CN115363217B - 一种益生菌喷雾干燥微胶囊的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种益生菌喷雾干燥微胶囊的制备方法，其包括如下步骤：制备WPI溶液、制备多糖溶液、制备水包油乳液、制备分离菌体、制备复合凝聚微胶囊、制备益生菌喷雾干燥微胶囊。本发明使用了复凝聚法和喷雾干燥相结合的工艺，制备出的成品大小均匀、工艺简单、存活率高，配合使用的高熔点油脂进一步提高了益生菌的存活率。

Description

一种益生菌喷雾干燥微胶囊的制备方法
技术领域
本发明属于益生菌微胶囊制剂技术领域，具体涉及到一种益生菌喷雾干燥微胶囊的制备方法。
背景技术
益生菌是指具有维持人体内菌群平衡，对人体健康产生有益作用的微生态制剂。口服足量活性益生菌有助于缓解急慢性胃肠炎、治疗腹泄、改善消化，缓解乳糖不耐症等症状。如何有效提高益生菌在生产、贮藏及销售过程中以及在宿主消化道内逆环境的抵抗力，成为国内外研究的热点。
微胶囊化是利用天然或合成的高分子成膜材料把分散均匀的固体微粒、液体或气体包覆形成微小固体颗粒的技术。其中，包裹在微胶囊内部的物质称为芯材(或囊芯物)，微胶囊外部的包覆膜称为包材(或囊壁)。物料通过微胶囊化后可制成微小颗粒添加到食品中，减小外界不利环境因素的破坏，改善其稳定性，延长货架期。利用微胶囊包埋技术能很好地解决益生菌储存期短，不耐胃酸等难题。
喷雾干燥法虽然应用广泛，但在制备益生菌微胶囊方面还存在一些不足，其最主要的原因是干燥过程中蒸发水分需要较高的温度，导致制成的微胶囊中细菌存活率低，性质不稳定。益生菌的存活情况主要依赖于菌体浓度与种类，微胶囊壁材的种类和含量以及喷雾干燥器出口的温度等。
复合凝聚法是将芯材分散在带有相反电荷的聚合物溶液中，通过改变体系pH、壁材比例等因素，使壁材因静电相互作用，溶解度下降而凝聚在芯材表面形成微胶囊析出。该法优点可以提高益生菌的包埋率，减少热空气对益生菌造成的热损伤。同时在壁材添加高熔点的油脂可以利用相转变吸热降低益生菌在喷雾干燥过程中的受到的热胁迫，提高益生菌的存活率。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种益生菌喷雾干燥微胶囊的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种益生菌喷雾干燥微胶囊的制备方法，其包括如下步骤，
制备WPI溶液：将乳清分离蛋白粉末溶于水中形成WPI溶液，冷藏进行水合；
制备多糖溶液：将多糖溶于水中制备多糖溶液，冷藏进行水合；
制备水包油乳液：取水合后的WPI溶液进行加热处理，加入高熔点油脂搅拌混合，制得O/W乳液
制备分离菌体：在无菌环境中，将益生菌从保藏状态恢复到室温状态，然后进行接种，接种在培养基中进行培养，结束后经过高速冷冻离心手机菌体沉淀物；
制备复合凝聚微胶囊：将菌体沉淀物加入O/W乳液中，然后加入多糖溶液，调整pH并保持以允许相分离制得复合凝聚微胶囊；
制备益生菌喷雾干燥微胶囊：将复合凝聚微胶囊进行喷雾干燥，制得白色的益生菌微胶囊粉末。
作为本发明所述的益生菌喷雾干燥微胶囊的制备方法的优选方案，其中：制备WPI溶液中，WPI的浓度为0.5～4wt％。
作为本发明所述的益生菌喷雾干燥微胶囊的制备方法的优选方案，其中：制备多糖溶液中，多糖为阿拉伯胶、果胶、魔芋胶、印度树胶中的一种或几种。
作为本发明所述的益生菌喷雾干燥微胶囊的制备方法的优选方案，其中：制备多糖溶液中，多糖溶液的浓度为0.5～4wt％。
作为本发明所述的益生菌喷雾干燥微胶囊的制备方法的优选方案，其中：制备水包油乳液中，乳清分离蛋白：阿拉伯胶＝1～8:1。
作为本发明所述的益生菌喷雾干燥微胶囊的制备方法的优选方案，其中：制备水包油乳液中，高熔点油脂为棕榈油、丙二醇酯、起酥油中的一种或几种。
作为本发明所述的益生菌喷雾干燥微胶囊的制备方法的优选方案，其中：按照体积计，制备水包油乳液中，高熔点油脂、WPI混合，高熔点油脂为融化状态，高熔点油脂和WPI溶液在搅拌转速为8000～11000ron的转速下搅拌5～8min。
作为本发明所述的益生菌喷雾干燥微胶囊的制备方法的优选方案，其中：按照体积计，制备水包油乳液中，高熔点油脂：WPI溶液＝1～4:4。
作为本发明所述的益生菌喷雾干燥微胶囊的制备方法的优选方案，其中：制备分离菌体中，益生菌包括鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌和长双歧杆菌中一种。
作为本发明所述的益生菌喷雾干燥微胶囊的制备方法的优选方案，其中：益生菌为鼠李糖乳杆菌GG。
本发明利用复凝聚法与喷雾干燥相结合的工艺，制备出大小均匀的高活性益生菌微胶囊，工艺简单，适合于工业化生产。同时该方法能够有效地将益生菌包埋在壁材中，同时减少喷雾干燥过程中高温对微胶囊中益生菌存活率的影响，存活率高达50％以上。
在本发明中，通过在壁材中添加高熔点油脂，利用相转变吸热降低益生菌在喷雾干燥过程中的受到的热胁迫，提高益生菌的存活率。同时结合复合凝聚的方法提高了益生菌在壁材中的包埋率，减少益生菌在热空气中的接触面积，进一步提高益生菌的存活率。结果发现本发明可制备出大小均匀的高活性益生菌微胶囊，工艺简单，适合于工业化生产。同时该方法能够有效地提高益生菌存活率，存活率高达50％以上。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明实施例1中高活性益生菌微胶囊样品图；
图2为本发明实施例1中高活性益生菌微胶囊扫描电子显微镜图；
图3为本发明实施例2中制得的不同浓度的复合凝聚微胶囊在pH2.5-7.0的Zeta电位；
图4为本发明实施例2中制得的不同浓度的WPI溶液制得的复合凝聚微胶囊的产率；
图5为本发明实施例3中制得的不同GA浓度制得的复合凝聚微胶囊在pH2.5-7.0的Zeta电位；
图6为本发明实施例3中制得的不同GA浓度制得的复合凝聚微胶囊的产率；
图7为本发明实施例4中制得的不同阴离子多糖种类制得的复合凝聚物在pH2.5-7.0的Zeta电位；
图8为本发明实施例4中制得的不同阴离子多糖种类制得的复合凝聚物的产率；
图9为本发明实施例5中制得的不同壁材中原料比例制得的复合凝聚物在pH2.5-7.0的Zeta电位；
图10为本发明实施例5中制得的不同壁材中原料比例制得的复合凝聚物的产率；
图11为本发明实施例6中制得的不同转速搅拌条件下制得的O/W乳液的粒径；
图12为本发明实施例7中制得的不同搅拌时间下制得的O/W乳液的粒径。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
我方发明中使用的粒度测量仪器为Mastersizer Nano-ZS 90激光粒度仪(英国Malvern公司)；使用的紫外分光光度计为翱艺A560紫外分光光度计。
实施例1
1、壁材溶液的制备：
(1)取一定量的乳清分离蛋白(WPI)粉末溶于水中搅拌3小时形成2wt％WPI溶液，然后将其放在4℃冰箱中，使其完全水合；
(2)取一定量的阿拉伯胶(GA)粉末溶于水中搅拌3小时形成2wt％GA溶液，然后将其放在4℃冰箱中，使其完全水合；
(3)按照比例称取一定的WPI溶液，放置于60℃的水浴锅内进行保温，将融化的起酥油加入WPI(起酥油：WPI＝3：4，w/w)溶液中，10000rpm的搅拌条件下搅拌7min使得高熔点油脂均匀分散，得到O/W乳液。
2、菌体沉淀物的制备：在无菌环境中，将鼠李糖乳杆菌GG从保藏状态恢复到室温状态，随后将菌体接种在培养基中培养，放在37℃条件下培养24小时，培养结束后经高速冷冻离心机收集菌体沉淀物。
3、复合凝聚微胶囊的制备：将所述的菌体沉淀物添加到(3)制备的乳液中。之后，在混合物中加入GA溶液，在WPI：GA＝4：1的条件下调整pH为4.00，并在4℃下保持24小时，以允许相分离。
4、益生菌喷雾干燥微胶囊的制备：将3中形成的的复合凝聚物进行喷雾干燥，进风温度为150℃，出风温度为75℃，进料流速为6mL/min。在出料口收集得到白色的益生菌微胶囊粉末。
将制得的益生菌微胶囊进行观察和电子显微镜扫描，得到图1和图2。由图1和图2可得，经过喷雾干燥的益生菌呈现均匀分散的球型颗粒状。
实施例2
复合凝聚是两种或多种带相反电荷的壁材相互作用形成复合凝聚体的过程，液体凝聚体的相互作用强度和性能受pH、生物聚合物配比等多种因素的影响。因此，确定喷雾干燥过程中壁材对益生菌的保护作用的最佳条件至关重要。采用与实施例1相同制备参数，分析了不同浓度WPI与GA的复合凝聚对体系的复合凝聚物的得率的影响。
1、壁材溶液的制备：
(1)取一定量的WPI粉末溶于水中搅拌3小时分别形成一定浓度(0.5wt％、1wt％、2wt％、4wt％)WPI溶液，然后将其放在4℃冰箱中，使其完全水合；
(2)取一定量的GA粉末溶于水中搅拌3小时形成2wt％GA溶液，然后将其放在4℃冰箱中，使其完全水合；
2、复合凝聚微胶囊的制备：将所述的壁材溶液以WPI：GA＝4：1的比例混合并搅拌均。用激光粒度仪在25℃条件下测定不同浓度WPI溶液、GA溶液及其混合体系在pH范围为2.5-7.0的条件下的zeta电位。
3、体系浊度的测定：用紫外分光光度计在25℃条件下在600nm处测定不同比例混合体系在等电点的浊度。在本次试验中，为了准确测定混合溶液的浑浊度，将混合溶液的生物聚合物浓度设置为0.05wt％，以避免混浊度过高。
4、复合凝聚物得率的测定：将不同混合体系的pH调整到各自的等电点，形成络合凝聚体。复合凝集物形成后，将pH调整后的混合物离心，收集湿凝集物，105℃干燥。
将测得的Zeta电位记录在图3中，将收集得到湿凝集物按照如下方法计算得率：对于干态的凝聚物的质量和WPI和GA所使用的质量进行测量。具体方法为：复合凝集物形成后，将pH调整后的混合物离心，收集湿态凝集物，将湿态凝集物置于105℃的恒温鼓风干燥箱中干燥2～4h，盖好盖子取出，在干燥器内冷却0.5h后称质量。重复操作，直至前后的称量差＜2mg即为质量恒定。将得到的数值带入到下述公式进行计算得到复合凝聚物得率。然后将得到的复合凝聚物得率记录在图4中。
由图4可得，2wt％浓度的WPI溶液有着最高的产率，综上所述，优选2wt％为WPI溶液的优选浓度。
实施例3
复合凝聚是两种或多种带相反电荷的壁材相互作用形成复合凝聚体的过程，液体凝聚体的相互作用强度和性能受pH、生物聚合物配比等多种因素的影响。因此，确定喷雾干燥过程中壁材对益生菌的保护作用的最佳条件至关重要。采用与实施例1相同制备参数，分析了WPI与不同浓度GA的复合凝聚对体系的复合凝聚物的得率的影响。
1、壁材溶液的制备：
(1)取一定量的WPI粉末溶于水中搅拌3小时形成2wt％WPI溶液，然后将其放在4℃冰箱中，使其完全水合；
(2)取一定量的GA粉末溶于水中搅拌3小时形成一定浓度(0.5wt％、1wt％、2wt％、4wt％)GA溶液，然后将其放在4℃冰箱中，使其完全水合；
2、复合凝聚微胶囊的制备：将所述的壁材溶液以WPI：GA＝4：1的比例混合并搅拌均。用电位仪测定WPI溶液、不同浓度GA溶液及其混合体系在pH范围为2.5-7.0的条件下的zeta电位。
3、体系浊度的测定：用紫外分光光度计在600nm处测定不同比例混合体系在等电点的浊度。在本次试验中，为了准确测定混合溶液的浑浊度，将混合溶液的生物聚合物浓度设置为0.05wt％，以避免混浊度过高。
4、复合凝聚物得率的测定：将不同混合体系的pH调整到各自的等电点，形成络合凝聚体。复合凝集物形成后，将pH调整后的混合物离心，收集湿凝集物，105℃干燥。
将测得的Zeta电位记录在图5中，将收集得到湿凝集物按照如下方法计算得率：对于干态的凝聚物的质量和WPI和GA所使用的质量进行测量。具体方法为：复合凝集物形成后，将pH调整后的混合物离心，收集湿态凝集物，将湿态凝集物置于105℃的恒温鼓风干燥箱中干燥2～4h，盖好盖子取出，在干燥器内冷却0.5h后称质量。重复操作，直至前后的称量差＜2mg即为质量恒定。将得到的数值带入到下述公式进行计算得到复合凝聚物得率。
将得到的复合凝聚物得率记录在图6中。
由图5可得，不同浓度的GA粉末有着不同的Zeta，综合优选2wt％为优选的GA溶液浓度设置，由图6可得，2wt％的GA粉末有着最高的产率，综合以上优选2wt％为优选的GA溶液浓度。
实施例4
复合凝聚是两种或多种带相反电荷的壁材相互作用形成复合凝聚体的过程，液体凝聚体的相互作用强度和性能受pH、生物聚合物配比等多种因素的影响。因此，确定喷雾干燥过程中壁材对益生菌的保护作用的最佳条件至关重要。采用与实施例1相同制备参数，分析了WPI与不同的阴离子多糖的复合凝聚对体系的复合凝聚物的得率的影响。
1、壁材溶液的制备：
(1)取一定量的WPI粉末溶于水中搅拌3小时形成2wt％WPI溶液，然后将其放在4℃冰箱中，使其完全水合；
(2)取一定量的阴离子多糖(GA)、果胶(PC)、魔芋胶(KGM)、印度树胶(GG)粉末溶于水中搅拌3小时形成2wt％水溶液，然后将其放在4℃冰箱中，使其完全水合；
2、复合凝聚微胶囊的制备：将所述的壁材溶液以WPI：阴离子多糖(W/W)＝4：1的比例混合并搅拌均。用电位仪测定阴离子多糖溶液及其混合体系在pH范围为2.5-7.0的条件下的zeta电位。
3、体系浊度的测定：用紫外分光光度计在600nm处测定不同比例混合体系在等电点的浊度。在本次试验中，为了准确测定混合溶液的浑浊度，将混合溶液的生物聚合物浓度设置为0.05wt％，以避免混浊度过高。
4、复合凝聚物得率的测定：将不同混合体系的pH调整到各自的等电点，形成络合凝聚体。复合凝集物形成后，将pH调整后的混合物离心，收集湿凝集物，105℃干燥。
将测得的Zeta电位记录在图7中，将收集得到湿凝集物按照如下方法计算得率：对于干态的凝聚物的质量和WPI和GA所使用的质量进行测量。具体方法为：复合凝集物形成后，将pH调整后的混合物离心，收集湿态凝集物，将湿态凝集物置于105℃的恒温鼓风干燥箱中干燥2～4h，盖好盖子取出，在干燥器内冷却0.5h后称质量。重复操作，直至前后的称量差＜2mg即为质量恒定。将得到的数值带入到下述公式进行计算得到复合凝聚物得率。将得到的复合凝聚物得率记录在图8中。
由图7可得，不同种类的多糖对于产生的产物有着不同的Zeta电位，使用阿拉伯胶制得成品相较其他种类多糖有着明显的更高的Zeta电位，由图8可得，阿拉伯胶制得的成品有着更高的产率，结合如上考虑，多糖的种类优选为阿拉伯胶。
实施例5
复合凝聚是两种或多种带相反电荷的壁材相互作用形成复合凝聚体的过程，液体凝聚体的相互作用强度和性能受pH、生物聚合物配比等多种因素的影响。因此，确定喷雾干燥过程中壁材对益生菌的保护作用的最佳条件至关重要。采用与实施例1相同制备参数，分析了乳清分离蛋白与阿拉伯胶的比值对体系的浊度以及复合凝聚物的得率的影响。
1、壁材溶液的制备：
(1)取一定量的乳清分离蛋白粉末溶于水中搅拌3小时形成2wt％乳清分离蛋白溶液，然后将其放在4℃冰箱中，使其完全水合；
(2)取一定量的阿拉伯胶粉末溶于水中搅拌3小时形成2wt％阿拉伯胶溶液，然后将其放在4℃冰箱中，使其完全水合；
2、复合凝聚微胶囊的制备：将所述的壁材溶液以一定不同的比例(WPI:GA(W/W)＝1:1,2:1,4:1,6:1,8:1)混合并搅拌均。用电位仪测定乳清分离蛋白溶液、阿拉伯胶溶液及其混合体系在pH范围为2.5-7.0的条件下的zeta电位。
3、体系浊度的测定：用紫外分光光度计在600nm处测定不同比例混合体系在等电点的浊度。在本次试验中，为了准确测定混合溶液的浑浊度，将混合溶液的生物聚合物浓度设置为0.05wt％，以避免混浊度过高。
4、复合凝聚物得率的测定：将不同混合体系的pH调整到各自的等电点，形成络合凝聚体。复合凝集物形成后，将pH调整后的混合物离心，收集湿凝集物，105℃干燥。
将测得的Zeta电位记录在图9中，将收集得到湿凝集物按照如下方法计算得率：对于干态的凝聚物的质量和WPI和GA所使用的质量进行测量。具体方法为：复合凝集物形成后，将pH调整后的混合物离心，收集湿态凝集物，将湿态凝集物置于105℃的恒温鼓风干燥箱中干燥2～4h，盖好盖子取出，在干燥器内冷却0.5h后称质量。重复操作，直至前后的称量差＜2mg即为质量恒定。将得到的数值带入到下述公式进行计算得到复合凝聚物得率。
将得到的复合凝聚物得率记录在图10中。
由图9可得，单纯的乳清分离蛋白具有较好的Zeta电位，由图10可得，当WPI和GA的比例为4:1时有着较好的产率，综上，优选WPI：GA＝4:1为优选的比例。
实施例6
为获得稳定的乳液，突出搅拌条件对粒径的影响，采用与实施例1相同制备参数，分析了不同搅拌速度对乳液粒径的影响。
1、壁材溶液的制备：
(1)取一定量的WPI粉末溶于水中搅拌3小时形成2wt％WPI溶液，然后将其放在4℃冰箱中，使其完全水合；
(2)按照比例称取一定的WPI溶液，放置于60℃的水浴锅内进行保温，将融化的起酥油加入WPI溶液中(起酥油：WPI＝3：4，w/w)，8000-11000rpm的搅拌条件下搅拌7min使高熔点油脂均匀分散，得到O/W乳液。
采用激光粒度仪在25℃下对得到的乳液进行粒径的测量为：将得到的数据记录在图11中。
由图11可得，随着转速的增大，乳液的粒径呈现下降的趋势，当转速在10000rpm之上时，随着转速的增大，粒径的减少趋势放缓，结合成本和性能两方面考虑，优选10000rpm作为优选的转速设置。
实施例7
为获得稳定的乳液，突出搅拌条件对粒径的影响，采用与实施例1相同制备参数，分析了不同搅拌时间对乳液粒径的影响。
1、壁材溶液的制备：
(1)取一定量的WPI粉末溶于水中搅拌3小时形成2wt％WPI溶液，然后将其放在4℃冰箱中，使其完全水合；
(2)按照比例称取一定的WPI溶液，放置于60℃的水浴锅内进行保温，将融化的起酥油加入WPI溶液中(起酥油：WPI＝3：4，w/w)，10000rpm的搅拌条件下搅拌5-8min使高熔点油脂均匀分散，得到O/W乳液。
由图12可得，随着搅拌时间的增长，乳液的粒径呈现下降趋势，当搅拌时间增长到7min或者更长时间时，粒径的减少趋势呈现下降，结合性能和成本考虑，优选7min为优选的搅拌时间。
实施例8
为进一步提高益生菌的存活率，突出高熔点油脂的添加对存活率的影响，采用与实施例1相同制备参数，分析了高熔点油脂类型对益生菌的存活率影响。
1、壁材溶液的制备：
(1)取一定量的WPI粉末溶于水中搅拌3小时形成2wt％WPI溶液，然后将其放在4℃冰箱中，使其完全水合；
(2)取一定量的GA粉末溶于水中搅拌3小时形成2wt％GA溶液，然后将其放在4℃冰箱中，使其完全水合；
(3)按照比例称取一定的WPI溶液，放置于60℃的水浴锅内进行保温，将融化的高熔点油脂(棕榈油、丙二醇酯、起酥油)加入WPI溶液中(油脂：WPI＝3：4，w/w)，10000rpm的搅拌条件下搅拌7min使得高熔点油脂均匀分散，得到O/W乳液。
2、菌体沉淀物的制备：在无菌环境中，将鼠李糖乳杆菌GG从保藏状态恢复到室温状态，随后将菌体接种在培养基中培养，放在37℃条件下培养24小时，培养结束后经高速冷冻离心机收集菌体沉淀物。
3、复合凝聚微胶囊的制备：将所述的菌体沉淀物添加到(3)制备的乳液中。之后，在混合物中加入GA溶液，在WPI：GA＝4：1的条件下调整其等电点(pH＝4)，并在4℃下保持24小时，以允许相分离。
4、益生菌喷雾干燥微胶囊的制备：将3中形成的的复合凝聚物进行喷雾干燥，进风温度为150℃，出风温度为75℃，进料流速为6mL/min。在出料口收集得到白色的益生菌微胶囊粉末。
将制得的的高熔点油脂制得的益生菌微胶囊粉末进行存活率测定，测定的方法为：益生菌存活率(％)：对于喷干后和喷干前益生菌的数据进行测量，测量的方法为平板划线法：取1g样品加入9mL灭菌后的生理盐水，用涡旋振荡器充分混合均匀后，采用10倍系列稀释，选择3个合适稀释度的样品均液，各取1mL加入无菌玻璃平板中，倒入灭菌后的MRS培养基，放入37℃培养箱中培养。每个梯度做三组平行，取平均值。将得到的数值带入下述公式中进行计算得到益生菌存活率。
将得到的数据记录在表1中。
表1不同高熔点油脂制得益生菌微胶囊粉末的存活率
由表1可得，当使用的高熔点油脂为起酥油时，制得的益生菌微生物胶囊有着最好的存活率，使用的高熔点油脂的种类优选为起酥油。
实施例9
为进一步提高益生菌的存活率，突出高熔点油脂的添加对存活率的影响，采用与实施例1相同制备参数，分析了油脂与蛋白比例对益生菌的存活率影响。
1、壁材溶液的制备：
(1)取一定量的WPI粉末溶于水中搅拌3小时形成2wt％WPI溶液，然后将其放在4℃冰箱中，使其完全水合；
(2)取一定量的GA粉末溶于水中搅拌3小时形成2wt％GA溶液，然后将其放在4℃冰箱中，使其完全水合；
(3)按照比例称取一定的WPI溶液，放置于60℃的水浴锅内进行保温，将融化的起酥油以一定的比例(1：4，2：4，3：4和4：4，w/w)加入WPI溶液中，10000rpm的搅拌条件下搅拌7min使得高熔点油脂均匀分散，得到O/W乳液。
2、菌体沉淀物的制备：在无菌环境中，将鼠李糖乳杆菌GG从保藏状态恢复到室温状态，随后将菌体接种在培养基中培养，放在37℃条件下培养24小时，培养结束后经高速冷冻离心机收集菌体沉淀物。
3、复合凝聚微胶囊的制备：将所述的菌体沉淀物添加到(3)制备的乳液中。之后，在混合物中加入GA溶液，在WPI：GA＝4：1的条件下调整其等电点(pH＝4)，并在4℃下保持24小时，以允许相分离。
4、益生菌喷雾干燥微胶囊的制备：将3中形成的的复合凝聚物进行喷雾干燥，进风温度为150℃，出风温度为75℃，进料流速为6mL/min。在出料口收集得到白色的益生菌微胶囊粉末。
将制得的的高熔点油脂制得的益生菌微胶囊粉末进行存活率测定，测定的方法为：益生菌存活率(％)：对于喷干后和喷干前益生菌的数据进行测量，测量的方法为平板划线法：取1g样品加入9mL灭菌后的生理盐水，用涡旋振荡器充分混合均匀后，采用10倍系列稀释，选择3个合适稀释度的样品均液，各取1mL加入无菌玻璃平板中，倒入灭菌后的MRS培养基，放入37℃培养箱中培养。每个梯度做三组平行，取平均值。将得到的数值带入下述公式中进行计算得到益生菌存活率。
将得到的数据记录在表2中。
表2不同油脂和蛋白比例制得益生菌微胶囊粉末的存活率
由表2可得，不同的油脂和蛋白比例有着不同的存活率，随着油脂的比例的增大，存活率有着提高的趋势，但是当油脂过多时，出现无法形成喷干粉末的效果，综合上述考虑，优选我方发明中油脂与蛋白的比例为3:4。
实施例10
为突出复合凝聚的形成以及油脂添加对益生菌存活率的影响，采用与实施例1相同制备参数，分析了不同益生菌的存活率影响。
1、壁材溶液的制备：
(1)取一定量的WPI粉末溶于水中搅拌3小时形成2wt％WPI溶液，然后将其放在4℃冰箱中，使其完全水合；
(2)取一定量的GA粉末溶于水中搅拌3小时形成2wt％GA溶液，然后将其放在4℃冰箱中，使其完全水合；
(3)按照比例称取一定的WPI溶液，放置于60℃的水浴锅内进行保温，将融化的起酥油加入WPI(起酥油：WPI＝3：4，w/w)溶液中，10000rpm的搅拌条件下搅拌7min使得高熔点油脂均匀分散，得到O/W乳液。
2、菌体沉淀物的制备：在无菌环境中，将菌种(鼠李糖乳杆菌GG、植物乳杆菌和长双歧杆菌)从保藏状态恢复到室温状态，随后将菌体接种在培养基中培养，放在37℃条件下培养24小时，培养结束后经高速冷冻离心机收集菌体沉淀物。
3、复合凝聚微胶囊的制备：将所述的菌体沉淀物添加到(3)制备的乳液中。之后，在混合物中加入GA溶液，在WPI：GA＝4：1的条件下调整pH为4.00，并在4℃下保持24小时，以允许相分离。
4、益生菌喷雾干燥微胶囊的制备：将3中形成的的复合凝聚物进行喷雾干燥，进风温度为150℃，出风温度为75℃，进料流速为6mL/min。在出料口收集得到白色的益生菌微胶囊粉末。
将制得的的高熔点油脂制得的益生菌微胶囊粉末进行存活率测定，测定的方法为：益生菌存活率(％)：对于喷干后和喷干前益生菌的数据进行测量，测量的方法为平板划线法：取1g样品加入9mL灭菌后的生理盐水，用涡旋振荡器充分混合均匀后，采用10倍系列稀释，选择3个合适稀释度的样品均液，各取1mL加入无菌玻璃平板中，倒入灭菌后的MRS培养基，放入37℃培养箱中培养。每个梯度做三组平行，取平均值。将得到的数值带入下述公式中进行计算得到益生菌存活率。
将得到的数据记录在表3中。
表3不同益生菌种类制得益生菌微胶囊粉末的存活率
由表3可得，不同的益生菌种类在本发明制备的益生菌微胶囊粉末均具备良好的存活率数据，其中保存效果最好的益生菌为鼠李糖乳杆菌GG。
对照例1(只用蛋白溶液)
1、壁材溶液的制备：取一定量的WPI粉末溶于水中搅拌3小时形成2wt％WPI溶液，然后将其放在4℃冰箱中，使其完全水合；
2、菌体沉淀物的制备：在无菌环境中，将鼠李糖乳杆菌GG从保藏状态恢复到室温状态，随后将菌体接种在培养基中培养，放在37℃条件下培养24小时，培养结束后经高速冷冻离心机收集菌体沉淀物。
3、混合芯材和壁材：将2中制备的菌体沉淀物添加到1制备的壁材并混合均匀，形成益生菌壁材混合液，调整溶液pH为7.00。
4、益生菌喷雾干燥微胶囊的制备：将3中形成的混合液进行喷雾干燥，进风温度为150℃，出风温度为75℃，进料流速为6mL/min。在出料口收集得到白色的益生菌微胶囊粉末。
将制得的的高熔点油脂制得的益生菌微胶囊粉末进行存活率测定，测定的方法为：益生菌存活率(％)：对于喷干后和喷干前益生菌的数据进行测量，测量的方法为平板划线法：取1g样品加入9mL灭菌后的生理盐水，用涡旋振荡器充分混合均匀后，采用10倍系列稀释，选择3个合适稀释度的样品均液，各取1mL加入无菌玻璃平板中，倒入灭菌后的MRS培养基，放入37℃培养箱中培养。每个梯度做三组平行，取平均值。将得到的数值带入下述公式中进行计算得到益生菌存活率。
将得到的数据和实施例1测得的存活率记录在表4中。
表4实施例1和对照例1制得益生菌微胶囊粉末的存活率
由表4可得，实施例1中制得的微胶囊的存活率显然高于对照例1。
对照例2(只用多糖溶液)
1、壁材溶液的制备：取一定量的GA粉末溶于水中搅拌3小时形成2wt％GA溶液，然后将其放在4℃冰箱中，使其完全水合。
2、菌体沉淀物的制备：在无菌环境中，将鼠李糖乳杆菌GG从保藏状态恢复到室温状态，随后将菌体接种在培养基中培养，放在37℃条件下培养24小时，培养结束后经高速冷冻离心机收集菌体沉淀物。
3、混合芯材和壁材：将2中制备的菌体沉淀物添加到1制备的壁材并混合均匀，形成益生菌壁材混合液，调整溶液pH为7.00。
4、益生菌喷雾干燥微胶囊的制备：将3中形成的混合液进行喷雾干燥，进风温度为150℃，出风温度为75℃，进料流速为6mL/min。在出料口收集得到白色的益生菌微胶囊粉末。
将制得的的高熔点油脂制得的益生菌微胶囊粉末进行存活率测定，测定的方法为：益生菌存活率(％)：对于喷干后和喷干前益生菌的数据进行测量，测量的方法为平板划线法：取1g样品加入9mL灭菌后的生理盐水，用涡旋振荡器充分混合均匀后，采用10倍系列稀释，选择3个合适稀释度的样品均液，各取1mL加入无菌玻璃平板中，倒入灭菌后的MRS培养基，放入37℃培养箱中培养。每个梯度做三组平行，取平均值。将得到的数值带入下述公式中进行计算得到益生菌存活率。
将得到的数据和实施例1测得的存活率记录在表5中。
表5实施例1和对照例2制得益生菌微胶囊粉末的存活率
由表5可得，实施例1中制得的微胶囊的存活率显然高于对照例2。
对照例3(缺少油脂和复合凝聚)
1、壁材溶液的制备：
(1)取一定量的WPI粉末溶于水中搅拌3小时形成2wt％WPI溶液，然后将其放在4℃冰箱中，使其完全水合；
(2)取一定量的GA粉末溶于水中搅拌3小时形成2wt％GA溶液，然后将其放在4℃冰箱中，使其完全水合；
(3)将(1)和(2)制备的壁材溶液以质量比为4：1的比例进行混合均匀。
2、菌体沉淀物的制备：在无菌环境中，将鼠李糖乳杆菌GG从保藏状态恢复到室温状态，随后将菌体接种在培养基中培养，放在37℃条件下培养24小时，培养结束后经高速冷冻离心机收集菌体沉淀物。
3、复合凝聚微胶囊的制备：将所述的菌体沉淀物添加到(3)制备的乳液中。之后，在混合物中加入GA溶液，在WPI：GA＝4：1的条件下调整pH为7.00，使其不发生相分离。
4、益生菌喷雾干燥微胶囊的制备：将3中形成的的复合凝聚物进行喷雾干燥，进风温度为150℃，出风温度为75℃，进料流速为6mL/min。在出料口收集得到白色的益生菌微胶囊粉末。
将制得的的高熔点油脂制得的益生菌微胶囊粉末进行存活率测定，测定的方法为：益生菌存活率(％)：对于喷干后和喷干前益生菌的数据进行测量，测量的方法为平板划线法：取1g样品加入9mL灭菌后的生理盐水，用涡旋振荡器充分混合均匀后，采用10倍系列稀释，选择3个合适稀释度的样品均液，各取1mL加入无菌玻璃平板中，倒入灭菌后的MRS培养基，放入37℃培养箱中培养。每个梯度做三组平行，取平均值。将得到的数值带入下述公式中进行计算得到益生菌存活率。
将得到的数据和实施例1测得的存活率记录在表6中。
表6实施例1和对照例3制得益生菌微胶囊粉末的存活率
由表6可得，实施例1中制得的微胶囊的存活率显然高于对照例3。
对照例4(缺少油脂)
1、壁材溶液的制备：
(1)取一定量的WPI粉末溶于水中搅拌3小时形成2wt％WPI溶液，然后将其放在4℃冰箱中，使其完全水合；
(2)取一定量的GA粉末溶于水中搅拌3小时形成2wt％GA溶液，然后将其放在4℃冰箱中，使其完全水合；
(3)将(1)和(2)制备的壁材溶液以质量比为4：1的比例进行混合均匀。
2、菌体沉淀物的制备：在无菌环境中，将鼠李糖乳杆菌GG从保藏状态恢复到室温状态，随后将菌体接种在培养基中培养，放在37℃条件下培养24小时，培养结束后经高速冷冻离心机收集菌体沉淀物。
3、复合凝聚微胶囊的制备：将所述的菌体沉淀物添加到(3)制备的乳液中。之后，在混合物中加入GA溶液，在WPI：GA＝4：1的条件下调整其等电点(pH＝4.00)，并在4℃下保持24小时，允许发生相分离。
4、益生菌喷雾干燥微胶囊的制备：将3中形成的的复合凝聚物进行喷雾干燥，进风温度为150℃，出风温度为75℃，进料流速为6mL/min。在出料口收集得到白色的益生菌微胶囊粉末。
将制得的的高熔点油脂制得的益生菌微胶囊粉末进行存活率测定，测定的方法为：益生菌存活率(％)：对于喷干后和喷干前益生菌的数据进行测量，测量的方法为平板划线法：取1g样品加入9mL灭菌后的生理盐水，用涡旋振荡器充分混合均匀后，采用10倍系列稀释，选择3个合适稀释度的样品均液，各取1mL加入无菌玻璃平板中，倒入灭菌后的MRS培养基，放入37℃培养箱中培养。每个梯度做三组平行，取平均值。将得到的数值带入下述公式中进行计算得到益生菌存活率。
将得到的数据和实施例1测得的存活率记录在表4中。
表7实施例1和对照例4制得益生菌微胶囊粉末的存活率
由表7可得，实施例1中制得的微胶囊的存活率显然高于对照例4。
对照例5(缺少复合凝聚的形成)
1、壁材溶液的制备：
(1)取一定量的WPI粉末溶于水中搅拌3小时形成2wt％WPI溶液，然后将其放在4℃冰箱中，使其完全水合；
(2)取一定量的GA粉末溶于水中搅拌3小时形成2wt％GA溶液，然后将其放在4℃冰箱中，使其完全水合；
(3)按照比例称取一定的WPI溶液，放置于60℃的水浴锅内进行保温，将融化的高熔点油脂加入WPI溶液中，10000rpm的搅拌条件下搅拌5-8min使得高熔点油脂均匀分散，得到O/W乳液。
2、菌体沉淀物的制备：在无菌环境中，将鼠李糖乳杆菌GG从保藏状态恢复到室温状态，随后将菌体接种在培养基中培养，放在37℃条件下培养24小时，培养结束后经高速冷冻离心机收集菌体沉淀物。
3、复合凝聚微胶囊的制备：将所述的菌体沉淀物添加到(3)制备的乳液中。之后，在混合物中加入GA溶液，在WPI：GA＝4：1的条件下调整pH为7.00，使其不发生相分离。
4、益生菌喷雾干燥微胶囊的制备：将3中形成的的复合凝聚物进行喷雾干燥，进风温度为150℃，出风温度为75℃，进料流速为6mL/min。在出料口收集得到白色的益生菌微胶囊粉末。
将制得的的高熔点油脂制得的益生菌微胶囊粉末进行存活率测定，测定的方法为：益生菌存活率(％)：对于喷干后和喷干前益生菌的数据进行测量，测量的方法为平板划线法：取1g样品加入9mL灭菌后的生理盐水，用涡旋振荡器充分混合均匀后，采用10倍系列稀释，选择3个合适稀释度的样品均液，各取1mL加入无菌玻璃平板中，倒入灭菌后的MRS培养基，放入37℃培养箱中培养。每个梯度做三组平行，取平均值。将得到的数值带入下述公式中进行计算得到益生菌存活率。
将得到的数据和实施例1测得的存活率记录在表8中。
表8实施例1和对照例5制得益生菌微胶囊粉末的存活率
由表8可得，实施例1中制得的微胶囊的存活率显然高于对照例5。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (2)

1.一种益生菌喷雾干燥微胶囊的制备方法，其特征在于：包括如下步骤，
制备WPI溶液：将乳清分离蛋白粉末溶于水中形成WPI溶液，冷藏进行水合；
制备多糖溶液：将多糖溶于水中制备多糖溶液，冷藏进行水合；
制备水包油乳液：取水合后的WPI溶液进行加热处理，加入高熔点油脂搅拌混合，制得O/W乳液；
制备分离菌体：在无菌环境中，将益生菌从保藏状态恢复到室温状态，然后进行接种，接种在培养基中进行培养，结束后经过高速冷冻离心收集菌体沉淀物；
制备复合凝聚微胶囊：将菌体沉淀物加入O/W乳液中，然后加入多糖溶液，调整pH并保持以允许相分离制得复合凝聚微胶囊；
制备益生菌喷雾干燥微胶囊：将复合凝聚微胶囊进行喷雾干燥，制得白色的益生菌微胶囊粉末；
所述制备WPI溶液中，WPI溶液的浓度为2 wt%；
所述多糖为阿拉伯胶，多糖溶液的浓度为2 wt%；
所述乳清分离蛋白溶液：阿拉伯胶溶液=4:1；
所述高熔点油脂为起酥油；
所述制备水包油乳液中，所述高熔点油脂：WPI溶液=3:4；
所述益生菌为鼠李糖乳杆菌GG。
2.根据权利要求1所述的益生菌喷雾干燥微胶囊的制备方法，其特征在于：按照体积计，所述制备水包油乳液中，高熔点油脂、WPI溶液混合，所述高熔点油脂为融化状态，所述高熔点油脂和WPI溶液在搅拌转速为8000~11000rpm的转速下搅拌5~8min。
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