疾病的影响的预防性或治疗性药物组合物,该组合物包含:
a)一种或多种如本文所述的AON;以及
b)一种或多种可药用载体和/或稀释剂。
该组合物可以包含约1nM至1000nM的本发明的每种所需AON。优选地,该组合物可以包含约1nM至500nM,最优选1nM至10nM之间的本发明的每种AON。
还提供了一种用于治疗、预防或缓解与ACE2表达相关的疾病的影响的方法,该方法包括以下步骤:
向该受试者施用有效量的一种或多种如本文所述的AON或包含该一种或多种AON的药物组合物。
在本发明的一种形式中,AON与调节肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的其他药剂共同施用,所述其他药剂包括血管紧张素受体阻滞剂和ACE抑制剂和重组ACE2。
在本发明的一种形式中,AON与调节冠状病毒感染性的其他药剂共同施用,所述其他药剂包括被动免疫、主动免疫或抗病毒疗法。
还提供了如本文所述的经纯化和分离的AON用于制造治疗、预防或缓解与ACE2表达和/或活性相关的疾病的影响的药物的用途。
还提供了一种用于治疗、预防或缓解受试者中与ACE2表达相关的疾病的影响的药盒,该药盒至少包含包装在合适容器中的如本文所述的AON及其组合或混合物,以及其使用说明。
优选地,受试者中与ACE2表达相关的疾病是冠状病毒感染、肺病、动脉粥样硬化、慢性心脏病、慢性肾病或糖尿病。
患有与ACE2表达相关的疾病的受试者可以是哺乳动物,包括人。
现将参照所附非限制性实施例和附图描述本发明的其他方面。
附图简述
在下面对本发明的几个非限制性实施方案的描述中更充分地描述了本发明的其他特征。将该描述包括在内仅用于举例说明本发明的目的。不应将其理解为对上述本发明的广泛概括、披露内容或描述的限制。该描述将参考附图进行,其中:
图1a.来自用选择的C端截短的ACE2构建体转染的CHO细胞的细胞培养基中的可溶性ACE2蛋白在蛋白质印迹上的表达,如通过多克隆抗ACE2抗体(图1a-i)或单克隆抗His抗体检测(图1a-ii)。
图1b.来自用选择的C端截短的mACE2构建体转染的CHO细胞的细胞培养基中的可溶性ACE2蛋白的表达,如通过抗ACE2 ELISA检测。条柱显示平均值±SEM。每个构建体n=6。
图1c.来自用选择的C端截短的mACE2构建体转染的CHO细胞的培养基中ACE2的催化活性,如通过淬灭荧光ACE2活性测定法检测。条柱显示平均值,误差条显示SEM。每个构建体n=6。
图1d.来自用含有选择的C端截短的mACE2构建体的DNA小环转染的CHO细胞的培养基中可溶性mACE2蛋白的表达,如使用多克隆抗ACE2抗体通过蛋白质印迹检测。
图1e.来自用编码mACE2(19-615)的DNA小环转染的CHO细胞的培养基中可溶性mACE2蛋白的表达,如通过抗ACE2 ELISA检测。条柱显示平均值,误差条显示SEM。每个构建体n=6。
图1f.通过用来自过量表达mACE2(19-615)的CHO细胞的培养基预孵育,拮抗AngII诱导的HAEC细胞中炎性细胞因子MCP-1的表达,并且选择性ACE2抑制剂MLN4760拮抗这种保护作用。数据表示为平均值±SEM。每列是n=8的组。
图1g.通过用来自过量表达mACE2(19-615)的CHO细胞的培养基预孵育,拮抗HAEC细胞中Ang II诱导的粘附分子ICAM-1的表达,并且选择性ACE2抑制剂MLN4760拮抗这种保护作用。
图1h.肌内注射编码mACE2(19-615)的DNA小环后4周,小鼠血清中的循环ACE2蛋白增加。
图1i.肌内注射编码mACE2(19-615)的DNA小环后4周,小鼠血清中的循环ACE2活性增加。
图1j.与载体转染的细胞相比,人Y613L-hACE2(19-613)蛋白在转染CHO细胞的15μL细胞培养基中的表达,如通过蛋白质印迹法检测。
图1k.来自用Y613L-hACE2(19-613)转染的CHO细胞的培养基中ACE2的催化活性,如通过ACE2活性测定法检测。重组Ace2(1-740)显示为阳性对照,来自未转染CHO细胞的培养基作为阴性对照。
图1l.用Y613L-ACE2处理后,以剂量依赖性方式减少用SARS-CoV-2感染VeroE6细胞后的空斑积聚。
图2a.ACE2的组成型剪接产生了外显子13-14-15的融合。如果这种剪接模式可以通过使用靶向外显子14的供体剪接位点和受体剪接位点的AON来改变,导致外显子14跳读,则它将产生编码Y613L-ACE2(19-613)的新mRNA剪接变体(Δ14剪接变体)。
图2b.RT-PCR扩增图显示在用(ii)H14A[-17+8](100nM)或(iii)H14A[-17+8]和H14D[+13-12](50+50nM)的组合处理人Caco-2细胞48小时后诱导Δ14剪接变体(箭头,绿色)的从头表达。在用非靶AON(100nM,i)转染的细胞中未观察到Δ14剪接变体的表达。18S显示为表达对照(蓝色)。
图2c.与剂量对照非靶AON比较,在用AON的组合,具体地,H14D[+9-16]和H14A[-17+8]以及H14D[+13-12]和H14A[-17+8],处理人Caco-2细胞后,包含外显子14的常规剪接的ACE2mRNA的表达。数据显示为平均值±SEM。*p<0.01vs剂量对照。
图2d.在用靶向ACE2的AON或非靶对照AON转染人Caco-2细胞后,所有ACE2 mRNA剪接变体(即含有外显子13和外显子15的ACE2 mRNA)的表达。数据显示为平均值±SEM。*p<0.01vs剂量对照。数据显示为平均值±SEM。
图2e.在用AON,具体地H14D[+9-16]和H14A[-17+8]、H14D[+13-12]和H14A[-17+8]、或非靶对照AON转染人Caco-2细胞后,保留外显子14的常规剪接的ACE2 mRNA和所有ACE2 mRNA剪接变体(即含有外显子13和外显子15)的表达。数据显示为平均值±SEM。*p<0.01vs剂量对照。
图2f.RT-PCR扩增图显示在用AON(i)H14D[+9-16]和H14A[-17+8];50+50nM的组合处理人Caco-2细胞后24小时,Δ14剪接变体的从头表达(绿色)。用非靶AON(100nM,ii)转染的细胞中未观察到Δ14剪接变体的表达。18S显示为表达对照(紫色/蓝色)。
图3a.在用靶向ACE2的AON,具体地H14A[-17+8]和H14D[+13-12],或非靶对照AON转染VeroE6细胞后,含有外显子14的常规剪接的ACE2 mRNA的表达和含有外显子13和外显子15的所有ACE2 mRNA剪接变体的表达。数据显示为平均值±SEM。*p<0.01vs剂量对照。
图3b.用靶向ACE2的AON,具体地H14A[-17+8]和H14D[+13-12]、H14A[-17+8]和H14D[+9-16]、H14A[-6+19]和H14D[+13-12]或非靶对照AON转染VeroE6细胞后,催化活性可溶性ACE2在细胞培养基中的表达,如通过测量合并培养基样品中的ACE2活性。
图3c.用靶向ACE2的AON,具体地H14A[-17+8]和H14D[+13-12]或非靶对照AON转染VeroE6细胞后,可溶性ACE2蛋白在细胞培养基中的表达,如通过ELISA测量。数据显示为平均值±SEM。*p<0.01vs剂量对照。
图3d.用靶向ACE2的AON,具体地H14A[-17+8]和H14D[+13-12]或非靶对照AON转染VeroE6后,SARS-CoV-2刺突糖蛋白(S1亚基)对VeroE6细胞表面的吸附。GFP的吸附显示为阴性对照。代表性图像显示在左侧。右侧数据显示为平均值±SEM。*p<0.01vs非靶对照。
图4a.用2’-O-Me PTO AON(50μM)转染后,Caco-2细胞中ACE2 mRNA剪接变体的表达,如用位于外显子13(正向)和外显子15(反向)的引物通过一步PCR检测的。
图4b.用2’-O-Me PTO AON(50nM)转染72小时后,在Calu-3细胞中ACE2 mRNA剪接变体的表达,如用位于外显子13(正向)和外显子15(反向)的引物通过一步PCR检测的。
图4c.用H14A[-22+3](SEQ ID NO:6;1uM)的体内吗啉代制剂预处理Calu-3细胞72小时,然后与SARS-CoV-2(Vic01)一起孵育,Calu-3细胞的培养基中的中位组织培养物感染量(TCID50)。
图5a.从外显子9到18且有和没有外显子17(倒数第二个外显子)的ACE2转录本的阅读框。由于外显子17是一个框内外显子,因此去除外显子17不会导致外显子18读数的移码。
图5b.用靶向外显子17的50-200μM 2’-O-Me PTO AON转染人成纤维细胞24小时后诱导不同的ACE2 mRNA剪接变体,如使用位于外显子13(正向)和外显子18(反向)的引物通过一步PCR检测的。
图5c.用靶向外显子17的50-200μM 2’-O-Me PTO AON转染人角质形成细胞系HaCaT后24小时诱导不同的ACE2 mRNA剪接变体,如使用位于外显子13(正向)和外显子18(反向)的引物通过一步PCR检测的。
图5d.用50-200μM的前三个候选AON和靶向外显子17的2’-O-Me PTO AON转染HaCaT细胞后对外显子17跳读的时程分析,如使用位于外显子13的引物(正向)和外显子18(反向)的引物通过一步PCR检测的。
图5e.在用M17A[+21+45](SEQ ID NO:9)的体内吗啉代制剂处理(1-3μM)后48小时,使用位于外显子13(正向)和外显子18(反向)的引物用一步PCR检测ACE2 mRNA剪接变体在Caco-2细胞中的表达。
图5f.用M17A[+21+45](SEQ ID NO:9),剂量为3mg/kg,在DI水中气管内递送,用对照AON或载剂气管内递送,处理后7天,小鼠肺中ACE2 mRNA的表达,如通过真实RT-PCR测量的。
图5g.在用M17A[+21+45](SEQ ID NO:32)以3mg/kg的剂量在DI水中气管内递送,用对照AON或载剂气管内递送,处理后7天,小鼠支气管肺泡液中可溶性ACE2蛋白的表达,如ELISA测量的。
图5h.用H17A[+21+45](SEQ ID NO:9;1uM)的体内吗啉代制剂预处理Calu-3细胞72小时,随后与SARS-CoV-2(Vic01)孵育的培养基中的中值组织培养物感染量(TCID50)。
图6a.用体内吗啉代AON,即,H17A[+21+45]或H14A[-22+3]或这两者(各1μM)处理后,Calu-3细胞中ACE2 mRNA剪接变体的表达,如使用位于外显子13(正向)和外显子15(反向)的引物通过一步PCR检测的。
图6b.用体内吗啉代AON,即,H17A[+21+45]、H14A[-22+3]、H17A[+21+45]和H14A[-22+3]两者、或对照寡核苷酸(各1μM)处理后,Caco-2细胞中ACE2 mRNA剪接变体的表达,如使用位于外显子13(正向)和外显子15(反向)的引物通过一步PCR检测的。
图6c.用体内吗啉代AON,即,H17A[+21+45]或H14A[-22+3]或这两者(各1μM)处理后,Caco-2细胞中ACE2 mRNA剪接变体的表达,如使用位于外显子13(正向)和外显子18(反向)的引物通过一步PCR检测的。
图6d.用H17A[+21+45]和H14A[-22+3](各0.5μM)的体内吗啉代制剂组合预处理Calu-3细胞72小时,随后与SARS-CoV-2(Vic01)孵育的培养基中的中值组织培养物感染量(TCID50)。
图7.本申请的序列。
发明描述
发明详述
反义寡核苷酸(AON)是短的、合成的、反义的、经修饰的DNA链或RNA链,这些链可以通过Watson–Crick碱基配对与前RNA/mRNA选择性地杂交并选择性地调节靶RNA的功能。
当AON用于调节mRNA的备选剪接时,常常将它们称为剪接转换寡核苷酸(SSO)。在本发明中,术语AON和SSO可以互换使用。AON与前mRNA碱基配对并通过阻断剪接机制的组分与前mRNA之间发生的RNA-RNA碱基配对或蛋白-RNA结合相互作用来破坏转录物的正常剪接库。AON可以诱导选定外显子的“跳读”和/或内含子序列的保留以调节翻译产物。这可以通过以下方式来实现:直接靶向剪接位点,或通过调节特异性蛋白的结合或改变前mRNA的二级结构来靶向参与剪接增强或沉默的顺式作用序列。
治疗性AON可用于治疗遗传疾病,以跳读有缺陷或未对齐的部分,从而允许生成内部缺失的,但现在作为治疗剂的功能性蛋白。
备选的剪接目前不被认为是ACE2转录后基因调控的重要层。转录有时确实会自然产生备选剪接变体,主要不同之处在于外显子1的5'延伸。然而,由于这些序列是非编码RNA,因此功能意义尚不清楚。值得注意的是,外显子14不会天然地进行备选剪接。
本发明使用AON来操纵ACE2前mRNA的剪接模式,导致产生编码可溶性ACE2同工型的新剪接变体,这些同工型具有酶促功能和/或充当诱饵受体以拮抗冠状病毒结合内源性ACE2。
值得注意的是,迄今为止在这些剪接位点处没有发现共同的ACE2多态性。ACE2序列高度保守,即使在物种之间也是如此。因此,与使用外显子跳读技术管理遗传疾病不同,不需要个性化或个体化的序列修饰。
本发明提供了一种用于治疗、预防或改善ACE2参与疾病的发生或进展的影响的备选方法,所述疾病包括但不限于冠状病毒感染、肺病、高血压、心脏病、肾病和糖尿病,所述方法是通过开发调节ACE2前mRNA或其部分的剪接的AON来实施的。
广义地说,根据本发明的一个方面,提供了一种分离的或纯化的AON,用于调节ACE2基因转录物或其部分中的前mRNA剪接。优选地,提供了用于在ACE2前mRNA或其部分中诱导外显子排除和/或内含子保留的分离或纯化的AON。纯化的AON优选具有修饰的主链结构。还提供了与此类反义寡聚体具有至少95%序列同一性并且具有修饰的主链结构的序列。
本发明提供了一种AON,其能够结合ACE2基因转录物上的选定靶标以调节ACE2基因转录物或其部分中的前mRNA剪接。
例如,在本发明的一个方面,提供了10至50个核苷酸的AON,其包含与ACE2前mRNA或其部分的区域互补的靶向序列,所述ACE2前mRNA或其部分的区域与参与调节mRNA剪接的蛋白质的结合相关。
表1a:人ACE2基因图谱
表1b:人ACE2基因的DNA序列
表2:人ACE2蛋白的蛋白结构域
残基 | 结构域 |
1..17 | 信号肽 |
18..740 | 胞外结构域 |
30..41 | 与SARS-CoV刺突糖蛋白相互作用 |
82..84 | 与SARS-CoV刺突糖蛋白相互作用 |
353..357 | 与SARS-CoV刺突糖蛋白相互作用 |
614-805 | 集合管蛋白同源结构域 |
652..659 | ADAM17切割所必需的 |
697..716 | TMPRSS11D和TMPRSS2切割所必需的 |
741..761 | 跨膜区 |
762..805 | 胞质尾 |
与其他基于AON的疗法不同,本发明不通过RNA酶H的募集来诱导增加的RNA降解,其中RNA酶H优先结合并降解双链体中与ACE2基因的DNA结合的RNA。它也不依赖于AON与ACE2基因组DNA的杂交或AON与mRNA的结合来调节通过干扰正常功能诸如复制、转录、易位和翻译而产生的ACE2蛋白的量。相反,AON用于选择性调节ACE2基因转录物或其部分中的前mRNA剪接,并诱导外显子“跳读”。该策略优选地减少全长膜相关ACE2的表达和/或增加缺乏跨膜或胞质结构域的截短可溶性ACE2同工型的产生。
根据本发明的第一方面,提供了能够与ACE2基因转录物上的选定靶标结合以调节ACE2基因转录物或其部分中的前mRNA剪接的AON。广泛地说,提供了用于在ACE2基因转录物或其部分中诱导靶向外显子排除/内含子保留的经分离或纯化的AON。
“分离的”是指大体上或基本上不含在其天然状态下通常伴随它的组分的物质。例如,如本文所用,“分离的多核苷酸”或“分离的寡核苷酸”可以指已从天然存在状态下位于其侧翼的序列中纯化或移除的多核苷酸,例如从基因组中与该DNA片段相邻的序列中移除的该DNA片段。当涉及细胞时,术语“分离”是指从来源受试者(例如,患有多核苷酸重复疾病的受试者)中纯化细胞(例如,成纤维细胞、淋巴母细胞)。在DNA、mRNA或蛋白质的上下文中,“分离”是指从来源(例如细胞)中回收DNA、mRNA或蛋白质。
可以说AON是“针对”或“靶向”与之杂交的靶序列。在某些实施方案中,靶序列包括包含预加工的mRNA的3'或5'剪接位点、分支点或剪接调控中涉及到的其他序列(包括剪接增强子和剪接沉默子以及决定影响剪接的RNA的二级结构的位点)的区域。靶序列可以处于外显子内或处于内含子内或跨越内含子/外显子连接处。
在某些实施方案中,AON与靶RNA(即,剪接位点选择受调节的RNA)具有足够的序列互补性,以有效的方式阻断靶RNA(例如,前mRNA)的区域。在示例性的实施方案中,ACE2前mRNA的此类阻断用以通过掩蔽剪接体蛋白的结合位点(否则将调节剪接)和/或通过改变靶向RNA的结构来调节剪接。在一些实施方案中,靶RNA是靶前mRNA(例如,ACE2基因前mRNA)。
AON与靶RNA序列具有足够的序列互补性以调节靶RNA剪接意指AON具有足以触发掩蔽天然蛋白的结合位点的序列和/或改变靶RNA的三维结构,其中所述掩蔽天然蛋白的结合位点否则将调节剪接。
可以使选定的AON更短,例如约12个碱基,或更长,例如约50个碱基,并且包括少量的错配,只要该序列足够互补以在与靶序列杂交时实现剪接调节,并且任选地与RNA形成具有45℃或更高的Tm的异源双链体。
优选地,AON选自包含SEQ ID NO:1-31,更优选地SEQ ID NO:5、6、9或11,和/或表3中列出的序列的组。更优选地,AON是SEQ ID NO:6和9或SEQ ID NO:6和11。
在某些实施方案中,靶序列与AON之间的互补程度足以形成稳定的双链体。AON与靶RNA序列的互补区域可以短至8-11个碱基,但可以是12-15个碱基或更多,例如10-50个碱基、10-40个碱基、12-30个碱基、12-25个碱基、15-25个碱基、12-20个碱基或15-20个碱基,包括这些范围之间的所有整数。约16-17个碱基的AON通常足够长以具有独特的互补序列。在某些实施方案中,如本文所讨论的,可能需要最小长度的互补碱基来达到必需的结合Tm。
在某些实施方案中,长达50个碱基的寡核苷酸可能是合适的,其中至少最小数目的碱基,例如10-12个碱基与靶序列互补。然而,一般而言,在小于约30个碱基的寡核苷酸长度下细胞中受到促进的摄取或主动摄取得以优化。对于本文进一步描述的磷酰二胺吗啉代寡聚体(phosphoro-diamidate morpholino oligomer,PMO)AON,结合稳定性和摄取的最佳平衡通常发生在18-25个碱基的长度。包括由约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个碱基组成的AON(例如,PMO、PMO-X、PNA、LNA、TINA、2’-OMe)。
在某些实施方案中,AON可以与靶序列100%互补,或者可以包括错配,例如以适应变体,只要在寡核苷酸与靶序列之间形成的异源双链体足够稳定以承受细胞核酸酶的作用和可能在体内发生的其他降解模式。因此,某些寡核苷酸可以在寡核苷酸与靶序列之间具有约或至少约70%的序列互补性,例如70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列互补性。
如果存在错配,通常在杂交双链的末端区域比中间不稳定性低。根据充分理解的双链体稳定性原理,允许的错配数目将取决于寡核苷酸的长度、双链体中G:C碱基对的百分比、双链体中的错配位置。尽管此类AON不一定与靶序列100%互补,但它有效地与靶序列稳定且特异性地结合,以便调节靶前RNA的剪接。
AON与靶序列之间形成的双链体的稳定性是结合Tm和双链体对细胞酶促裂解的敏感性的函数。寡核苷酸相对于互补序列RNA的Tm可通过常规方法测量,诸如Hames等人,Nucleic Acid Hybridization[核酸杂交],IRL出版社,1985,第107-108页描述的那些或如Miyada C.G.和Wallace R.B.,1987,Oligonucleotide Hybridization Techniques[寡核苷酸杂交技术],MethodsEnzymol.[酶学方法]第154卷第94-107页所述的那些。在某些实施方案中,相对于互补序列RNA,AON可具有高于体温且优选高于约45℃或50℃的结合Tm。还包括在60-80℃或更高范围内的Tm。
变体额外的实例包括在SEQ ID NO:1-31,更优选地SEQ ID NO:5、6、9或11,和/或表3中列出的序列中任一个所示序列的整个长度上具有约或至少约70%序列同一性或同源性,例如70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性或同源性的AON。更优选地,AON是SEQ ID NO:6和9或SEQ ID NO:6和11。
更具体地,提供了一种能够结合选定的靶位点以修饰ACE2基因转录物或其部分中的前mRNA剪接的AON。AON优选地选自SEQ ID NO:1-31,更优选地SEQ ID NO:5、6、9或11,和/或任一表3中所列的序列。更优选地,AON是SEQ ID NO:6和9或SEQ ID NO:6和11。
对前mRNA剪接的修饰优选地诱导mRNA的一个或多个外显子的“跳读”或去除或内含子的保留。由于内部截短或过早终止,与亲本全长ACE2蛋白相比时,所得蛋白优选具有较短的长度。这些C端截短的ACE2蛋白可称为全长ACE2蛋白的同工型。
生成的mRNA的剩余外显子可以是读框内的并且产生较短的蛋白,该较短的蛋白具有类似于亲本全长蛋白的序列,只是它在原始3'与5'末端之间的区域中具有内部截短。在另一种可能性中,外显子跳读可以诱导产生下述蛋白的移码,其中该蛋白的第一部分与亲本全长蛋白基本上相同,但是其中该蛋白的第二部分由于移码而具有不同的序列(例如无义序列)。备选地,由于阅读框的破坏和翻译过早终止的存在,外显子跳读可诱导过早终止蛋白的产生。过早终止蛋白可以是mRNA过早终止(例如,外显子14的跳读)的结果,或错义跳读的结果,从而提供含有外显子14mRNA的mRNA,但不提供由这些外显子编码的蛋白的表达。
跳读单个外显子可以优选地破坏ACE2转录物的阅读框。这可能引入导致蛋白质功能障碍或降解的错义编码序列,或导致过早终止密码子的无义编码序列,从而导致C端截短蛋白质的翻译或通过无义介导的衰变增加mRNA的降解。
跳读单个外显子可以优选地保持阅读框完整。这将优选地导致内部截短的蛋白质的翻译。该截短的蛋白质或ACE2同工型可能具有完全消除的功能,可能具有降低的功能或充当诱饵受体。
优选地,这些截短的或过早终止的蛋白质缺乏一个或多个参与膜滞留和受体内化的功能域。
例如,外显子14编码ACE2的非催化集合管蛋白样结构域的起始点,去除该外显子可以产生可溶性ACE2蛋白,该蛋白可以潜在地充当通过ACE2介导的冠状病毒内化的可溶性诱饵或竞争性拮抗剂。截短的、无义的或过早终止的蛋白可能进一步缺乏其他因子的附着或结合位点,去除这些位点可能导致ACE2蛋白与相关信号传导途径的相互作用减少。
存在内部截短的蛋白(即,缺乏由一个或多个外显子编码的氨基酸的蛋白)是优选的。如果抑制ACE2的催化活性,则当身体试图补偿ACE2蛋白总量的减少时,可能存在ACE2转录升高的问题。相反,内部截短的蛋白(优选缺乏完整ACE2蛋白的一个或多个特征)的存在应足以防止转录升高,但由于可溶性ACE2的增加和膜结合ACE2蛋白的总量减少,仍提供治疗优势。
使用AON的本发明的跳读过程可以排除(跳读)单个外显子,或者可以导致一次跳读两个或更多个外显子。
使用AON的本发明的跳读过程可以包括保留内含子序列,有或没有直接跳读一个或多个外显子。
本发明的AON可以是能够与选定靶标结合以诱导ACE2基因转录物中的外显子排除的两种或更多种AON的组合。该组合可以是两种或更多种AON的混合物和/或包含连接在一起的两种或更多种或者两种或更多种AON的构建体。
表3:用于调节人ACE2外显子剪接的AON序列
本发明进一步提供了一种用于调节ACE2基因转录物中的备选剪接的方法,该方法包括以下步骤:
提供一种或多种如本文所述的AON,并且使所述一种或多种寡聚体与靶核酸位点结合。
根据本发明的另一个方面,提供了一种用于调节ACE2前mRNA的备选剪接的核酸序列靶标,该核酸序列靶标包含选自由SEQ ID NO:1-31,更优选地SEQ ID NO:5、6、9或11,和/或任一表3中列出的序列组成的组的核酸序列的DNA等效物,以及与其互补的序列。更优选地,AON的组合优选SEQ ID NO:6和9的组合或SEQ ID NO:6和11的组合。
设计AON以完全掩蔽共有剪接位点可能不一定会在靶向外显子的剪接方面产生变化。此外,发明人已经发现,当设计AON时,AON本身的大小或长度并不总是主要因素。对于一些靶,短至20个碱基的AON能够诱导一些外显子包含,在某些情况下比针对相同外显子的其他较长(例如25个碱基)的寡聚体更有效。
发明人还已发现,似乎不存在可被AON阻断或掩蔽以重新定向剪接的任何标准基序。已经发现,必须凭经验对每个基因靶标设计AON并且评估它们各自的功效。
更具体地,AON可选自表3中任一个所示的那些。序列优选地选自由SEQ ID NO:1-31中的任何一个或多个、更优选地SEQ ID NO:5、6、9或11、及其组合或混合物组成的组。AON的组合优选地是SEQ ID NO:6和9的组合或SEQ ID NO:6和11的组合。这包括可以在严格杂交条件下与此类序列杂交的序列,与其互补的序列,含有经修饰的碱基的序列,经修饰的主链,以及在ACE2基因转录物中具有或调节前mRNA加工的其功能性截短物或延伸物。
当每个分子中足够数目的相应位置被可以彼此氢键结合的核苷酸占据时,寡聚体和DNA、cDNA或RNA彼此互补。因此,“可特异性杂交的”和“互补的”是用于表示足够程度的互补或配对使得在寡聚体与DNA、cDNA或RNA靶标之间发生稳定且特异性的结合的术语。本领域中理解,AON的序列不必与其可特异性杂交的靶序列100%互补。当AON化合物与靶DNA或RNA分子的结合干扰靶DNA或RNA产物的正常功能,并且在需要特异性结合的条件下,即在体内测定或治疗性处理的情况下在生理条件下,以及在体外测定的情况下在进行这些测定的条件下,有足够程度的互补性以避免AON与非靶序列的非特异性结合,则该AON是可特异性杂交的。
选择性杂交可以在低、中或高严格条件下进行,但优选在高严格条件下进行。本领域技术人员将认识到,除了碱基组成、互补链的长度和杂交核酸之间核苷酸碱基错配的数目之外,杂交的严格性还将受到诸如盐浓度、温度或有机溶剂等条件的影响。严格的温度条件通常将包括超过30℃,典型地超过37℃,以及优选地超过45℃,优选地至少50℃,并且典型地60℃-80℃或更高的温度。严格的盐条件一般将小于1000mM,典型地小于500mM,且优选地小于200mM。然而,参数的组合比任何单个参数的量度重要得多。严格的杂交条件的实例是65℃和0.1xSSC(1xSSC=0.15M NaCl,0.015M柠檬酸钠pH7.0)。因此,本发明的AON可包括与表3或SEQ ID NO:1-31、更优选地SEQ ID NO:5、6、9或11中提供的序列选择性杂交的寡聚体。更优选地,AON的组合优选地是SEQ ID NO:6和9的组合或SEQ ID NO:6和11的组合。
应理解,结构蛋白中外显子末端的密码子排列可能并非总是在密码子末端处断裂,因此可能需要从前mRNA中删除一个以上外显子以确保mRNA的读框内阅读。在此类情形下,可能需要通过本发明的方法选择多种AON,其中每一种针对负责诱导所需外显子和/或内含子的包含的不同区域。在给定的离子强度和pH下,Tm是50%的靶序列与互补多核苷酸杂交所处的温度。此类杂交可以发生在AON与靶序列“接近”或“基本”互补以及精确互补的情况下。
通常,当与AON的核苷酸在至少约14个核苷酸的链段上存在至少约55%同一性,优选至少约65%,更优选至少约75%且最优选至少约90%、95%、98%或99%同一性时,将发生选择性杂交。如所述,同源性比较的长度可以是更长的链段,并且在某些实施方案中常常将是至少约九个核苷酸,通常至少约12个核苷酸,更通常至少约20个,常常至少约21、22、23或24个核苷酸,至少约25、26、27或28个核苷酸,至少约29、30、31或32个核苷酸,至少约36个或更多个核苷酸的链段。
因此,本发明的AON序列优选地与本文序列表中所示的序列具有至少75%,更优选至少85%,更优选至少86%、87%、88%、89%或90%的同源性。更优选存在至少91%、92%、93%、94%或95%,更优选至少96%、97%、98%或99%的同源性。通常,AON的长度越短,获得选择性杂交所需的同源性越高。因此,在本发明的AON由少于约30个核苷酸组成的情况下,优选的是,与本文序列表中列出的AON相比,百分比同一性大于75%,优选大于85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。核苷酸同源性比较可以通过序列比较程序进行,诸如GCG Wisconsin Bestfit程序或GAP(Deveraux等人,1984,Nucleic Acids Research[核酸研究]12,387-395)。以这种方式,可以通过在比对中插入空位来比较与本文引用的序列长度相似或基本上不同的序列,此类空位例如通过GAP使用的比较算法来确定。
本发明的AON可以具有与靶序列同源性降低的区域以及与靶序列有精确同源性的区域。寡聚体不必在其整个长度上具有精确同源性。例如,寡聚体可以具有与靶序列相同的至少4或5个碱基的连续链段,优选与靶序列相同的至少6或7个碱基的连续链段,更优选与靶序列相同的至少8或9个碱基的连续链段。寡聚体可以具有与靶序列相同的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个碱基的链段。寡聚体序列的剩余链段可间断性地与靶序列相同;例如,剩余序列可以具有相同的碱基,后面是不相同的碱基,后面是相同的碱基。备选地(或以及),寡聚体序列可具有散布有不完全同源的链段的若干相同序列链段(例如3、4、5或6个碱基)。此类序列错配将优选没有或很少有剪接转换活性损失。
术语“调节(modulate)”或“调节(modulates)”包括“增加”或“减小(decrease)”一个或多个可量化的参数,任选地以限定的和/或统计上显著的量。术语“增加(increase)”或“增加(increasing)”、“增强(enhance)”或“增强(enhancing)”或“刺激(stimulate)”或“刺激(stimulating)”通常是指一种或多种AON或组合物在细胞或受试者中产生或引起相对于没有AON时或对照化合物引起的反应更大的生理反应(即,下游效应)的能力。术语“减小(decreasing)”或“减小(decrease)”通常是指一种或多种AON或组合物在细胞或受试者中产生或引起相对于没有AON时或对照化合物引起的反应降低的生理反应(即,下游效应)的能力。
相关的生理或细胞反应(体内或体外)对于本领域技术人员而言将是显而易见的,并且可以包括在有需要的细胞、组织或受试者中增加编码ACE2的前mRNA中特定外显子的排除、增加可溶性ACE2或减少全长ACE2蛋白的表达。“增加的”或“增强的”量通常是统计上显著的量,并且可以包括是没有AON(不存在试剂)时或对照化合物产生的量的1.1倍、1.2倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍或更多倍(例如,500倍、1000倍)(包括其间且在1倍以上的所有整数和小数点,例如1.5、1.6、1.7、1.8倍)的增加。术语“降低”或“抑制”通常可涉及一种或多种AON或组合物“减少”相关生理或细胞反应(诸如本文所述的疾病或病症的症状)的能力,如根据诊断领域中的常规技术所测量。相关的生理或细胞反应(体内或体外)对于本领域技术人员而言将是显而易见的,并且可以包括疾病诸如冠状病毒感染、肺部疾病、慢性肾病、慢性心脏病、高血压和糖尿病的症状或病理的减轻。与没有AON时或对照组合物产生的反应相比,反应的“减少”可以是统计上显著的,并且可以包括1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%的减少,包括其间的所有整数。
AON的长度可以变化,只要它能够与前mRNA分子内的预期位置选择性地结合。此类序列的长度可根据本文所述的选择程序来确定。通常,AON的长度将为约10个核苷酸,长度最多约50个核苷酸。然而,应当理解,该范围内的任何核苷酸长度都可用于该方法中。优选地,AON的长度为10至40、10至35、15至30个核苷酸长或20至30个核苷酸长,最优选约25至30个核苷酸长。例如,寡聚体的长度可以是20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
如本文所用,“AON”是指允许核碱基通过沃森-克里克碱基配对与RNA中的靶序列杂交以在靶序列内形成寡核苷酸:RNA异源双链体的核苷酸或核苷酸类似物的线性序列。术语“AON”、“AON”、“寡聚体”和“反义化合物”可以互换用于指寡核苷酸。环状亚基可基于核糖或另一种戊糖,或在某些实施方案中,基于吗啉基(参见以下对吗啉代寡核苷酸的描述)。除了本领域已知的其他反义试剂外,还考虑了肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)和2'-O-Me PTO寡核苷酸。
包括非天然存在的AON或“寡核苷酸类似物”,包括具有以下方面的AON或寡核苷酸:(i)经修饰的主链结构(例如不同于天然存在的寡核苷酸和多核苷酸中发现的标准磷酸二酯连键的主链)和/或(ii)经修饰的糖部分(例如吗啉基部分而非核糖或脱氧核糖部分)。寡核苷酸类似物支持能够通过沃森-克里克碱基配对与标准多核苷酸碱基氢键结合的碱基,其中类似物主链以容许寡核苷酸类似物分子与标准多核苷酸(例如单链RNA或单链DNA)中的碱基之间以序列特异性方式进行这种氢键结合的方式呈现碱基。优选的类似物是具有基本上不带电荷的含磷主链的那些。
产生AON的一种方法是2'羟基核糖位置的甲基化和硫代磷酸酯主链的并入产生表面上类似于RNA但对核酸酶降解更具抗性的分子,但是本发明领域的技术人员将知道可用于本发明目的的其他形式的合适主链。
为了避免前mRNA在与AON形成双链体期间降解,该方法中使用的AON可适于最小化或防止内源RNA酶H的裂解。这种性质是高度优选的,因为用未甲基化的寡聚体(胞内或在含有RNA酶H的粗提物中)处理RNA导致前mRNA:AON双链体的降解。能够绕过或不诱导此类降解的任何形式的经修饰的AON都可以用于本发明方法中。可通过修饰本发明的AON使其包含部分不饱和脂族烃链和一个或多个极性基团或带电基团(包括羧酸基团、酯基团和醇基团)来获得核酸酶抗性。
当与RNA形成双链体时不被细胞RNA酶H裂解的AON的实例是2'-O-甲基衍生物。此类2'-O-甲基-寡核糖核苷酸在细胞环境和动物组织中是稳定的,并且它们与RNA的双链体具有比它们的核糖或脱氧核糖对应物更高的Tm值。备选地,本发明的核酸酶抗性AON可以有最后3'-末端核苷酸中的至少一个被氟化。还备选地,本发明的核酸酶抗性AON在最后3-末端核苷酸碱基中的至少两个之间具有硫代磷酸酯键连接,优选在最后四个3'-末端核苷酸碱基之间具有硫代磷酸酯键连接。
也可以用备选的寡核苷酸化学方法实现增加的剪接转换。例如,AON可以选自包括以下项的列表:氨基磷酸酯或磷酰二胺吗啉代寡聚体(PMO);PMO-X;PPMO;肽核酸(PNA);锁核酸(LNA)、硫代吗啉代寡核苷酸(TMO)及其衍生物,包括α-L-LNA、2'-氨基LNA、4'-甲基LNA和4’-O-甲基LNA;乙烯桥接核酸(ENA)及其衍生物;硫代磷酸酯寡聚体;三环DNA寡聚体(tcDNA);三环硫代磷酸酯寡聚体;2’O-甲基修饰的寡聚体(2’-OMe);2’-O-甲氧基乙基(2’-MOE);2’-氟代,2’-氟代阿拉伯糖(FANA);非锁核酸(UNA);热稳定扭曲插入核酸(TINA)、己糖醇核酸(HNA);环己烯基核酸(CeNA);2’-氨基(2’-NH2);2’-O-亚乙基胺或作为mixmer或作为gapmer的前述的任何组合。为了进一步提高递送功效,上面提到的经修饰的核苷酸常常与脂肪酸/脂质/胆固醇/氨基酸/碳水化合物/多糖/纳米颗粒等一起缀合至糖或核碱基部分。这些缀合的核苷酸衍生物也可用于构建跳读外显子的AON。反义寡核苷酸诱导的人ACE2基因转录物的剪接修饰通常使用硫代磷酸酯主链上的寡核糖核苷酸、PNA、2’-O-Me或2’-MOE修饰的碱基。2’-O-Me PTO AON由于当作为阳离子脂质复合物递送时它们在体外有效摄取,通常用于寡核苷酸设计。当使用备选的化学方法生成本发明的AON时,本文提供的序列的尿嘧啶(U)可被胸腺嘧啶(T)置换、或核糖核苷酸可被脱氧核糖核苷酸置换。
在本发明的AON内包括非天然存在的寡聚体或“寡核苷酸类似物”,包括具有以下方面的寡聚体:(i)经修饰的主链结构(例如不同于天然存在的寡核苷酸和多核苷酸中发现的标准磷酸二酯连键的主链)和/或(ii)经修饰的糖部分(例如吗啉基部分而非核糖或脱氧核糖部分)。寡聚体类似物支持能够通过沃森-克里克碱基配对与标准多核苷酸碱基氢键结合的碱基,其中类似物主链以容许寡聚体类似物分子与标准多核苷酸(例如单链RNA或单链DNA)中的碱基之间以序列特异性方式进行这种氢键结合的方式呈现碱基。优选的类似物是具有基本上不带电荷的含磷主链的那些。
不激活RNA酶H的反义寡核苷酸可以根据已知技术制备(参见,例如,美国专利5,149,797)。此类AON,可以是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸序列,仅仅含有在空间上阻碍或防止RNA酶H与含有寡聚体作为其一个成员的双链体分子结合的任何结构修饰,该结构修饰基本上不会阻碍或破坏双链体形成。因为双链体形成中所涉及的寡聚体部分基本上不同于RNA酶H与其结合中所涉及的那些部分,所以可获得许多不激活RNA酶H的AON。例如,此类AON可以是寡聚体,其中至少一个或全部核苷酸间桥接磷酸残基是经修饰的磷酸酯,诸如甲基膦酸酯、甲基硫代磷酸酯、磷酰吗啉、磷酰哌嗪、硼磷酸酯、酰胺连键和氨基磷酸酯。例如,每隔一个核苷酸间桥接磷酸残基可以如所述进行修饰。在另一个非限制性实例中,此类AON是其中至少一个或全部核苷酸含有2’低级烷基部分(诸如C1-C4直链或支链、饱和或不饱和烷基,诸如甲基、乙基、乙烯基、丙基、1-丙烯基、2-丙烯基和异丙基)的分子。例如,每隔一个核苷酸可以如所述进行修饰。
虽然上述AON是本发明AON的优选形式,但本发明包括其他寡聚反义分子,包括但不限于如下所述的寡聚体模拟物。
可用于本发明的优选AON的具体实例包括含有经修饰的主链或非天然核苷间连键的寡聚体。如本说明书中所定义,具有经修饰的主链的寡聚体包括在主链中保留磷原子的那些和在主链中没有磷原子的那些。出于本说明书的目的,并且如本领域中有时提及的,在它们的核苷间主链中没有磷原子的经修饰的寡聚体也可以被认为是AON。
在其他优选的寡聚体模拟物中,核苷酸单元的糖和核苷间连键(即主链)均被新基团置换。维持碱基单元以与适当的核酸靶化合物杂交。一种此类寡聚化合物,即已经证实具有优异杂交性质的寡聚体模拟物,被称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中,寡聚体的糖主链被含酰胺的主链,尤其是氨基乙基甘氨酸主链置换。这些核碱基得以保留并且直接或间接地结合至该主链的酰胺部分的氮杂氮原子。
另一种优选的化学物质是不受任何已知的核酸酶或蛋白酶降解的磷酰二胺吗啉代寡聚体(PMO)寡聚化合物。这些化合物不带电荷,当与RNA链结合时不激活RNA酶H活性,并且已经证实在体内施用后会发挥持续的剪接调节作用(Summerton和Weller,AntisenseNucleic Acid Drug Development[反义核酸药物开发],7,187-197)。
经修饰的寡聚体可以含有一个或多个经取代的糖部分。寡聚体也可以包括核碱基(在本领域中常常简称为“碱基”)修饰或取代。某些核碱基对提高本发明的寡聚化合物的结合亲和力是特别有用的。这些包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤,包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已经证实5-甲基胞嘧啶取代会使核酸双链体稳定性增加0.6-1.2℃,甚至更特别是当与2’-MOE修饰组合时。
本发明寡聚体的另一种修饰涉及将增强寡聚体的活性、细胞分布或细胞摄取的一个或多个部分或缀合物化学连接到寡聚体。此类部分包括但不限于脂质部分(诸如胆固醇部分)、胆酸、硫醚(例如己基-S-三苯甲基硫醇)、硫代胆固醇、脂肪链(例如十二烷二醇或十一烷基残基)、磷脂(例如二-十六烷基-外消旋甘油或三乙铵1,2-二-O-十六烷基外消旋甘油-3-H-膦酸酯)、聚胺或聚乙二醇链或金刚烷乙酸、棕榈基部分、肉豆蔻基或十八烷基胺或己氨基-羰基-羟胆固醇部分。
已经将细胞穿透肽添加到磷酰二胺吗啉代寡聚体中以增强细胞摄取和核定位。已经证实不同的肽标签会影响摄取效率和靶组织特异性,如Jearawiriyapaisarn等人(2008),Mol.Ther.[分子疗法]169,1624-1629中所示。
对于给定化合物中的所有位置而言不需要均一地进行修饰,并且事实上可以将上述修饰中的多于一种并入单一化合物中,或者甚至并入寡聚体内的单一核苷处。本发明还包括是嵌合化合物的AON。在本发明的上下文中,“嵌合”AON或“嵌合体”是AON,特别是寡聚体,其含有两个或更多个化学上不同的区域,每个区域由至少一个单体单元组成,在寡聚体化合物的情况下即是核苷酸。这些寡聚体通常含有至少一个区域,其中寡聚体经修饰以便赋予寡聚体或AON对核酸酶降解增加的抗性,增加的细胞摄取,和用于增加对靶核酸的结合亲和力的额外区域。
AON及其变体的活性可以根据本领域的常规技术进行测定。例如,检查的RNA和蛋白的剪接形式和表达水平可以通过用于检测转录的核酸或蛋白的剪接形式和/或表达的多种公知方法中的任一种来评估。此类方法的非限制性实例包括RNA剪接形式的RT-PCR,接着是PCR产物的大小分离,核酸杂交方法例如Northern印迹和/或使用核酸阵列;核酸扩增方法;用于检测蛋白的免疫学方法;蛋白纯化方法;以及蛋白功能或活性测定。
RNA表达水平可以通过从细胞、组织或生物体制备mRNA/cDNA(即,转录的多核苷酸),并通过使mRNA/cDNA与参考多核苷酸(其是测定的核酸的补体)或其片段杂交来评估。cDNA可任选地在与互补多核苷酸杂交之前使用多种聚合酶链反应或体外转录方法中的任一种进行扩增;优选地,它不进行扩增。还可以使用定量PCR检测一种或多种转录物的表达以评估转录物的表达水平。
本发明提供了AON诱导的ACE2基因转录物的剪接转换、临床相关的寡聚体化学和递送系统,以将ACE2剪接操纵引导至治疗水平。全长ACE2 mRNA的量大幅降低,以及因此来自ACE2基因转录的全长ACE2蛋白的量大幅降低通过以下方式实现:
a)使用成纤维细胞细胞系通过以下的实验评估进行体外寡聚体精制:(i)内含子增强子靶基序,(ii)AON长度和寡聚体混合物的开发,(iii)化学的选择,和(iv)添加细胞穿透肽(CPP)以增强寡聚体递送;以及
b)详细评价生成具有一个或多个缺失外显子的ACE2转录物的新方法。
因而,本文显示ACE2前mRNA的备选剪接可用特异性AON调节。以这种方式,可以获得全长(能够进行病毒内化的)ACE2蛋白的量的功能性显著减少,和/或可以实现可溶性诱饵受体ACE2同工型或其他诱饵受体的增加,从而减少与诸如冠状病毒感染、肺病、慢性心脏病、慢性肾病、高血压和糖尿病等疾病相关的严重病理。
根据本发明使用的AON可以通过公知的固相合成技术方便地制备。用于此类合成的设备由包括例如应用生物系统公司(Applied Biosystems)(加州福斯特市(FosterCity,Calif.))在内的几个供应商销售。在美国专利号4,458,066中描述了一种用于在修饰性固体支持物上合成寡聚体的方法。
可以额外地或备选地采用本领域已知的用于此类合成的任何其他手段。使用类似技术制备寡聚体诸如硫代磷酸酯和烷基化衍生物是公知的。在一个此类自动化实施方案中,二乙基-亚磷酰胺用作起始材料并且可以如Beaucage等人(1981)Tetrahedron Letters[四面体快报],22:1859-1862所述那样合成。
本发明的AON是体外合成的,且不包括生物来源的反义组合物,或设计用于指导AON体内合成的遗传载体构建体。本发明的分子还可以与其他分子、分子结构或化合物的混合物,例如脂质体,受体靶向分子,口服、直肠、局部或其他制剂包封、缀合或以其他方式缔合,以辅助摄取、分布和/或吸收。
本发明的AON还可用作可用于疾病治疗目的的预防剂或治疗剂。因此,在一个实施方案中,本发明提供以治疗有效量与可药用载体、稀释剂或赋形剂配混的与ACE2前mRNA中的选定靶标结合以诱导如本文所述的有效且一致的跳读外显子的AON。
因此本发明提供了一种用于治疗、预防或缓解受试者中与ACE2表达相关的疾病的影响的预防性或治疗性药物组合物,该组合物包含:
a)一种或多种如本文所述的AON,和
b)一种或多种可药用载体和/或稀释剂。
优选地,与ACE2表达相关的疾病选自包含以下项的列表:冠状病毒感染、心血管疾病、呼吸系统疾病、肌肉骨骼疾病、肾脏疾病和内分泌疾病。
在本发明的一种形式中,ACE2相关疾病是选自以下的冠状病毒感染:严重急性呼吸综合征相关的冠状病毒、SARS、SARS-2、HNL63-CoV(NL63-S)和WIV1-CoV感染。
在本发明的一种形式中,ACE2相关疾病是选自下组的心血管疾病:动脉粥样硬化、缺血性心脏病、心肌炎、心内膜炎、心肌病、急性风湿热、慢性风湿性心脏病、脑血管疾病/中风、心力衰竭、血管钙化、外周血管疾病和淋巴管炎。
在本发明的一种形式中,ACE2相关疾病为呼吸(肺部)疾病并且选自下组:急性上呼吸道感染、鼻炎、鼻咽炎、鼻窦炎、喉炎、流感和肺炎、急性支气管炎、急性细支气管炎、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、支气管扩张、肺气肿、由外部试剂引起的慢性肺病、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、肺嗜酸性粒细胞增多症和胸膜炎、肺部创伤以及肺损伤、创伤或手术恢复。
在本发明的一种形式中,ACE2相关疾病为肾脏疾病并且选自下组:肾小球肾炎、肾炎、糖尿病性肾病、间质性肾炎、阻塞性和反流性肾病、急性肾衰竭和慢性肾病。
在本发明的一种形式中,ACE2相关疾病是选自下组的内分泌疾病:糖尿病、胰岛素抵抗、葡萄糖耐量降低和甲状腺炎。
该组合物可以包含约1nM至1000nM的本发明的每种所需AON。优选地,该组合物可包含约1nM至500nM、10nM至500nM、50nM至750nM、10nM至500nM、1nM至100nM、1nM至50nM、1nM至40nM、1nM至30nM、1nM至20nM,最优选1nM至10nM的本发明的每种AON。
该组合物可包含约1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、20nm、50nm、75nm、100nm、150nm、200nm、250nm、300nm、350nm、400nm、450nm、500nm、550nm、600nm、650nm、700nm、750nm、800nm、850nm、900nm、950nm或1000nm的本发明的每种所需AON。
本发明进一步提供了一种或多种AON,其适于以适合递送至受试者的形式帮助对诸如ACE2表达相关疾病或病理等疾病症状的预防性或治疗性处理、预防或改善。
短语“可药用的”是指分子实体和组合物是生理上可耐受的,并且当施用给受试者时,通常不会产生过敏或类似不良反应,诸如胃部不适等。术语“载剂(carrier)”是指与化合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类药物载剂可以是无菌液体,诸如水和油,包括石油、动物、植物或合成来源的那些,诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。水或盐水溶液及右旋糖和甘油水溶液优选用作载剂,特别是对于注射液而言。合适的药物载剂在Martin,Remington’s Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学],第18版,宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版有限公司(Mack Publishing Co.,Easton,PA)(1990)中有描述。
在本发明的更具体的形式中,提供了包含治疗有效量的一种或多种本发明的AON以及可药用稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载剂的药物组合物。此类组合物包括各种缓冲液含量(例如Tris-HCI、乙酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度的稀释剂以及添加剂,诸如洗涤剂和增溶剂(例如吐温80(Tween80)、聚山梨醇酯80),抗氧化剂(例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠),防腐剂(例如硫柳汞、苯甲醇)和填充物质(例如乳糖、甘露醇)。该材料可以掺入聚合化合物诸如聚乳酸、聚乙醇酸等的颗粒制备物中或掺入脂质体中。也可以使用透明质酸。此类组合物可影响本发明蛋白和衍生物的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除率。参见,例如,Martin,Remington’s Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学],第18版(1990,宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版有限公司(Mack Publishing Co.,Easton,PA)18042)第1435-1712页,其通过援引并入本文。该组合物可以制成液体形式,或者可以呈干粉,诸如冻干形式。
应当理解,根据本发明提供的药物组合物可以通过本领域已知的任何手段施用。优选地,用于施用的药物组合物通过注射、口服、局部施用或通过肺或鼻途径施用。适当的途径可由本领域技术人员视治疗中受试者的状况来确定。
在某些实施方案中,本公开的AON可通过肺或鼻途径递送(例如,经由掺入AON的雾化盐水)。在肺部中发现ACE2 mRNA在健康人组织中的最高内源性表达并且可经由气道接近。吸入式寡核苷酸是呼吸道疾病的新兴治疗方式。气道独特地衬有肺表面活性物质,这些表面活性物质主要由两性离子脂质组成。这些表面活性物质脂质在呼吸道的pH下具有阳离子特性。当吸入阴离子寡核苷酸时,它们倾向于被表面活性物质吸附,产生重新配制的颗粒,已经假设这些颗粒被支气管和肺泡上皮细胞有效地吸收到肺细胞中。值得注意的是,已经证实AON能够经受雾化过程。
在某些实施方案中,AON更优选通过静脉内、动脉内、腹膜内、肌内或皮下施用途径递送。血管或血管外循环、血液或淋巴系统和脑脊髓液是可以引入AON的一些非限制性部位。
在某些实施方案中,可以采用直接CNS递送,例如,可以使用脑室内或鞘内施用作为施用途径。
用于局部施用的制剂包括其中本公开的寡聚体与局部递送剂诸如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂配混的那些。脂质和脂质体包括中性(例如,二油酰基磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱DMPC、二硬脂酰基磷脂酰胆碱)、阴离子性(例如二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油DMPG)和阳离子性(例如二油酰基四甲基氨基丙基DOTAP和二油酰基磷脂酰乙醇胺DOTMA)。对于局部或其他施用,本公开的寡聚体可包封在脂质体内或者可与脂质体形成复合物,特别与阳离子脂质体形成复合物。备选地,寡聚体可以与脂质,特别是与阳离子脂质复合。脂肪酸和酯、其可药用盐及其用途在美国专利号6,287,860和/或1999年5月20日提交的美国专利申请序列号09/315,298中有进一步描述。
在某些实施方案中,本公开的AON可通过透皮方法递送(例如,经由将AON掺入到例如乳液中,其中此类AON任选地包装到脂质体中)。此类透皮和乳液/脂质体介导的递送方法在本领域中描述用于AON递送,例如在美国专利号6,965,025中。
本文所述的AON也可经由可植入装置递送。此类装置的设计是本领域公认的方法,例如美国专利号6,969,400中描述的合成植入物设计。
用于口服施用的组合物和制剂包括粉末或颗粒剂、微粒、纳米颗粒、在水或非水介质中的悬浮液或溶液、胶囊、凝胶胶囊、小袋、片剂或小片。可能需要增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂。口服制剂是其中本公开的寡聚体连同一种或多种渗透增强剂表面活性剂和螯合剂一起施用的那些。表面活性剂包括脂肪酸和/或其酯或盐、胆汁酸和/或其盐。胆汁酸/盐和脂肪酸及其用途在美国专利号6,287,860中有进一步描述。在一些实施方案中,本公开提供了渗透增强剂的组合,例如脂肪酸/盐与胆汁酸/盐组合。示例性的组合是月桂酸、癸酸和UDCA的钠盐。其他渗透增强剂包括聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-十六烷基醚。本公开的寡聚体可以以颗粒形式(包括喷雾干燥的颗粒)口服递送,或复合形成微粒或纳米颗粒。寡聚体复合剂及其用途在美国专利号6,287,860中有进一步描述。寡聚体的口服制剂及其制备在U.S.6,887,906、09/315,298(1999年5月20日提交)和/或US20030027780中有详细描述。
用于肠胃外、鞘内或心室内施用的组合物和制剂可包括无菌水溶液,该无菌水溶液还可以含有缓冲剂、稀释剂和其他合适的添加剂,诸如但不限于渗透增强剂、载剂化合物和其他可药用载体或赋形剂。
治疗有用量的AON的递送可以通过先前公开的方法实现。例如,AON的细胞内递送可以经由包含AON与有效量的嵌段共聚物的配混物的组合物进行。在美国专利申请US20040248833中描述了这种方法的实例。在Mann C J等人(2001)Proc,Natl.Acad.Science[美国国家科学院院刊],98(1)42-47和在Gebski等人(2003)HumanMolecular Genetics[人类分子遗传学],12(15):1801-1811中描述了将AON递送到细胞核的其他方法。在US6,806,084中描述了将核酸分子通过表达载体以裸DNA或与脂质载剂复合的方式引入细胞中的方法。
可能需要在胶体分散体系中递送AON。胶体分散体系包括大分子复合物、纳米囊、微球、珠和基于脂质的体系,包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体或脂质体制剂。这些胶体分散体系可用于制造治疗性药物组合物。
脂质体是可以用作体外和体内递送媒介物的人工膜囊泡。这些制剂可以具有净阳离子、阴离子或中性电荷特征,并且具有用于体外、体内和离体递送方法的有用特征。已经证实大的单层囊泡可包封相当大百分比的含有大分子的水性缓冲液。RNA和DNA可以包封在水性内部并以生物活性形式递送至细胞(Fraley等人,Trends Biochem.Sci.[生物化学趋势]6:77,1981)。
为了使脂质体成为有效的基因转移媒介物,应当存在以下特征:(1)高效包封目标AON,同时不损害其生物活性;(2)与非靶细胞相比,与靶细胞优先大幅结合;(3)高效递送囊泡的水性内容物至靶细胞的细胞质;以及(4)遗传信息的准确和有效表达(Mannino等人,Biotechniques[生物技术],6:682,1988)。脂质体的组成通常是磷脂(特别是高相变温度磷脂)通常与类固醇(尤其是胆固醇)的组合。也可以使用其他磷脂或其他脂质。脂质体的物理特征取决于pH、离子强度和二价阳离子的存在。阳离子脂质体是带正电荷的脂质体,据信,带正电荷的脂质体与带负电荷的DNA分子相互作用形成稳定的复合物。据信,pH敏感性或带负电荷的脂质体会捕获DNA而不是与它复合。阳离子和非阳离子脂质体均已用于将DNA递送至细胞。
脂质体还包括“空间稳定的”脂质体,如本文所用的术语“空间稳定的”脂质体是指包含一种或多种特化脂质的脂质体,特化脂质当掺入到脂质体中时,相对于缺乏此类特化脂质的脂质体,导致循环寿命增加。空间稳定的脂质体的实例是其中脂质体的形成囊泡的脂质部分的一部分包含一种或多种糖脂或是具有一种或多种亲水性聚合物诸如聚乙二醇(PEG)部分的衍生物的那些脂质体。脂质体及其用途在U.S.6,287,860中有进一步描述。
本文所述的AON也可经由可植入装置递送。此类装置的设计是本领域公认的方法,例如美国专利号6,969,400中描述的合成植入物设计,该专利的内容通过援引以其全文并入本文作为参考。
可以使用本领域公认的技术(例如,转染、电穿孔、融合、脂质体、胶体聚合物颗粒和病毒及非病毒载体以及本领域已知的其他手段)将反义寡核苷酸引入细胞中。所选择的递送方法将至少取决于待治疗的细胞和细胞的位置,并且对于本领域技术人员将是显而易见的。例如,可以通过表面上具有特定标志物的脂质体实现定位以引导脂质体,直接注射到含有靶细胞的组织中,特异性受体介导的摄取等。
如本领域已知的,可以使用例如涉及脂质体介导的摄取、脂质缀合物、聚赖氨酸介导的摄取、纳米颗粒介导的摄取和受体介导的胞吞作用的方法,以及另外的非胞吞递送模式,诸如显微注射、透化(例如,链球菌溶血素-O透化、阴离子肽透化)、电穿孔和本领域已知的各种非侵入性非胞吞递送方法(参考Dokka和Rojanasakul,Advanced Drug DeliveryReviews[高级药物递送综述]44,35-49,通过援引以其全文并入本文作为参考)来递送AON。
AON还可与其他可药用载体或稀释剂组合以产生药物组合物。合适的载剂和稀释剂包括等渗盐水溶液,例如磷酸盐缓冲盐水。组合物可以配制成用于肠胃外、肌内、静脉内、皮下、眼内、口服或透皮施用。
所描述的施用途径仅旨在作为指导,因为熟练的从业者将能够容易地确定用于任何特定动物和疾病的最佳施用途径和任何剂量。
已经尝试了在体外和体内将功能性新遗传物质引入细胞中的多种方法(Friedmann(1989)Science[科学],244:1275-1280)。这些方法包括将待表达的基因整合到经修饰的逆转录病毒中(Friedmann(1989)同上;Rosenberg(1991)Cancer Research[癌症研究]51(18),增刊:5074S-5079S);整合到非逆转录病毒载体中(Rosenfeld等人(1992)Cell[细胞],68:143-155;Rosenfeld等人(1991)Science[科学],252:431-434);或经由脂质体递送与异源启动子-增强子元件连接的转基因(Friedmann(1989)同上;Brigham等人(1989)Am.J.Med.Sci.[美国医学科学杂志],298:278-311;Nabel等人(1990)Science[科学],249:1285-1288;Hazinski等人(1991)Am.J.Resp.Cell Molec.Biol.[美国呼吸细胞与分子生物学杂志],4:206-209;以及Wang和Huang(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊](USA),84:7851-7855);与配体特异性的基于阳离子的转运系统偶联(Wu和Wu(1988)J.Biol.Chem.[生物化学杂志],263:14621-14624)或使用裸DNA、表达载体(Nabel等人(1990),同上);Wolff等人(1990)Science[科学],247:1465-1468)。将转基因直接注射到组织中仅产生局部表达(Rosenfeld(1992)同上);Rosenfeld等人(1991)同上;Brigham等人(1989)同上;Nabel(1990)同上;和Hazinski等人(1991)同上)。Brigham等人的小组(Am.J.Med.Sci.[美国医学科学杂志](1989)298:278-311和Clinical Research[临床研究](1991)39(摘要))报道了静脉内或气管内施用DNA脂质体复合物后仅体内转染小鼠的肺部。人类基因治疗程序的综述文章的实例是:Anderson,Science[科学](1992)256:808-813;Barteau等人(2008),Curr Gene Ther[当今基因疗法];8(5):313-23;Mueller等人(2008).Clin Rev Allergy Immunol[过敏与免疫学临床综述];35(3):164-78;Li等人(2006)Gene Ther.[基因疗法],13(18):1313-9;Simoes等人(2005)Expert Opin DrugDeliv[药物递送专家见解];2(2):237-54。
本发明的AON涵盖任何可药用盐、酯或此类酯的盐,或在施用给包括人在内的动物后能够(直接或间接)提供其生物活性代谢物或残基的任何其他化合物。因此,作为实例,本公开还涉及本发明化合物的前药和可药用盐、此类前药的可药用盐和其他生物等效物。
术语“可药用盐”是指本发明化合物的生理学上和可药用盐:即,保留母体化合物的所需生物活性而不会对其产生不期望的毒理学作用的盐。对于寡聚体,可药用盐的优选实例包括但不限于(a)与阳离子(诸如钠、钾、铵、镁、钙)、聚胺(诸如精胺和亚精胺)等形成的盐;(b)与无机酸(例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等)形成的酸加成盐;(c)与有机酸形成的盐,这些有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、鞣酸、棕榈酸、海藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等;以及(d)由元素阴离子(诸如氯、溴和碘)形成的盐。本发明的药物组合物可以多种方式施用,这取决于需要局部治疗还是全身治疗以及待治疗的区域。施用可以是局部(包括眼部和粘膜,以及直肠递送)、肺部(例如通过吸入或吹入粉末或气雾剂)(包括通过喷雾器、经气管内、鼻内、表皮和透皮)、口服或肠胃外。肠胃外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注;或颅内(例如鞘内或心室内)施用。据信,具有至少一个2'-MOE修饰的寡聚体特别适用于口服施用。优选地,AON经由肺途径递送。
可以方便地以单位剂型呈现的本发明的药物制剂可以根据制药业中公知的常规技术制备。此类技术包括将活性成分与药物载剂或赋形剂缔合的步骤。一般而言通过将活性成分与液体载剂或细分固体载剂或这两者均匀且紧密地缔合,然后,如果需要,使产品成形来制备制剂。
在一个实施方案中,以有效产生至少200-400nM AON的峰值血液浓度的量和方式施用AON。典型地,通常定期施用一剂或多剂AON,持续约一周至两周。口服施用的优选剂量为每70kg约1mg至1000mg寡聚体。在一些情况下,可能需要大于1000mg寡聚体/受试者的剂量。对于静脉施用,优选的剂量为每70kg约0.5mg至1000mg寡聚体。对于静脉内或皮下施用,AON可以约120mg/kg的剂量每天或每周施用。
AON可以在短时间内定期施用,例如每天施用,持续两周或更短时间。然而,在一些情况下,在更长的时间段内间歇性地施用寡聚体。施用之后或同时可以是抗生素或其他治疗性处理的施用。治疗方案可以基于免疫测定、其他生物化学试验和接受治疗的受试者的生理检查的结果按照指示进行调整(剂量、频率、途径等)。
给药取决于待治疗的疾病状态的严重程度和反应性,治疗过程持续几天至几个月,或直至实现治愈或达到疾病状态的减弱。最佳给药方案可以根据受试者体内药物积聚的测量值计算。普通技术人员可以容易地确定最佳剂量、给药方法和重复率。最佳剂量可以根据单个寡聚体的相对效力而变化,并且通常可以基于在体外和体内动物模型中发现有效的EC50来估计。一般而言,剂量为0.01μg至100g/kg体重,并且可以每天、每周、每月或每年给予一次或多次,或甚至每2至20年给予一次。基于测量的药物在体液或组织中的停留时间和浓度,本领域的普通技术人员可以容易地估计给药的重复率。在治疗成功后,可能需要让受试者进行维持治疗以防止疾病状态的复发,其中以范围为0.01μg至100g/kg体重的维持剂量施用寡聚体,每天一次或多次至每20年一次。
使用本发明的AON的有效体内治疗方案可以根据施用的持续时间、剂量、频率和途径以及接受治疗的受试者的状况而变化(即,预防性施用对比响应于局部或全身感染的施用)。因此,为了获得最佳治疗结果,此类体内疗法常常将会需要通过适于治疗的特定类型的疾病的试验进行监测,并相应地调整剂量或治疗方案。
可以例如通过本领域已知的疾病的一般指标来监测治疗。体内施用的本发明的AON的功效可以从在施用AON之前、期间和之后取自受试者的生物样品(组织、血液、尿液等)确定。此类样品的测定包括(1)使用本领域技术人员已知的程序,例如电泳凝胶迁移率测定,监测存在或不存在与靶序列和非靶序列形成异源双链体;(2)监测通过标准技术诸如RT-PCR、Northern印迹、ELISA或Western印迹测定的突变mRNA相对于参照正常mRNA或蛋白的量。
核内寡聚体递送是AON的主要挑战。不同的细胞穿透肽(CPP)在不同的条件和细胞系中不同程度地定位PMO,发明人评价了新型CPP将PMO递送至靶细胞的能力。术语CPP或“增强细胞摄取的肽部分”可互换使用并且是指阳离子细胞穿透肽,也称为“转运肽”、“载体肽”或“肽转导结构域”。如本文所示的肽具有在给定细胞培养群体的约或至少约30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%细胞内诱导细胞穿透的能力,并且在全身施用后允许大分子在体内多个组织内易位。CPP是本领域中公知的,并且例如在美国申请号2010/0016215中披露,该申请通过援引以其全文并入本文作为参考。
因此,本发明提供了与细胞穿透肽组合用于制造治疗性药物组合物的本发明的AON。
根据本发明的另一方面,提供了一种或多种如本文所述的用于基于AON的疗法的AON。优选地,该疗法用于与ACE2表达有关的疾病。更优选地,用于与ACE2表达有关的疾病的疗法是用于选自以下的疾病的疗法:冠状病毒感染、肺部疾病、慢性肾病、慢性心脏病、高血压和糖尿病。
更具体地,AON可选自由表3中和/或SEQ ID NO:1-31任一个中所列的任何一种或多种AON,更优选地SEQ ID NO:5、6、9或11,以及它们的组合或混合物组成的组。更优选地,AON是SEQ ID NO:6和9或SEQ ID NO:6和11。这包括可以在严格杂交条件下与此类序列杂交的序列,与其互补的序列,含有经修饰的碱基的序列,经修饰的主链,以及在ACE2基因转录物中具有或调节前mRNA加工活性的其功能性截短物或延伸物。
本发明还扩展到能够与选定靶标结合以诱导ACE2基因转录物中的外显子排除的两种或更多种AON的组合。该组合可以是两种或更多种AON的混合物,包含连接在一起的两种或更多种或两种或更多种AON的构建体,用于基于AON的疗法。AON的组合优选地是SEQ IDNO:6和9的组合或SEQ ID NO:6和11的组合。
本发明提供了一种用于治疗、预防或缓解与ACE2表达相关的疾病的影响的方法,该方法包括以下步骤:
a)向受试者施用有效量的一种或多种AON或包含如本文所述的一种或多种AON的药物组合物。
此外,本发明提供了一种治疗、预防或改善冠状病毒感染、肺病、慢性肾病、慢性心脏病、高血压和糖尿病的影响的方法,该方法包括以下步骤:
a)向受试者施用有效量的一种或多种AON或包含如本文所述的一种或多种AON的药物组合物。
优选地,该疗法用于通过外显子跳读策略增加ACE2蛋白的可溶性水平。优选地通过修饰ACE2基因转录物或其部分中的前mRNA剪接来调节转录物水平,从而实现ACE2水平的增加。
可溶性ACE2的增加优选地导致ACE2相关疾病或病理学症状的数量、持续时间或严重程度的降低,所述ACE2相关疾病或病理学例如冠状病毒感染、肺病、慢性肾病、慢性心脏病、高血压和糖尿病。
如本文所用,受试者(例如哺乳动物,诸如人)或细胞的“治疗”是在试图改变个体或细胞的自然过程中使用的任何类型的干预。治疗包括但不限于施用药物组合物,并且可以预防性地进行或在病理事件开始或与病原体接触后进行。还包括“预防性”治疗,这可以涉及降低所治疗的疾病或病症的进展速率、延迟该疾病或病症的发作、或降低其发作的严重程度。“治疗”或“预防”不一定表示完全根除、治愈或预防疾病或病症或其相关症状。
根据本发明的另一方面,提供了一种或多种如本文所述的AON在制造用于调节或控制与ACE2表达相关的疾病的药物中的用途。
本发明还提供了如本文所述的经纯化和分离的AON用于制造治疗与ACE2表达相关的疾病的药物的用途。
提供了如本文所述的经纯化和分离的AON用于制造治疗、预防或缓解与ACE2表达相关的疾病的影响的药物的用途。
优选地,ACE2相关病理或疾病是冠状病毒感染、肺病、慢性肾病、慢性心脏病、高血压和糖尿病。
根据本发明的另一方面,本发明扩展到本发明的AON序列的cDNA或克隆拷贝,以及含有本发明的AON序列的载体。本发明还进一步扩展到含有此类序列和/或载体的细胞。
本发明的AON可以与另一种治疗分子共同施用。例如,AON可以与为化合物的第二治疗剂一起施用,所述第二治疗剂例如肾素血管紧张素系统的阻滞剂,例如ACE抑制剂或血管紧张素受体阻滞剂。也可以与本发明的AON组合提供抗炎剂。
在本发明的一种形式中,AON与调节冠状病毒感染性的其他药剂共同施用,包括被动免疫和抗病毒疗法。如果ACE2相关病理或疾病是冠状病毒感染,则本发明的AON可与选自以下列表的另一种抗病毒治疗分子共同施用:奥司他韦扎那米韦利巴韦林、瑞德西韦、喷昔洛韦、法维帕韦、萘莫司他、硝唑尼特(nitazoxanide)、甲磺酸卡莫司他、干扰素α(例如干扰素αB2)、利托那韦、洛匹那韦、ASC09、阿兹夫定、巴洛沙韦(baloxavir marboxil)、地瑞那韦、考比司他、阿奇霉素、氯喹和羟氯喹。如果冠状病毒是SARS-CoV-2,这类额外的治疗剂可能会特别有帮助。
本发明还提供了用于治疗、预防或缓解受试者中与ACE2表达相关的疾病或病症的药盒,该药盒至少包含包装在合适容器中的用于修饰ACE2基因转录物或其部分中的前mRNA剪接的经分离或纯化的AON,以及其使用说明。
在一个优选的实施方案中,药盒将含有至少一种如本文所述的AON,为SEQ ID NO:1-31、更优选地SEQ ID NO:5、6、9或11、和/或表3中任一个所示的序列中的任何一个或多个,或如本文所述的AON的混合物。药盒还可以包含外围试剂,诸如缓冲剂、稳定剂等。更优选地,AON是SEQ ID NO:6和9或SEQ ID NO:6和11。
因此,提供了一种用于治疗、预防或缓解受试者中与ACE2表达相关的疾病或病症的药盒,该药盒至少包含包装在合适容器中的本文所述的AON,为SEQ ID NO:1-31、更优选地SEQ ID NO:5、6、9或11、和/或表3中任一个所示的序列中的任何一个或多个及其组合或混合物,以及其使用说明。更优选地,AON的组合优选地是SEQ ID NO:6和9的组合或SEQ IDNO:6和11的组合。
优选地,该疾病或病症选自包括以下项的列表:冠状病毒感染、肺病、慢性肾病、慢性心脏病、高血压和糖尿病。
药盒的内容物可以是冻干的,并且药盒可以另外含有用于重构冻干组分的合适溶剂。药盒的各个组分将被包装在单独的容器中,与此类容器相关的可以是由监管药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的公告,该公告反映了该机构批准制造、使用或销售以供人类施用。
当药盒的组分以一种或多种液体溶液提供时,液体溶液可以是水溶液,例如无菌水溶液。对于体内使用,可以将表达构建体配制成可药用可注射组合物。在这种情况下,容器装置本身可以是吸入器、注射器、移液管、滴眼管或其他类似设备,可以从这些容器装置中将制剂施加到动物的受影响区域(诸如肺部),注射到动物体内,或甚至施加到药盒的其他组分中并与药盒的其他组分混合。
药盒的组分也可以干燥或冻干形式提供。当试剂或组分以干燥形式提供时,通常通过添加合适的溶剂进行重构。设想溶剂也可以提供在另一容器装置中。不考虑容器的数目或类型,本发明的药盒还可以包括或包装有用于辅助将最终的复合组合物注射/施用或放置在动物体内的仪器。此类仪器可以是吸入器、注射器、移液管、镊子、量匙、滴眼管或任何此类医学上批准的递送媒介物。
本领域的普通技术人员应当理解,上述方法的应用对于鉴定适合用于治疗许多其他疾病的AON具有广泛的应用。
本发明的AON还可以与备选疗法诸如药物疗法联合使用。
因此,本发明提供了一种治疗、预防或改善与ACE2表达相关的疾病或病症的影响的方法,其中本发明的AON和另一种与治疗、预防或改善与ACE2表达相关的疾病或病症的影响相关的备选疗法依次或同时施用。优选地,该疾病或病症选自包括以下项的列表:冠状病毒感染、肺病、慢性肾病、慢性心脏病、高血压和糖尿病..
总则
本领域技术人员将理解,除了具体描述的那些之外,本文描述的本发明易于改变和修改。应当理解,本发明包括所有此类改变和修改。本发明还包括说明书中单独或共同提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物,以及这些步骤或特征的任何和所有组合或任何两个或更多个。
本发明的范围不受本文描述的特定实施方案的限制,这些实施方案仅旨在用于举例说明的目的。功能上等效的产品、组合物和方法显然在本文所述的本发明的范围内。
本文引用的所有出版物(包括专利、专利申请、期刊论文、实验室手册、书籍或其他文件)的全部披露内容通过援引并入本文。不承认任何参考文献都构成现有技术或者是在本发明所涉领域中工作的技术人员的公知常识的一部分。
在本文中引用的每个文件、参考文献、专利申请或专利明确地通过援引以其全文并入本文作为参考,这意味着读者应将它作为本文的一部分来阅读和考虑。在本文中引用的文件、参考文献、专利申请或专利在本文中不再重复仅仅是出于简洁的原因。
本文或通过援引并入本文的任何文件中提及的任何产品的任何制造商的说明书、描述、产品规格和产品清单特此通过援引并入本文,并且可用于本发明的实践。
如本文所用,术语“衍生的”和“衍生自”应理解为表示特定整数可从特定来源获得,但不一定直接从该来源获得。
如本文所用,除非上下文另外明确指出,否则单数形式“一”、“一种(个)”和“该”包括复数指示物。
在整个说明书中,除非上下文另有要求,否则词语“包含(comprise)”或诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”的变型将被理解为暗示纳入所陈述的整数或整数的组,但不排除任何其他整数或整数的组。
除了在操作实施例中,或在另外指明的情况下,否则在说明书和权利要求书中使用的表示成分的量、反应条件等的所有数字均应理解为在所有情况下由术语“约”修饰。因此,除非指出相反,否则在说明书和权利要求书中列出的数值参数是近似值,其可以根据本发明所寻求获得的所需性质而变化。因此,“约80%”意指“约80%”且也指“80%”。至少,每个数值参数都应当根据有效数位的数字和普通的舍入方法来解释。
尽管阐述本发明广泛范围的数值范围和参数是近似值,但具体实施例中列出的数值是尽可能精确地报告的。然而,任何数值固有地含有由其相应的试验测量中存在的标准偏差所必然引起的某些误差。
本文所用的选定术语的其他定义可在本发明的详细描述中找到并通篇适用。除非另有定义,否则本文所使用的所有其他科学和技术术语均具有与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同含义。
包含本说明书中所包括的核苷酸和氨基酸序列信息的序列标识号(“SEQ IDNO:”)汇总于说明书结尾并且已经使用Patentln 3.0版程序进行了编制。每个核苷酸或氨基酸序列在序列表中用数字指示符<210>,其后是序列标识符(例如<210>1、<210>2等)来标识。每个核苷酸或氨基酸序列的长度、序列类型和来源生物体分别由数字指示符字段<211>、<212>和<213>中提供的信息标识。
提出并公开了反义寡聚体命名系统以区分不同的反义寡聚体(参见Mann等人,(2002)J Gen Med[普通医学杂志]4,644-654)。当测试全部针对相同靶区域的几种略有不同的反义寡聚体时,这种命名变得特别相关,如下所示:
H#A/D(x:y)
第一个字母指示物种(例如H:人,M:鼠类)
“#”指示靶外显子数目
“A/D”分别指示外显子起点/末端处的受体或供体剪接位点
(xy)表示退火坐标,其中“-”或“+”分别指示内含子或外显子序列。例如,A(-6+18)指示靶外显子之前的内含子的最后6个碱基和靶外显子的前18个碱基。距离最近的剪接位点将是受体,所以这些坐标前面将会有“A”。描述供体剪接位点处的退火坐标可以是D(+2-18),其中最后2个外显子碱基和前18个内含子碱基对应于反义寡聚体的退火位点。将由A(+65+85)表示的完全外显子退火坐标是从该外显子开始的第65个和第85个核苷酸之间(包括端值)的位点。
以下实施例更全面地描述使用上述发明的方式,以及阐述实施本发明各个方面的最佳模式。应当理解,这些方法并不限制本发明的范围,而是为了说明的目的而呈现。
实施例
在以下每个实施例中,除非上下文另有要求,否则以下一般材料和方法适用。
中国仓鼠卵巢(CHO)细胞高水平表达重组蛋白,使其成为研究ACE2的C端截短对截短的ACE2的表达、活性和分泌的影响的理想系统。对于实验,CHO细胞在F12培养基(补充有10%FBS)中生长。然后使用编码截短的ACE2构建体的质粒用Lipofectamine2000转染CHO细胞。2天后,收集培养基,使用分子量截止滤器浓缩,并使用抗hACE2抗体(R&D systems)通过蛋白质印迹检测并检测ACE2催化活性。
对于实验,Caco-2细胞在MCDB 131培养基(10%FCS和10mM谷氨酰胺、EGF和氢化可的松)中培养。Calu-3细胞在EMEM(10%FCS)中培养。HeCAT细胞在10%FBS DMEM中培养。原代正常人真皮成纤维细胞在补充有10%FBS DMEM的DMEM和补充有10ng/ml表皮生长因子、1μg/ml氢化可的松、10%FBS DMEM和1x谷氨酰胺的MCDB 131中的HMEC中繁殖。非洲绿猴(Chlorocebus sp)衍生的VeroE6细胞在αMEM培养基中培养。
对于AON的转染,将细胞接种到6或24孔板中,然后使用Lipofectamine3000试剂(0.15ul/孔lipofectamine3000;0.4ul/孔P3000/孔)与靶向人ACE2的AON或剂量等同的非靶对照(与人RAGE的外显子9退火而不改变RAGE剪接)转染。然后将细胞与50-200μM AON/阳离子脂质复合物在37℃孵育24-72小时,然后裂解细胞,提取RNA并使用循环阈值法(CycleThreshold method)或Trizol法生成cDNA。使用Superscript III[Life Technologies:Carlsbad,CA,USA]和大约50ng总RNA作为模板进行一步RT-PCR。使用ACE2尾部区域的正向和反向引物的PCR产物在Tris-乙酸盐-EDTA缓冲液中的2%琼脂糖凝胶上进行分级分离,并在凝胶记录系统[Vilber Lourmat,Eberhardzell,德国]上捕获图像。
为了测量AON对ACE2剪接的定量影响,然后使用定量实时RT-PCR用针对ACE2 mRNA的外显子边界的探针确定基因表达。
还使用分子量截止滤器收集和浓缩培养基。然后通过ELISA和通过ACE2催化活性的存在来确定可溶性ACE2的存在。
为了确定来自SARS-CoV-2的S1吸附到VeroE6细胞的细胞表面上,将转染的细胞与GFP标记的S1在无血清Optimum培养基中孵育30分钟,然后使用培养基洗涤并使用荧光板读数仪检测绿色荧光。
使用噬斑测定法确定SARS-Cov-2的感染。在该测定法中,将Y613L-ACE2(19-613)添加到VeroE6细胞(0.002-2ug/ml)中,然后将SARS-CoV-2(50PFU)添加到每个孔中。30分钟后,用2XL15培养基和琼脂糖(0.9%w/v)覆盖孔,然后在37℃孵育1-3天,然后计数噬斑并估计TCID50。
对于体内实验,在全身麻醉(氯胺酮)下用AON(3mg/kg,在30uL去离子水中)的单次气管内剂量处理雄性C57bl6小鼠,然后跟踪7天,之后用二氧化碳麻醉人道地杀死。死后进行支气管肺泡灌洗(BAL),并使用商业ELISA测量液体中的ACE2。然后取出肺并在Trizol提取后估计ACE2 mRNA表达。
实施例1.C端截短的ACE2突变体的构建和验证
该实施例证明,当在体外和体内表达时,C端截短的ACE2同工型可以是可溶的、稳定的、分泌的、有催化活性的并保留抗病毒活性。
首先产生并表达了一系列C端截短的鼠ACE2(mAce2)突变体,以确定C端截短对体外和体内ACE2分泌、稳定性和酶活性的影响。从所有构建体中省略了内源性N端信号肽(1-18),并将6-His标签和短接头(-GKT)-添加到所有构建体的C端以用于纯化目的。选择615位点是因为它代表与集合管蛋白同源结构域的假定边界(表1),并且是如果备选剪接的话导致外显子14跳读的产物。选择740位点是因为它代表与跨膜结构域的边界。选择697位点是因为它代表ACE2的推定可诱导切割位点。特别地使用鼠ACE2,因为非鼠ACE2的表达导致中和抗体的产生,这排除了进行体内长期测试。
在用含有mAce2(19-615)的质粒转染CHO细胞后48小时观察到分泌到培养基中的活性ACE2的最高量,通过蛋白质印迹(图1a)和ELISA(图1b)观察到使用mAce2(19-740)的较少量。此外,两种构建体都产生了酶活性蛋白(图1c)。值得注意的是,尽管mAce2(19-697)是诱导型ACE2自膜脱落的推定产物,但观察到了较差的表达(图1a)。
当用含有C端截短的ACE2的DNA小环转染CHO细胞时,较短的ACE2构建体mAce2(19-615)的分泌量也高于mAce2(19-740),如蛋白质印迹所示(图1d)。如ELISA所示(图1e),用编码mAce2(19-615)的DNA小环转染CHO细胞也在培养基中产生ACE2蛋白。
来自mAce2(19-615)转染的CHO细胞的培养基也拮抗人主动脉内皮细胞中ICAM-1和MCP-1基因表达的Ang II(1μM)依赖性诱导,这与功能相关的血管紧张素酶活性的存在一致(图1f和图1g)。值得注意的是,这种保护被选择性ACE2抑制剂MLN-4760阻断,这与仅由培养基中的ACE2催化活性赋予的保护一致。
然后将编码mAce2(19-615)的DNA小环注射C57bl6小鼠的小腿肌肉(40μg/IM),并在注射后4周诱导循环ACE2蛋白和活性的可检测增加(分别为图1h和图1i),证实了C端截短产物mAce2(19-615)可以在体内表达、分泌和保留酶功能,与其构象完整性一致。
然后开发了最佳mAce2(19-615)构建体的人类似物Y613L-ACE2(19-613)并转染到CHO细胞中,所述Y613L-ACE2(19-613)也高水平表达并产生有效分泌到培养基的ACE2蛋白(图1j),其催化ACE2活性与掺入商业重组ACE2(1-740;图1k)的培养基相当。
用SARS-CoV-2感染VeroE6细胞后的噬斑积聚也在用从转染的CHO细胞培养基浓缩的Y613L-ACE2蛋白处理后以剂量依赖性方式得到抑制(图1l),证实了其抗病毒活性。
综上所述,该实施例证明了在催化(ACE样)结构域和集合管蛋白样结构域的假定边界处优先C端截短的ACE2同工型将很好地表达、分泌、具有酶活性和抗病毒,与构象完整性一致。
实施例2.在CACO-2细胞中使用AON调节ACE2外显子14的剪接
该实施例详细说明了如何设计和利用AON来跳读人ACE2前mRNA中的外显子14,以生成编码可溶性ACE2同工型的新的ACE2 mRNA剪接变体(Δ14剪接变体),其在ACE样结构域和集合管蛋白样结构域的推定边界处被截断,同时减少保留外显子14并编码膜结合的全长ACE2同工型的常规剪接ACE2 mRNA的表达。
人ACE2的外显子14编码氨基酸613-633(图2a)。它是一个短编码序列(59bp),位于两个大内含子(>1kb;表1b)之间。由于外显子13和15的相位不同,跳读外显子14会在距离最近的下游外显子-外显子连接点超过55个核苷酸处引入一个读框内终止密码子。这种由异常剪接引入的提前终止密码子(PTC)通常是无义介导衰变(NMD)的靶标,以消除低效转录本。但是,虽然55bp启发式预测在大多数情况下的NMD敏感性,但也报告了许多例外。我们假设跳读外显子14会产生一个剪接变体,其编码功能性截短同工型Y613L-ACE2(19-613)(图2a),这种截短恰好发生在外部ACE样血管紧张素酶结构域和ACE2的集合管蛋白样内部结构域之间的嵌合边界处,这种剪接变体可能会逃脱NMD。
为了诱导外显子跳读,用靶向外显子14的5'和/或3'剪接位点的2'O-Me PTO反义寡核苷酸(50-100μM)转染人结肠上皮细胞(Caco-2)。Caco-2内源性高水平表达ACE2,并且已知摄入SARS-CoV-2。在载体处理的细胞中,没有跳读外显子14的ACE2 mRNA剪接变体(图2b,小图i)。然而,在用H14A[-17+8](100nM;小图ii)或用AON H14A[-17+8]和H14D[+13-12](各50nm,小图iii)的组合转染48小时后,导致Δ14剪接变体的从头生成,其中外显子14被跳读,并将外显子13和15剪接在一起,如RT-PCR扩增曲线所示(图2b)。
在用H14A[-17+8]或包括H14A[-17+8]的组合处理Caco-2细胞后,Δ14剪接变体的表达增加,这伴随着常规剪接的ACE2 mRNA保留外显子14序列的剪接变体的同时减少(图2c),而总ACE2 mRNA表达没有显著变化(图2d)。
在用靶向ACE2的AON转染的Caco-2细胞中观察到类似的结果,所述AON包括H14A[-17+8]和H14D[+13-12],以及H14A[-17+8]和H14D[+9-16],使用Trizol方法进行RNA纯化以获得更大的mRNA拷贝数,其中包含外显子14的ACE2剪接变体减少了80%以上,而总ACE2(即包含外显子13和15这两者的ACE2剪接变体;图2e)没有任何减少。
在时程研究中,在转染后短短24小时后观察到Δ14剪接变体的从头生成,如RT-PCR扩增曲线所示(图2f)。特别是,H14A[-17+8]和H14D[+13-12]的组合(小图i)导致了Δ14剪接变体的从头生成。又,在用对照AON转染后没有观察到新的剪接变体(小图ii)。
总而言之,该数据表明了一种新的ACE2 mRNA剪接变体,其中外显子14被跳读(Δ14剪接变体),意外地避免了大量的NMD,并且可以在用某些AON处理后诱导该新的ACE2mRNA剪接变体。
实施例3.在VEROE6细胞中使用AON调节ACE2外显子14的剪接
该实施例详细说明了设计为跳读人ACE2外显子14的AON如何也能够调节VeroE6细胞中ACE2的剪接,并在其中抑制SARS-CoV-2刺突蛋白吸附到细胞表面。
用靶向人外显子14的5'和3'剪接位点的2’-O-Me PTO AON转染VeroE6细胞也调节猴来源的VeroE6细胞中的ACE2剪接。特别是,在转染H14A[-17+8]和H14D[+13-12](各50nm)的组合后48小时,常规剪接的含有外显子14的ACE2 mRNA剪接变体显著减少(>95%)(图3a)。同时,总ACE2表达(表示为包含外显子13和外显子15这两者的ACE2 mRNA剪接变体)没有显著变化。这意味着必然也发生了外显子14跳读。
用靶向人外显子14的5'和3'剪接位点的2’-O-Me PTO AON,具体地H14A[-17+8]和H14D[+13-12],转染VeroE6细胞也导致与用非靶AON转染的细胞相比,浓缩的细胞培养基中Ace2活性的增加(图3b)和培养基中可溶性ACE2蛋白的增加(图3c),这与新的可溶性ACE2蛋白同工型的释放一致。
刺突糖蛋白(S1)吸附到VeroE6细胞上取决于ACE2的表面表达。用靶向人外显子14的5'和3'剪接位点的2’-O-Me PTO AON,具体地H14A[-17+8]和H14D[+13-12],转染VeroE6细胞,也减少了绿色荧光蛋白(GFP)标记的S1吸附到VeroE6细胞上(图3d),表明了用靶向ACE2外显子14的AON转染的抗病毒活性。
实施例4.调节ACE2外显子14剪接的寡核苷酸的优化
该实施例详细说明了设计为跳读人ACE2的外显子14的AON如何通过少量移动其靶序列来改变,以提高其功效。
已经表明,某些AON,具体地H14A[-17+8],本身具有调节ACE2外显子14剪接的适度能力(图2b和2c),设计了靶向相邻区域的额外2’-O-Me PTO AON(SEQ ID NO:5-8)并在人结肠上皮(Caco-2)细胞中进行了测试。在这些构建体中,用H14A[-25-1]和H14A[-22+3](分别为SEQ ID NO:5和6]转染48小时后诱导外显子14跳读具有最大的个别效应(图4a),如使用针对外显子13和外显子15之间序列的引物在一步PCR上的较小条带(白色箭头)所示,超过了单独使用H14A[-17+7](SEQ ID NO:4)的反应。
用2’-O-Me硫代磷酸酯AON,即H14A[-25-1]和H14A[-22+3](分别为SEQ ID NO:5和6)转染Calu-3细胞也在48小时后诱导跳读外显子14(图4b),如使用针对外显子13和外显子15之间序列的引物在一步PCR上的较小条带(白色箭头)所示。
用H14A[-22+3](SEQ ID NO:6)的体内吗啉代制剂转染Calu-3细胞也在72小时后诱导外显子14跳读(图6a),如使用外显子13和外显子15之间序列的引物在一步PCR上的较小条带(白色箭头)所示。用H14A[-22+3](SEQ ID NO:6)的体内吗啉代制剂预处理Calu-3细胞72小时,在该细胞体外暴露于SARS-CoV-2(Vic01)后,也降低了培养基中的病毒TCID50(图4c),表明显著抑制了冠状病毒的感染活性,这是由外显子14跳读引起的。
实施例5.使用AON调节ACE2的外显子17的剪接
本实施例详细说明了如何设计和利用AON来跳读ACE2前mRNA的倒数第二个外显子,即外显子17,从而去除残基706-762的编码序列并产生不编码跨膜结构域的新ACE2剪接变体,同时减少保留外显子17表达的常规剪接的ACE2 mRNA,所述外显子17表达的常规剪接的ACE2 mRNA编码的ACE2同工型是膜保留的,并且能够介导冠状病毒吸附。
用靶向ACE2外显子17的5'和3'剪接位点或具有作为顺式作用序列调节外显子17剪接潜力的相邻区域的25-mer 2’-O-Me PTO AON,使用Lipofectamine3000转染15000个人成纤维细胞。在对照处理和未处理(UT)细胞中,没有跳读外显子17的ACE2 mRNA的备选剪接。然而,在用H17A[-15+10]、H17A[-5+20]、H17A[-10+15]、H17A[+21+45]转染24小时后,观察到新的ACE2 mRNA剪接变体,其中外显子17被跳读(Δ17剪接变体),如使用位于外显子13(正向)和外显子18(反向)的引物在一步PCR中新的较低条带所示(图5b)。
用靶向外显子17的5'和3'剪接位点之一或具有作为顺式作用序列调节剪接潜力的相邻区域的20-mer 2’-O-Me PTO AON转染30000个人角质形成细胞系(HaCat),也产生了新的Δ17剪接变体,如使用位于外显子13(正向)和外显子18(反向)的引物在一步PCR中新的较低条带所示(图5c)。
将HaCat细胞用显示改变外显子17剪接的三种最佳2’-O-Me PTO AON,即H17A[-2+18]、H17A[+26+45]和H17A[+21+45]转染都导致了新Δ17剪接变体的产生,并减少了保留外显子17的常规剪接形式的表达,如一步PCR上新的较低条带所示(图5d)。这表明,优选的25-mer的缩短衍生物H17A[+21+45](SEQ ID NO:9)或H17A[-5+20](SEQ ID NO:11)能够在体外达到类似的功效。
通过实时RT-PCR检测,用H17A[+21+45]的体内吗啉代制剂处理(1μM)Caco-2细胞也导致48小时后对编码外显子17的常规剪接ACE2 mRNA的显著抑制(图5e)。
然后用M17A[+21+45],一种对小鼠ACE2 mRNA序列(SEQ ID NO:32)特异的2’-O-MePTO AON构建体,以3.0mg/kg的剂量在去离子水中气管内递送处理雄性C57bl6小鼠。7天后,肺中编码外显子17的常规剪接ACE2 mRNA显著减少,而总ACE2没有显著变化,表明ACE2备选剪接的诱导(图5f)。此外,如通过ELISA测量所示,与用非靶AON对照处理的小鼠相比,支气管肺泡液中可溶性ACE2蛋白增加(图5g),这与调节ACE2前mRNA剪接产生可溶性蛋白质同工型一致。
单独用H17A[+21+45]的体内吗啉代制剂(2uM)预处理Calu-3细胞72小时,在该细胞体外暴露于SARS-CoV-2(Vic01)后,不显著降低培养基中的病毒TCID5(图5h)。这与图4b中详述的H14A[-22+3]形成对比。这例示用H17A[+21+45]处理尽管产生了可溶性ACE2并且减少了全长ACE2 mRNA,但抗病毒活性也需要构象完整性。
实施例6.使用靶向人ACE2的外显子14和17的AON的组合调节ACE2的剪接
该实施例详细说明了如何组合某些AON以增强编码和产生优选的可溶性ACE2同工型的新ACE2 mRNA剪接变体的产生,同时降低编码全长ACE2的常规剪接ACE2 mRNA的表达。所述全长ACE2既是膜保留的,又能够介导病毒吸附和摄入。
跳读外显子17(例如,使用H17A[+21+45]或H17A[-5+20])预计会产生含有残基19-705、跳读跨膜结构域,然后是短的(43aa)ACE2胞质尾的ACE2蛋白同工型。这种新的Δ17剪接变体的蛋白质表达可能低于生成Y613L-ACE2(19-613)的Δ14剪接变体,我们发现该Δ14剪接变体比较长的ACE2胞外结构域构建体(包括ACE2(19-697))更有活性和表达的更好(图1a)。由Δ17剪接变体产生的可溶性蛋白也可能具有与天然ACE2不同的构象,这是由于胞质尾的保留可能会干扰其活性、保留或稳定性。这与具有催化活性和明显抗病毒作用的优选同工型Y613L-ACE2(19-613)不同(图1l)。我们假设如果ACE2 mRNA中的外显子14和17(例如将H14A[-22+3]与H17A[+21+45]结合使用)都可以被跳读,这会增加更理想的高表达Y613L-ACE2(19-613)同工型的产生。此外,使用一个AON改变前mRNA在一个靶位点的剪接也有可能通过改变前mRNA的构象来调节不同AON在其他地方诱导备选剪接的能力(例如,增加SSO与靶序列的可及性,从而改变新剪接变体的稳定性或衰减。然而,这类相互作用是不可预测的,并且对于每个前mRNA和每个靶标都是独特的。
在该实施例中,我们显示与仅用H14A[-22+3]相比,用两种体内吗啉代AON,即H17A[+21+45]和H14A[-22+3](各1μM)的组合处理Calu-3细胞显著增加了表达跳读外显子14的新ACE2 mRNA剪接变体,其中仅用H14A[-22+3]在该细胞系中72小时后仅具有适度的影响(白色箭头;图6a)。仅用H17A[+21+45]对外显子14剪接本身没有影响(因为它靶向外显子17)。用H17A[+21+45]和H14A[-22+3]的组合处理72小时后,保留外显子14的ACE2 mRNA剪接变体的表达也降低了(红色箭头),如使用位于外显子13(正向)和外显子15(反向)的引物通过一步PCR检测的那样。
在Caco-2细胞中也观察到对两种体内吗啉代AON,即H17A[+21+45]和H14A[-22+3]组合的类似协同反应,跳读外显子14的新ACE2 mRNA剪接变体的表达显著增加(白色箭头;图6b)。值得注意的是,仅使用H17A[+21+45]时观察到的Δ17剪接变体在与H14A[-22+3]组合使用时也减少了(图6c),证实了由组合产生的主要剪接变体跳读外显子17和14这两者(绿色箭头),如使用位于外显子13(正向)和外显子18(反向)的引物通过一步PCR测量的那样。这种新剪接变体(Δ14,17)将编码偏好的蛋白质产物Y613L-ACE2(19-613)。此外,显然在该组合处理中全长剪接变体(红色箭头)的减少最大。
当用H17A[+21+45]和H14A[-22+3]的体内吗啉代制剂(各1μM)的组合预处理Calu-3细胞72小时时,观察到强的抗病毒反应,如该细胞暴露于SARS-CoV-2(Vic01)后培养基中病毒TCID50的减少所证实的那样(图6d),超过了仅使用其中任一AON的抗病毒反应。
Claims (16)
1.一种分离或纯化的反义寡聚体,用于修饰血管紧张素转换酶2(ACE2)中的前mRNA剪接,以调节ACE2基因转录物或其部分的剪接,所述分离或纯化的反义寡聚体具有修饰的主链结构;以及与此类反义寡聚体具有至少75%序列同一性且具有修饰的主链结构的序列。
2.根据权利要求1所述的反义寡聚体,其选自包含以下所列序列:
a)SEQ ID NO:1-31;和/或
b)SEQ ID NO:5、6、9或11;和/或
c)表3。
3.根据权利要求1所述的反义寡聚体,其中所述反义寡聚体含有一个或多个核苷酸位置,所述核苷酸位置受到选自包含下列的备选化学或修饰:(i)修饰的糖部分;(ii)对RNaseH的抗性;和/或(iii)寡聚模拟化学。
4.根据权利要求1所述的反义寡聚体,其中所述反义寡聚体通过(i)化学缀合至部分;和/或(ii)用细胞穿透肽标记进一步修饰。
5.根据权利要求1所述的反义寡聚体,其中如果反义寡聚体中存在尿嘧啶,则用胸腺嘧啶(T)替换反义寡聚体的尿嘧啶(U)。
6.根据权利要求1所述的反义寡聚体,其中前mRNA剪接的修饰导致ACE2前mRNA的一个或多个外显子序列的跳读。
7.一种药物组合物、预防组合物、防止组合物或治疗组合物,用于治疗、预防或改善受试者中与ACE2表达相关的疾病的影响,所述组合物包含:
a)根据权利要求1至6中任一项所述的一种或多种反义寡聚体,和
b)一种或多种可药用载体和/或稀释剂。
8.在ACE2基因转录物中操纵剪接的方法,所述方法包括以下步骤:
a)提供一种或多种根据权利要求1至6中任一项所述的反义寡聚体并允许所述寡聚体与靶核酸位点结合。
9.调节ACE2同工型的表达、浓度或活性的方法,包括以下步骤:
(a)向受试者施用有效量的根据权利要求1至6中任一项所述的一种或多种反义寡聚体或包含所述一种或多种反义寡聚体的药物组合物。
10.治疗、预防或改善与ACE2表达相关的疾病的影响的方法,包括以下步骤:
a)向受试者施用有效量的根据权利要求1至6中任一项所述的一种或多种反义寡聚体或包含所述一种或多种反义寡聚体的药物组合物。
11.根据权利要求1至6中任一项所述的纯化和分离的反义寡聚体的用途,用于制备治疗、预防或改善与ACE2表达相关的疾病的影响的药物。
12.用于治疗、预防或改善受试者中与ACE2表达相关的疾病的影响的试剂盒,所述试剂盒包含包装在合适的容器中的至少一种根据权利要求1至6中任一项所述的反义寡聚体和其组合或混合物,以及其使用说明。
13.根据权利要求7所述的组合物、根据权利要求8-10中任一项所述的方法、根据权利要求11所述的用途或根据权利要求12所述的试剂盒,其中所述ACE2表达相关的疾病选自包含以下所列:由严重急性呼吸综合征相关的冠状病毒引起的感染、肺病、慢性肾病、慢性心脏病、高血压和糖尿病。
14.根据权利要求7所述的组合物、根据权利要求8-10中任一项所述的方法、根据权利要求11所述的用途或根据权利要求12所述的试剂盒,其中所述反义寡聚体与选自包含下列的第二治疗剂组合施用:可溶性ACE2同工型;能够调节RAAS的化合物、抗病毒疗法或靶向冠状病毒的被动免疫疗法。
15.根据权利要求7所述的组合物、根据权利要求8-10中任一项所述的方法、根据权利要求11所述的用途或根据权利要求12所述的试剂盒,其中所述反义寡聚体是反义寡聚体的组合。
16.根据权利要求15所述的组合物、方法、用途或试剂盒,其中所述反义寡聚体的组合选自SEQ ID NO:6和9或SEQ ID NO:6和11的组合。
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