CN115372512B

CN115372512B - 一种用于食用植物油中乙基麦芽酚的检测方法

Info

Publication number: CN115372512B
Application number: CN202210992822.7A
Authority: CN
Inventors: 葛敏敏; 李赵平; 董宇; 谢晓燕
Original assignee: Kaifeng Food And Drug Inspection Institute
Current assignee: Kaifeng Food And Drug Inspection Institute
Priority date: 2022-08-18
Filing date: 2022-08-18
Publication date: 2023-08-11
Anticipated expiration: 2042-08-18
Also published as: CN115372512A

Abstract

本发明公开了一种用于食用植物油中乙基麦芽酚的检测方法，包括样品前处理和定量检测，所述样品前处理包括以下步骤：Ⅰ、称取混合均匀的食用植物油1.00g，加入1mL二氯甲烷，涡旋混匀后，加入NaOH水溶液5mL，涡旋30min，4℃条件下4000r/min离心5min后，取上清液；Ⅱ、固相萃取柱经过5mL乙腈、5mL纯净水依次润洗活化，取上清液2.5mL用磷酸调节pH至2～9后注入固相萃取柱，待过柱液流出后用5mL水淋洗2次，弃去淋洗液，甲醇洗脱并定容，滤液过滤，以进行净化，待HPLC‑MS/MS上样分析。本发明与现有技术相比的优点在于：检测准确、灵敏度高，尤其能有效减少芝麻油的基质效应，适用范围广。

Description

一种用于食用植物油中乙基麦芽酚的检测方法

技术领域

本发明涉及乙基麦芽酚的检测，具体是指一种用于食用植物油中乙基麦芽酚的检测方法。

背景技术

乙基麦芽酚是一种广普的食品添加剂，具有香味且能达到增香抑菌作用，在肉制品、饼干、饮料中应用广泛，有研究表明乙基麦芽酚的过量摄入会对人的肝脏、肺产生一定影响。一些生产厂家为了使劣质食用油以次充好或达到造假的目的在其中加入乙基麦芽酚这种香料，GB 2760-2014 食品安全国家标准食品添加剂使用标准中明确规定食用植物油脂中不得添加任何香精香料，食用植物油中乙基麦芽酚的非法添加不仅存在食品安全隐患，更会损害消费者的经济利益。

食品中乙基麦芽酚的检测方法有高效液相色谱、气相色谱、高效液相色谱串联质谱法、气相色谱串联质谱法，分光光度法、光谱法等检测方法等，研究基质主要为饮料、烟草、糖果、肉制品、饼干、面包、乳及乳制品等，食品中乙基麦芽酚检测的高效液相色谱、气相色谱、气相色谱串联质谱、分光光度检测方法的检出限在100~1000 μg/kg范围，检出限仍处于较高水平。由于植物油中的乙基麦芽酚属于违法添加，其检测方法要求检出限应当尽可能低，尽管食品中乙基麦芽酚的检测方法较多，而植物油中乙基麦芽酚合适的检测方法只有液相色谱串联质谱方法。

唐韵熙等在《分析试验室》上发表的《芝麻油、芝麻调和油中乙基麦芽酚HPLC-MS/MS分析》一文中建立了食用植物油中乙基麦芽酚检测的液相色谱串联质谱方法，提取溶剂为甲醇，方法定量限为4.0 μg/kg；陈坤等在《质量与认证》上发表的《固相萃取—液相色谱串联质谱法检测食用植物油中乙基麦芽酚的研究》和宁霄等在《食品安全质量检测学报》上发表的《超高效液相色谱-串联质谱法同时测定食品中麦芽酚，乙基麦芽酚，香兰素，甲基香兰素和乙基香兰素》中建立了食用植物油中乙基麦芽酚检测的固相萃取液相色谱串联质谱方法，方法定量限分别为5 μg/kg和4.5 μg/kg，提取溶剂均为有机试剂，固相萃取柱分别为C18固相萃取小柱和WAX混合型阴离子交换固相萃取柱，其提取净化过程操作较为复杂。目前，食用植物油中乙基麦芽酚暂无国标检测方法，目前的国家抽检按照市场监督管理局发布的补充方法《食用植物油中乙基麦芽酚的测定》（BJS201708）进行测定，该方法与唐韵熙等《芝麻油、芝麻调和油中乙基麦芽酚HPLC-MS/MS分析》中较为一致，没有净化步骤对仪器污染较大。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服以上技术缺陷，提供一种检测准确、灵敏度高，尤其能有效减少芝麻油的基质效应，适用范围广的一种用于食用植物油中乙基麦芽酚的检测方法。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种用于食用植物油中乙基麦芽酚的检测方法，包括样品前处理和定量检测，所述样品前处理包括以下步骤：Ⅰ、称取混合均匀的食用植物油1.00 g，加入1 mL二氯甲烷，涡旋混匀后，加入0~3%NaOH水溶液5 mL，涡旋30 min，4 ℃条件下4000 r/min离心5 min后，取上清液；Ⅱ、固相萃取柱经过5 mL乙腈、5mL纯净水依次润洗活化，取上清液2.5 mL用磷酸调节pH至2~9后注入固相萃取柱，待过柱液流出后用5 mL水淋洗2次，弃去淋洗液，甲醇洗脱并定容1~5mL，滤液过滤，以进行净化，待HPLC-MS/MS上样分析；所述定量检测采用电喷雾电离源正离子多反应监测模式进行检测，采用溶剂匹配标准曲线外标法进行定量。

本发明与现有技术相比的优点在于：本申请的乙基麦芽酚检测的HPLC-MS/MS方法，首次采用NaOH水溶液进行提取，乙基麦芽酚的具有类似于苯酚的吡喃酮羟基结构，在强碱性条件下其结构中的吡喃酮羟基解离，水溶性增强，借助这个特点可实现乙基麦芽酚与油脂分离，从而油脂中的乙基麦芽酚被提取到水溶液中；NaOH水溶液在提取植物油时，植物油密度较小，提取液在下层不利于转移，而植物油与二氯甲烷1:1（v/v）混合后，其密度会增大。该实验利用NaOH水溶液对植物油中的乙基麦芽酚进行提取，植物油样品在提取前需与等体积二氯甲烷混合；然后通过磷酸调节PH值进行富集，再利用固相萃取柱进行净化，不仅可以降低样品对仪器的污染，而且可以降低基质效应，实现了溶剂匹配标准曲线对食用植物油中的乙基麦芽酚的定量分析，为查处植物油中乙基麦芽酚的违法添加提供有力的技术支撑，也为食用植物油国标方法扩充提供参考。

进一步的，所述固相萃取柱采用PLS固相萃取柱，PLS固相萃取柱的柱回收最高，PLS固相萃取柱其材料为含亲水基团的聚苯乙烯/二乙烯基苯共聚物球形颗粒，具有亲水亲脂的特性，对酚类化合物具有良好的富集作用，因此本实验选用PLS固相萃取柱。

进一步的，所述NaOH水溶液浓度为1.5%，提取液的NaOH浓度在0%~1.5%范围内，提取效率随着NaOH浓度增大而增大，达到1.5%后提取效率达到最大并进入平台期，因此提取液的NaOH浓度以1.5%为最优。

进一步的，所述上清液2.5 mL用磷酸调节pH至4~7，在酸性及中性条件下，PLS固相萃取柱可实现对乙基麦芽酚的富集，pH值在4~7范围之内，乙基麦芽酚的回收率比较稳定并保持在最高水平，在碱性条件下回收率则较低。

进一步的，所述甲醇洗脱并定容2mL，样品提取液在净化过程中经过淋洗，分别用1mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL甲醇进行洗脱，结果表明2 mL即可实现乙基麦芽酚的完全洗脱，因此选择洗脱体积为2 mL。

进一步的，色谱条件：色谱柱：Kinetex-C18色谱柱（100 mmx-C18MS，2.6 mm）；柱温：40 ℃；进样量：2 μL；流动相A：含1%甲酸的水溶液；流动相B：甲醇溶液；梯度洗脱程序：0～0.2 min，80 %A；0.2～3 min，80%～20% A；3～4 min，20%～10% A；4～4.1 min，10%～80%A；4.1～9 min，80% A；流速：0.25 mL/min；质谱条件：离子源：电喷雾正离子源（ESI+）；毛细管电压：3.00 kV；锥孔电压：35.00 V；离子源温度：150 ℃；干燥气温度：500 ℃；干燥气流速：1000 L/h（氮气）；锥孔气流速：1 L/h（氮气）；碰撞气：氩气；采集模式：多反应监测（MRM）模式，以获得最佳的质谱采集参数，提高仪器灵敏度，对乙基麦芽酚的前体离子、产物离子、碎裂电压、碰撞能量进行优化。

附图说明

图1是固相萃取柱的选择。

图2是提取液NaOH浓度的优化。

图3是提取液过固相萃取柱前的pH值优化。

图4是芝麻油色谱图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明。

一种用于食用植物油中乙基麦芽酚的检测方法，包括样品前处理和定量检测，所述样品前处理包括以下步骤：Ⅰ、称取混合均匀的食用植物油1.00 g，加入1 mL二氯甲烷，涡旋混匀后，加入0~3%NaOH水溶液5 mL，涡旋30 min，4 ℃条件下4000 r/min离心5 min后，取上清液；Ⅱ、固相萃取柱经过5 mL乙腈、5 mL纯净水依次润洗活化，取上清液2.5 mL用磷酸调节pH至2~9后注入固相萃取柱，待过柱液流出后用5 mL水淋洗2次，弃去淋洗液，甲醇洗脱并定容1~5mL，滤液通过0.22 μm滤膜进行过滤，以进行净化；所述定量检测通过HPLC-MS/MS上样分析，采用电喷雾电离源正离子多反应监测模式进行检测，采用溶剂匹配标准曲线外标法进行定量。

所述固相萃取柱采用PLS固相萃取柱，固相萃取技术在富集植物油中乙基麦芽酚的同时，还可以除去提取液中的的无机酸、无机碱、色素、残留油脂，从而达到减小基体干扰的目的，固相萃取柱的填料在其中起着至关重要的作用，本实验对填料为PLS、PWA、C18、弗罗里硅土的固相萃取柱进行筛选优化。乙基麦芽酚标准品配置成200 ng/mL的乙基麦芽酚水溶液，取1 mL分别注入PLS、PWA、C18、弗罗里硅土固相萃取柱，5 mL甲醇洗脱，结果如图1所示，PLS固相萃取柱的柱回收最高，PLS固相萃取柱其材料为含亲水基团的聚苯乙烯/二乙烯基苯共聚物球形颗粒，具有亲水亲脂的特性，对酚类化合物具有良好的富集作用，因此本实验选用PLS固相萃取柱。

所述NaOH水溶液浓度为1.5%，乙基麦芽酚的具有类似于苯酚的吡喃酮羟基结构，在强碱性条件下其结构中的吡喃酮羟基解离，水溶性增强，借助这个特点可实现乙基麦芽酚与油脂分离，从而油脂中的乙基麦芽酚被提取到水溶液中。NaOH水溶液在提取植物油时，植物油密度较小，提取液在下层不利于转移，而植物油与二氯甲烷1:1（v/v）混合后，其密度会增大。该实验利用NaOH水溶液对植物油中的乙基麦芽酚进行提取，植物油样品在提取前需与等体积二氯甲烷混合。研究显示，2%NaOH（m/v）水溶液用于奶粉、豆浆中乙基麦芽酚的提取，具有良好的提取效果。本实验分别对提取液NaOH含量为0%、0.5%、1%、1.5%、2%、3%（m/v）的六个浓度进行优化，以乙基麦芽酚加标浓度约为500 μg/kg的芝麻油样品作为实验样品，结果如图2所示，提取液的NaOH浓度在0%~1.5%范围内，提取效率随着NaOH浓度增大而增大，达到1.5%后提取效率达到最大并进入平台期，因此提取液的NaOH浓度以1.5%为最优。

所述上清液2.5 mL用磷酸调节pH至4~7，1.5%的NaOH水溶液提取液呈强碱性，而乙基麦芽酚在酸性条件下稳定，PLS固相萃取柱的柱回收率也会受pH的影响，因此对样品提取液过固相萃取柱前的pH值进行优化非常有必要。仍以乙基麦芽酚加标浓度约为500 μg/kg的芝麻油样品作为实验样品，用磷酸调节其提取液pH值分别为2、3、4、5、7、9，其仪器相对响应如图3所示，在酸性及中性条件下，PLS固相萃取柱可实现对乙基麦芽酚的富集，pH值在4~7范围之内，乙基麦芽酚的回收率比较稳定并保持在最高水平，在碱性条件下回收率则较低，因此，过固相萃取柱前提取液的pH值应调节到4~7之间，基于这个pH范围比较广泛，日常样品检测中可用pH试纸代替酸度计对提取液的pH进行测定。

所述甲醇洗脱并定容2mL，样品提取液在净化过程中经过淋洗，分别用1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL甲醇进行洗脱，结果表明2 mL即可实现乙基麦芽酚的完全洗脱，因此选择洗脱体积为2 mL。

色谱条件：色谱柱：Kinetex-C18色谱柱（100 mmx-C18MS，2.6 mm）；柱温：40 ℃；进样量：2 μL；流动相A：含1%甲酸的水溶液；流动相B：甲醇溶液；梯度洗脱程序：0～0.2 min，80 %A；0.2～3 min，80%～20% A；3～4 min，20%～10% A；4～4.1 min，10%～80% A；4.1～9min，80% A；流速：0.25 mL/min；质谱条件：离子源：电喷雾正离子源（ESI+）；毛细管电压：3.00 kV；锥孔电压：35.00 V；离子源温度：150 ℃；干燥气温度：500 ℃；干燥气流速：1000L/h（氮气）；锥孔气流速：1 L/h（氮气）；碰撞气：氩气；采集模式：多反应监测（MRM）模式，以获得最佳的质谱采集参数，提高仪器灵敏度，对乙基麦芽酚的前体离子、产物离子、碎裂电压、碰撞能量进行优化，具体参数见表1。

表1 乙基麦芽酚的保留时间和质谱参数

当采用电喷雾电离源时，样品基质的存在会对目标物的电离产生抑制或增强的作用，即基质效应。基质效应的存在会相应的影响所建方法的性能参数，例如定量限、线性、精密度等。将100 μL 1000 ng/mL的乙基麦芽酚标准品在25 ℃水浴条件下氮气吹干，分别用1mL甲醇和基质液复溶，以乙基麦芽酚在基质中的信号峰面积与在溶剂标准溶液中的信号峰面积比值计算基质效应，并与BJS 201708检测方法的基质效应做了对比，见表2。

表2乙基麦芽酚的在不同种类植物油中的基质效应和相对标准偏差（n=3）

结果表明，乙基麦芽酚在橄榄油、菜籽油、花生油、葵花油、大豆油和玉米油中基质效应不明显，在芝麻油中的基质效应较为明显，利用该实验的前处理方法能明显降低芝麻油的基质效应，故而，采用芝麻油进行线性关系与定量限的试验。

在芝麻油的线性关系与定量限试验中，将乙基麦芽酚标准品用甲醇配置成浓度分别为6.25 ng/mL、12.5 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL的标准溶液，在6.25 ng/mL-100 ng/mL 5个点线性范围内，乙基麦芽酚质谱响应（y）与浓度（x）的线性关系为y =173113.8x +20059.8（R2>0.999）。在该实验中，以10倍信噪比（S/N=10）确定乙基麦芽酚的仪器定量限为1 ng/mL。芝麻油样品中存在乙基麦芽酚的本底，图4为一个芝麻油样品，2020-2021年风险监测及监督抽检中，芝麻油中乙基麦芽酚含量均在20.0 μg/kg以下（除去违法添加样品），芝麻油本底都会小于国家规定的方法限值(25.0 μg/kg)，乙基麦芽酚可能来自于芝麻油的原料本身或者加工过程，因此，该实验将方法定量限的仍确定为25.0 μg/kg，与BJS 201708方法保持一致。

最后，针对检测方法进行验证实验，该实验采用溶剂标准曲线-外标法定量，在空白芝麻油、菜籽油基质中添加乙基麦芽酚标准溶液进行回收率实验，添加水平分别为25 μg/kg、100 μg/kg、200 μg/kg，按照已经优化的方法进行前处理，每个添加水平重复6次，加标回收率和相对标准偏差见表3，从中可以看出乙基麦芽酚在芝麻油和菜籽油基质中3种不同添加水平下，回收率比较稳定，在82.9%~105.1%之间，相对标准偏差均小于5%，满足检测要求。

表3 乙基麦芽酚在芝麻油和菜籽油中的平均回收率和相对标准偏差

该实验建立了一种用于食用植物油中乙基麦芽酚的检测方法，前处理以1.5%NaOH水溶液为提取液，提取液经过磷酸调节pH至4~7，过PLS固相萃取柱进行净化，结果表明该方法在6.25 ng/mL-100 ng/mL浓度范围内线性关系良好（R2>0.999），方法定量限为25.0 μg/kg，在3个加标水平下的平均回收率为82.9%～105.1%，相对标准偏差小于5 %，重复性好；该方法能明显降低食用植物油的基质效应，溶剂标准曲线-外标法定量能实现对所有植物油样品中的乙基麦芽酚的定性定量检测。

以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种用于食用植物油中乙基麦芽酚的检测方法，其特征在于：包括样品前处理和定量检测，所述样品前处理包括以下步骤：Ⅰ、称取混合均匀的食用植物油1.00 g，加入1 mL二氯甲烷，涡旋混匀后，加入0.5~3%NaOH水溶液5 mL，涡旋30 min，4 ℃条件下4000 r/min离心5 min后，取上清液；Ⅱ、PLS固相萃取柱经过5 mL乙腈、5 mL纯净水依次润洗活化，取上清液2.5 mL用磷酸调节pH至2~7后注入PLS固相萃取柱，待过柱液流出后用5 mL水淋洗2次，弃去淋洗液，甲醇洗脱并定容1~5mL，滤液过滤，以进行净化，待HPLC-MS/MS上样分析；所述定量检测采用电喷雾电离源正离子多反应监测模式进行检测，采用溶剂匹配标准曲线外标法进行定量。

2.根据权利要求1所述的一种用于食用植物油中乙基麦芽酚的检测方法，其特征在于：所述NaOH水溶液浓度为1.5%。

3.根据权利要求1所述的一种用于食用植物油中乙基麦芽酚的检测方法，其特征在于：所述甲醇洗脱并定容2mL。

4.根据权利要求1所述的一种用于食用植物油中乙基麦芽酚的检测方法，其特征在于：色谱条件：色谱柱：Kinetex-C18色谱柱；柱温：40 ℃；进样量：2 μL；流动相A：含1%甲酸的水溶液；流动相B：甲醇溶液；梯度洗脱程序：0～0.2 min，80 %A；0.2～3 min，80%～20% A；3～4 min，20%～10% A；4～4.1 min，10%～80% A；4.1～9 min，80% A；流速：0.25 mL/min；质谱条件：离子源：电喷雾正离子源（ESI+）；毛细管电压：3.00 kV；锥孔电压：35.00 V；离子源温度：150 ℃；干燥气温度：500 ℃；干燥气采用氮气，流速为1000 L/h；锥孔气采用氮气，流速为1 L/h；碰撞气：氩气；采集模式：多反应监测（MRM）模式。