CN115368264A - 化合物、脂质体及其用途 - Google Patents

化合物、脂质体及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN115368264A
CN115368264A CN202210524125.9A CN202210524125A CN115368264A CN 115368264 A CN115368264 A CN 115368264A CN 202210524125 A CN202210524125 A CN 202210524125A CN 115368264 A CN115368264 A CN 115368264A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lipid
compound
peg
mol
optionally
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210524125.9A
Other languages
English (en)
Inventor
黄渊余
黄金宇
胡泊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Institute of Technology BIT
Original Assignee
Beijing Institute of Technology BIT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Institute of Technology BIT filed Critical Beijing Institute of Technology BIT
Publication of CN115368264A publication Critical patent/CN115368264A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/14—Esters of carboxylic acids, e.g. fatty acid monoglycerides, medium-chain triglycerides, parabens or PEG fatty acid esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0033—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being non-polymeric
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0041—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being polymeric
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C229/04—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C229/06—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton
    • C07C229/10—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton the nitrogen atom of the amino group being further bound to acyclic carbon atoms or to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings
    • C07C229/16—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton the nitrogen atom of the amino group being further bound to acyclic carbon atoms or to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings to carbon atoms of hydrocarbon radicals substituted by amino or carboxyl groups, e.g. ethylenediamine-tetra-acetic acid, iminodiacetic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C229/04—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C229/24—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having more than one carboxyl group bound to the carbon skeleton, e.g. aspartic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C229/04—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C229/26—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having more than one amino group bound to the carbon skeleton, e.g. lysine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/34—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by amino groups
    • C07C233/35—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by amino groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom
    • C07C233/36—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by amino groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom having the carbon atom of the carboxamide group bound to a hydrogen atom or to a carbon atom of an acyclic saturated carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C237/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups
    • C07C237/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C237/04—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C237/08—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to an acyclic carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明提供了一种化合物、脂质体、制备脂质体的方法、药物载体、药物组合物以及药物组合物在治疗或预防高血脂症及其相关疾病中的用途。所述化合物具有式(I)所示的结构，且可作为脂质体和药物载体，可负载带有负电的药物活性成分，并将药物活性成分送呈至细胞内并有效从内涵体中逃逸至胞浆，利于所负载的药物活性成分发挥药效，且具有毒性低和稳定性高等优点。

Description

化合物、脂质体及其用途
优先权信息
本申请要求申请日为2021年5月20日、国际申请号为PCT/CN2021/094937的PCT专利申请的优先权，并将其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地，涉及化合物、脂质体、药物载体及它们的用途、制备脂质体的方法、药物组合物及用途。
背景技术
核酸类分子，例如siRNA、mRNA等是非常有潜力的药物分子，他们需要进入细胞内发挥作用。然而核酸类分子本身是大分子量、高负电性、易降解的化合物，自身不能够进入细胞。因此需要合适的递送载体将其携带转染进入细胞，或体内组织中。
脂质体已经被证明是一种有效的核酸载体，由脂质体包裹的siRNA药物Onpattro已经上市。随着核酸类药物，特别是siRNA药物、mRNA药物等研究的进展，对核酸药物载体的具有持续研究需求，包括研究靶向不同细胞类型和组织类型的脂质体，更好的保护核酸不被酶降解，或更好的在细胞内释放的脂质体，更低毒性，易于生物降解的脂质体等。
因此，需要研发一种稳定性高、毒性低、易于生物降解的脂质体。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种化合物，其为式(I)所示化合物或式(I)所示化合物的立体异构体、互变异构体、溶剂化物、药学上可接受的盐，
Figure RE-GDA0003815960700000011
其中，X、Y、R1、R2、R3具有如本发明所述定义。
根据本发明的实施例，各X和Y分别各自独立地选自-CH2-或-CO-；X和Y不同时为-CH2-或-CO-，其中，各X相同或不同，各Y相同或不同；R2选自H、任意取代的C1-C20烷基、任意取代的C1-C20 烯基或任意取代的C1-C20炔基；R3选自H、任意取代的C1-C20烷基、任意取代的C1-C20烯基或任意取代的C1-C20炔基，其中，取代基团各自独立地选自H、F、Cl、Br、CN、NO2；R1选自
Figure RE-GDA0003815960700000012
Figure RE-GDA0003815960700000013
其中n为选自0-10的整数，Z选自
Figure RE-GDA0003815960700000014
R4选自任意取代的C4-C20 烷基、任意取代的C4-C20烯基或任意取代的C4-C20炔基，其中，取代基团各自独立地选自H、F、Cl、 Br、CN、NO2。
根据本发明的实施例，R2选自H、任意取代的C1-C20烷基、任意取代的C1-C20烯基、任意取代的C1-C20炔基或R1，R3选自H、任意取代的C1-C20烷基、任意取代的C1-C20烯基、任意取代的C1-C20 炔基或R1，其中，取代的基团各自独立地选自H、F、Cl、Br、CN、NO2。
根据本发明的实施例，R2选自H、CH3-或R1；R3选自H或R1；R1选自
Figure RE-GDA0003815960700000015
Figure RE-GDA0003815960700000016
其中n为选自1-5的整数，Z选自
Figure RE-GDA0003815960700000017
R4选自C4-C20烷基、C4-C20 烯基或C4-C20炔基，其中，所述C4-C20烯基含有1-3个双键，所述C4-C20炔基含有1-3个三键。
根据本发明的实施例，R4选自C5-C15烷基、C5-C15烯基，其中，所述C5-C15烯基含有1-3个双键。
根据本发明的实施例，R1、R2和R3相同；R4选自C10-C15烷基、C10-C15烯基，其中，所述C10-C15 烯基含有1-3个双键。
根据本发明的实施例，所述化合物具有以下其中之一的结构：
Figure RE-GDA0003815960700000021
根据本发明的实施例，化合物骨架包含4个胺基的骨架主链结构和多个支链烷基或取代烷基结构。在骨架主链上，各个胺基由烷基或酰基连接，其中至少有两个酰基，这降低了化合物的碱性，降低了烷胺基碱性对支链包含的酯基的化学稳定性影响，并且降低了化合物的正电性，有利于降低脂质体所带的正电性，同时，酰胺键增强了在体内的可代谢性，避免化合物在体内的蓄积。此外，发明人经过大量实验发现，若骨架主链结构中含有四个酰胺基，即为该骨架主链结构中没有烷氨基，会导致其电性大幅降低，使其与核酸结合能力变弱，对核酸负载力变差。
在本发明的第二方面，本发明提出了上述化合物在制备脂质体中的用途。根据本发明的实施例，上述化合物为含胺脂质化合物，具有可离子化性质，可用于制备脂质体。
根据本发明的实施例，上述化合物可以聚合物形式制备脂质体；上述化合物可与其他物质形成共价连接制备脂质体；上述化合物可与其他物质发生化学反应制备脂质体。根据本发明的实施例，上述化合物制备脂质体的具体方式不受限制，使用上述化合物制备脂质体，脂质体中含有上述化合物全部或部分结构即视为本发明的用途。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种脂质体。根据本发明实施例的脂质体由本发明第一方面所提出的化合物制成，脂质体可以通过脂质双分子层的流动作用将加入的待负载物质包裹在内，包封效果良好，可使负载物质有效进入细胞并从内涵体中逃逸至胞浆。
根据本发明的实施例，上述化合物可与疏水性脂质和/或双亲性脂质通过自组装形成脂质体。
根据本发明的实施例，脂质体进一步包括疏水性脂质、双亲性脂质、缓冲试剂和/或有机溶剂，所述双亲性脂质包括选自中性脂质、阳离子脂质和PEG-脂质的至少之一，所述疏水性脂质包括固醇。
根据本发明的实施例，所述中性脂质包括选自下列至少之一：二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、磷脂酰胆碱(POPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)、焦碳酸二乙酯(DEPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)和蛋黄卵磷脂(EPC)。
根据本发明的实施例，所述阳离子脂质选自下列至少之一：溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵 (DOTAP)、氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵(DOTMA)、双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB)、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵(DOSPA)、溴化三甲基十二烷基铵 (DTAB)、溴化三甲基十四烷基铵(TTAB)、溴化三甲基十六烷基铵(CTAB)、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油酰氧基丙基铵(DORI)、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油烯氧基丙基铵(DORIE)、溴化二甲基-3-羟丙基-2,3-二油烯氧基丙基铵(DORIE-HP)、溴化二甲基-4-羟丁基-2,3-二油烯氧基丙基铵 (DORIE-HB)、溴化二甲基-5-羟戊基-2,3-二油烯氧基丙基铵(DORIE-HPc)、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3- 双十六烷氧基丙基铵(DPRIE)、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十八烷氧基丙基铵(DSRIE)、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十四烷氧基丙基铵(DMRIE)、N-(2-精胺甲酰基)-N’,N’-双十八烷基甘氨酰胺(DOGS)、 1，2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯(DOSC)、3β-[N-(N’,N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇 (DC-Chol)、脂质多聚-L-赖氨酸(LPLL)、硬脂铵(SA)。
根据本发明的实施例，所述PEG-脂质包括选自下列至少之一：二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-PEG (DPPE-PEG)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-PEG(DSPE-PEG)、二肉豆蔻基甘油-PEG(DMG-PEG)和二甲基丙烯酸酯-PEG(DMA-PEG)。
根据本发明的实施例，所述固醇为胆固醇。
根据本发明的实施例，所述缓冲试剂为酸性缓冲试剂。
根据本发明的实施例，所述缓冲试剂包括选自柠檬酸、柠檬酸钠、醋酸、醋酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、三羟甲基氨基甲烷-盐酸、磷酸二氢钾-氢氧化钠、硼酸-硼砂、甘氨酸-盐酸、邻苯二甲酸-盐酸、邻苯二甲酸氢钾和磷酸二氢钠-柠檬酸的至少之一。
根据本发明的实施例，所述有机溶剂包括选自甲醇、乙醇、异丙醇、苯、甲苯、二甲苯、戊烷、己烷、辛烷、环己烷、环己酮、甲苯环己酮、氯苯、二氯苯、二氯甲烷、乙醚、环氧丙烷、丙酮、甲基丁酮、甲基异丁酮、乙腈、吡啶、苯酚、苯乙烯、全氯乙烯、三氯乙烯、乙烯乙二醇醚和三乙醇胺的至少之一。
根据本发明的实施例，基于所述脂质体，所述化合物的量为3～80％mol/mol。
根据本发明的实施例，基于所述脂质体，所述化合物的量为20～80％mol/mol。
根据本发明的实施例，所述化合物、中性脂质、固醇和PEG-脂质的摩尔比为(20～80)：(5～50)： (10～60)：(0.2～20)。
根据本发明的实施例，所述化合物、中性脂质、固醇和PEG-脂质的摩尔比为(40～61)：(8～20)： (30～60)：(0.5～5)。
根据本发明的实施例，所述化合物、固醇和PEG-脂质的摩尔比为(20～80)：(5～50)：(10～60)。
根据本发明的实施例，所述化合物、固醇和PEG-脂质的摩尔比为(40～70)：(5～20)：(20～40)。
根据本发明的实施例，基于所述脂质体，所述化合物的量为3～50％mol/mol。
根据本发明的实施例，所述化合物、中性脂质、固醇、PEG-脂质和阳离子脂质的摩尔比为(3～50)： (1～20)：(2～50)：(0.01～10)：(5～92)。
根据本发明的实施例，所述化合物、中性脂质、固醇、PEG-脂质和阳离子脂质的摩尔比为(3～41)： (1～12)：(2～45)：(0.05～2)：(10～90)。
根据本发明的实施例，基于所述脂质体，所述缓冲试剂的体积为50～90％v/v。
根据本发明的实施例，基于所述脂质体，所述缓冲试剂的体积为75％v/v。
根据本发明的实施例，采用上述配比的脂质体，转染效率高，包封效果好，药物呈递能力强。
根据本发明的实施例，基于所述脂质体，所述化合物的量为20～80％mol/mol；所述化合物、中性脂质、固醇和PEG-脂质的摩尔比为(20～80)：(5～50)：(10～60)：(0.2～20)；基于所述脂质体，所述缓冲试剂的体积为75％v/v。
根据本发明的实施例，基于所述脂质体，所述化合物的量为20～80％mol/mol；所述化合物、固醇和 PEG-脂质的摩尔比为(20～80)：(5～50)：(10～60)；基于所述脂质体，所述缓冲试剂的体积为75％v/v。
根据本发明的实施例，基于所述脂质体，所述化合物的量为3～50％mol/mol；所述化合物、中性脂质、固醇、PEG-脂质和阳离子脂质的摩尔比为(3～50)：(1～20)：(2～50)：(0.01～10)：(5～92)；基于所述脂质体，所述缓冲试剂的体积为75％v/v。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种制备上述脂质体的方法。根据本发明的实施例，包括：将预定量的本发明第一方面所提出的化合物与有机溶剂混合，以便获得所述脂质体。根据本发明的实施例，将所述化合物溶于有机溶剂中利于脂质体形成。
根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：将预定量脂质溶解于上述有机溶液后与缓冲试剂混合，以便获得所述脂质体。根据本发明的实施例，基于所述脂质体，所述化合物的量为20～80％mol/mol；所述化合物、中性脂质、固醇和PEG-脂质的摩尔比为(20～80)：(5～50)：(10～60)：(0.2～20)；基于所述脂质体，所述缓冲试剂的体积为75％v/v。根据本发明的实施例，基于所述脂质体，所述化合物的量为20～80％mol/mol；所述化合物、固醇和PEG-脂质的摩尔比为(20～80)：(5～50)：(10～60)；基于所述脂质体，所述缓冲试剂的体积为75％v/v。根据本发明的实施例，基于所述脂质体，所述化合物的量为4～50％mol/mol；所述化合物、中性脂质、固醇、PEG-脂质和阳离子脂质的摩尔比为(3～50)： (1～20)：(2～50)：(0.01～10)：(5～92)；基于所述脂质体，所述缓冲试剂的体积为75％v/v。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种药物载体，包括在本发明第一方面所提出的化合物或本发明第三方面提出的脂质体。根据本发明的实施例，所述化合物为可离子化含胺脂质，所述药物载体为可离子化载体，可负载带有负电或呈疏水性的药物，并将药物送呈至细胞内并有效从内涵体中逃逸至胞浆，利于所负载的药物药效发挥。
在本发明的第六方面，本发明提出了本发明第一方面所提出的化合物、本发明第三方面提出的脂质体或本发明第五方面所提出的药物载体在制备药物中的用途。
在本发明的第七方面，本发明提出了一种药物组合物，所述药物组合物含有载体和药物活性成分，其中，所述载体包括本发明第五方面所提出的药物载体。根据本发明的实施例，所述药物载体为可离子化载体，可负载带有负电或呈疏水性的药物活性成分，并将药物活性成分送呈至细胞内并有效从内涵体中逃逸至胞浆，利于所负载的药物活性成分发挥药效。
根据本发明的实施例，所述药物活性成分包括选自下列至少之一：DNA分子、RNA分子、蛋白、多肽和小分子药物。
根据本发明的实施例，所述药物活性成分带有负电性或呈疏水性。根据本发明的实施例，所述药物载体中含有可离子化含胺脂质，在特定pH下带有正电性，可与带有负电性的药物活性成分结合，此外，还可以通过脂质双分子层的流动作用药物活性成分包裹在内，送呈至细胞中。
根据本发明的实施例，所述药物活性成分含有核酸。根据本发明的实施例，所述药物活性成分含有 DNA、RNA、核酸-蛋白复合物、核酸-脂质复合物、核酸-核素复合物等，所述核酸类型不受特别限制。
根据本发明的实施例，所述载体与所述药物活性成分的质量比为(5～50)：1；优选为，所述载体与所述药物活性成分的质量比为(5～40)：1。
根据本发明的实施例，所述载体与所述药物活性成分的质量比为(8～20)：1。
根据本发明的实施例，所述载体所述药物活性成分的质量比为15：1。
在本发明的第八方面，本发明提出了一种转染复合物，其特征在于，所述转染复合物包含上述化合物或上述脂质体。
根据本发明的实施例，所述转染复合物包含至少一种生物活性剂。
根据本发明的实施例，所述生物活性剂包括选自下列至少之一：DNA分子、RNA分子、蛋白、多肽和药物。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明实施例的凝胶阻滞实验结果；
图2是根据本发明实施例的siA4-13的制剂在4℃下的稳定性结果；
图3是根据本发明实施例的Cy-siFLA4-13在C57BL/6小鼠体内的分布的定量数据；
图4是根据动物接受本发明实施例的不同浓度的siA4-13制剂后或不同时间点ApoB mRNA表达变化以及CHO、TG、LDL-c、HDL-c水平变化，其中，图a为动物接受1mg/kg或3mg/kg siA4-13制剂后不同时间点的ApoB mRNA表达变化，图b为CHO、TG、LDL-c、HDL-c水平变化；
图5为根据本发明实施例的血清生化指标的变化；
图6为根据本发明实施例的siANA4-13在db/db小鼠体内的降血脂效果和ANGPTL3mRNA表达抑制能力；
图7为根据本发明实施例的不同治疗组动物肝脏的脂质沉积情况；
图8为根据本发明实施例的siApoCA4-13治疗以及停药4周内的降血脂效果和血脂变化；
图9为根据本发明实施例的不同配方脂质体介导的荧光素酶mRNA在细胞上表达结果；
图10为根据本发明实施例的mLuA4-13介导的荧光素酶mRNA在小鼠体内的表达结果；
图11为根据本发明实施例的mLuA4-13以及mLuDA4-1至mLuDA4-9在小鼠肺、肝、肾的表达；
图12为根据本发明实施例的A4-13包裹不同比例的GOx蛋白得到的siGA4-1至siGA4-9与等量的单独GOx的细胞杀伤能力对比；
图13为脂质E的化学结构；
图14为根据本发明实施例的脂质A4与脂质E在40摄氏度的稳定性测试结果；
图15为根据本发明实施例的A4-13与Lipofactamine 2000在C57小鼠体内的药效对比。
发明详细描述
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
现在详细描述本发明的某些实施方案，其实例由随附的结构式和化学式说明。本发明意图涵盖所有的替代、修改和等同技术方案，它们均包括在如权利要求定义的本发明范围内。本领域技术人员应认识到，许多与本发明所述类似或等同的方法和材料能够用于实践本发明。本发明绝不限于本发明所述的方法和材料。在所结合的文献、专利和类似材料的一篇或多篇与本申请不同或相矛盾的情况下(包括但不限于所定义的术语、术语应用、所描述的技术，等等)，以本申请为准。
应进一步认识到，本发明的某些特征，为清楚可见，在多个独立的实施方案中进行了描述，但也可以在单个实施例中以组合形式提供。反之，本发明的各种特征，为简洁起见，在单个实施方案中进行了描述，但也可以单独或以任意适合的子组合提供。
除非另外指出，本发明所使用的技术和科学术语与本发明所属技术领域技术人员的常规理解具有相同的含义，除非另外指出，在本发明公开全部内容所引用的所有专利公开出版物通过引用方式将其整体并入本发明。
本发明将应用以下定义除非其他方面表明。根据本发明的目的，化学元素根据元素周期表，CAS版本和化学药品手册,75,thEd,1994来定义。另外，有机化学一般原理见“Organic Chemistry”,Thomas Sorrell, University Science Books,Sausalito:1999,and“March's Advanced Organic Chemistry”,by Michael B.Smith and Jerry March,John Wiley&Sons,New York:2007，因此本发明所有的内容都融合了参考文献。
在本文中，“脂质体”或“脂质纳米颗粒(LNP)”指以生物相容的脂质材料作为载体，将药物或其它的生物活性物质溶解或包裹于脂质核或吸附、附着于纳米粒子表面的载药系统。
本发明还包括同位素标记的本发明化合物，其除以下事实外与本发明所述的那些化合物相同：一个或多个原子被原子质量或质量数不同于天然常见原子质量或质量数的原子代替。还可引入本发明化合物中的示例性同位素包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，如2H、3H、13C、14C、15N、16O、17O、31P、32P、36S、18F和37Cl。
包含前述同位素和/或其他原子的其他同位素的本发明化合物以及所述化合物的药学上可接受的盐都包括在本发明范围内。同位素标记的本发明化合物，例如放射性同位素，如3H和14C掺入到本发明化合物中可用于药物和/或底物组织分布分析。由于易于制备以及检测，氚代的，即3H，以及碳-14，即14C，同位素特别优选。此外，用重的同位素，如氘，即2H取代，可提供一些源自更大的代谢稳定性的治疗上的优势，例如增加的体内半衰期或减少的剂量需求。因此，在一些情形下可能是优选的。
本发明使用的立体化学定义和惯例大体上按照S.P.Parker，Ed.，McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book Company，New York；andEliel，E.and Wilen，S.，“Stereochemistry of Organic Compounds”，John Wiley&Sons，Inc.，New York，1994。本发明化合物可含有不对称中心或手性中心，因此以不同的立体异构形式存在。所预期的是，本发明化合物的所有立体异构形式，包括但不限于非对映异构体、对映异构体和阻转异构体(atropisomer)及它们的混合物如外消旋混合物，也包含在本发明范围之内。许多有机化合物以光学活性形式存在，即它们具有使平面偏振光的平面发生旋转的能力。当描述具有光学活性的化合物时，使用前缀D和L或R和S来表示就分子中的手性中心(或多个手性中心) 而言分子的绝对构型。前缀d和l或(+)和(-)是用于指定化合物所致平面偏振光旋转的符号，其中(-)或l 表示化合物是左旋的。前缀为(+)或d的化合物是右旋的。就给定的化学结构而言，除了这些立体异构体互为镜像外，这些立体异构体是相同的。具体的立体异构体也可称为对映异构体，并且所述异构体的混合物通常称作对映异构体的混合物。对映异构体的50：50混合物称为外消旋混合物或外消旋体，当在化学反应或方法中没有立体选择性或立体特异性时，可出现所述外消旋混合物或外消旋体。
依据原料和方法的选择，本发明化合物可以以可能的异构体中的一个或它们的混合物的形式存在，例如作为纯旋光异构体，或作为异构体混合物，如作为外消旋和非对应异构体混合物，这取决于不对称碳原子的数量。旋光性的(R)-或(S)-异构体可使用手性合成子或手性制剂制备，或使用常规技术拆分。如果此化合物含有一个双键，取代基可能为E或Z构型；如果此化合物中含有二取代的环烷基，环烷基的取代基可能为顺式或反式(cis-或trans-)构型。
本发明化合物可以含有不对称中心或手性中心，因此以不同的立体异构体形式存在。所预期的是，本发明化合物的所有立体异构体形式，包括但不限于非对映异构体、对映异构体和阻转异构体 (atropisomer)和几何(或构象)异构体及它们的混合物，如外消旋混合物，均在本发明的范围之内。
除非另外指出，本发明描述的结构还表示包括此结构的所有异构体(如，对映体、非对映体阻转异构体(atropisomer)和几何(或构象))形式；例如，各不对称中心的R和S构型，(Z)和(E)双键异构体，以及 (Z)和(E)构象异构体。因此，本发明化合物的单个立体化学异构体以及对映体混合物、非对映体混合物和几何异构体(或构象异构体)混合物均在本发明的范围之内。
术语“互变异构体”或“互变异构形式”是指具有不同能量的可通过低能垒(lowenergy barrier)互相转化的结构异构体。若互变异构是可能的(如在溶液中)，则可以达到互变异构体的化学平衡。例如，质子互变异构体(protontautomer)(也称为质子转移互变异构体(prototropic tautomer))包括通过质子迁移来进行的互相转化，如酮-烯醇异构化和亚胺-烯胺异构化。价键互变异构体(valence tautomer)包括通过一些成键电子的重组来进行的互相转化。酮-烯醇互变异构的具体实例是戊烷-2,4-二酮和4-羟基戊-3-烯-2-酮互变异构体的互变。互变异构的另一个实例是酚-酮互变异构。酚-酮互变异构的一个具体实例是吡啶-4-醇和吡啶-4(1H)-酮互变异构体的互变。除非另外指出，本发明化合物的所有互变异构体形式都在本发明的范围之内。
本发明所使用的“氮氧化物”是指当化合物含几个胺官能团时，可将1个或大于1个的氮原子氧化形成N-氧化物。N-氧化物的特殊实例是叔胺的N-氧化物或含氮杂环氮原子的N-氧化物。可用氧化剂例，如过氧化氢或过酸(例如过氧羧酸)处理相应的胺形成N-氧化物(参见Advanced Organic Chemistry,Wiley Interscience,第4版,Jerry March,pages)。尤其是，N-氧化物可用L.W.Deady的方法制备(Syn.Comm.1977, 7,509-514)，其中例如在惰性溶剂，例如二氯甲烷中，使胺化合物与间-氯过苯甲酸(MCPBA)反应。
本发明的“溶剂化物”是指一个或多个溶剂分子与本发明的化合物所形成的缔合物。形成溶剂化物的溶剂包括，但并不限于，水、异丙醇、乙醇、甲醇、二甲亚砜、乙酸乙酯、乙酸、氨基乙醇。术语“水合物”是指溶剂分子是水所形成的缔合物。
本发明所使用的“药学上可接受的盐”是指本发明的化合物的有机盐和无机盐。药学上可接受的盐在所属领域是为我们所熟知的，如文献：S.M.Berge et al.,describepharmaceutically acceptable salts in detail in J.Pharmaceutical Sciences,1977,66：1-19.所记载的。药学上可接受的无毒的酸形成的盐包括但并不限于，与氨基基团反应形成的无机酸盐(如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、高氯酸盐)，和有机酸盐(如乙酸盐、草酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、丙二酸盐)，或通过书籍文献上所记载的其他方法如离子交换法来得到这些盐。其他药学上可接受的盐包括己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、重硫酸盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊基丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、反丁烯二酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡萄糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐，等等。通过适当的碱得到的盐包括碱金属，碱土金属，铵和N+(C1-4烷基)4的盐。本发明也拟构思了任何所包含N的基团的化合物所形成的季铵盐。水溶性或油溶性或分散产物可以通过季铵化作用得到。碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁、等等。药学上可接受的盐进一步包括适当的、无毒的铵，季铵盐和抗平衡离子形成的胺阳离子，如卤化物，氢氧化物，羧化物，硫酸化物，磷酸化物，硝酸化物，C1-8磺酸化物和芳香磺酸化物。
本发明化合物的任何不对称原子(例如，碳等)都可以以外消旋或对映体富集的形式存在，例如(R)-、 (S)-或(R,S)-构型形式存在。在某些实施方案中，各不对称原子在(R)-或(S)-构型方面具有至少50％对映体过量，至少60％对映体过量，至少70％对映体过量，至少80％对映体过量，至少90％对映体过量，至少95％对映体过量，或至少99％对映体过量。如果可能的话，具有不饱和双键的原子上的取代基可以以顺式-(Z)-或反式-(E)-形式存在。
因此，如本发明所描述的那样，本发明的化合物可以以可能的异构体、旋转异构体、阻转异构体、互变异构体中的一种形式或其混合物的形式存在，例如为基本纯的几何(顺式或反式)异构体、非对映异构体、光学异构体(对映体)、外消旋体或其混合物形式。
可以根据组分的物理化学差异将所得的任何异构体混合物分离成纯或基本纯的几何或光学异构体、非对映异构体、外消旋体，例如通过色谱法和/或分步结晶来进行分离。
可以用已知的方法将任何所得终产物或中间体的外消旋体通过本领域技术人员熟悉的方法拆分成光学对映体，如，通过对获得的其非对映异构的盐进行分离。外消旋的产物也可以通过手性色谱来分离，如，使用手性吸附剂的高压液相色谱(HPLC)。特别地，对映异构体可以通过不对称合成制备(如，Jacques, et al.,Enantiomers,Racemates andResolutions(Wiley Interscience,New York,1981)；Principles of AsymmetricSynthesis(2nd Ed.Robert E.Gawley,Jeffrey Aubé,Elsevier,Oxford,UK,2012)；Eliel,E.L. Stereochemistry of Carbon Compounds(McGraw-Hill,NY,1962)；and Wilen,S.H.Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p.268(E.L.Eliel,Ed.,Univ.of Notre Dame Press,Notre Dame,IN 1972)。
像本发明所描述的，本发明的化合物可以任选地被一个或多个取代基所取代，如上面的通式化合物，或者像实施例里面特殊的例子，子类，和本发明所包含的一类化合物。应了解“任选取代的”这个术语与“取代或非取代的”这个术语可以交换使用。术语“任选地”，“任选的”或“任选”是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。一般而言，术语“任选地”不论是否位于术语“取代的”之前，都表示所给结构中的一个或多个氢原子被具体取代基所取代。除非其他方面表明，一个任选的取代基团可以在基团各个可取代的位置进行取代。当所给出的结构式中不只一个位置能被选自具体基团的一个或多个取代基所取代，那么取代基可以相同或不同地在各个位置取代。其中所述的取代基可以是，但并不限于，F、Cl、Br、CN、 N3、OH、NH2、NO2、氧代(＝O)等。
术语“N3”表示一个叠氮结构。这种基团可以与其他基团相连接，例如，可与一个甲基相连形成叠氮甲烷(MeN3)，或者与一个苯基相连形成叠氮苯(PhN3)。
另外，需要说明的是，除非以其他方式明确指出，在本发明中所采用的描述方式“各…独立地为”与“…各自独立地为”和“…独立地为”可以互换，均应做广义理解，其既可以是指在不同基团中，相同符号之间所表达的具体选项之间互相不影响，也可以表示在相同的基团中，相同符号之间所表达的具体选项之间互相不影响。
在本说明书的各部分，本发明公开化合物的取代基按照基团种类或范围公开。特别指出，本发明包括这些基团种类和范围的各个成员的每一个独立的次级组合。例如，术语“C1-6烷基”特别指独立公开的甲基，乙基，C3烷基，C4烷基，C5烷基和C6烷基。
在本发明的各部分，描述了连接取代基。当该结构清楚地需要连接基团时，针对该基团所列举的马库什变量应理解为连接基团。例如，如果该结构需要连接基团并且针对该变量的马库什基团定义列举了“烷基”或“芳基”，则应该理解，该“烷基”或“芳基”分别代表连接的亚烷基基团或亚芳基基团。
本发明使用的术语“烷基”或“烷基基团”，表示含1-20个碳原子的饱和直链或支链的一价碳氢化合物原子团。除非另外详细说明，烷基基团含有1-20个碳原子，其中一些实施例是，烷基基团含有1-10个碳原子，另外一些实施例是，烷基基团含有1-9个碳原子；另外一些实施例是，烷基基团含有1-8个碳原子，另外一些实施例是，烷基基团含有1-6个碳原子，另外一些实施例是，烷基基团含有1-4个碳原子，另外一些实施例是，烷基基团含有1-3个碳原子，另外一些实施例是，烷基基团含有10-20个碳原子，另外一些实施例是，烷基基团含有10-18个碳原子，另外一些实施例是，烷基基团含有10-16个碳原子，另外一些实施例是，烷基基团含有10-14个碳原子，另外一些实施例是，烷基基团含有10-13个碳原子。
烷基基团的实例包含，但并不限于，甲基(Me，-CH3)、乙基(Et，-CH2CH3)、正丙基(n-Pr，-CH2CH2CH3)、异丙基(i-Pr，-CH(CH3)2)、正丁基(n-Bu，-CH2CH2CH2CH3)、异丁基(i-Bu，-CH2CH(CH3)2)、仲丁基(s-Bu， -CH(CH3)CH2CH3)、叔丁基(t-Bu，-C(CH3)3)、正戊基(-CH2CH2CH2CH2CH3)，2-戊基 (-CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊基(-CH(CH2CH3)2)、2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)、3-甲基-2-丁基 (-CH(CH3)CH(CH3)2)、3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)、2-甲基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)、正己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))、 2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)、4-甲基-2-戊基 (-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)、3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、 2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)、3,3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3)、正庚基、正辛基等等，其中所述烷基基团可以独立地未被取代或被一个或多个本发明所描述的取代基所取代。
本发明所使用的术语“烷基”和其前缀“烷”，都包含直链和支链的饱和碳链。
术语“烯基”表示2-20个碳原子，或2-18个碳原子，或2-16个碳原子，或2-12个碳原子，或2-8个碳原子，或2-6个碳原子，或2-4个碳原子的直链或支链的一价烃基，其中至少一个位置C-C为sp2双键不饱和状态，其中链烯基的基团可以独立地未被取代或被一个或多个本发明所描述的取代基所取代，包括基团有“顺”“反”或"Z""E"的定位，其中具体的实例包括，但并不限于，乙烯基(-CH＝CH2)，烯丙基 (-CH2CH＝CH2)等等。
术语“炔基”表示2-20个碳原子，或2-18个碳原子，或2-16个碳原子，或2-12个碳原子，或2-8个碳原子，或2-6个碳原子，或2-4个碳原子的直链或支链的一价烃基，其中至少一个位置C-C为sp三键不饱和状态，其中炔基基团可以独立地未被取代或被一个或多个本发明所描述的取代基所取代，具体的实例包括，但并不限于，乙炔基(-C≡CH)、炔丙基(-CH2C≡CH)、1-丙炔基(-C≡C-CH3)等等。
术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
如本发明所述，术语“药学上可接受的载体”包括任何溶剂，分散介质，包衣衣料，表面活性剂，抗氧化剂，防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)，等渗剂，盐，药物稳定剂，粘合剂，赋形剂，分散剂，润滑剂，甜味剂，调味剂，着色剂，或其组合物，这些载体都是所属技术领域技术人员的已知的(如 Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed.MackPrinting Company,1990,pp.1289-1329所述)。除了任意常规载体与活性成分不相容的情况外，涵盖其在治疗或药物组合物中的用途。
化合物
在本发明的第一方面，本发明提出了一种化合物，其为式(I)所示化合物或式(I)所示化合物的立体异构体、互变异构体、溶剂化物、药学上可接受的盐，
Figure RE-GDA0003815960700000081
其中，X、Y、R1、R2、R3具有如本发明所述定义。
在一些实施方案中，各X和Y分别各自独立地选自-CH2-或-CO-；X和Y不同时为-CH2-或-CO-，其中，各X相同或不同，各Y相同或不同；R2选自H、任意取代的C1-C20烷基、任意取代的C1-C20 烯基或任意取代的C1-C20炔基；R3选自H、任意取代的C1-C20烷基、任意取代的C1-C20烯基或任意取代的C1-C20炔基，其中，取代基团各自独立地选自H、F、Cl、Br、CN、NO2；R1选自
Figure RE-GDA0003815960700000082
Figure RE-GDA0003815960700000083
其中n为选自0-10的整数，Z选自
Figure RE-GDA0003815960700000084
R4选自任意取代的C4-C20 烷基、任意取代的C4-C20烯基或任意取代的C4-C20炔基，其中，取代基团各自独立地选自H、F、Cl、 Br、CN、NO2。
在一些实施方案中，R2选自H、CH3-或R1；R3选自H或R1；R1选自
Figure RE-GDA0003815960700000085
Figure RE-GDA0003815960700000086
其中n为选自1-5的整数，Z选自
Figure RE-GDA0003815960700000087
R4选自C4-C20烷基、C4-C20 烯基或C4-C20炔基，其中，所述C4-C20烯基含有1-3个双键，所述C4-C20炔基含有1-3个三键。
在一些实施方案中，R4选自C5-C15烷基、C5-C15烯基，其中，所述C5-C15烯基含有1-3个双键。
在一些实施方案中，R1、R2和R3相同；R4选自C10-C15烷基、C10-C15烯基，其中，所述C10-C15 烯基含有1-3个双键。
进一步地，所述化合物具有以下其中之一的结构：
Figure RE-GDA0003815960700000088
Figure RE-GDA0003815960700000091
本发明所述的化合物是指在一个大分子链上具有亲水头部和疏水尾部。其中，亲水头部可以是N1， N4-双(3-丙氨基)丁二酰胺(N1,N4-bis(3-aminopropyl)succinamide)或3,3'-(丁烷-1,4-二基(甲基拉扎二基)二丙酰胺(3,3'-(butane-1,4-diylbis(methylazanediyl))dipropanamide)或3,3'-(丁烷-1,4-二基二((2-羟丙基)偶氮二基)二丙酰胺(3,3'-(butane-1,4-diylbis((2-hydroxypropyl)azanediyl))dipropanamide)。疏水尾部可以是具有双键和/或酯键的直碳链，总链长可以为12、14、16、18个原子。本发明的化合物可以是亲水头部中的一种与疏水尾部中的一种或多种，按照1：1或1：2或1：3等多种比例形成的。
在一些实施方案中，疏水尾部具有下列化学结构至少之一：
Figure RE-GDA0003815960700000092
其中，式1中双键和酯键的位置可以变化，依据方便的原料易得性即可，总链长设定为16个原子或18个原子；式2中酯键的位置可以变化，依据方便的原料易得性即可，总链长设定为14、16个或18 个原子；式3中链长可以变化，可以为12、14、16、18(其中，12、14个原子更佳)。
在一些实施方案中，所述盐是指药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的”是指物质或组合物必须与包含制剂的其它成分和/或用其治疗的哺乳动物化学上和/或毒理学上相容。
本发明的化合物还包括这样的化合物的其他盐，该其他盐不一定是药学上可接受的盐，并且可以用作用于制备和/或提纯本发明的化合物和/或用于分离本发明的化合物的对映体的中间体。
可药用的酸加成盐可与无机酸和有机酸形成，例如乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、溴化物/氢溴酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、樟脑磺酸盐、氯化物/盐酸盐、氯茶碱盐、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、马尿酸盐、氢碘酸盐/碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘甲酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、十八酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、聚半乳糖酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、磺基水杨酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和三氟乙酸盐。
可以由其衍生得到盐的无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。
可以由其衍生得到盐的有机酸包括例如乙酸、丙酸、羟基乙酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、磺基水杨酸等。
可药用碱加成盐可与无机碱和有机碱形成。
可以由其衍生得到盐的无机碱包括，例如铵盐和周期表的I族至XII族的金属。在某些实施方案中，该盐衍生自钠、钾、铵、钙、镁、铁、银、锌和铜；特别适合的盐包括铵、钾、钠、钙和镁盐。
可以由其衍生得到盐的有机碱包括伯胺、仲胺和叔胺、取代的胺包括天然存在的取代的胺、环状胺、碱性离子交换树脂等。某些有机胺包括，例如，异丙胺、苄星青霉素(benzathine)、胆碱盐(cholinate)、二乙醇胺、二乙胺、赖氨酸、葡甲胺(meglumine)、哌嗪和氨丁三醇。
本发明的可药用盐可以用常规化学方法由母体化合物、碱性或酸性部分来合成。一般而言，该类盐可以通过使这些化合物的游离酸形式与化学计量量的适宜碱(如Na、Ca、Mg或K氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐等)反应，或者通过使这些化合物的游离碱形式与化学计量量的适宜酸反应来进行制备。该类反应通常在水或有机溶剂或二者的混合物中进行。一般地，在适当的情况中，需要使用非水性介质如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。在例如“Remington′s Pharmaceutical Sciences”，第20版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，(1985)；和“药用盐手册：性质、选择和应用(Handbook of PharmaceuticalSalts：Properties，Selection，and Use)”，Stahl and Wermuth(Wiley-VCH，Weinheim，Germany，2002)中可找到另外一些适宜盐的列表。
而且，本发明化合物、包括其盐也可以以其水合物形式获得，或者包括其他用于其结晶的溶剂。本发明化合物可以固有地或通过设计形成具有可药用溶剂(包括水)的溶剂化物；因此，本发明意在包括溶剂化的和未溶剂化的形式。
本发明给出的任何结构式也意欲表示这些化合物未被标记的形式以及同位素标记的形式。同位素标记的化合物具有本发明给出的通式描绘的结构，除了一个或多个原子被具有所选择原子量或质量数的原子替换。可引入本发明化合物中的示例性同位素包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，如2H、3H、11C、13C、14C、15N、18F、31P、32P、36S、37Cl或125I。
另一方面，本发明所述化合物包括用各种同位素标记的本发明所定义的化合物，例如，其中存在放射性同位素，如3H、14C和18F的那些化合物，或者其中存在非放射性同位素，如2H和13C。该类同位素标记的化合物可用于代谢研究(使用14C)、反应动力学研究(使用例如2H或3H)、检测或成像技术，如正电子发射断层扫描术(PET)或包括药物或底物组织分布测定的单光子发射计算机断层成像术(SPECT)，或可用于患者的放疗中。18F标记的化合物对PET或SPECT研究而言是特别理想的。同位素标记的式(I) 化合物可以通过本领域技术人员熟悉的常规技术或本发明中的实施例和制备过程所描述使用合适的同位素标记试剂替代原来使用过的未标记试剂来制备。
此外，较重同位素特别是氘(即，2H或D)的取代可提供某些治疗优点，这些优点是由代谢稳定性更高带来的。例如，体内半衰期增加或剂量需求降低或治疗指数得到改善带来的。应当理解，这一上下文中的氘被看做式(I)化合物的取代基。可以用同位素富集因子来定义该类较重同位素特别是氘的浓度。本发明所使用的术语“同位素富集因子”是指所指定同位素的同位素丰度和天然丰度之间的比例。如果本发明化合物的取代基被指定为氘，该化合物对各指定的氘原子而言具有至少3500(各指定氘原子处52.5％的氘掺入)、至少4000(60％的氘掺入)、至少4500(67.5％的氘掺入)，至少5000(75％的氘掺入)，至少 5500(82.5％的氘掺入)、至少6000(90％的氘掺入)、至少6333.3(95％的氘掺入)、至少6466.7(97％的氘掺入)、至少6600(99％的氘掺入)或至少6633.3(99.5％的氘掺入)的同位素富集因子。本发明可药用的溶剂化物包括其中结晶溶剂可以是同位素取代的例如D2O、丙酮-d6、或DMSO-d6的那些溶剂化物。
脂质体及制备方法
本发明提出了一种脂质体。根据本发明实施例的脂质体由本发明第一方面所提出的化合物制成，脂质体可以通过脂质双分子层的流动作用将加入的待负载物质包裹在内，包封效果良好，可使负载物质有效进入细胞并从内涵体中逃逸至胞浆。
上述化合物可与疏水性脂质通过自组装形成脂质体。
在一些实施方案中，脂质体进一步包括疏水性脂质、双亲性脂质、缓冲试剂和/或有机溶剂，所述双亲性脂质包括选自中性脂质、阳离子脂质和PEG-脂质的至少之一，所述疏水性脂质包括固醇。
在一些实施方案中，所述中性脂质包括选自下列至少之一：二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、二月桂酰磷脂酰胆碱、焦碳酸二乙酯、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、蛋黄卵磷脂。
在一些实施方案中，所述阳离子脂质选自下列至少之一：溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵、氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵(、双十二烷基二甲基溴化铵、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2- 精胺甲酰氨基)乙基铵(DOSPA)、溴化三甲基十二烷基铵、溴化三甲基十四烷基铵、溴化三甲基十六烷基铵、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油酰氧基丙基铵、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油烯氧基丙基铵、溴化二甲基-3-羟丙基-2,3-二油烯氧基丙基铵、溴化二甲基-4-羟丁基-2,3-二油烯氧基丙基铵、溴化二甲基-5- 羟戊基-2,3-二油烯氧基丙基铵、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十六烷氧基丙基铵、溴化二甲基-2-羟乙基 -2,3-双十八烷氧基丙基铵、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十四烷氧基丙基铵、N-(2-精胺甲酰基)-N’,N’-双十八烷基甘氨酰胺、1，2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯、3β-[N-(N’,N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基] 胆固醇、脂质多聚-L-赖氨酸、硬脂铵。
在一些实施方案中，所述PEG-脂质包括选自下列至少之一：二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-PEG、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-PEG、二肉豆蔻基甘油-PEG和二甲基丙烯酸酯-PEG。
在一些实施方案中，所述固醇为胆固醇。
在一些实施方案中，所述缓冲试剂为酸性缓冲试剂。
在一些实施方案中，所述缓冲试剂包括选自柠檬酸、柠檬酸钠、醋酸、醋酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、三羟甲基氨基甲烷-盐酸、磷酸二氢钾-氢氧化钠、硼酸-硼砂、甘氨酸-盐酸、邻苯二甲酸-盐酸、邻苯二甲酸氢钾和磷酸二氢钠-柠檬酸的至少之一。
在一些实施方案中，所述有机溶剂包括选自甲醇、乙醇、异丙醇、苯、甲苯、二甲苯、戊烷、己烷、辛烷、环己烷、环己酮、甲苯环己酮、氯苯、二氯苯、二氯甲烷、乙醚、环氧丙烷、丙酮、甲基丁酮、甲基异丁酮、乙腈、吡啶、苯酚、苯乙烯、全氯乙烯、三氯乙烯、乙烯乙二醇醚和三乙醇胺的至少之一。
根据本发明的实施例，基于所述脂质体，所述化合物的量为3～80％mol/mol，进一步地，所述化合物的量为3％mol/mol、4％mol/mol、5％mol/mol、6％mol/mol、7％mol/mol、8％mol/mol、9％mol/mol、 10％mol/mol、11％mol/mol、12％mol/mol、13％mol/mol、14％mol/mol、15％mol/mol、16％mol/mol、 17％mol/mol、18％mol/mol、19％mol/mol、20％mol/mol、21％mol/mol、22％mol/mol、23％mol/mol、 24％mol/mol、25％mol/mol、26％mol/mol、27％mol/mol、28％mol/mol、29％mol/mol、30％mol/mol、 31％mol/mol、32％mol/mol、33％mol/mol、34％mol/mol、35％mol/mol、36％mol/mol、37％mol/mol、 38％mol/mol、39％mol/mol、40％mol/mol、41％mol/mol、42％mol/mol、43％mol/mol、44％mol/mol、 45％mol/mol、46％mol/mol、47％mol/mol、48％mol/mol、49％mol/mol、50％mol/mol、51％mol/mol、 52％mol/mol、53％mol/mol、54％mol/mol、55％mol/mol、56％mol/mol、57％mol/mol、58％mol/mol、 59％mol/mol、60％mol/mol、61％mol/mol、62％mol/mol、63％mol/mol、64％mol/mol、65％mol/mol、 66％mol/mol、67％mol/mol、68％mol/mol、69％mol/mol、70％mol/mol、71％mol/mol、72％mol/mol、 73％mol/mol、74％mol/mol、75％mol/mol、76％mol/mol、77％mol/mol、78％mol/mol、79％mol/mol、 80％mol/mol。
在一些实施方案中，基于所述脂质体，所述化合物的量为20～80％mol/mol，进一步地，所述化合物的量为20％mol/mol、21％mol/mol、22％mol/mol、23％mol/mol、24％mol/mol、25％mol/mol、26％ mol/mol、27％mol/mol、28％mol/mol、29％mol/mol、30％mol/mol、31％mol/mol、32％mol/mol、33％ mol/mol、34％mol/mol、35％mol/mol、36％mol/mol、37％mol/mol、38％mol/mol、39％mol/mol、40％ mol/mol、41％mol/mol、42％mol/mol、43％mol/mol、44％mol/mol、45％mol/mol、46％mol/mol、47％ mol/mol、48％mol/mol、49％mol/mol、50％mol/mol、51％mol/mol、52％mol/mol、53％mol/mol、54％ mol/mol、55％mol/mol、56％mol/mol、57％mol/mol、58％mol/mol、59％mol/mol、60％mol/mol、61％ mol/mol、62％mol/mol、63％mol/mol、64％mol/mol、65％mol/mol、66％mol/mol、67％mol/mol、68％ mol/mol、69％mol/mol、70％mol/mol、71％mol/mol、72％mol/mol、73％mol/mol、74％mol/mol、75％mol/mol、76％mol/mol、77％mol/mol、78％mol/mol、79％mol/mol、80％mol/mol。
在一些实施方案中，所述化合物、中性脂质、固醇和PEG-脂质的摩尔比为(20～80)：(5～50)： (10～60)：(0.2～20)。
根据本发明的实施例，所述化合物、中性脂质、固醇和PEG-脂质的摩尔比为(40～61)：(8～20)： (30～60)：(0.5～5)。
根据本发明的实施例，所述化合物、固醇和PEG-脂质的摩尔比为(20～80)：(5～50)：(10～60)。
根据本发明的实施例，所述化合物、固醇和PEG-脂质的摩尔比为(40～70)：(5～20)：(20～40)。
根据本发明的实施例，基于所述脂质体，所述化合物的量为3～50％mol/mol，进一步地，所述化合物的量为3％mol/mol、4％mol/mol、5％mol/mol、6％mol/mol、7％mol/mol、8％mol/mol、9％mol/mol、 10％mol/mol、11％mol/mol、12％mol/mol、13％mol/mol、14％mol/mol、15％mol/mol、16％mol/mol、 17％mol/mol、18％mol/mol、19％mol/mol、20％mol/mol、21％mol/mol、22％mol/mol、23％mol/mol、24％mol/mol、25％mol/mol、26％mol/mol、27％mol/mol、28％mol/mol、29％mol/mol、30％mol/mol、 31％mol/mol、32％mol/mol、33％mol/mol、34％mol/mol、35％mol/mol、36％mol/mol、37％mol/mol、 38％mol/mol、39％mol/mol、40％mol/mol、41％mol/mol、42％mol/mol、43％mol/mol、44％mol/mol、 45％mol/mol、46％mol/mol、47％mol/mol、48％mol/mol、49％mol/mol、50％mol/mol。
根据本发明的实施例，所述化合物、中性脂质、固醇、PEG-脂质和阳离子脂质的摩尔比为(3～50)： (1～20)：(2～50)：(0.01～10)：(5～92)。
根据本发明的实施例，所述化合物、中性脂质、固醇、PEG-脂质和阳离子脂质的摩尔比为(3～41)： (1～12)：(2～45)：(0.05～2)：(10～90)。
在一些实施方案中，基于所述脂质体，所述缓冲试剂的体积为50～90％v/v。进一步地，所述缓冲试剂的体积为50％v/v、51％v/v、52％v/v、53％v/v、54％v/v、55％v/v、56％v/v、57％v/v、58％v/v、59％v/v、 60％v/v、61％v/v、62％v/v、63％v/v、64％v/v、65％v/v、66％v/v、67％v/v、68％v/v、69％v/v、70％v/v、 71％v/v、72％v/v、73％v/v、74％v/v、75％v/v、76％v/v、77％v/v、78％v/v、79％v/v、80％v/v、81％v/v、 82％v/v、83％v/v、84％v/v、85％v/v、86％v/v、87％v/v、88％v/v、89％v/v、90％v/v。
在一些实施方案中，基于所述脂质体，所述缓冲试剂的体积为75％v/v。
根据本发明的实施例，采用上述配比的脂质体，转染效率高，包封效果好，药物呈递能力强。
根据本发明的实施例，基于所述脂质体，所述化合物的量为20～80％mol/mol；所述化合物、中性脂质、固醇和PEG-脂质的摩尔比为(20～80)：(5～50)：(10～60)：(0.2～20)；基于所述脂质体，所述缓冲试剂的体积为75％v/v。
根据本发明的实施例，基于所述脂质体，所述化合物的量为20～80％mol/mol；所述化合物、固醇和 PEG-脂质的摩尔比为(20～80)：(5～50)：(10～60)；基于所述脂质体，所述缓冲试剂的体积为75％v/v。
根据本发明的实施例，基于所述脂质体，所述化合物的量为3～50％mol/mol；所述化合物、中性脂质、固醇、PEG-脂质和阳离子脂质的摩尔比为(3～50)：(1～20)：(2～50)：(0.01～10)：(5～92)；基于所述脂质体，所述缓冲试剂的体积为75％v/v。
在一些实施方案中，上述化合物还可与磷脂衍生物形成脂质体，磷脂衍生物包括但不限于二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺。
在一个具体的实施方案中，脂质体包括上述化合物，进一步地，脂质体还包含中性脂质和能够减少脂质体颗粒聚集的脂质。
在一个具体的实施方案中，脂质体主要由以下组成：(i)至少一种本发明的脂质；(ii)选自DSPC、DPPC、 POPC、DOPE、DLPC、DEPC、DMPC、EPC、DOTAP等的中性脂质；(iii)固醇，例如胆固醇；和(iv)PEG- 脂质，例如DPPE-PEG,DSPE-PEG,PEG-DMG或PEG-DMA，以约20-80％含胺脂质：5-50％中性脂质： 10-60％固醇：0.2-20％PEG-脂质的摩尔比配合组成。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种制备上述脂质体的方法。根据本发明的实施例，包括：将预定量的本发明第一方面所提出的化合物与有机溶剂混合，以便获得所述脂质体。
在一些实施方案中，上述化合物在有机溶液中的浓度为10-30mg/mL，进一步地，上述化合物在有机溶液中的浓度为10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、 18mg/mL、19mg/mL、20mg/mL、21mg/mL、22mg/mL、23mg/mL、24mg/mL、25mg/mL、26mg/mL、 27mg/mL、28mg/mL、29mg/mL、30mg/mL。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括：将预定量疏水性脂质、双亲性脂质溶解于上述有机溶液后与缓冲试剂混合，以便获得所述脂质体。根据本发明的实施例，基于所述脂质体，所述化合物的量为 20～80％mol/mol；所述化合物、中性脂质、固醇和PEG-脂质的质量比为(20～80)：(5～50)：(10～60)： (0.2～20)，优选为，所述化合物、中性脂质、固醇和PEG-脂质的摩尔比为(40～61)：(8～20)：(30～60)： (0.5～5)；基于所述脂质体，所述缓冲试剂的体积为75％v/v。根据本发明的实施例，基于所述脂质体，所述化合物的量为4～50％mol/mol；所述化合物、中性脂质、固醇、PEG-脂质和阳离子脂质的摩尔比为 (3～50)：(1～20)：(2～50)：(0.01～10)：(5～92)；基于所述脂质体，所述缓冲试剂的体积为 75％v/v。根据本发明的实施例，基于所述脂质体，所述化合物的量为20～80％mol/mol；所述化合物、固醇和PEG-脂质的摩尔比为(20～80)：(5～50)：(10～60)；基于所述脂质体，所述缓冲试剂的体积为75％v/v。
在一些实施方案中，基于所述脂质体，所述化合物的量为20％mol/mol、21％mol/mol、22％mol/mol、 23％mol/mol、24％mol/mol、25％mol/mol、26％mol/mol、27％mol/mol、28％mol/mol、29％mol/mol、 30％mol/mol、31％mol/mol、32％mol/mol、33％mol/mol、34％mol/mol、35％mol/mol、36％mol/mol、 37％mol/mol、38％mol/mol、39％mol/mol、40％mol/mol、41％mol/mol、42％mol/mol、43％mol/mol、 44％mol/mol、45％mol/mol、46％mol/mol、47％mol/mol、48％mol/mol、49％mol/mol、50％mol/mol、51％mol/mol、52％mol/mol、53％mol/mol、54％mol/mol、55％mol/mol、56％mol/mol、57％mol/mol、 58％mol/mol、59％mol/mol、60％mol/mol、61％mol/mol、62％mol/mol、63％mol/mol、64％mol/mol、 65％mol/mol、66％mol/mol、67％mol/mol、68％mol/mol、69％mol/mol、70％mol/mol、71％mol/mol、 72％mol/mol、73％mol/mol、74％mol/mol、75％mol/mol、76％mol/mol、77％mol/mol、78％mol/mol、 79％mol/mol、80％mol/mol。
药物载体、药物组合物、转染复合物
在本发明的另一方面，本发明提出了一种药物载体，包括上述化合物或脂质体。根据本发明的实施例，所述化合物为可离子化含胺脂质，所述药物载体为可离子化载体，可负载带有负电或呈疏水性的药物，并将药物送呈至细胞内并有效从内涵体中逃逸至胞浆，利于所负载的药物药效发挥。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种药物组合物，所述药物组合物含有载体和药物活性成分，其中，所述载体包括本发明第五方面所提出的药物载体。根据本发明的实施例，所述药物载体为可离子化载体，可负载带有负电或呈疏水性的药物活性成分，并将药物活性成分送呈至细胞内并有效从内涵体中逃逸至胞浆，利于所负载的药物活性成分发挥药效。
在一些实施方案中，所述药物活性成分包括选自下列至少之一：DNA分子、RNA分子、蛋白、多肽和疏水性药物。根据本发明的实施例，所述药物载体含有长碳链，可以负载疏水性物质，例如，疏水性小分子药物。
进一步地，本发明的药物载体还可以负载蛋白质、多肽类物质，所述蛋白质、多肽类复制不受特殊限制，可以为肽链、蛋白质本身，也可以为上述物质的衍生物或与其他物质的复合体，例如，Cas9蛋白或其部分结构域肽段、负载有核素的蛋白质、抗体等物质。
进一步地，本发明的药物载体还可以负载核酸类物质，例如，反义核酸等。
在一些实施方案中，所述药物活性成分带有负电性。根据本发明的实施例，所述药物载体中含有可离子化含胺脂质，在特定pH下带有正电性，可与带有负电性的药物活性成分结合，此外，还可以通过脂质双分子层的流动作用药物活性成分包裹在内，送呈至细胞中。
在一些实施方案中，所述药物活性成分含有核酸。根据本发明的实施例，所述药物活性成分含有 DNA、RNA、核酸-蛋白复合物、核酸-脂质复合物、核酸-核素复合物等，所述核酸类型不受特别限制。作为该核酸的具体例，可以为siRNA、mRNA、tRNA、rRNA、cDNA、miRNA(微RNA)、核酶、反义寡核普酸、质粒DNA、肽核酸、三链形成型寡核普酸(Triplex FormingOligonucleotide，TFO)、基因等。其中，本发明载体在将siRNA向细胞内转运方面特别有效。本发明的载体适用的核酸，可以是来自人、动物、植物、细菌、病毒等的核酸，另外，也可以是通过化学合成制备的核酸。进而，上述核酸可以是单链、双链、三链中的任一种，并且对其分子量也没有特殊的限定。另外，本发明中，核酸可以为被化学、酶或肽修饰的核酸。本发明中，核酸可以单独使用1种，也可以2种以上适当地组合使用。在一较佳的实施方式中，本发明的核酸转运用载体组合物优选转运小干扰核酸(siRNA)或其类似物。
在一些实施方案中，所述载体与所述药物活性成分的质量比为(5～50)：1；优选为，所述载体与所述药物活性成分的质量比为(5～40)：1。
在一些实施方案中，所述载体与所述药物活性成分的质量比为(8～20)：1。
在一些实施方案中，所述载体与所述药物活性成分的质量比为5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10： 1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、20：1、21：1、22：1、23： 1、24：1、25：1、26：1、27：1、28：1、29：1、30：1、31：1、32：1、33：1、34：1、35：1、36： 1、37：1、38：1、39：1、40：1。
在一些实施方案中，所述载体与所述药物活性成分的质量比为15：1。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种转染复合物。根据本发明的实施例，所述转染复合物包含上述化合物或上述脂质体。
在一些实施方案中，适用于制备和形成本文公开的转染复合物的辅助脂质可以包括，但不限于，胆固醇、胆固醇衍生物或者己知会实现或促进外源性生物活性分子向细胞或组织内部的引入的中性或阳离子脂质中的任一种。在某些实施方案中，可以在本文所述的转染复合物的配制中使用超过一种辅助脂质。
在一些实施方案中，所述转染复合物包含至少一种生物活性剂。根据本发明实施例的转染复合物，其适用于向体外或体内细胞、组织或器官递送一种或多种生物活性剂。
在一些实施方案中，所述转染复合物可以包括一种或多种要递送至细胞或递送至体外或体内靶组织的生物活性剂。合适的生物活性剂可以包括这样的任意分子，所述分子能够与本文所述的转染试剂形成转染复合物，且当被递送至一个或多个细胞内部或被递送至体内或体外组织时会引起生物应答。用于本文所述的实施方案中的生物活性剂可以是阳离子的、中性的或阴离子的试剂。
在一些实施方案中，所述生物活性剂包括选自下列至少之一：DNA分子、RNA分子、蛋白、多肽和药物。根据本发明的实施例，适用于配制转染复合物的示例性生物活性剂可以包括、但不限于：核酸 (包括、但不限于单链或双链直链或环状DNA分子(包括cDNA分子)、单链或双链RNA分子、小干扰 RNA(siRNA)分子、小发夹RNA(shRNA)分子、微RNA(miRNA)分子、寡核昔酸、反义寡核昔酸、有义寡核昔酸)、多肽、抗体、寡肽、治疗性的肽或蛋白分子、肽核酸(PNA)、阳离子的、阴离子的或中性的有机分子或药物，以及它们的药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，本文所述的转染复合物可以任选地包括一种或多种融合肽或细胞穿透肽。融合肽或细胞穿透肽是能够促进含脂质复合物与细胞膜(质膜或胞内体膜)的融合的任何肽大分子。多种融合肽或细胞穿透肽是本领域己知的，并且在从业人员的技能水平内，无需过多实验即可鉴别出合适的融合肽或细胞穿透肽及其在本发明中的使用条件。
在一些实施方案中，本文所述的转染复合物可以任选地包括一种或多种转染辅助剂或靶向部分。靶向部分可以是肽、经修饰的肽、抗体、经修饰的抗体、受体分子、经修饰的受体分子、单链或双链核酸分子、经修饰的单链或双链核酸分子、肽或核酸适体、经修饰的肽或核酸适体、有机分子、多糖、或这样的任意其它分子，所述分子能够将转染复合物靶向特定组织或细胞类型以给其靶向递送生物活性剂。
在一些实施方案中，本文提供的转染复合物可以稳定最多1年，且可以与待转染的细胞或组织接触，或在形成后立即或不久施用给动物或人，或者可以任选地在与细胞或组织接触或施用给动物或人之前保存一段时间。所述转染复合物是稳定的，且可以在室温或在大于冰点直到约室温的温度保存下述时间段，至少30分钟、至少45分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少 10小时、至少15小时、至少20小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少5天、至少7 天、至少14天、至少28天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少 6个月或至少1年。应当理解，本文所述的制剂可以包括一种或多种稳定剂、防腐剂、缓冲剂等，其辅助生物活性制剂的长期稳定和贮存，正如生物学和药学领域的熟练的从业人员会容易地理解的，且无需过度实验即可实现。还应当理解，贮存期可以是这些时间段中的任一种，例如31分钟至1小时，或1 小时至24小时。
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
检测和计算方法：
1、核磁共振谱仪检测，用于确定含铵脂质的结构
所用核磁共振谱仪为Bruker 400M核磁共振谱仪。具体计算方法参考文献，Boulmedais F.，Frisch B.， Etienne O.，Lavalle Ph.，Picart C.，Ogier J.，Voegel J-C.，Schaaf P.，Egles C.Polyelectrolyte multilayer films with pegylatedpolypeptides as a new type of anti-microbial protection for biomaterials，Biomaterials，2004， 25，2003-2011。
2、凝胶阻滞实验，用于证明制剂中核酸的负载
将抗载脂蛋白B siRNA(siApoB)溶于DEPC处理水，并与不同质量比(w/w)的LNP新鲜组装。此后，与6×上样缓冲液(宝日医生物技术(北京)有限公司)混合，将含有等量siRNA的制剂加入含0.01％gel stain(w/w)(北京全式金生物)的1％(w/w)琼脂糖凝胶中。在1×TAE电泳缓冲液中，90v电压电泳 30min。用凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)在紫外光波长320nm处记录结果。siApoB序列如表 1所示：
表1：
Figure RE-GDA0003815960700000141
3、粒径及表面电势的测定，初步判定脂质配方是否可用
LNP包裹siRNA后得到的制剂在测量粒径和表面电势前首先进行10倍稀释。粒径和表面电势测量所用仪器为美国Malven公司Zetasizer 3000HS型激光粒度仪，测量温度为25℃，角度为90°，入射光波长为677nm。
4、制剂内siRNA浓度测定
采用RiboGreen法测定siRNA浓度。将待测制剂稀释20倍后加入100μl至96孔板内，用于检测制剂外部siRNA荧光量。另取15μl稀释后的待测制剂用50μl 2％Triton-X-100(w/w)的混合液破坏脂质结构以完全释放内部的siRNA，再在孔中加入35μl 1×TE缓冲液补齐体积，用于检测制剂全部siRNA荧光量。此外，用siRNA标准品、1×TE、2％Triton-X-100制作标准曲线，用于计算待测样品中siRNA的浓度。待所有待测样品加样完毕后，室温孵育30分钟。然后避光加入RiboGreen工作液100μl/孔并立即用酶标仪进行荧光检测。检测条件如表2所示：
表2：
参数 设置
检测方法 荧光
类型 终点/动力学
关学元件类型 单色器
激发光 480/17.0
发射光 520/17.0
光学元件位置 顶部
增益 60
5、透射电镜(TEM)实验，用于检测制剂的粒子形态
所用透射电镜为荷兰JEM-100CX II型透射电镜。首先将铜网浸入待测样品溶液中，然后用0.1重量％磷钨酸溶液进行染色，大约3分钟后，将多余液体用滤纸滤去，于室温下晾干。然后用透射电镜观察，并拍摄体系中粒子的形态。
6、体外转染实验
对于检测候选制剂的siRNA递送效率。将人类肝癌细胞株HepG2用含有10％胎牛血清的DMEM 完全培养基接种于12孔板，接种密度为1×105细胞/孔，每孔1mL培养基，37℃培养过夜。
第二日将12孔板中细胞培养液吸弃，所有待转染孔中每孔加入1mL新鲜的含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM完全培养基。Mock组不做进一步处理，待测样品孔中加入对应的制剂，加样体积根据先前利用RiboGreen法测定的LNP内siRNA浓度计算，使得siApoB的最终浓度为50nM。细胞于37℃培养4小时，再向每孔中加入1mL含有10％胎牛血清的DMEM完全培养基，继续在37℃培养过夜。
此后，利用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-Time PCR)检测待测样品中ApoB mRNA的相对表达。具体步骤为培养转染的细胞24小时后，使用RNA isolator(南京诺唯赞生物科技有限公司，货号 R401-01-AA)、氯仿、异丙醇提取细胞中的总RNA；分别取1μg总RNA按照反转录试剂盒(北京全式金生物技术有限公司，货号AT311-03)的使用方法反转录得到cDNA。使用实时荧光定量PCR mix(上海翊圣生物科技有限公司，货号11201ES08)，以cDNA为模板按照说明书的步骤检测目的基因ApoB以及内参基因磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的表达，其中ApoB的表达需参考GAPDH。用于扩增ApoB和作为内参基因的GAPDH的PCR引物如表3所示。
表3：
Figure RE-GDA0003815960700000151
7、细胞毒性检测
利用MTT法(四唑盐比色法)对受试物的细胞毒性进行检测，具体方法如下：
(1)在96孔板中接种1.25×104个HepG2细胞/孔，每孔培养基体积为100μl，在5％CO2，37℃条件下孵育过夜。
(2)24小时后，每孔加入相应量的包裹抗虫萤光素酶siRNA(siFirefly)的siFLA4-13，使孔中siRNA 的含量为1nM到200nM不等。同时设置对照孔(细胞、与含有制剂的液体体积相同的pH值为7.4的PBS、培养液)，在5％CO2，37℃条件下孵育48小时。
(3)每孔加入20μl的MTT溶液(5mg/mL)，继续在5％CO2，37℃条件下孵育4小时。
(4)小心弃去孔内上清培养液，每孔加入150μl二甲基亚砜，置低速振荡仪上振荡10分钟，使结晶物充分溶解。在连续光谱多功能酶标仪(TECAN Infinite 200)540nm处测量各孔的吸光值。
(5)按照以下公式计算各个样品孔细胞相对活力：
Figure DEST_PATH_BDA0003643336020000152
siFirefly序列如表4所示：
表4
Figure RE-GDA0003815960700000153
Figure RE-GDA0003815960700000161
8、亚细胞定位，用于判断核酸是否进入细胞
在测试的前一天，2×105HepG2细胞将被接种在35mm培养皿中，并在5％CO2，37℃条件下培养过夜。第二天，用A4-13或Lipofectamine 2000(Invitrogen)包裹在siFirefly正义链3’端连接Cy5基团的 Cy5-siFirefly制备Cy-siFLA4-13或Cy-siFLLipo，并加入至对应的培养皿中并继续培养4小时以便细胞胞吞转染试剂。到达规定时间后，全部弃去含有转染试剂的培养基并用1×PBS清洗培养皿上的细胞三次。在此之后，在培养皿中加入1mL染色工作液(Lysotracker用1×PBS 1：3000(v/v)稀释，另含有 Hoechst 33342 0.1mg/ml)，在37℃下避光染色15分钟。完成染色后，用激光共聚焦显微镜(LSM 700, Zeiss)观察荧光信号在细胞内的分布情况。
9、细胞摄取，用于判断核酸进入细胞的效率
HepG2细胞将在检测前一天被接种在12孔板中，浓度为2×105细胞/mL，体积为1mL/孔。24小时后，在孔中加入Cy-siFLA4-13，使其终浓度为50nM，并在5％CO2，37℃条件下培养4小时。此后，全部弃去含有转染试剂的培养基，用胰蛋白酶消化细胞、完全培养基终止消化，收集液体至离心管内。 800转/分钟离心5分钟后用1×PBS重悬，并重复润洗细胞三次。此后，用流式细胞仪(FACSverse,BD) 检测HepG2细胞对制剂的胞吞效率。利用FlowJo7.6对数据进行分析。
10、体内分布实验，用于判断药物在体内的代谢以及分布特征
实验以6-8周C57BL/6小鼠为实验对象，分为两组后分别通过尾静脉给予1×PBS或Cy-siFLA4-13，其中Cy5-siFirefly的量为2mg/kg。在给药后的不同时间点将通过小动物活体成像系统FX Pro(柯达) 检测小鼠体内的Cy5信号分布情况。此外，在给药后0.5小时、4小时以及24小时活体成像完成后，每组将有1-2只动物被安乐死并分离心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、颌下腺和胸腺用于脏器成像。结果分析通过Carestream软件完成，折线图由GraphpadPrism 8生成。
在另一试验中，实验对象为6-8周C57BL/6小鼠，分别通过尾静脉给予1×PBS或mLuA4-13制剂， mRNA的量为20μg/只动物。在给药后第6、9小时安乐死动物分离心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、颌下腺和胸腺用于脏器成像。结果分析通过livingimage软件完成。
在另一实验中，实验对象为6-8周C57BL/6小鼠，分别通过肺内喷雾的给药方式给予1×PBS、 mLuA4-13，或mLuDA4-1至mLuDA4-9制剂，mRNA的量为4μg/只动物。在给药后第6小时安乐死动物分离心、肝、脾、肺用于脏器成像。结果分析通过livingimage软件完成。
11、剂量依赖实验
32只6-8周的C57BL/6小鼠被分成8组后分别接受1×PBS或0.01mg/kg到1mg/kgsiA4-13。42小时后，动物将被禁食6小时并安乐死。收集血清和肝组织样品用于分析血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(CHO)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)以及肝组织内ApoB mRNA 的表达变化。用于扩增小鼠ApoB和作为内参基因的GAPDH的PCR引物如表5所示。
表5：
Figure RE-GDA0003815960700000162
12、作用时长实验
96只6-8周的C57BL/6小鼠被分为三组，分别接受1×PBS或1mg/kg或3mg/kg siA4-13。在给药后第7、14、21、28、35、42、49天，分别将每组4只动物禁食6小时并安乐死，收集血清和肝组织样品用于分析血清中TG、CHO、LDL-c、HDL-c以及肝组织内ApoB mRNA的表达变化。作用时长曲线由Graphpad Prism 8生成。
13、药效试验
实验分为两部分。在第一部分中，以瘦素受体敲除db/db小鼠(C57BLKS/JGpt-Leprem2Cd/Gpt)为实验对象，相同遗传背景的无基因敲除小鼠(m/m)作为对照。此部分实验旨在检测包裹了抗血管形成素样蛋白3siRNA(siANGPTL3)的制剂siANA4-13的降血脂效果和靶基因的表达变化。在第二部分中，以人源化载脂蛋白C3(ApoC3)转基因小鼠(hApoC3，Tg(APOC3)3707Bres)为实验对象，C57BL/6 小鼠作为对照。此部分实验旨在检测包裹了siApoC3(siApoC3是针对ApoC3 mRNA的siRNA)制剂 siApoCA4-13的降血脂效果以及停药后动物的血脂恢复情况。
在第一部分中，db/db小鼠将分别通过尾静脉注射1×PBS或0.5mg/kg siFLA4-13或0.5mg/kg siANA4-13或0.25mg/kg siANA4-13。测试共进行4次给药，每周一次。在每次给药后的第三天，所用动物将接受6小时禁食并通过眼眶收集血液用于分析TG、CHO的变化。末次给药后第2天，全部动物将接受6小时禁食后被处死，收集血液和肝组织样本，以便进一步测定血脂变化和肝组织中ANGPTL3 mRNA的表达。每组1只动物收集肝脏用于油红O染色用于观察肝脏中脂质沉积变化。
在第二部分中，hApoC3小鼠将分别通过尾静脉注射1×PBS或0.5mg/kg siFLA4-13或0.5mg/kg siApoCA4-13或0.25mg/kg siApoCA4-13。实验计划进行5次给药，每次间隔一周，期间检测血脂变化。在末次给药后，所有动物仍每周接受一次血脂检测，共4次。此后，安乐死动物收集血液检测血脂。实验涉及的siANGPTL3和siApoC3的序列，以及用于扩增小鼠ANGPTL3和人ApoC3的PCR引物如分别表6和表7所示：
表6：
Figure RE-GDA0003815960700000171
表7：
Figure RE-GDA0003815960700000172
14、体外mRNA表达测试
HepG2细胞将在检测前一天被接种在12孔板中，浓度为2×105细胞/mL，体积为1mL/孔。24小时后，在孔中加入包裹了荧光素酶mRNA的不同LNP，使每孔中加入的mRNA的量为400ng，并在5％CO2， 37℃条件下培养6小时。到达预定时间时，用被动裂解液裂解细胞并收集细胞裂解液。此后，在96孔板中加入细胞裂解液10μl/样品，并在每孔中加入50μl荧光素酶底物。完成后立即用酶标仪检测样品的发出的荧光量。
15、siRNA与CRISPR/Cas系统的基因抑制对比测试
转染前24小时将HepG2-luc细胞接种于在6孔板中，浓度为2×105细胞/mL，体积为1mL/孔。次日，将LNP分别包裹了抗polo样激酶基因1的siRNA(siPLK1)和同时表达Cas蛋白和PLK1 sgRNA 的质粒(pCPLK1)的siPLKA4-13和pCPA4-13加入对应的孔内，使siRNA和质粒的量为1600ng。Mock 组不做进一步处理。细胞在5％CO2，37℃条件下培养4小时。此后每孔加入新鲜培养基1mL，并继续进一步培养20小时。到达规定时间后，利用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-Time PCR)检测待测样品中PLK1 mRNA的相对表达。PLK1 siRNA的核酸及引物序列分别如表8和表9所示。
表8
Figure RE-GDA0003815960700000173
表9
Figure RE-GDA0003815960700000174
16、BCA法检测LNP内蛋白浓度
首先利用2％Triton-X-100破坏LNP的结构以释放被包裹的GOx。此后，加入50μl处理后的样品在96孔板内。同时，加入50μl不同浓度的蛋白标准品以制作标准曲线。每孔加入200μl BCA工作液并在37℃下孵育30分钟。最后用酶标仪检测562nm处的吸光度。通过绘制标准曲线计算待测样品中蛋白的浓度。
制备例1合成含胺脂质化合物A4
合成化合物A2：
Figure RE-GDA0003815960700000181
反应在三颈瓶中进行，其中含有叔丁基(3-氨基丙基)氨基甲酸酯(1.01g,5.7mmol)、1,2-环氧十二烷 (2.33g,12.6mmol)和12.00mL乙醇，50℃氮气回流。用薄层色谱(TLC)监测反应，反应结束后停止。粗品减压浓缩后，以二氯甲烷：甲醇＝30：1(v/v)为展开剂，经硅胶柱分离纯化。得到产物A2(1.61g, 产率78.1％).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)0.88(t,J＝13.68Hz,6H),1.26-1.44(m,45H),1.67(m, 2H),2.38-2.70(m,6H),3.18(m,2H),3.70(m,2H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm)156.22,79.39, 69.58,62.90,52.70,38.58,38.53,35.13,34.98,31.92,29.62,29.35,28.44,25.65,22.70,14.13；高分辨质谱(EI+模式)扫描化合物A2(分子量543.5023)，扫描结果为543.5108。
合成化合物A3：
Figure RE-GDA0003815960700000182
在含有化合物A2(1.04g,1.8mmol)和20.00mL二氯甲烷的三颈瓶中，搅拌时缓慢加入盐酸。室温反应16小时，反应结束后停止，TLC板检测。用1M NaOH水溶液调节反应混合液pH为7-8，再用水和乙酸乙酯萃取3次。在减压的情况下浓缩得到产物A3 398.0mg,产率49.9％。1H NMR(400MHz, CDCl3)δ(ppm)0.88(t,J＝13.08Hz,6H),1.26(m,32H),1.43(m,4H),1.96(m,J＝14.5Hz,2H),2.60(m, J＝20.9Hz,4H),3.01(m,2H),3.25(m,2H),3.80(m,2H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm)70.41, 63.21,58.29,40.79,36.15,31.94,29.91,29.69,29.39,23.90,22.70,14.11；高分辨质谱(EI+模式)扫描化合物A3(分子量443.4498)，扫描结果443.4576。
合成化合物A4：
Figure RE-GDA0003815960700000183
将A3(2.2g,4.9mmol)和琥珀酸(263.3mg,2.2mmol)溶于20.00mL的二氯甲烷中，置于三颈烧瓶中。然后加入催化剂1-羟基苯并三唑(753.3mg,5.6mmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.13 g,5.6mmol)。在氮气的保护下，反应12小时。经薄层色谱检测后停止反应。粗产物用水洗两次，饱和盐水洗两次，有机相洗两次。得到产物A4 0.1g,产率3.3％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)0.88 (t,J＝13.24Hz,12H),1.26-1.47(m,72H),1.93(m,4H),2.56-3.41.74(m,20H),3.89(m,4H),5.03(m,4 H),8.04(m,2H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ(ppm)173.26,67.14,59.69,51.69,35.70,34.47,34.21, 33.21,30.95,30.52,29.30,28.72,28.42,21.70,13.11；高分辨质谱(EI+模式)扫描化合物(分子量967.9051), 扫描结果967.9137.
实施例1
将制备例1获得的脂质A4与DSPC、胆固醇、DMG-PEG(购于艾伟拓(上海)医药科技有限公司) 溶于无水乙醇，浓度为20mg/ml。上述材料准备完成后，按照A4：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝66.8： 10.9：20.0：2.2的质量比将四种原料混合并全部吸入胰岛素注射器中备用。此外，另准备有机相混合液三倍体积的pH＝4.0，浓度为50mM的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液，同样全部吸入胰岛素注射器中备用。在此之后，将分别装有有机相混合液和缓冲液的胰岛素注射器置于同一个离心管中并快速释放出全部液体，轻轻摇匀离心管即制备成脂质纳米颗粒A4-1。
测试例1
此测试例旨在通过凝胶阻滞实验检测实施例1得到的脂质纳米颗粒包裹siRNA的能力，同时探索脂质纳米颗粒与siRNA的最优质量比，测试结果如图1所示。结果显示当LNP与siRNA的质量比低于5： 1时，siRNA仍有大量泄露，说明低质量比不适和siRNA的递送。当质量比大于等于5：1时，siRNA 被LNP高效包裹，当质量比为15：1时，siRNA几乎被完全包裹。说明当LNP与siRNA的质量比为5：1-30：1时，是LNP与siRNA适合的质量比范围，质量比大于等于15：1可能实现siRNA的高效递送。因此在后续的制备例中，都选择此质量比制备LNP。
实施例2
上述溶解好的四种原料按照A4：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝58.5：14.3：23.4：3.8的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成脂质纳米颗粒A4-2。
实施例3
上述溶解好的四种原料按照A4：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝50.2：16.4：25.1：8.2的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成脂质纳米颗粒A4-3。
实施例4
上述溶解好的四种原料按照A4：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝42.8：17.5：25.7：14.0的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成脂质纳米颗粒A4-4。
实施例5
上述溶解好的四种原料按照A4：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝61.8：8.6：21.0：8.6的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成脂质纳米颗粒A4-5。
实施例6
上述溶解好的四种原料按照A4：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝57.4：12.0：14.6：16.0的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成脂质纳米颗粒A4-6。
实施例7
上述溶解好的四种原料按照A4：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝55.0：15.3：28.1：1.5的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成脂质纳米颗粒A4-7。
实施例8
上述溶解好的四种原料按照A4：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝54.7：19.0：23.3：3.1的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成脂质纳米颗粒A4-8。
实施例9
上述溶解好的四种原料按照A4：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝57.7：7.0：21.3：14.0的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成脂质纳米颗粒A4-9。
实施例10
上述溶解好的四种原料按照A4：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝57.2：10.4：25.4：7.0的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成脂质纳米颗粒A4-10。
实施例11
上述溶解好的四种原料按照A4：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝66.1：16.0：14.7：3.2的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成脂质纳米颗粒A4-11。
实施例12
上述溶解好的四种原料按照A4：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝61.6：18.6：18.2：1.5的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成脂质纳米颗粒A4-12。
实施例13
上述溶解好的四种原料按照A4：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝64.8：6.9：25.5：2.8的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成脂质纳米颗粒A4-13。
实施例14
上述溶解好的四种原料按照A4：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝66.2：10.6：21.7：1.4的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成脂质纳米颗粒A4-14。
实施例15
上述溶解好的四种原料按照A4：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝59.1：12.7：15.5：12.7的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成脂质纳米颗粒A4-15。
实施例16
上述溶解好的四种原料按照A4：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝63.6：17.0：12.5：6.8的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成脂质纳米颗粒A4-16。
在上述实施例中，A4、DSPC、胆固醇、DMG-PEG分别被设置了4个水平，如表10所示：
表10：
A4 DSPC 胆固醇 DMG-PEG
40 8 30 0.5
47 12 37 1
54 16 44 2.5
61 20 51 5
实施例1-16的配比是利用正交设计软件(正交设计助手ii V3.1)进行设计的，16个配比不同的LNP 的摩尔比与质量比如表11所示：
表11：
Figure RE-GDA0003815960700000201
实施例17-32
将siApoB的浓度调整至1000ng/μl，并与等体积的50％乙醇溶液混合，制备成乙醇含量为25％的 500ng/μl的siApoB溶液。
对实施例1-16得到的16个不同配比的脂质纳米颗粒，与siApoB溶液按照质量比15：1(即体积比1.5：1)混合，轻轻摇匀后在50℃下孵育20分钟，使siApoB尽可能地被脂质纳米颗粒包裹。在此之后，将16个脂质纳米颗粒/siApoB复合物转移至截留分子量为100000道尔顿的透析管内(spectrum， G235035)，并在1×PBS中透析3小时。
测试例2
本测试例旨在检测实施例1-16得到的16个未包裹siRNA的脂质纳米颗粒的粒径(size)、多分散系数(PDI)结果如表12所示，本发明的制剂可满足作为优良递送载体的前提。
表12：
编号 size(nm) PDI
A4-1 106.75±0.21 0.173±0.057
A4-2 146.90±0.99 0.547±0.374
A4-3 120.45±0.21 0.112±0.002
A4-4 171.45±1.63 0.179±0.033
A4-5 191.70±0.14 0.141±0.009
A4-6 203.85±3.18 0.254±0.013
A4-7 201.95±0.49 0.263±0.018
A4-8 200.70±0.99 0.274±0.010
A4-9 155.80±0.28 0.268±0.006
A4-10 187.20±0.71 0.248±0.001
A4-11 129.90±0.71 0.142±0.013
A4-12 106.34±0.49 0.124±0.028
A4-13 97.16±0.37 0.133±0.008
A4-14 92.25±0.32 0.130±0.007
A4-15 137.10±0.99 0.143±0.004
A4-16 120.50±0.42 0.278±0.011
测试例3
本测试例旨在检测实施例17-32得到的16个包裹siApoB的制剂的粒径(size)、多分散系数(PDI)、包封率(E.E.)和颗粒内siRNA浓度(conc)，结果如表13所示，所有配方都能高效地包裹siRNA。
表13：
Figure RE-GDA0003815960700000211
Figure RE-GDA0003815960700000221
测试例4
对实施例17-32得到的16个制剂进行体外转染实验，实时荧光定量PCR结果表14所示，所有配方均能将包裹的siRNA递送至细胞内，并实现基因抑制，其中siA4-13性能最好。
表14：
编号 活性 编号 活性
siA4-1 0.413±0.171 siA4-9 0.605±0.167
siA4-2 0.802±0.059 siA4-10 0.622±0.062
siA4-3 0.820±0.033 siA4-11 0.488±0.067
siA4-4 1.396±0.521 siA4-12 0.761±0.032
siA4-5 0.582±0.028 siA4-13 0.370±0.073
siA4-6 0.679±0.267 siA4-14 0.396±0.056
siA4-7 0.619±0.099 siA4-15 0.624±0.149
siA4-8 0.769±0.303 siA4-16 0.543±0.291
测试例5
对实施例17-32得到的16个制剂在动物水平进行活性验证。试验以C57BL/6为对象，68只雌性小鼠被分为17组，分别通过尾静脉注射1×PBS或剂量为0.5mg/kg的制剂。在给药后42小时，动物将被禁食6小时并安乐死。收集肝组织样品用于分析ApoB mRNA相对于接受1×PBS的动物的表达变化。ApoB mRNA表达通过实时荧光定量PCR检测。活性测试的分析结果由Graphpad Prism 8生成并如表15 所示，所有制剂均能实现动物水平的基因抑制，其中siA4-13性能最好。
表15：
编号 活性 编号 活性
siA4-1 0.263±0.112 siA4-9 0.628±0.200
siA4-2 0.500±0.198 siA4-10 0.295±0.086
siA4-3 0.540±0.196 siA4-11 0.228±0.068
siA4-4 0.850±0.213 siA4-12 0.433±0.101
siA4-5 0.364±0.186 siA4-13 0.133±0.057
siA4-6 0.690±0.421 siA4-14 0.213±0.094
siA4-7 0.531±0.320 siA4-15 0.509±0.133
siA4-8 0.840±0.315 siA4-16 0.424±0.154
实施例33
将siFirefly用DEPC处理水将浓度调整至1000ng/μl，并与等体积的50％乙醇溶液混合，制备成乙醇浓度为25％的含500ng/μl的siFirefly溶液。
对实施例13得到的编号为A4-13的脂质纳米颗粒，与siFirefly溶液按照质量比15：1(即体积比1.5：1)混合，轻轻摇匀后在50℃下孵育20分钟，使siFirefly尽可能地被脂质纳米颗粒包裹。在此之后，将复合物转移至截留分子量为100000道尔顿的透析管内(spectrum，G235035)，并在1×PBS中透析3小时得到siFLA4-13。
测试例6
此测试例旨在测试实施例33得到的编号为siFLA4-13制剂的细胞毒性，测试结果如表16所示：
表16：
含量 相对活力 含量 相对活力
1nM 0.98±0.06 50nM 0.96±0.02
5nM 0.99±0.02 100nM 0.97±0.06
10nM 0.98±0.05 200nM 0.94±0.04
测试例7
此测试例旨在测试实施例29得到的编号为siA4-13的制剂在4℃下的稳定性。具体地，在制剂制备完成后利用激光粒度仪检测制剂的粒径。完成操作后放置于4℃保存。此后，在第3、7、21天分别再次检测制剂的粒径，检测结果如图2所示，证明该制剂在4℃下至少可保持稳定3周。
实施例34
将Cy5-siFirefly用DEPC处理水将浓度调整至1000ng/μl，并与等体积的50％乙醇溶液混合，制备成乙醇浓度为25％的含500ng/μl的Cy5-siFirefly溶液。
对实施例13得到的编号为A4-13的脂质纳米颗粒，与Cy5-siFirefly溶液按照质量比15：1(即体积比1.5：1)混合，轻轻摇匀后在50℃下孵育20分钟，使Cy5-siFirefly尽可能地被脂质纳米颗粒包裹。在此之后，将复合物转移至截留分子量为100000道尔顿的透析管内(spectrum，G235035)，并在1×PBS 中透析3小时得到Cy-siFLA4-13，上述过程须全程避光。
测试例8
本测试例旨在检测实施例34得到的Cy-siFLA4-13在C57BL/6小鼠肝内的代谢特征。结果如图3所示，Cy-siFLA4-13在小鼠肝脏内的信号显著高于未被A4-13包裹的Cy5-siFirefly的信号，说明A4-13能显著提高siRNA在肝脏内的积累。
测试例9
此测试例旨在测试实施例29得到的编号为siA4-13制剂，在C57BL/6小鼠体内的剂量依赖行为。 ApoB mRNA表达变化以及总胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)水平变化情况分别如表17和表18所示，经计算，该制剂的半数有效剂量约为0.18mg/kg。
表17：
剂量 mRNA相对表达
1mg/kg 0.19±0.08
0.5mg/kg 0.27±0.06
0.25mg/kg 0.38±0.15
0.1mg/kg 0.56±0.23
0.05mg/kg 0.94±0.29
0.025mg/kg 0.92±0.23
0.01mg/kg 0.84±0.24
表18：
剂量 TG CHO HDL-c LDL-c
PBS 1.68±0.14 2.79±0.19 2.30±0.12 0.68±0.05
1mg/kg 0.86±0.21 1.01±0.26 0.89±0.19 0.17±0.05
0.5mg/kg 1.06±0.24 1.33±0.14 1.23±0.11 0.20±0.05
0.25mg/kg 1.11±0.21 1.73±0.25 1.58±0.19 0.31±0.09
0.1mg/kg 1.20±0.26 2.09±0.53 1.81±0.46 0.42±0.10
0.05mg/kg 1.17±0.28 2.06±0.63 1.69±0.56 0.58±0.14
0.025mg/kg 1.21±0.16 2.62±0.20 2.19±0.11 0.75±0.10
0.01mg/kg 1.47±0.19 2.57±0.16 2.09±0.14 0.64±0.08
实施例35
将实施例33得到的制剂用孔径大小为100Kd的超滤管浓缩，用RiboGreen法测定siRNA浓度后将制剂中siRNA的浓度分别调整至300ng/μl(对应给药浓度3mg/kg)和100ng/μl(对应给药浓度1mg/kg)。
测试例10
此测试例旨在测试C57BL/6小鼠接受单次注射实施例35中得到的siA4-13制剂后不同时间点ApoB mRNA表达变化以及CHO、TG、LDL-c、HDL-c水平变化。结果如图4所示，给药4周后，ApoB mRNA、TG以及LDL-c水平仍低于对照组，支持每4周给药1次。
实施例36
将实施例34得到的制剂用孔径大小为100Kd的超滤管浓缩，用RiboGreen法测定siRNA浓度后将制剂中siRNA的浓度分别调整至300ng/μl(对应给药浓度3mg/kg)和100ng/μl(对应给药浓度1mg/kg)。
测试例11
此测试例旨在测试CD1小鼠接受实施例36得到的制剂后主要血清生化指标的变化，并以此判定制剂的安全性，结果如图5所示，测试实验表明制剂的毒性满足要求。
实施例37
将siANGPTL3的浓度用DEPC处理水调整至1000ng/μl，并与等体积的50％乙醇溶液混合，制备成乙醇浓度为25％的500ng/μl的siANGPTL3溶液。
对实施例13得到的编号为A4-13的脂质纳米颗粒，与siANGPTL3溶液按照质量比15：1(即体积比1.5：1)混合，轻轻摇匀后在50℃下孵育20分钟，使siANGPTL3尽可能地被脂质纳米颗粒包裹。在此之后，将复合物转移至截留分子量为100000道尔顿的透析管内(spectrum，G235035)，并在1×PBS 中透析3小时得到siANA4-13。此后，将siANA-13的浓度调整至50 ng/μl得到siANG-H(对应给药浓度0.5mg/kg)和25ng/μl得到siANG-L(对应给药浓度0.25mg/kg)。
测试例12
此测试例旨在测试实施例36得到的siANA4-H和siANG-L在db/db小鼠体内的降血脂效果和 ANGPTL3 mRNA表达抑制能力。接受治疗后的小鼠的TG和CHO变化情况如图6所示，该实验证明模型动物接受治疗后其血脂可以明显下降到正常动物的水平。
接受siANG-H和siANG-L治疗的小鼠与接受0.5mg/kg siNC治疗的小鼠的靶基因表达对比如表19 所示，说明图6的血脂降低是由靶基因被抑制引起的。
表19：
组别 mRNA表达变化
siANG-H 0.03±0.02
siANG-L 0.15±0.06
不同治疗组动物肝脏的脂质沉积情况如图7所示，结果显示制剂有逆转肝脏中脂质沉积的能力。
实施例38
将siApoC3的浓度用DEPC处理水调整至1000ng/μl，并与等体积的50％乙醇溶液混合，制备成乙醇浓度为25％的500ng/μl的siApoC3溶液。
对实施例13得到的编号为A4-13的脂质纳米颗粒，与siApoC3溶液按照质量比15：1(即体积比 1.5：1)混合，轻轻摇匀后在50℃下孵育20分钟，使siApoC3尽可能地被脂质纳米颗粒包裹。在此之后，将复合物转移至截留分子量为100000道尔顿的透析管内(spectrum，G235035)，并在1×PBS中透析3小时得到siApoCA4-13。此后，将siApoCA-13的浓度调整至50ng/μl得到siApoC-H(对应给药浓度0.5mg/kg)和25ng/μl得到siApoC-L(对应给药浓度0.25mg/kg)。
测试例13
此测试例旨在测试hApoC3小鼠在接受实施例37得到的siApoC-H和siApoC-L治疗以及停药4周内的降血脂效果和血脂变化。接受治疗后的小鼠的TG和CHO变化情况如图8所示，该试验表明模型动物接受治疗后血脂明显降低，当停药后，血脂需经过一段时间后才会恢复至治疗前的水平。
制备例2合成含胺脂质化合物A10
合成化合物A7
Figure RE-GDA0003815960700000241
Ar气保护下加入20ml无水二氯甲烷，搅拌下加入2g反-2-十三碳烯-1-醇和1.71g3-溴丙酰氯，室温搅拌反应2h。TLC检测反应完毕，减压浓缩除去二氯甲烷后，硅胶柱纯化得淡黄色油状物2.7g，产率 89％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：5.75-5.86(1，m，CH＝CH)，5.52-5.65(1，m，CH＝CH)， 4.56-4.61(2H，d OCH2)，3.56-3.62(2H，t CH2)，2.89-2.97(2H，tCH2)，2.16-2.97(2H，m CH2)，1.22-1.45(16H，m)，0.90(3H，t，CH3)ppm。
合成化合物A8
Figure RE-GDA0003815960700000251
Ar气保护下，向反应瓶内加入10ml无水DMF，搅拌下加入280mg N-Boc-1,3-二氨基丙烷盐酸盐和 721.4mg DIPEA，室温搅拌2h后滴加1g化合物A7，于室温搅拌过夜。反应结束后，加压浓缩除去DMF，硅胶柱层析得163mg淡黄色油状物即化合物A8。产率18％。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：5.76-5.83(2H，m，CH＝CH)，5.54-5.62(2，m，CH＝CH)，4.53-4.57(4H，d OCH2)，2.71-2.78(4H，t CH2)，2.43-2.52(6H，m CH2)，2.04-2.18(4H，mCH2)，1.60-1.68(2H， m),1.43-1.50(12H，m)，1.22-1.36(32H，m)，0.84-0.90(6H，m，CH3)ppm。
合成化合物A9
Figure RE-GDA0003815960700000252
室温下将163mg化合物A8加于5ml的4M HCl乙酸乙酯溶液中，室温搅拌反应。1h后TLC检测反应。已无原料，说明反应完毕。减压浓缩除去溶剂，用真空泵浓缩5min直接用于下一步反应。
合成化合物A10
Figure RE-GDA0003815960700000253
Ar气保护下，将上步产物溶于2ml无水二氯甲烷中，加入45mg三乙胺，室温搅拌30min后滴加 14mg琥珀酰氯。于室温搅拌反应1h，TLC检测反应。反应液加10ml二氯甲烷稀释用1M盐酸洗，收集有机相，减压浓缩过硅胶柱。流动相为DCM：MeOH＝60：1加5‰氨水(不加氨水产物挂柱子)得到产物A10，淡黄色油状物56mg。两步产率37％。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：6.85(2H，s，NH),5.77-5.83(4H，m，CH＝CH)，5.52-5.61(4， m，CH＝CH)，4.51-4.55(8H，d OCH2)，3.20-3.26(4H，m)，2.71-2.77(8H，t CH2)，2.56(4H，s)，2.45-2.51(12H，m CH2)，2.07-2.15(8H，m CH2)，1.61-1.68(4H m,),1.21-1.33(64H，m)，0.85-0.91(12H， m，CH3)ppm。
MASS理论值1239.88，实测M+1＝1239.9。
实施例39
将制备例获得的脂质A10与DSPC、胆固醇、DMG-PEG(购于艾伟拓(上海)医药科技有限公司)溶于无水乙醇，浓度为20mg/ml。上述材料准备完成后，按照A10：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝72.2：8.1： 14.9：4.9的质量比将四种原料混合并全部吸入胰岛素注射器中备用。此外，另准备有机相混合液三倍体积的pH＝4.0，浓度为50mM的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液，同样全部吸入胰岛素注射器中备用。在此之后，将分别装有有机相混合液和缓冲液的胰岛素注射器至于同一个离心管中并快速释放出全部液体，轻轻摇匀离心管即制备成LNP A10-1。
实施例40
上述溶解好的四种原料按照A10：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝61.8：12.1：19.1：7.0的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP A10-2。
实施例41
上述溶解好的四种原料按照A10：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝52.1：14.6：21.5：11.5的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP A10-3。
实施例42
上述溶解好的四种原料按照A10：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝65.9：5.9：16.3：11.9的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP A10-4。
实施例43
上述溶解好的四种原料按照A10：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝64.9：10.2：21.4：3.5的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP A10-5。
实施例44
上述溶解好的四种原料按照A10：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝69.3：15.6：11.4：3.7的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP A10-6。
实施例45
上述溶解好的四种原料按照A10：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝70.2：5.3：19.3：5.3的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP A10-7。
实施例46
上述溶解好的四种原料按照A10：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝70.5：9.2：9.7：10.6的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP A10-8。
实施例47
上述溶解好的四种原料按照A10：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝69.5：13.0：14.3：3.1的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP A10-9。
在上述实施例中，A10、DSPC、胆固醇、DMG-PEG分别被设置了3个水平，如表20所示：
表20：
A10 DSPC 胆固醇 DMG-PEG
40 8 30 1.5
50 14 45 2.5
60 20 60 5
实施例39-47的配比是利用正交设计软件(正交设计助手ii V3.1)进行设计的，9个配比不同的LNP 的摩尔比与质量比如表21所示：
表21：
Figure RE-GDA0003815960700000261
Figure RE-GDA0003815960700000271
实施例48-56
对实施例39-47得到的9个不同配比的LNP，与siApoB溶液按照质量比15：1(即体积比1.5：1) 混合，轻轻摇匀后在50℃下孵育20分钟，使siApoB尽可能地被LNP包裹。在此之后，将9个LNP/siApoB 复合物转移至截留分子量为100000道尔顿的透析管内(spectrum，G235035)，并在1×PBS中透析3 小时。
测试例14
本测试例旨在检测实施例39-47得到的9个未包裹siApoB的LNP的粒径(size)、多分散系数(PDI)、表面电势(zeta)，结果如表22所示，所有制剂均有成为优良递送载体的前提。
表22：
编号 size(nm) PDI zeta(mV)
A10-1 86.54 0.190±0.004 33.65±5.30
A10-2 62.87±0.02 0.138±0.016 35.35±0.35
A10-3 62.58±0.03 0.123±0.027 34.10±0.28
A10-4 72.58±0.01 0.233±0.013 30.25±3.89
A10-5 72.32±0.01 0.172±0.013 32.90±1.56
A10-6 77.2 0.201±0.005 44.70±0.42
A10-7 64.41±0.01 0.100±0.010 46.65±1.06
A10-8 75.53±0.01 0.206±0.006 36.00±2.83
A10-9 79.68 0.218±0.004 39.78±2.21
测试例15
本测试例旨在检测实施例48-56得到的9个包裹siApoB的制剂的粒径(size)、多分散系数(PDI)、表面电势(zeta)、包封率(E.E.)和颗粒内siRNA浓度(conc)，结果如表23所示，所有制剂均有成为优良递送载体的前提。
表23：
编号 size(nm) PDI zeta(mV) E.E.(％) conc.(ng/μl)
siA10-1 180.65±3.32 0.266±0.032 -6.05±1.76 90.0±1.1 151.1
siA10-2 136.40±1.41 0.181±0.040 -3.83±0.64 88.7±0.1 142.2±0.9
siA10-3 126.15±1.20 0.172±0.006 -3.06±0.44 86.3±0.1 134.3±0.4
siA10-4 149.75±2.19 0.163±0.027 -4.13±0.21 88.1±0.2 127.7±4.0
siA10-5 148.10±0.85 0.201±0.017 -3.88±0.13 93.1±0.4 131.6±0.2
siA10-6 153.05±0.49 0.240±0.011 -0.42±0.84 90.8±0.3 149.3±2.3
siA10-7 135.25±1.20 0.119±0.013 -5.22±0.42 87.2±0.5 120.8±2.7
siA10-8 149.05±0.92 0.188±0.014 0.09±0.19 81.3±0.8 152.1±0.5
siA10-9 164.65±2.62 0.190±0.009 -3.89±0.92 89.2±0.2 110.4±0.8
测试例16
将实施例48-56得到的9个制剂进行体外转染实验，实时荧光定量PCR结果如表24所示，所有制剂均能实现基因抑制。
表24：
编号 mRNA相对表达
siA10-1 0.82±0.17
siA10-2 0.89±0.24
siA10-3 0.59±0.18
siA10-4 0.70±0.32
siA10-5 0.84±0.20
siA10-6 0.85±0.04
siA10-7 0.67±0.04
siA10-8 0.60±0.10
siA10-9 0.67±0.06
制备例3合成含胺脂质化合物B8
合成化合物B3
Figure RE-GDA0003815960700000281
将1.0g化合物B1(1.0eq)溶于15ml无水二氯甲烷中，冰浴下加入0.97g(1.01eq)三乙胺，后将0.87g(1.01eq)化合物B2滴入体系，氩气保护反应，2小时后，TLC监测原料反应毕，所得化合物 B3的粗品，未经处理直接投下一步。
合成化合物B4
Figure RE-GDA0003815960700000282
将1.92g(2.1eq)三乙胺注射进入上一步反应体系，后将4.92g肉豆蔻酰氯注射入体系，冰浴氩气保护下继续反应，2小时后，TLC监测原料反应毕，加入1M的稀盐酸洗涤三次，H2O洗涤一次，收集有机相，无水硫酸钠干燥后，减压浓缩除去溶剂，硅胶柱纯化(DCM/DCM：MeOH＝500：1)，得3.0g白色固体即化合物B4。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：6.58-5.63(1H，m，CH＝CH)，6.32-5.42(1H，d， CH＝CH)，5.68-5.73(1，d，CH＝CH)，4.18-4.30(4H，dt NCH2)，3.64-3.74(4H，t CH2)，2.30-2.38(4H， t CH2)，1.58-1.68(4H，m),1.29-1.29(42H，m)，0.85-0.90(6H，m，CH3)ppm。
合成化合物B5
Figure RE-GDA0003815960700000283
将1.0g(1.0eq)丁二胺溶于30ml无水二氯甲烷，冰浴下将5.2g(2.1eq)Boc酸酐滴入体系，搅拌反应6h，TLC监测原料反应毕，依次加入1M的稀盐酸、饱和NaHCO3洗涤，收集有机相，无水硫酸钠干燥后，减压浓缩除去溶剂，得白色固体粉末2.2g，即化合物B5。
合成化合物B6
Figure RE-GDA0003815960700000284
将1.0g(1.0eq)化合物B5溶于20ml无水二氯甲烷，冰浴下将0.55g(3.0eq)质量分数为60％的 NaH缓慢加入体系中，搅拌反应15min后，用恒压滴液漏斗将1.0g(2.0eq)CH3I缓慢滴入体系，低温反应1小时后，移至室温，反应过夜，第二天监测原料反应毕，加入1M的稀盐酸淬灭反应，减压浓缩除去DMF，后加入DCM溶解，DCM/H2O萃取洗涤，收集有机相减压浓缩除去溶剂，硅胶柱纯化 (PE；EA＝10：1)，得3.0g白色固体即化合物B6。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：3,24(4H，m)，2.83(6H， s，CH3)，1.46-1.51(4H，m)，1.38-1.48(18H，m)ppm。
合成化合物B7
Figure RE-GDA0003815960700000291
将2.5g(1.0eq)化合物B6溶于30ml HCl的EA溶液(4M)中，室温搅拌反应3小时，减压浓缩除去溶剂，得到0.8g白色固体粉末，即化合物B7。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：2.97(4H，s)，2.57(6H，s，CH3)，1.56-1.61(4H，m)ppm
合成化合物B8
Figure RE-GDA0003815960700000292
将130mg(1.0eq)化合物B7溶于15ml异丙醇中，加入142.6mg(2.05eq)三乙胺，室温搅拌反应 30min后，加入817.1mg(2.05eq)化合物B4，90℃搅拌反应24h，TLC显示原料有少量剩余，停止反应，减压浓缩除去溶剂，加入DCM溶解，后加1M的稀盐酸洗涤三次，H2O洗涤一次，收集有机相，无水硫酸钠干燥后，减压浓缩除去溶剂，硅胶柱纯化，得化合物B8 136mg，产率16％。1H NMR(400MHz， CDCl3)δ：4.19-2.24(8H，m)，3.58-3.68(8H，m)，2.67-2.76(4H，m)，2.54-2.62(4H，m)，2.25-2.34(8H， m)，2.24-2.25(6H，m)，1.61-1.70(8H，m)，1.43-1.50(4H，m)，1.23-1.32(80H，m)，0.76-0.89(12H，t， CH3)ppm。MASS理论值＝1275.99，实测值M+1＝1276.0。
实施例57
将制备例3获得的脂质B8与DSPC、胆固醇、DMG-PEG(购于艾伟拓(上海)医药科技有限公司) 溶于无水乙醇，浓度为20mg/ml。上述材料准备完成后，按照B8：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝70.1： 8.7：15.9：5.2的质量比将四种原料混合并全部吸入胰岛素注射器中备用。此外，另准备有机相混合液三倍体积的pH＝4.0，浓度为50mM的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液，同样全部吸入胰岛素注射器中备用。在此之后，将分别装有有机相混合液和缓冲液的胰岛素注射器至于同一个离心管中并快速释放出全部液体，轻轻摇匀离心管即制备成LNP B8-1。
实施例58
上述溶解好的四种原料按照B8：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝59.5：12.9：20.3：7.4的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP B8-2。
实施例59
上述溶解好的四种原料按照B8：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝49.7：15.4：22.6：12.4的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP B8-3。
实施例60
上述溶解好的四种原料按照B8：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝63.7：6.3：17.4：12.7的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP B8-4。
实施例61
上述溶解好的四种原料按照B8：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝62.6：10.9：22.8：3.7的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP B8-5。
实施例62
上述溶解好的四种原料按照B8：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝67.1：16.6：12.2：4.0的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP B8-6。
实施例63
上述溶解好的四种原料按照B8：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝68.1：5.6：20.6：5.6的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP B8-7。
实施例64
上述溶解好的四种原料按照B8：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝68.4：9.9：10.4：11.3的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP B8-8。
实施例65
上述溶解好的四种原料按照B8：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝67.4：13.9：15.3：3.4的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP B8-9。
在上述实施例中，B8、DSPC、胆固醇、DMG-PEG分别被设置了3个水平，如表25所示：
表25：
B8 DSPC 胆固醇 DMG-PEG
40 8 30 1.5
50 14 45 2.5
60 20 60 5
实施例57-65的配比是利用正交设计软件(正交设计助手ii V3.1)进行设计的，9个配比不同的LNP 的摩尔比与质量比如表26所示：
表26：
Figure RE-GDA0003815960700000301
实施例66-74
对实施例57-65得到的9个不同配比的LNP，与siApoB溶液按照质量比15：1(即体积比1.5：1) 混合，轻轻摇匀后在50℃下孵育20分钟，使siApoB尽可能地被LNP包裹。在此之后，将9个LNP/siApoB 复合物转移至截留分子量为100000道尔顿的透析管内(spectrum，G235035)，并在1×PBS中透析3 小时。
测试例17
本测试例旨在检测实施例57-65得到的9个未包裹siApoB的LNP的粒径(size)、多分散系数(PDI)、表面电势(zeta)，结果如表27所示，所有制剂均有良好的理化性质，具有成为优良递送载体的潜力。
表27：
Figure RE-GDA0003815960700000302
Figure RE-GDA0003815960700000311
测试例18
本测试例旨在检测实施例66-74得到的9个包裹siApoB的制剂的粒径(size)、多分散系数(PDI)、表面电势(zeta)、包封率(E.E.)和颗粒内siRNA浓度(conc)，结果如表28所示，所有制剂均有良好的理化性质，具有成为优良递送载体的潜力。
表28：
编号 size(nm) PDI zeta(mV) E.E.(％) conc.(ng/μl)
siB8-1 184.05±0.78 0.172±0.021 -9.16±0.85 84.9±0.8 191.2±2.1
siB8-2 131.75±0.64 0.236±0.019 1.15±0.86 90.4±1.1 189.2±0.6
siB8-3 142.40±0.14 0.160±0.002 -3.08±0.04 93.2±0.8 200
siB8-4 99.19±0.38 0.191±0.001 2.13±0.23 91.1±0.3 200
siB8-5 213.30±1.98 0.332±0.046 2.33±0.15 91.3±0.3 185.1±3.7
siB8-6 212.50±2.83 0.325±0.011 6.93±0.25 89.2±0.8 200
siB8-7 186.90±0.42 0.213 2.28±0.31 92.6±1.1 193.8±0.5
siB8-8 119.70±0.57 0.179±0.041 4.53±0.93 85.8±1.4 200
siB8-9 210.75±7.85 0.309±0.033 1.91±0.44 87.2±1.0 174.4±10.6
测试例19
将实施例66-74得到的9个制剂进行体外转染实验，实时荧光定量PCR结果如表29所示，所有制剂均能实现基因抑制。
表29：
编号 mRNA相对表达
siB8-1 0.74±0.01
siB8-2 0.96±0.07
siB8-3 0.70±0.05
siB8-4 0.80±0.12
siB8-5 0.84±0.14
siB8-6 0.49±0.04
siB8-7 0.63±0.02
siB8-8 0.66±0.05
siB8-9 0.84±0.02
制备例4合成含胺脂质化合物C3
合成化合物C2
Figure RE-GDA0003815960700000321
将200mg(2.27mmol)的1，4-丁二胺溶在10ml的异丙醇中，加入1.1g(4.76mmol)的化合物C1，体系呈无色透明状态，加热到70℃搅拌，3h后，有白色固体析出，继续加热搅拌5h后，TLC检测到原料 C1完全反应，停止反应。减压除去异丙醇后加入20ml正己烷，室温下搅拌1h，抽滤得到化合物C2(540mg，产率为47％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：3.61(2H，s)，2.58-2.65(6H，m)，2.44-2.52(2H，m)， 1.47-1.59(8H，m)，1.23-1.34(40H，m)，0.73-0.88(6H，t，CH3)ppm。
合成化合物C3
Figure RE-GDA0003815960700000322
将130mg(0.224mmol)化合物B4溶在5ml的异丙醇中，再加入57.49mg(0.112mmol)化合物C2， 90℃反应10h后，TLC检测到原料B4和C2都完全反应，停止反应。不做后处理直接硅胶柱纯化得终产物C3(54mg，产率29％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：4.25(8H，m)，3.56-3.67(10H，m)，2.24-2.95(24H，m)，1.44-1.62(12H，m)，1.17-1.39(124H，m)，0.76-0.91(18H，t，CH3)ppm。Mass理论值＝1672.68，实测M+1＝1673.6。
实施例75
将制备例4获得的脂质C3与DSPC、胆固醇、DMG-PEG(购于艾伟拓(上海)医药科技有限公司) 溶于无水乙醇，浓度为20mg/ml。上述材料准备完成后，按照C3：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝75.5： 7.1：13.1：4.3的质量比将四种原料混合并全部吸入胰岛素注射器中备用。此外，另准备有机相混合液三倍体积的pH＝4.0，浓度为50mM的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液，同样全部吸入胰岛素注射器中备用。在此之后，将分别装有有机相混合液和缓冲液的胰岛素注射器至于同一个离心管中并快速释放出全部液体，轻轻摇匀离心管即制备成LNP C3-1。
实施例76
上述溶解好的四种原料按照C3：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝65.8：10.9：17.1：6.2的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP C3-2。
实施例77
上述溶解好的四种原料按照C3：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝56.4：13.3：19.6：10.7的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP C3-3。
实施例78
上述溶解好的四种原料按照C3：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝69.7：5.3：14.5：10.6的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP C3-4。
实施例79
上述溶解好的四种原料按照C3：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝68.7：9.1：19.1：3.1的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP C3-5。
实施例80
上述溶解好的四种原料按照C3：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝72.8：13.8：10.1：3.3的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP C3-6。
实施例81
上述溶解好的四种原料按照C3：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝73.7：4.6：17.0：4.7的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP C3-7。
实施例82
上述溶解好的四种原料按照C3：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝74.0：8.2：8.5：9.3的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP C3-8。
实施例83
上述溶解好的四种原料按照C3：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝73.1：11.5：12.7：2.8的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP C3-9。
在上述实施例中，C3、DSPC、胆固醇、DMG-PEG分别被设置了3个水平，如表30所示：
表30：
C3 DSPC 胆固醇 DMG-PEG
40 8 30 1.5
50 14 45 2.5
60 20 60 5
实施例75-83的配比是利用正交设计软件(正交设计助手ii V3.1)进行设计的，9个配比不同的LNP 的摩尔比与质量比如表31所示：
表31：
Figure RE-GDA0003815960700000331
实施例84-92
对实施例75-83得到的9个不同配比的LNP，与siApoB溶液按照质量比15：1(即体积比1.5：1) 混合，轻轻摇匀后在50℃下孵育20分钟，使siApoB尽可能地被LNP包裹。在此之后，将9个LNP/siApoB 复合物转移至截留分子量为100000道尔顿的透析管内(spectrum，G235035)，并在1×PBS中透析3 小时。
测试例20
本测试例旨在检测实施例75-83得到的9个未包裹siApoB的LNP的粒径(size)、多分散系数(PDI)、表面电势(zeta)，结果如表32所示，所有制剂均有良好的理化性质，具有成为优良递送载体的潜力。
表32：
Figure RE-GDA0003815960700000332
Figure RE-GDA0003815960700000341
测试例21
本测试例旨在检测实施例84-92得到的9个包裹siApoB的制剂的粒径(size)、多分散系数(PDI)、表面电势(zeta)、包封率(E.E.)和颗粒内siRNA浓度(conc)，结果如表33所示，所有制剂均有良好的理化性质，具有成为优良递送载体的潜力。
表33：
编号 size(nm) PDI zeta(mV) E.E.(％) conc.(ng/μl)
siC3-1 197.10±0.14 0.353±0.026 -6.56±1.00 87.4±0.2 200
siC3-2 176.15±3.04 0.221±0.018 -3.82±0.01 85.3 174.2±2.0
siC3-3 112.85±0.78 0.212±0.009 1.59±0.60 83.1 200
siC3-4 152.30±0.57 0.249 -2.51±0.16 89.3±0.1 200
siC3-5 166.80±0.42 0.149±0.029 -1.95±1.47 81.4±2.6 124.8±0.8
siC3-6 302.65±5.44 0.406±0.016 -1.53±0.88 78.9±8.1 38.6±3.9
siC3-7 179.75±1.20 0.196±0.021 -2.10±0.40 91.4±2.7 81.0±1.1
siC3-8 142.25±2.33 0.187±0.022 -9.57±0.41 90.1±0.1 200
siC3-9 178.15±2.62 0.246±0.008 -0.55±0.12 78.4±5.0 46.8±1.1
测试例22
将实施84-92得到的9个制剂进行体外转染实验，实时荧光定量PCR结果如表34所示，除siC3-2 外所有制剂均能实现基因抑制。
表34：
编号 mRNA相对表达
siC3-1 0.89±0.04
siC3-2 1.10±0.30
siC3-3 0.91±0.03
siC3-4 0.40±0.12
siC3-5 0.68±0.10
siC3-6 0.78±0.09
siC3-7 0.62±0.16
siC3-8 0.65±0.13
siC3-9 0.57±0.08
实施例93
将制备例1获得的脂质A4与DOPE、胆固醇、DMG-PEG(购于艾伟拓(上海)医药科技有限公司) 溶于无水乙醇，浓度为20mg/ml。上述材料准备完成后，按照A4：DOPE：胆固醇：DMG-PEG＝45.0： 23.1：30：2.0的质量比将四种原料混合并全部吸入胰岛素注射器中备用。此外，另准备有机相混合液三倍体积的pH＝4.0，浓度为50mM的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液，同样全部吸入胰岛素注射器中备用。在此之后，将分别装有有机相混合液和缓冲液的胰岛素注射器置于同一个离心管中并快速释放出全部液体，轻轻摇匀离心管即制备成脂质纳米颗粒mA4-1。
实施例94
上述溶解好的四种原料按照A4：DOPE：胆固醇：DMG-PEG＝36.9：28.4：31.5：3.2的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP mA4-2。
实施例95
上述溶解好的四种原料按照A4：DOPE：胆固醇：DMG-PEG＝31.3：32.1：32.5：4.1的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP mA4-3。
实施例96
上述溶解好的四种原料按照A4：DOPE：胆固醇：DMG-PEG＝27.3：35.1：32.8：4.8的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP mA4-4。
实施例97
上述溶解好的四种原料按照A4：DOPE：胆固醇：DMG-PEG＝47.1：18.1：30.1：4.6的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP mA4-5。
实施例98
上述溶解好的四种原料按照A4：DOPE：胆固醇：DMG-PEG＝45.3：26.1：22.6：5.9的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP mA4-6。
实施例99
上述溶解好的四种原料按照A4：DOPE：胆固醇：DMG-PEG＝37.0：28.5：33.3：1.2的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP mA4-7。
实施例100
上述溶解好的四种原料按照A4：DOPE：胆固醇：DMG-PEG＝35.6：34.3：27.8：2.3的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP mA4-8。
实施例101
上述溶解好的四种原料按照A4：DOPE：胆固醇：DMG-PEG＝49.1：15.1：30.6：5.2的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP mA4-9。
实施例102
上述溶解好的四种原料按照A4：DOPE：胆固醇：DMG-PEG＝44.2：20.4：31.8：3.5的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP mA4-10。
实施例103
上述溶解好的四种原料按照A4：DOPE：胆固醇：DMG-PEG＝48.4：29.8：19.3：2.5的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP mA4-11。
实施例104
上述溶解好的四种原料按照A4：DOPE：胆固醇：DMG-PEG＝43.3：33.3：22.2：1.1的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP mA4-12。
实施例105
上述溶解好的四种原料按照A4：DOPE：胆固醇：DMG-PEG＝52.6：13.5：31.6：2.3的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP mA4-13。
实施例106
上述溶解好的四种原料按照A4：DOPE：胆固醇：DMG-PEG＝51.9：20.0：27.0：1.1的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP mA4-14。
实施例107
上述溶解好的四种原料按照A4：DOPE：胆固醇：DMG-PEG＝49.3：25.3：21.0：4.3的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP mA4-15。
实施例108
上述溶解好的四种原料按照A4：DOPE：胆固醇：DMG-PEG＝49.0：31.4：16.3：3.2的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP mA4-16。
在上述实施例中，A4、DOPE、胆固醇、DMG-PEG分别被设置了4个水平，如表35所示：
表35：
A4 DOPE 胆固醇 DMG-PEG
15 10 25 0.25
20 15 32 0.5
25 20 39 0.75
30 25 45 1
实施例93-108的配比是利用正交设计软件(正交设计助手ii V3.1)进行设计的，16个配比不同的 LNP的摩尔比与质量比如表36所示：
表36：
Figure RE-GDA0003815960700000361
实施例109-124
将荧光素酶mRNA(mLuc)的浓度调整至1000ng/μl，并与等体积的50％乙醇溶液混合，制备成乙醇含量为25％的500ng/μl的mLuc溶液。
对实施例93-108得到的16个不同配比的脂质纳米颗粒，与mLuc溶液按照质量比15：1(即体积比1.5：1)混合，轻轻摇匀后在50℃下孵育20分钟，使mLuc尽可能地被脂质纳米颗粒包裹。在此之后，将16个LNP/mLuc复合物转移至截留分子量为100000道尔顿的透析管内(spectrum，G235035)，并在1×PBS中透析3小时。得到的包裹了mRNA的制剂mLuA4-1–mLuA4-16。
测试例23
本测试例旨在检测实施例109-124得到的16个制剂的体外mRNA表达效率，测试结果如图9所示。结果显示16个制剂均可介导mRNA在细胞内的高效表达，其中以mLuA4-13为佳。
测试例24
本测试例旨在检测实施例121得到的mLuA4-13在C57BL/6小鼠体内的代谢特征，尾静脉注射 mLuA4-13 6小时后各主要脏器平均荧光信号强度如图10所示，表示mA4-13可介导mRNA在体内高效表达。
实施例125
将同时表达PLK1 sgRNA和Cas9蛋白的质粒pCPLK1的浓度调整至1000ng/μl，并与等体积的50％乙醇溶液混合，制备成乙醇含量为25％的500ng/μl的pCPLK1溶液。将实施例105得到的mA4-13与 pCPLK1溶液按照质量比15：1(即体积比1.5：1)混合，轻轻摇匀后在50℃下孵育20分钟，使pCPLK1 尽可能地被脂质纳米颗粒包裹并得到pCPA4-13。在此之后，将pCPA4-13复合物转移至截留分子量为 100000道尔顿的透析管内(spectrum，G235035)，并在1×PBS中透析3小时。
实施例126
将PLK1 siRNA的浓度调整至1000ng/μl，并与等体积的50％乙醇溶液混合，制备成乙醇含量为25％的500ng/μl的siPLK1溶液。将A4-13与siPLK1溶液按照质量比15：1(即体积比1.5：1)混合，轻轻摇匀后在50℃下孵育20分钟，使siPLK1尽可能地被脂质纳米颗粒包裹并得到siPLKA4-13。在此之后，将siPLKA4-13复合物转移至截留分子量为100000道尔顿的透析管内(spectrum，G235035)，并在1×PBS 中透析3小时。
测试例25
此测试例旨在测试实施例125得到的pCPA4-12在细胞水平的靶标基因的编辑效率，并与实施例126 得到的siPLKA4-13进行基因抑制效率对比，结果如表37所示。结果显示细胞接受pCPA4-12处理后靶标基因PLK1的表达明显高于siPLKA4-13，但与PBS对照组相比，仍有极显著差异，说明mA4-12有较好的基因编辑应用前景。
表37：
组别 mRNA相对表达
PBS 1.00±0.02
siPLKA4-13 0.14±0.04
pCPA4-13 0.66±0.13
实施例127
将制备例1获得的脂质A4与DOPE、胆固醇、DMG-PEG、DOTAP，(购于艾伟拓(上海)医药科技有限公司)溶于无水乙醇，浓度为20mg/ml。按照A4：DOPE：胆固醇：DMG-PEG：DOTAP＝46.4：12.6： 27.8：2.0：11.1的质量比将五种原料混合并全部吸入胰岛素注射器中备用。此外，另准备有机相混合液三倍体积的pH＝4.0，浓度为50mM的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液，同样全部吸入胰岛素注射器中备用。在此之后，将分别装有有机相混合液和缓冲液的胰岛素注射器置于同一个离心管中并快速释放出全部液体，轻轻摇匀离心管即制备成脂质纳米颗粒mDA4-1。
实施例128
上述溶解好的五种原料按照A4：DOPE：胆固醇：DMG-PEG：DOTAP＝40.8：11.1：24.5：1.8：21.9 的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP mDA4-2。
实施例129
上述溶解好的五种原料按照A4：DOPE：胆固醇：DMG-PEG：DOTAP＝35.2：9.6：21.1：1.5：32.5 的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP mDA4-3。
实施例130
上述溶解好的五种原料按照A4：DOPE：胆固醇：DMG-PEG：DOTAP＝29.9：8.1：17.9：1.3：42.8 的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP mDA4-4。
实施例131
上述溶解好的五种原料按照A4：DOPE：胆固醇：DMG-PEG：DOTAP＝24.6：6.7：14.8：1.1：52.9 的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP mDA4-5。
实施例132
上述溶解好的五种原料按照A4：DOPE：胆固醇：DMG-PEG：DOTAP＝19.5：5.3：11.7：0.9：62.7 的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP mDA4-6。
实施例133
上述溶解好的五种原料按照A4：DOPE：胆固醇：DMG-PEG：DOTAP＝14.4：3.9：8.7：0.6：72.4 的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP mDA4-7。
实施例134
上述溶解好的五种原料按照A4：DOPE：胆固醇：DMG-PEG：DOTAP＝9.5：2.6：5.7：0.4：81.8 的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP mDA4-8。
实施例135
上述溶解好的五种原料按照A4：DOPE：胆固醇：DMG-PEG：DOTAP＝4.7：1.3：2.8：0.2：91.0 的质量比混合并吸入胰岛素注射器中。另准备3倍体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液吸入胰岛素注射器并与有机相混合，轻轻摇匀即制备成LNP mDA4-9。
实施例136-144
将荧光素酶mRNA(mLuc)的浓度调整至1000ng/μl，并与等体积的50％乙醇溶液混合，制备成乙醇含量为25％的500ng/μl的mLuc溶液。
对实施例127-135得到的9个不同配比的脂质纳米颗粒，与mLuc溶液按照质量比15：1(即体积比1.5：1)混合，轻轻摇匀后在50℃下孵育20分钟，使mLuc尽可能地被脂质纳米颗粒包裹。在此之后，将9个LNP/mLuc复合物转移至截留分子量为100000道尔顿的透析管内(spectrum，G235035)，并在1×PBS中透析3小时。得到的包裹了mRNA的制剂mLuDA4-1–mLuDA4-9。
测试例26
此测试例旨在测试实施例121和136-144得到的LNP所介导的mRNA在小鼠体内的肺部靶向递送能力，结果如图11所示。结果显示加入DOTAP后能改变LNP在小鼠体内的分布行为，其中mLuDA4-2 至mLuDA4-9可实现mRNA的特异性的肺靶向递送，递送效果以mLuDA4-2为最佳。该配方克服了LNP 仅能有效地将药物递送至肝脏的缺点，实现了肺部递送，拓展了LNP的应用范围。
实施例145-149
将葡萄糖氧化酶蛋白(GOx)溶解于DEPC水中并将GOx的浓度分别调整为5000μg/ml、10000μg/ml、 20000μg/ml、40000μg/ml和80000μg/ml。将上述不同浓度的GOx溶液分别与实施例13得到的A4-13等体积混合，使得LNP与GOx的质量比分别为1：1、1：2、1：4、1：8和1：16。在此之后，将上述复合物在50℃孵育20分钟后转移至截留分子量为500000道尔顿的透析袋内(Ruitaibio)，并在1×PBS 中透析3小时，得到了包裹GOx蛋白的制剂GA4-1–GA4-5。
测试例27
此测试例旨在测试LNP与GOx在不同的质量比下，LNP对GOx的负载能力。此测试例通过BCA 法检测完成，结果如表38所示。
表38：
LNP:GOx(w/w) GOx实际浓度(μg/ml) GOx理论浓度(μg/ml) 负载率
1：1 525 2500 0.21
1：2 675 5000 0.135
1：4 990 10000 0.099
1：8 1035 20000 0.052
1：16 1285 40000 0.032
结果表明LNP可实现GOx蛋白的包裹，该过程不受二者比例的影响，但LNP对GOx的负载效率明显受到二者比例的影响。
实施例150
将siFirefly和葡萄糖氧化酶蛋白(GOx)溶解于DEPC水中，使siFirefly的浓度为500ng/μl，GOx 的浓度为156.25μg/ml。将上述溶液与实施例13得到的A4-13混合，使得LNP与siRNA的质量比为15：1，LNP与GOx的质量比为32：1。在此之后，将上述复合物在50℃孵育20分钟后转移至截留分子量为500000道尔顿的透析袋内(Ruitaibio)，并在1×PBS中透析3小时，所得制剂为siGA4-1。
实施例151
将siFirefly和葡萄糖氧化酶蛋白(GOx)溶解于DEPC水中，使siFirefly的浓度为500ng/μl，GOx 的浓度为312.5μg/ml。将上述溶液与实施例13得到的A4-13混合，使得LNP与siRNA的质量比为15： 1，LNP与GOx的质量比为16：1。在此之后，将上述复合物在50℃孵育20分钟后转移至截留分子量为500000道尔顿的透析袋内(Ruitaibio)，并在1×PBS中透析3小时，所得制剂为siGA4-2。
实施例152
将siFirefly和葡萄糖氧化酶蛋白(GOx)溶解于DEPC水中，使siFirefly的浓度为500ng/μl，GOx 的浓度为625μg/ml。将上述溶液与实施例13得到的A4-13混合，使得LNP与siRNA的质量比为15：1，LNP与GOx的质量比为8：1。在此之后，将上述复合物在50℃孵育20分钟后转移至截留分子量为500000 道尔顿的透析袋内(Ruitaibio)，并在1×PBS中透析3小时，所得制剂为siGA4-3。
实施例153
将siFirefly和葡萄糖氧化酶蛋白(GOx)溶解于DEPC水中，使siFirefly的浓度为500ng/μl，GOx 的浓度为1250μg/ml。将上述溶液与实施例13得到的A4-13混合，使得LNP与siRNA的质量比为15： 1，LNP与GOx的质量比为4：1。在此之后，将上述复合物在50℃孵育20分钟后转移至截留分子量为 500000道尔顿的透析袋内(Ruitaibio)，并在1×PBS中透析3小时，所得制剂为siGA4-4。
实施例154
将siFirefly和葡萄糖氧化酶蛋白(GOx)溶解于DEPC水中，使siFirefly的浓度为500ng/μl，GOx 的浓度为2500μg/ml。将上述溶液与实施例13得到的A4-13混合，使得LNP与siRNA的质量比为15： 1，LNP与GOx的质量比为2：1。在此之后，将上述复合物在50℃孵育20分钟后转移至截留分子量为 500000道尔顿的透析袋内(Ruitaibio)，并在1×PBS中透析3小时，所得制剂为siGA4-5。
实施例155
将siFirefly和葡萄糖氧化酶蛋白(GOx)溶解于DEPC水中，使siFirefly的浓度为500ng/μl，GOx 的浓度为5000μg/ml。将上述溶液与实施例13得到的A4-13混合，使得LNP与siRNA的质量比为15： 1，LNP与GOx的质量比为1：1。在此之后，将上述复合物在50℃孵育20分钟后转移至截留分子量为 500000道尔顿的透析袋内(Ruitaibio)，并在1×PBS中透析3小时，所得制剂为siGA4-6。
实施例156
将siFirefly和葡萄糖氧化酶蛋白(GOx)溶解于DEPC水中，使siFirefly的浓度为500ng/μl，GOx 的浓度为10000μg/ml。将上述溶液与实施例13得到的A4-13混合，使得LNP与siRNA的质量比为15： 1，LNP与GOx的质量比为1：2。在此之后，将上述复合物在50℃孵育20分钟后转移至截留分子量为 500000道尔顿的透析袋内(Ruitaibio)，并在1×PBS中透析3小时，所得制剂为siGA4-7。
实施例157
将siFirefly和葡萄糖氧化酶蛋白(GOx)溶解于DEPC水中，使siFirefly的浓度为500ng/μl，GOx 的浓度为20000μg/ml。将上述溶液与实施例13得到的A4-13混合，使得LNP与siRNA的质量比为15： 1，LNP与GOx的质量比为1：4。在此之后，将上述复合物在50℃孵育20分钟后转移至截留分子量为 500000道尔顿的透析袋内(Ruitaibio)，并在1×PBS中透析3小时，所得制剂为siGA4-8。
实施例158
将siFirefly和葡萄糖氧化酶蛋白(GOx)溶解于DEPC水中，使siFirefly的浓度为500ng/μl，GOx 的浓度为40000μg/ml。将上述溶液与实施例13得到的A4-13混合，使得LNP与siRNA的质量比为15： 1，LNP与GOx的质量比为1：8。在此之后，将上述复合物在50℃孵育20分钟后转移至截留分子量为 500000道尔顿的透析袋内(Ruitaibio)，并在1×PBS中透析3小时，所得制剂为siGA4-9。
测试例28
此测试例旨在测试LNP同时负载蛋白和siRNA的能力。此测试例通过BCA法和RiboGreen法检测完成，结果如表39所示。
表39
Figure RE-GDA0003815960700000391
结果表明LNP可同时负载GOx蛋白和siRNA。
测试例29
此测试例旨在测试实施例150-158得到的制剂中GOx的杀伤性，即检测LNP是否影响包裹在内的 GOx的功能。此测试通过MTT法完成，结果如图12显示。结果表明LNP不影响GOx的功能。
实施例159
将溶解于无水乙醇的四种原料按照A4：DSPC：胆固醇：DMG-PEG＝64.8：6.9：25.5：2.8的质量比混合，然后在混合物中加入BET bromodomain抑制剂JQ1。JQ1是一种可以抑制BRD4生物活性的小分子。待所有成分完全溶解于乙醇后，将混合物全部吸入胰岛素注射器中备用。此外，另准备有机相混合液三倍体积的pH＝4.0，浓度为50mM的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液，同样全部吸入胰岛素注射器中备用。将分别装有有机相混合液和缓冲液的胰岛素注射器置于同一个离心管中并快速释放出全部液体。此时，小分子JQ1在混合物中的浓度为1.85mg/ml。在此之后，将复合物转移至截留分子量为100000道尔顿的透析管内(spectrum，G235035)，并在1×PBS中透析3小时。所得制剂为JQA4。
测试例29
此测试例旨在测试LNP对小分子JQ1的包裹效率。取50μl JQA4与17μl 2％Triton-X-100在室温下孵育30分钟，以破坏LNP的脂质结构并释放被包裹的JQ1。将样品在-80℃冷冻12小时后冻干，然后溶解于100μl乙腈并通过HPLC-MS检测，不同浓度JQ1(标准品)和JQA4的峰面积如表40所示。经计算，LNP对JQ1的包裹效率为0.1095。证明了LNP可实现JQ1的包裹。
表40：
样品 保留时间(分钟) 峰面积(mAU.s) 浓度(mg/ml)
标准品1 17.93333333 48364.81209 0.5
标准品2 17.9 26243.95475 0.25
标准品3 17.93333333 14262.96759 0.125
标准品4 17.93333333 7019.228105 0.0625
标准品5 17.96666667 3727.460656 0.03125
标准品6 17.96666667 2111.725313 0.015625
JQA4-1 17.933 20643.45596 0.202632659
实施例160
将制备例1获得的脂质A4与胆固醇、DMG-PEG(购于艾伟拓(上海)医药科技有限公司)溶于无水乙醇，浓度为20mg/ml。上述材料准备完成后，按照A4：胆固醇：DMG-PEG＝56.3：11.1：32.6的质量比将三种原料混合并全部吸入胰岛素注射器中备用。此外，另准备有机相混合液三倍体积的pH＝4.0，浓度为50mM的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液，同样全部吸入胰岛素注射器中备用。在此之后，将分别装有有机相混合液和缓冲液的胰岛素注射器置于同一个离心管中并快速释放出全部液体，轻轻摇匀离心管即制备成脂质纳米颗粒3A4。
实施例161
将siApoB的浓度调整至1000ng/μl，并与等体积的50％乙醇溶液混合，制备成乙醇含量为25％的 500ng/μl的siApoB溶液。
对实施例160得到的脂质纳米颗粒，与siApoB溶液按照质量比15：1(即体积比1.5：1)混合，轻轻摇匀后在50℃下孵育20分钟，使siApoB尽可能地被脂质纳米颗粒包裹。在此之后，将脂质纳米颗粒 /siApoB复合物转移至截留分子量为100000道尔顿的透析管内(spectrum，G235035)，并在1×PBS中透析3小时，即得到si3A4。
实施例162
将荧光素酶mRNA(mLuc)的浓度调整至1000ng/μl，并与等体积的50％乙醇溶液混合，制备成乙醇含量为25％的500ng/μl的mLuc溶液。
对实施例160得到的脂质纳米颗粒，与mLuc溶液按照质量比15：1(即体积比1.5：1)混合，轻轻摇匀后在50℃下孵育20分钟，使mLuc尽可能地被脂质纳米颗粒包裹。在此之后，将脂质纳米颗粒 /mLuc复合物转移至截留分子量为100000道尔顿的透析管内(spectrum，G235035)，并在1×PBS中透析3小时，即得到m3A4。
测试例30
本测试例旨在测试实施例160-162得到的受试样品的粒径(size)、多分散系数(PDI)、包封率(E.E.) 和颗粒内siRNA浓度(conc)，结果如表41所示，证明该制剂能够高效地包裹siRNA和mRNA。
表41
编号 size(nm) PDI E.E.(％) conc.(ng/μl)
3A4 123.12±0.03 0.257±0.080 / /
si3A4 134.64±0.25 0.182±0.019 92％ 125.8
mA4-2 139.85±0.88 0.171±0.003 89％ 102.1
测试例31
本测试例旨在测试实施例161得到的si3A4在细胞水平对靶标mRNA表达的抑制能力，结果如表 42所示，证明在细胞水平上，si3A4的性能与商业专业试剂Lipo相当。
表42
编号 活性
Lipo/siApoB 0.823±0.066
si3A4 0.853±0.221
测试例32
本测试例旨在测试实施例162得到的m3A4在细胞水平的mRNA递送能力，结果如表43所示，证明在细胞水平上，si3A4的性能与商业专业试剂Lipo相当。
表43
编号 平均荧光信号强度
Lipo/siApoB 6730.2±234.0
m3A4 6624.9±365.2
对比例1
此对比例旨在对比制备例1得到的脂质A4与对照物脂质E的稳定性。其中，脂质E的化学结构式如图13所示。
将脂质A4与脂质E分别溶解于含有90％无水乙醇和10％浓度为0.05M、pH为4.0的柠檬酸盐(w/w) 的溶剂中。立即吸取100μl样品作为孵育前样品，立即保存于-80℃防止样品发生降解。该日即为实验第 0天。此后，分别将A4和E待测样品放置在40℃下持续孵育，分别于实验第1天、第3天、第5天和第7天吸取100μl样品并置于-80℃保存。待得到所有样品后，用HPLC测试样品的稳定性，测试结果如图14所示。测试条件如下：
表44：
参数 设置
柱型 Waters XBridge C8：186006050
流速 1ml/分钟
柱温 50℃
高压限制 10000psi
样品温度 10℃
移动项A 0.05％TFA-Water
移动项A 0.05％TFA-33％ACN-67％IPA
测试时间 16分钟
表45：
Figure RE-GDA0003815960700000411
对比例2
Lipofectime 2000(Lipo)是市售的商业转染试剂，能在细胞水平介导高效的核酸递送，然而其在动物水平几乎不能实现有效递送。本实验旨在对比siA4-13在C57小鼠体内的药效(给药剂量为0.5mg/kg)， Lipo/siApoB的相对表达为0.85，siA4-13的相对表达为0.27。结果如图15所示。实验结果证明Lipo在体内的递送效率低，而A4-13则能实现高效的siRNA递送。
对比例3
本测试例旨在检测Cy-siFLA4-13的细胞摄取效率。测试分析结果如表46所示，表明该制剂在细胞水平的递送效率与商业转染试剂相当，考虑到Lipo不能实现动物水平的核酸高效递送，A4-13的在核酸递送领域的应用潜力优势明显。
表46：
组别 平均荧光信号强度 阳性率(％)
Mock 4.3±2.3 0.4±0.1
Lipo/Cy5-sifirefly 5370.5±313.2 91.9±3.9
Cy-siFLA4-13 4502.5±477.3 90.4±4.2
对比例4
此对比例旨在对比Lipo包裹mRNA后得到的复合物与mLuA4-13在细胞水平介导的胞吞效率，测试结果如表47所示，表明Lipo与mLuA4-13都使得几乎所有细胞成功胞吞了荧光素酶mRNA，Lipo实现了更高的平均荧光信号强度，即单个细胞胞吞了更多的荧光素酶mRNA。然而，考虑到Lipo不能实现动物水平的核酸高效递送，mA4-13仍有更广阔的应用范围。
表47：
组别 平均荧光信号强度 阳性率(％)
Mock 5.3±1.9 0.8±0.2
Lipo/mLuc 6262 98.85±0.07
mLuA4-13 4381 98.25±0.07
对比例5
此对比例旨在对比以脂质E为核心脂质得到的脂质体E，进一步与siApoB孵育得到的siE与实施例 29得到的siA4-13在细胞水平介导的递送效率。结果如表48所示，表明siA4-13可实现高效的细胞水平的靶标基因抑制，而siE则几乎不能在细胞水平实现靶标基因抑制。
表48：
组别 mRNA相对表达
siE 0.891±0.072
siA-13 0.402±0.066
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (17)

1.一种化合物，其为式(I)所示化合物或式(I)所示化合物的立体异构体、互变异构体、溶剂化物、药学上可接受的盐，
Figure FDA0003643336010000011
其中，各X和Y分别各自独立地选自-CH2-或-CO-；X和Y不同时为-CH2-或-CO-，其中，各X相同或不同，各Y相同或不同；
R2选自H、任意取代的C1-C20烷基、任意取代的C1-C20烯基或任意取代的C1-C20炔基，R3选自H、任意取代的C1-C20烷基、任意取代的C1-C20烯基或任意取代的C1-C20炔基，其中，取代的基团各自独立地选自H、F、Cl、Br、CN、NO2；
R1选自
Figure FDA0003643336010000012
其中n为选自0-10的整数，Z选自
Figure FDA0003643336010000013
Figure FDA0003643336010000014
R4选自任意取代的C4-C20烷基、任意取代的C4-C20烯基或任意取代的C4-C20炔基，其中，取代的基团各自独立地选自H、F、Cl、Br、CN、NO2。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，R2选自H、任意取代的C1-C20烷基、任意取代的C1-C20烯基、任意取代的C1-C20炔基或R1，R3选自H、任意取代的C1-C20烷基、任意取代的C1-C20烯基、任意取代的C1-C20炔基或R1，其中，取代的基团各自独立地选自H、F、Cl、Br、CN、NO2；
任选地，R2选自H、CH3-或R1；R3选自H或R1；
R1选自
Figure FDA0003643336010000015
其中n为选自1-5的整数，Z选自
Figure FDA0003643336010000016
Figure FDA0003643336010000017
R4选自C4-C20烷基、C4-C20烯基或C4-C20炔基，其中，所述C4-C20烯基含有1-3个双键，所述C4-C20炔基含有1-3个三键。
3.根据权利要求2所述的化合物，其特征在于，R4选自C5-C15烷基、C5-C15烯基，其中，所述C5-C15烯基含有1-3个双键。
4.根据权利要求3所述的化合物，其特征在于，R1、R2和R3相同；
R4选自C10-C15烷基、C10-C15烯基，其中，所述C10-C15烯基含有1-3个双键。
5.根据权利要求4所示的化合物，其特征在于，所述化合物具有以下其中之一的结构：
Figure FDA0003643336010000018
Figure FDA0003643336010000021
6.权利要求1～5任一项所述的化合物在制备脂质体中的用途。
7.一种脂质体，其特征在于，所述脂质体由权利要求1～4任一项所述的化合物制成。
8.根据权利要求7所述的脂质体，其特征在于，进一步包括选自下列至少之一：疏水性脂质、双亲性脂质、缓冲试剂和有机溶剂，其中，所述双亲性脂质包括选自中性脂质、阳离子脂质和PEG-脂质的至少之一，所述疏水性脂质选自固醇；
任选地，所述中性脂质包括选自下列至少之一：二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、二月桂酰磷脂酰胆碱、焦碳酸二乙酯、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱和蛋黄卵磷脂；
任选地，所述阳离子脂质选自下列至少之一：溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵、氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵、双十二烷基二甲基溴化铵、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵、溴化三甲基十二烷基铵、溴化三甲基十四烷基铵、溴化三甲基十六烷基铵、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油酰氧基丙基铵、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油烯氧基丙基铵、溴化二甲基-3-羟丙基-2,3-二油烯氧基丙基铵、溴化二甲基-4-羟丁基-2,3-二油烯氧基丙基铵、溴化二甲基-5-羟戊基-2,3-二油烯氧基丙基铵、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十六烷氧基丙基铵、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十八烷氧基丙基铵、溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十四烷氧基丙基铵、N-(2-精胺甲酰基)-N’,N’-双十八烷基甘氨酰胺、1，2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯、3β-[N-(N’，N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇、脂质多聚-L-赖氨酸、硬脂铵；
任选地，所述PEG-脂质包括选自下列至少之一：二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-PEG、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-PEG、二肉豆蔻基甘油和二甲基丙烯酸酯；
任选地，所述固醇为胆固醇；
任选地，所述缓冲试剂为酸性缓冲试剂；
任选地，所述缓冲试剂包括选自柠檬酸、柠檬酸钠、醋酸、醋酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、三羟甲基氨基甲烷-盐酸、磷酸二氢钾-氢氧化钠、硼酸-硼砂、甘氨酸-盐酸、邻苯二甲酸-盐酸、邻苯二甲酸氢钾和磷酸二氢钠-柠檬酸的至少之一；
任选地，所述有机溶剂包括选自甲醇、乙醇、异丙醇、苯、甲苯、二甲苯、戊烷、己烷、辛烷、环己烷、环己酮、甲苯环己酮、氯苯、二氯苯、二氯甲烷、乙醚、环氧丙烷、丙酮、甲基丁酮、甲基异丁酮、乙腈、吡啶、苯酚、苯乙烯、全氯乙烯、三氯乙烯、乙烯乙二醇醚和三乙醇胺的至少之一。
9.根据权利要求8所述的脂质体，其特征在于，基于所述脂质体，所述化合物的量为3～80％mol/mol；
任选地，基于所述脂质体，所述化合物的量为20～80％mol/mol；
任选地，所述化合物、中性脂质、固醇和PEG-脂质的摩尔比为(20～80)：(5～50)：(10～60)：(0.01～20)；
任选地，所述化合物、中性脂质、固醇和PEG-脂质的摩尔比为(40～61)：(8～20)：(30～60)：(0.5～5)；
任选地，所述化合物、固醇和PEG-脂质的摩尔比为(20～80)：(5～50)：(10～60)；
优选地，所述化合物、固醇和PEG-脂质的摩尔比为(40～70)：(5～20)：(20～40)；
任选地，基于所述脂质体，所述缓冲试剂的体积为50～90％v/v；
优选地，基于所述脂质体，所述缓冲试剂的体积为75％v/v；
任选地，基于所述脂质体，所述化合物的量为3～50％mol/mol；
任选地，所述化合物、中性脂质、固醇、PEG-脂质和阳离子脂质的摩尔比为(3～50)：(1～20)：(2～50)：(0.01～10)：(5～92)；
优选地，所述化合物、中性脂质、固醇、PEG-脂质和阳离子脂质的摩尔比为(3～41)：(1～12)：(2～45)：(0.05～2)：(10～90)。
10.一种制备权利要求7～9任一项所述脂质体的方法，其特征在于，包括：
将预定量的权利要求1～5任一项所述化合物与有机溶剂混合，以便获得所述脂质体。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，进一步包括：
将预定量疏水性脂质、双亲性脂质和/或缓冲试剂与权利要求10中所获得的溶液混合，以便获得所述脂质体。
12.一种药物载体，包括权利要求1～5任一项所述的化合物或权利要求7～9任一项所述的脂质体。
13.权利要求1～5任一项所述化合物、权利要求7～9任一项所述脂质体或权利要求12所述药物载体在制备药物中的用途。
14.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有载体和药物活性成分，所述载体包括权利要求12所述药物载体。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，其特征在于，所述药物活性成分包括选自下列至少之一：
DNA分子、RNA分子、蛋白、多肽和小分子药物；
任选地，所述药物活性成分带有负电性或呈疏水性；
任选地，所述载体与所述药物活性成分的质量比为(5～50)：1，优选为，所述载体与所述药物活性成分的质量比为(5～40)：1；
任选地，所述载体与所述药物活性成分的质量比为(8～20)：1；
优选地，所述载体与所述药物活性成分的质量比为15：1。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其特征在于，所述药物活性成分含有核酸。
17.一种转染复合物，其特征在于，所述转染复合物包含权利要求1～5任一项所述的化合物或权利要求7～9任一项所述的脂质体；
任选地，所述转染复合物包含至少一种生物活性剂；
任选地，所述生物活性剂包括选自下列至少之一：
DNA分子、RNA分子、蛋白、多肽和药物。
CN202210524125.9A 2021-05-20 2022-05-13 化合物、脂质体及其用途 Pending CN115368264A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNPCT/CN2021/094937 2021-05-20
PCT/CN2021/094937 WO2022241723A1 (zh) 2021-05-20 2021-05-20 化合物、脂质体及其用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115368264A true CN115368264A (zh) 2022-11-22

Family

ID=84060038

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210524125.9A Pending CN115368264A (zh) 2021-05-20 2022-05-13 化合物、脂质体及其用途

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP4342881A1 (zh)
KR (1) KR20240011178A (zh)
CN (1) CN115368264A (zh)
WO (1) WO2022241723A1 (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103380113A (zh) * 2010-11-15 2013-10-30 生命科技公司 含胺的转染试剂及其制备和使用方法
WO2018232120A1 (en) * 2017-06-14 2018-12-20 Modernatx, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of agents
WO2019110067A1 (en) * 2017-12-07 2019-06-13 Aarhus Universitet Hybrid nanoparticle

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006138380A2 (en) * 2005-06-15 2006-12-28 Massachusetts Institute Of Technology Amine-containing lipids and uses thereof
EP2068886B1 (en) * 2006-10-03 2013-09-18 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Lipid containing formulations
CN108265052B (zh) * 2016-12-30 2021-05-28 苏州瑞博生物技术股份有限公司 一种小干扰核酸和药物组合物及其用途
CN117105811A (zh) * 2017-11-06 2023-11-24 日东电工株式会社 用于递送生物活性分子的膜融合化合物

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103380113A (zh) * 2010-11-15 2013-10-30 生命科技公司 含胺的转染试剂及其制备和使用方法
WO2018232120A1 (en) * 2017-06-14 2018-12-20 Modernatx, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of agents
WO2019110067A1 (en) * 2017-12-07 2019-06-13 Aarhus Universitet Hybrid nanoparticle

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ORAPAN PAECHAROENCHAI, 等: "Nonionic Surfactant Vesicles Composed of Novel Spermine-Derivative Cationic Lipids as an Effective Gene Carrier In Vitro", AAPS PHARMSCITECH, vol. 15, no. 3, pages 722 - 730, XP093005040, DOI: 10.1208/s12249-014-0095-x *

Also Published As

Publication number Publication date
EP4342881A1 (en) 2024-03-27
WO2022241723A1 (zh) 2022-11-24
KR20240011178A (ko) 2024-01-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2018202688B2 (en) Novel low molecular weight cationic lipids for oligonucleotide delivery
US9725720B2 (en) Low molecular weight cationic lipids for oligonucleotide delivery
AU776301B2 (en) Esters of L-carnitine or alkanoyl L-carnitines useful as cationic lipids for the intracellular delivery of pharmacologically active compounds
WO2012061259A2 (en) Novel low molecular weight cyclic amine containing cationic lipids for oligonucleotide delivery
JP6389477B2 (ja) カチオン性脂質
WO2023186149A1 (zh) 一种脂质化合物、包含其的组合物及应用
EP3733647B1 (en) Cationic lipid
CN115947672B (zh) 用于递送药物的化合物、脂质体及药物载体
AU2018359904B2 (en) Fusogenic compounds for delivery of biologically active molecules
CN115368264A (zh) 化合物、脂质体及其用途
US20240180832A1 (en) Compound, liposome, and uses thereof
JP2024521735A (ja) 化合物、リポソーム及びその使用
EP4371976A1 (en) Ionizable lipids and lipid nanoparticles containing thereof
RU2808990C2 (ru) Фузогенные соединения для доставки биологически активных молекул
CN117088825A (zh) 一种可离子化脂质、含该可离子化脂质的药物组合物及其用途
CN117800859A (zh) 具有戊二酸骨架的脂质化合物及基于其的脂质载体、核酸脂质纳米粒组合物和药物制剂
WO2023233042A1 (en) Polyvalent molecule based lipid nanoparticles for nucleic acid delivery
CN117500819A (zh) 脂质和组合物
AU2007214359B2 (en) Esters of L-carnitine or alkanoyl L-carnitines useful as cationic lipids for the intracellular delivery of pharmacologically active compounds

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination