KR20150039469A - 바이오폴리머 마이크로캡슐 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은(a) 단백질 및 식이섬유질의 용액을 각각 준비하는 단계; (b) 상기 (a)단계의 단백질 용액에 핵물질을 첨가한 후 균질화하여 유중수적형(O/W)형태의 1차 에멀젼을 형성하는 단계; (c) 상기 (b)단계의 유중수적형(O/W)형태의 1차 에멀젼에 상기 (a)단계의 식이섬유질 용액을 첨가한 후 50 내지 160 rpm의 교반속도로 10 내지 100 초 동안 균질화하여 유중수중수적형(O/W/W)형태의 에멀젼을 형성하는 단계; 및 (d) 상기 (c)단계에서 제조한 O/W/W형태의 에멀젼에 응고제를 첨가하여 겔화시키는 단계;를 포함하는 바이오폴리머 마이크로캡슐의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 바이오폴리머 마이크로캡슐을 제조하는 단계 중에 두 개의 상으로 분리되는 바이오폴리머를 이용하여 제조비용이 저렴하고, 공정이 간단한 마이크로캡슐을 제공한다. 또한, 본 발명의 제조방법으로 제조된 바이오폴리머 마이크로캡슐은 oil-water-in-water(O/W/W)형 에멀젼을 형성하여 핵물질이 가지는 이취 및 이미를 감소시켜 섭취시 거부감을 해결할 수 있고, 산화 안정성 및 저장성을 나타낸다. 아울러 천연 고분자가 가지고 있는 항균성, 항산화성, 식이섬유 등의 성분이 이행되어 기능성 식품뿐만 아니라, 의약 및 화장품 산업에 활용할 수 있다.

Description

바이오폴리머 마이크로캡슐 및 그 제조방법{Composition of biopolymer microcapsule and method of preparation}

본 발명은 바이오폴리머 마이크로캡슐 및 그 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 열, 산화 등에 안전하고, 생리활성 물질의 저장성을 가지는 유중수중수형(oil-water-water, O/W/W형) 바이오폴리머 마이크로캡슐 및 그 제조방법에 관한 것이다.

건강에 대한 관심이 증대되고 사람들의 기호가 다양해지면서 기능성은 좋으나 물질자체의 이취 또는 이미 등으로 인하여 사용에 제한이 있는 지질생리활성 물질의 사용상 한계를 극복하기 위한 다양한 시도가 행해지고 있는데, 이의 해결책의 하나가 지질생리활성 물질을 미세캡슐화(micro-encapsulation)하여 이용하는 것이다.

상기 미세캡슐화(microencapsulation)란 미세하게 분산된 기능성 생리활성물질을 핵물질(core material)로 하여 수 마이크로미터(㎛)에서 수백 마이크로미터(㎛) 크기의 피막(film)을 형성시키는 공정으로, 의료, 전기/전자, 농화학, 식품, 환경 등 다양한 분야에 걸쳐 널리 사용되고 있다, 특히, 식품산업에서 미세캡슐화는 향기성분, 비타민, 필수지방산, 미생물 및 효소 등의 기능성 지질생리활성 물질을 빛, 산소 및 수분과 같은 외부 환경으로부터 격리시켜 물질의 산화를 방지하여 보존성 향상 및 용출 속도를 조절할 수 있고, 취식에 문제가 되는 냄새 및 맛을 차단시켜 기능성 물질을 직접 섭취 가능하게 하며, 액상 식품의 경우 고형화를 통해 취급을 간편하게 할 수 있는 장점을 가진다.

일반적으로 캡슐화에 사용되는 피복물질은 탄수화물, 단백질, 검류, 셀룰로오스 계통 등의 고분자 물질들이 사용되고 있는데, 이러한 고분자 물질들은 기본적으로 피막형성능 및 유화 안전성이 우수하며, 가공저장 중 핵물질과 반응성이 적고 외부 환경으로부터 핵물질을 보호하며, 용해도가 우수하다고 알려져 있다.

이와 같은 미세캡슐을 제조하는 방법은 피복물질을 핵물질, 계면활성제 및 용매와 함께 유화시켜 유제(emulsion, 에멀젼)시킨 후 고정화시켜 캡슐을 만드는 유화법이 주로 사용되고 있으며, 이 외에도 액중 건조법, 동결 건조법, 상분리법(coacervation), 스프레이 건조법 및 분무 건조법 등이 있다. 유제(emulsion)란 서로 섞이지 않는 두 액체가 일정한 비를 가지고 작은 액적의 형태로 다른 액체에 분산된 상태로, 물에 기름이 분산된 Oil-in-Water형(O/W형, 유중수형), 기름에 물이 분산된 Water-in-Oil형(W/O형, 유중수형) 및 다중유제형(W/O/W형, O/W/O형 등)으로 존재한다. 그 예로, 우유, 크림, 아이스크림, 드레싱 소스, 스프 또는 마요네즈 등이 있다. 그러나 이러한 유화형 식품들을 코팅하고 있는 피복물질은 열처리를 통해 겔화과정이 이루어지므로 지질 물질이 산화될 수 있다는 문제점이 있다. 이에 다층의 입자를 가지며 지질생리활성 물질의 산화를 최소화할 수 있는 미세캡슐 입자에 대한 연구가 진행되고 있다.

이와 관련된 기술로 대한민국 등록특허 제10-0544443호는 음이온계면활성제, 코아세르베이션 강화성분인 키토산 수중유중수중(W₁/O/W₂)형의 다중에멀젼 방식을 이용한 키토산마이크로캡슐의 제조방법에 대하여 개시하고 있고, 대한민국 등록특허 제10-0638602호는 친유형으로 변형된 폴리프록토스계 고분자 유화제를 이용한 수중유중수(W/O/W)상의 화장료 및 그 제조방법에 대하여 개시하고 있으며, 대한민국 등록특허 제10-0616133호는 열, 산화에 불안정한 고도불포화지방산을 단백질계 피복물질과 트란스글루타미나제 효소를 이용하여 유중수중수형(O/W/O형) 다중유화액을 이용한 미세캡슐의 제조방법에 대하여 개시하고 있다. 그러나 상기 특허문헌의 다중유제형(W/O/W 또는 O/W/O 등)을 제조하는 공정이 복잡하고, 단일유제형(O/W 또는 W/O형)의 단일유화액을 이용하여 제조된 미세캡슐보다 산화 안정성 및 저장기간이 낮아 전단력이 떨어지며, 유화액 제조시 사용되는 계면활성제 및 용액은 독성을 가진 합성물질이기 때문에 식품 또는 약품 등의 전달체로 사용하기에 문제점이 있다. 따라서 식품 및 약품 전달체로 적절한 피복물질, 산화 안정성 및 저장기간이 향상된 다중유제형의 다중 유화액 및 캡슐화기술이 필요하다.

이에 본 발명자들은 제조공정이 간단하고, 유중수중수형(Oil-in-water-in-water, O/W/W형)의 에멀젼을 이용하여 열, 산화 등의 안정성 및 저장성을 가지는 바이오폴리머 마이크로캡슐의 제조방법을 개발하고자 노력하였으며, 그 결과 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 단백질 및 식이섬유질을 이용하여 유중수중수형(Oil-in-water-in-water, O/W/W형)의 에멀젼을 형성하는 바이오폴리머 마이크로캡슐의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 방법에 의하여 제조된 바이오폴리머 마이크로캡슐 및 산업적 용도를 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 단백질 및 식이섬유질의 용액을 각각 준비하는 단계; (b) 상기 (a)단계의 단백질 용액에 핵물질을 첨가한 후 균질화하여 유중수적형(O/W)형태의 1차 에멀젼을 형성하는 단계; (c) 상기 (b)단계의 유중수적형(O/W)형태의 1차 에멀젼에 상기 (a)단계의 식이섬유질 용액을 첨가한 후 50 내지 160 rpm의 교반속도로 10 내지 100 초 동안 균질화하여 유중수중수적형(O/W/W)형태의 에멀젼을 형성하는 단계; 및 (d) 상기 (c)단계에서 제조한 O/W/W형태의 에멀젼에 응고제를 첨가하여 겔화시키는 단계;를 포함하는 바이오폴리머 마이크로캡슐의 제조방법에 관한 것이다.

이하에서는, 본 발명에 따른 바이오폴리머 마이크로캡슐의 제조방법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

(a) 단백질 용액 및 식이섬유질 용액을 각각 준비하는 단계이다.

단백질과 식이섬유질은 대표적인 식품 거대분자들로서, 두 거대분자의 상호작용으로 인해 구조적 기능성이 결정되어 겔화제, 증점제, 에멀젼 및 안정제로서 역할을 하고 있다. 구체적으로 상기 단백질 용액과 식이섬유질 용액을 혼합하는 용액의 농도, 단백질과 식이섬유의 종류, pH, 온도, 이온강도 등에 따라 수용성 복합체(soluble complex), 불용성 복합체(insoluble complex), 단일상의 혼합물(single-phase mixtures) 및 2 상의 혼합물(two-phase mixtures)을 형성할 수 있다. 하나의 예로 단백질과 식이섬유질의 교차결합이 용이하게 이루어지도록 단백질에 열처리를 하여 음전하의 결합반응 위치를 노출시켜 두 개의 상이 분리된 에멀젼을 형성하며, 이를 높은 온도에서 반응시켜 더욱 강한 겔을 형성할 수 있다. 그러나 단백질은 어느 범위 수준 이상의 열에 노출될 경우 단백질의 성질이 변성되거나 단백질이 응축되는 문제점이 있다.

따라서 본 발명의 단백질 용액 및 식이섬유질 용액은 pH 2.0 내지 pH 10.0, 바람직하게는 pH 5.0 내지 pH 10.0의 수소이온농도를 가지는 것이 바람직하다. 상기 단백질 용액 및 식이섬유질 용액의 pH가 2.0 미만인 경우 단백질 용액은 양 전하값을 가지고 식이섬유 용액은 음 전하값을 가져 상 분리가 이루어지지 않으며, 상기 단백질 용액 및 식이섬유질 용액의 pH가 10.0을 초과하는 경우 두 용액 모두 음전하값을 가지나 그 이하의 pH 값을 가지는 용액에 비하여 전하값의 증가가 일어나지 않아 비효율적이다.

또한, 본 발명의 상기 단백질 용액과 식이섬유질 용액은 하기 (c) 단계를 통해 혼합되어 핵물질을 피복하는 두 개의 상이 분리된 에멀젼을 형성하게 되는데, 이때 상기 단백질은 단백질 용액의 총 중량에 대하여 2 내지 20중량%, 바람직하게는 5 내지 15중량%, 식이섬유질은 식이섬유질 용액의 총 중량에 대하여 0.5 내지 4중량%, 바람직하게는 2 내지 4중량%로 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 단백질의 함량이 2중량% 미만이거나 식이섬유질의 함량이 0.5중량% 미만인 경우 두 용액의 상 분리가 이루어지지 않으며, 단백질의 함량이 20중량%를 초과하거나 식이섬유질의 함량이 4중량%를 초과하는 경우 두 용액의 상 분리가 이루어지기는 했으나 위층의 시료는 불투명하고 아래층의 시료는 투명하다는 문제가 있다.

본 발명에 있어서, 상기 단백질은 핵물질의 코팅하여 외부환경으로부터 핵물질의 산화를 방지하는 효능을 가지는 것이라면 그 종류가 제한되지는 않으나, 바람직하게는 유청단백질, 대두단백질, 젤라틴 및 카제인 중의 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 식이섬유질은 단백질과 교차결합을 통해 겔화과정시 영향을 받지 않는 것이라면 그 종류가 제한되지는 않으나, 바람직하게는 구아검, 고멕토실 펙틴 및 카파-카라기난 중의 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

상기 pH 및 농도를 가지는 단백질 용액과 식이섬유질 용액을 혼합하는 경우 별도의 처리공정 없이 두 개의 상으로 분리되는 water-in-water(W/W)형의 에멀젼을 형성할 수 있으므로, 이후 겔화과정을 통해 단백질의 성질 변화 또는 응집 등이 일어나는 일 없이 마이크로캡슐을 제조할 수 있다.

(b) 유중수적형(Oil-in-Water; O/W형) 에멀젼을 형성하는 단계이다.

상기 (a)단계의 열변성된 단백질 용액에 핵물질을 첨가한 후 균질화하여 유중수적형(O/W형) 에멀젼을 형성하는 단계이다. 상기 균질화는 단백질 용액과 핵물질이 고르게 섞이도록 하는 방법이라면 이에 한정되지는 않으나, 바람직하게는 5,000 내지 10,000 rpm에서 2 내지 15 분, 바람직하게는 2 내지 8 분 동안 균질하여 유중수적형(O/W형) 에멀젼을 형성할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 핵물질은 바이오폴리머 입자에 둘러싸일 수 있는 크기를 가진 것이라면 그 종류가 제한되지 않으며, 고체 또는 액체 모두 사용 가능하다. 예를 들어, 어유, 비타민, 카로티노이드, 식물성스테롤, 미네랄, 계란, 효소, 유산균, DHA, EPA, DPA, 포화지방산 또는 불포화지방산 등이다.

(c) 유중수중수적형(Oil-in-Water-in-Water; O/W/W형) 에멀젼을 형성하는 단계이다.

상기 (b)단계에서 형성한 유중수적형(O/W형) 에멀젼에 상기 (a)단계의 식이섬유질 용액을 첨가한 후 균질화하여 유중수중수적형(O/W/W형) 에멀젼을 형성하는 단계이다.

상기 균질화는 O/W형 에멀젼과 식이섬유질 용액을 혼합하는 것으로, 교반속도 50 내지 160 rpm, 바람직하게는 80 내지 120 rpm의 교반속도로 10 내지 100 초, 바람직하게 30 내지 70 초 동안 이루어지는 것이 바람직하다. 상기 교반속도가 50 rpm 미만이거나 교반시간이 10 초 미만인 경우 유중수중수적형(O/W/W형)의 에멀젼이 형성되지 않아 핵물질의 맛, 냄새 및 산패를 충분히 차단시키지 못하며, 교반속도가 160 rpm을 초과하거나 교반시간이 100 초를 초과하는 경우 그 이하의 조건에서 교반하여 제조된 마이크로캡슐과 비교하였을 때 마이크로캡슐의 형태 및 크기가 유사하므로 비효율적이다.

본 발명에 있어서, 상기 교반속도 및 시간으로 균질화하여 유중수중수적형(O/W/W형) 에멀젼을 제조하는 경우 10 내지 25 ㎛ 크기를 형성하여 핵물질의 저장성 및 산화 안정성을 가지는 효과가 있다.

하나의 구체적 실시에서, 10중량%의 유청단백질 용액(pH8.0) 10 ml과 3중량%의 고멕톡실 펙틴 용액(pH8.0) 10 ml을 혼합하고 80 내지 160 rpm의 교반속도로 10 내지 100 초 동안 교반하여 제조한 W/W형 에멀젼의 크기를 측정한 결과, 100 rpm의 교반속도로 50 초 동안 교반하여 제조한 W/W형 에멀젼이 가장 균일하고 약 15 내지 20 ㎛의 크기를 가지는 것으로 확인되었다.

(d) 겔화단계이다.

상기 (c)단계에서 제조된 O/W/W형 에멀젼에 응고제를 첨가하여 단백질 용액을 겔화시켜 바이오폴리머 마이크로캡슐로 고정시키는 단계이다.

본 발명의 응고제(Coagulant)는 단백질을 침전 또는 겔화시키는 양전하 물질로, 단백질의 아미노기(-NH₂)와 카르복실기(-COOH)간의 탈수반응을 촉진시켜 응고시키는 역할을 한다.

상기 응고제는 O/W/W형 에멀젼의 단백질 용액을 고정시키는 것이라면 어느 것이나 사용 가능하며, 예를 들어 염화나트륨(NaCl), 탄산칼슘(CaCO₃), 염화칼슘(CaCl₂), 글루코노 델타 락톤(Glucono-delta-lactone, GDL) 및 인산수소 나트륨(NaH₂PO₄)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이들의 수화물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 염화칼슘(CaCl₂) 및 글루코노 델타 락톤(Glucono-delta-lactone, GDL)이다.

하나의 구체적 실시에서, 10중량%의 유청단백질(pH 8) 10 ml과 3중량%의 고메톡실 펙틴 용액(pH 8) 10 ml을 혼합하여 W/W형 에멀젼을 형성한 후 0.1 M의 염화나트륨(NaCl), 탄산칼슘(CaCO₃), 염화칼슘(CaCl₂), 글루코노 델타 락톤(Glucono-delta-lactone, GDL) 및 인산수소 나트륨(NaH₂PO₄)을 각각 10 ml씩 첨가하여 유청단백질의 겔화 정도를 관찰한 결과, 염화칼슘 및 글루코노 델타 락톤은 유청단백질을 완전히 응고시키며, 이 중 글루코노 델타 락톤이 염화칼슘에 비하여 짧은 시간에 유청단백질을 응고시키는 것을 확인하였다.

본 발명에 따른 상기 응고제를 첨가하여 O/W/W형 에멀젼을 히드로겔(hydrogel)을 형성하는 경우 열처리를 통해 히드로겔을 형성하는 것과 유사한 겔을 형성할 수 있다. 또한, 지질 생리활성물질의 저장 및 산화 안정성을 가지는 효과를 가진다.

하나의 구체적 실시에서, 10중량%의 유청단백질 용액(pH8.0) 10 ml과 어유 1 ml을 혼합한 후 10,000 rpm의 교반속도로 5 분 동안 균질화하여 O/W형 에멀젼을 제조하였다. 그 다음 3중량%의 고메톡실 용액(pH8.0) 10 ml을 첨가한 후 100 rpm의 교반속도로 50 초 동안 균질화하여 O/W/W형 에멀젼을 제조하고, 0.1 M의 GDL 10 ml를 첨가하여 제조된 마이크로캡슐의 크기, 캡슐효율, 방출속도 및 지방산패도를 측정한 결과, 약 14 ㎛ 크기의 마이크로캡슐을 형성하고 240 시간 후에 산성조건에서는 62.31%를 방출하였고, 중성조건에서는 94.81%를 방출하므로 약 79%의 캡슐효율을 가지며, 지질 과산화물인 말론디알데이드의 생성은 산성조건에서 48 시간 이후부터 급격하게 증가하였고, 중성조건에서는 120 시간 이후로부터 말론디알데이드를 생성하는 것으로 확인되었다.

한편, 본 발명의 방법에 의하여 제조된 바이오폴리머 마이크로캡슐은 산화 안정성 및 저장성을 가지므로, 예를 들어 식품, 기능성 음료, 의약품 및 화장품 등에 사용하여 캡슐에 포집된 핵물질의 안정성을 확보하면서 경구나 비경구를 통해 인체 내 투여 또는 섭취될 수 있도록 한다.

본 발명에 따르면, 바이오폴리머 마이크로캡슐을 제조하는 단계 중에 두 개의 상으로 분리되는 바이오폴리머를 이용하여 제조비용이 저렴하고, 공정이 간단한 마이크로캡슐을 제공한다. 또한, 상기 바이오폴리머 마이크로캡슐은 oil-water-in-water(O/W/W)형 에멀젼을 형성하여 핵물질이 가지는 이취 및 이미를 감소시켜 섭취시 거부감을 해결할 수 있고, 산화 안정성 및 저장성을 나타낸다. 아울러 천연 고분자가 가지고 있는 항균성, 항산화성, 식이섬유 등의 성분이 이행되어 기능성 식품뿐만 아니라, 의약 및 화장품 산업에도 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 열변성 유청단백질과 펙틴의 농도에 따른 두 개의 상으로 분리되는 구간을 관찰한 결과이다.
도 2는 본 발명의 유청단백질과 펙틴의 pH에 따른 두 개의 상으로 분리되는 구간을 관찰한 결과이다.
도 3은 본 발명의 교반속도 및 교반시간에 따른 W/W형 에멀젼의 모양을 광학현미경으로 관찰한 결과이다.
도 4는 본 발명의 응고제의 종류에 따른 W/W형 에멀젼의 모양을 광학현미경으로 관찰한 결과이다.
도 5는 본 발명의 제조방법을 이용하여 제조한 GDL 첨가 유무에 따른 W/W형 에멀젼 형태를 광학현미경으로 비교 관찰한 결과이다.
도 6은 본 발명의 제조방법을 이용하여 제조한 GDL 첨가 유무에 따른 W/W형 에멀젼 크기를 비교 측정한 결과이다.
도 7은 본 발명의 제조방법을 이용하여 제조한 지질입자를 포함하는 O/W/W형 바이오폴리머 마이크로캡슐을 광학현미경으로 관찰한 결과이다.
도 8을 본 발명의 제조방법을 이용하여 제조한 O/W/W형 바이오폴리머 마이크로캡슐의 pH 조건에 따른 방출효율을 측정한 결과이다.
도 9는 본 발명의 제조방법을 이용하여 제조한 O/W/W형 바이오폴리머 마이크로캡슐의 pH 조건에 따른 지방산패도를 측정한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : 천연 고분자 용액 제조

1-1. 농도별 열변성 유청단백질(HD-WPI) 용액 제조

유청단백질(Whey protein isolate, WPI, MSC international ingredients, illinois, USA) 분말을 0.04%의 아지드화나트륨 용액 100 ml에 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 및 20 g을 첨가한 후 300 rpm에서 3 시간 동안 교반하여 유청단백질 용액을 제조하였다. 상기 제조된 유청단백질 용액은 4℃의 온도에서 16 시간 동안 보관하였다. 그 다음 상기 유청단백질 용액을 80℃에서 10 분 동안 중탕시킨 후 4℃의 온도가 유지되는 용기에 30 분 동안 침지시켜 열변성 유청단백질 용액을 제조하였다.

1-2. pH 별 유청단백질 용액 제조

유청단백질(Whey protein isolate, WPI, MSC international ingredients, illinois, USA) 분말을 0.04%의 아지드화나트륨 용액 100 ml에 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 및 20 g을 첨가한 후 300 rpm에서 3 시간 동안 교반하여 유청단백질 용액을 제조하였다. 상기 제조된 유청단백질 용액은 4℃의 온도에서 16 시간 동안 보관하였다. 그 다음 상기 유청단백질 용액을 꺼낸 후 와트만(Whatman, Piscatawawy, New Jersey, USA)에 걸러준 후 0.1 N NaOH을 사용하여 pH 2.0 내지 pH 10.0으로 맞춰 각각 다른 pH를 가지는 유청단백질 용액을 제조하였다.

1-3. 농도별 고메톡실 펙틴(HMP) 용액 제조

고메톡실 펙틴(High methoxyl pectin, HMP, CP kelco, Type YM-100-H, Denmark)을 0.04%의 아지드화나트륨 용액 100 ml에 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5 및 4 g을 첨가한 후 300 rpm에서 24 시간 동안 교반하여 고메톡실 펙틴 용액을 제조하였다.

1-4. pH별 고메톡실 펙틴(HMP) 용액 제조

고메톡실 펙틴(High methoxyl pectin, HMP, CP kelco, Type YM-100-H, Denmark)을 0.04%의 아지드화나트륨 용액 100 ml에 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5 및 4 g을 첨가한 후 300 rpm에서 24 시간 동안 교반하여 고메톡실 펙틴 용액을 제조하였다. 그 다음 상기 고메톡실 펙틴 용액에 0.1 N NaOH을 첨가하여 pH 2.0 내지 pH 10.0으로 맞춰 각각 다른 pH를 가지는 고메톡실 펙틴 용액을 제조하였다.

실시예 2 : 천연 고분자 용액의 농도 및 pH에 따른 상분리 구간 확립

2-1. 천연 고분자 용액의 농도에 따른 상분리 구간 확립

상기 실시예 1-1 및 실시예 1-3에서 제조된 2 내지 20 중량%의 열변성된 유청단백질 용액과 0.5 내지 4 중량%의 고메톡실 펙틴 용액을 각각 10 ml씩 혼합하고, 5,000 rpm으로 30 분 동안 원심분리하여 상분리(Phase separation)되는 구간을 관찰하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

그 결과, 도 1에서 보는 바와 같이 10 중량%의 열변성 유청단백질 용액과 3 중량%의 고메톡실 펙틴 용액을 혼합하였을 때 상분리가 가장 잘 이루어지는 것으로 확인되었다.

2-2. 천연 고분자 용액의 pH에 따른 상분리 구간 확립

상기 실시예 1-3 및 실시예 1-4에서 제조된 pH 2.0 내지 pH 10.0을 가지는 유청단백질 용액 또는 고메톡실 용액의 등전점과 전하값(제타 포텐셜)을 측정하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

실험 결과, 유청단백질의 등전점은 pH 4.5에서 나타났고, pH가 등전점보다 낮을 경우 양의 전하값을 가지며, pH가 등전점보다 높을 경우에는 음의 전하값을 가지는 것을 확인하였다.

또한, 고메톡실 용액의 경우 pH 4보다 낮은 pH을 띠는 용액은 pH가 낮아질 수록 중성의 전하값과 가까워지고, pH 5 이상에서는 약 -40 mV의 전하값을 가지는 것을 확인하였다.

따라서 유청단백질 용액과 고메톡실 용액 모두 pH 8에서 음의 전하값이 최대로 형성되는 것을 확인하였다.

실시예 3 : Water-in-Water(W/W)형 에멀젼 형성 조건 확인

3-1. 교반속도 및 교반시간에 따른 W/W형 에멀젼 관찰

상기 실시예 1-2에서 제조된 10% 유청단백질 용액(pH 8.0) 10 ml과 상기 실시예 1-4에서 제조된 3% 고메톡실 펙틴 용액(pH 8.0) 10 ml을 혼합하고 80, 100 및 160 rpm의 교반속도로 10, 20, 30, 50 및 100 초 동안 교반하여 W/W형 에멀젼을 제조하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

실험 결과, 도 3에서 보는 바와 같이 교반속도가 증가함에 따라 W/W형 에멀젼의 크기가 작아지는 것을 확인하였다. 구체적으로 80 rpm의 교반속도로 10 초 동안 교반하여 형성된 에멀젼, 100 rpm의 교반속도로 20초 동안 교반하여 형성된 에멀젼 및 160 rpm의 교반속도로 10, 20 및 30 초 동안 교반하여 형성된 에멀젼은 다분산상을 가지는 것을 확인하였고, 100 rpm 및 160 rpm의 교반속도로 100 초 동안 교반하여 형성된 에멀젼은 길쭉한 타원 모양의 에멀젼을 형성하는 것을 확인되었으며, 100 rpm의 교반속도로 50 초 동안 교반하여 형성된 에멀젼은 균일한 다분산상을 가지고 약 15 내지 20 ㎛의 크기를 가지는 에멀젼을 형성하는 것으로 확인되었다.

3-2. 단백질 응고제 종류에 따른 W/W형 에멀젼의 겔화 관찰

상기 실시예 1-2에서 제조된 10 중량%의 유청단백질 용액(pH 8.0) 10 ml과 실시예 1-4에서 제조된 3 중량%의 고메톡실 펙틴 용액(pH 8.0) 10 m을 혼합하여 100 rpm의 교반속도로 50 초 동안 균질화하여 W/W형 에멀젼을 제조하였다. 그 다음 상기 제조한 W/W형 에멀젼에 0.1 M의 염화나트륨(NaCl), 탄산칼슘(CaCO₃), 염화칼슘(CaCl₂), 글루코노-델타-락톤(Glucono-delta-lactone, GDL) 및 인산수소 나트륨(NaH₂PO₄)을 각각 10 ml를 첨가하여 유청단백질의 겔화정도를 광학현미경을 이용하여 관찰하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

그 결과, 도 4에서 보는 바와 같이 염화나트륨, 탄산칼슘 및 인산수소 나트륨을 첨가한 유청단백질은 완전히 굳지 못한 반면, 염화칼슘 및 GDL을 첨가한 유청단백질은 굳었으며, 이중 GDL를 첨가하였을 때 유청단백질이 좀 더 빠르게 굳는 것을 확인하였다.

실시예 4 : 바이오폴리머 마이크로캡슐의 크기 측정

상기 실시예 1-2에서 제조된 10 중량%의 유청단백질 용액(pH 8.0) 10 ml과 실시예 1-4에서 제조된 3 중량%의 고메톡실 펙틴 용액(pH 8.0) 10 ml을 혼합하여 100 rpm의 교반속도로 50 초 동안 균질화하여 W/W형 에멀젼을 제조하였다. 그 다음 상기 W/W 에멀젼 10 ml에 GDL 10 ml을 첨가하여 W/W형 에멀젼을 제조하였다.

그 다음 상기 W/W형 에멀젼을 광학현미경을 이용하여 관찰한 후, UTHSCSA 이미지 툴(Image Tool)(Version 2, University of Texas, USA)을 이용하여 입자의 크기를 측정하였다. 대조군으로는 상기 실시예 1-2에서 제조된 10 중량%의 유청단백질 용액(pH 8.0) 10 ml과 실시예 1-4에서 제조된 3 중량%의 고메톡실 펙틴 용액(pH 8.0) 10 ml을 혼합한 W/W형 에멀젼을 사용하였다. 그 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다.

실험 결과, 도 5 및 도 7에서 보는 바와 같이 대조군은 17 ㎛ 크기를 형성하고, 본 발명의 바이오폴리머 마이크로캡슐은 14 ㎛ 크기를 형성하는 것을 확인하였다.

실시예 5 : 지질입자를 포함하는 바이오폴리머 마이크로캡슐 제조

어유(Fish oil, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) 1ml에 Red oil O(Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) 염색약 0.3 ml을 첨가하여 녹여준 후 상기 실시예 1-2에서 제조된 10% 유청단백질 용액(pH 8) 10 ml과 혼합하였다. 그 다음 상기 혼합물을 10,000 rpm의 교반속도로 5 분 동안 균질화하여 Oil-Water(O/W)형의 나노 입자를 제조하였다. 그 다음 상기 제조된 O/W형 나노입자 10ml에 상기 실시예 1-4에서 제조된 3 중량%의 고메톡실 펙틴 용액(pH 8) 10 ml을 첨가한 후 균질기를 이용하여 100 rpm의 교반속도로 50 초 동안 균질화하여 O/W/W형 에멀젼을 제조하였다. 그 다음 상기 O/W/W형 에멀젼 20 ml에 GDL 10 ml을 혼합하여 구형의 O/W/W형 마이크로캡슐을 제조하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

그 결과, 도 7에서 보는 바와 같이 어유를 포함하는 유중수중수형(O/W/W형)의 바이오폴리머 마이크로캡슐을 형성함을 확인하였다.

실시예 6 : 지질입자를 포함하는 바이오폴리머 마이크로캡슐의 캡슐효율 및 방출속도 측정

상기 실시예 5에서 제조한 바이오폴리머 마이크로캡슐 4 ml을 각각 40 ml의 pH 2 또는 pH 7의 완충용액에 첨가한 후 37℃의 온도에서 교반하여 0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 24, 48, 72 및 96 시간 동안 어유가 방출되는 양을 측정하였다. 상기 방출량은 매 시간에 따라 시료 1 ml을 채취하여 핵산 3 ml 첨가한 후 2 분 동안 볼텍싱(vortex)하여 혼합한 후 3,000 rpm으로 5 분 동안 원심분리 하였다. 그 다음 상기 원심분리한 시료의 상층액을 취하여 분광광도계(UV-VIS Spectrophotomoter, Elisa, Helainki, Finland)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 그 다음 하기 실험식 1을 이용하여 캡슐효율을 계산하였다. 그 결과를 표 1 및 도 8에 나타내었다.

[실험식 1]

캡슐효율(%) = [(A-B)/A]×100

A : 총 어유의 사용한 무게(g)

B : 어유로부터 분리한 핵산의 무게(g)

	캡슐효율(%)
실시예 5(pH 2)	79.69±3.09
실시예 5(pH 7)	78.13±2.47

실험 결과, 상기 표 1에 나타낸 바와 같이 pH 2의 완충용액 내의 마이크로캡슐은 79.69±3.093%의 효율을 나타내었고, pH 7의 완충용액 내의 마이크로캡슐은 78.13±2.47%의 효율을 나타내었다.

한편, 도 8에 나타낸 바와 같이 시간의 증가에 따른 어유의 방출은 pH 2의 완충용액 내에서 240 시간 후에 마이크로캡슐은 62.31% 방출하였고, pH 7의 완충용액 내에서 240 시간 후에 마이크로캡슐은 94.81%를 방출하는 것을 확인하였다.

실시예 7 : 지질입자를 포함하는 바이오폴리머 마이크로캡슐의 지방산패도 측정

상기 실시예 5에서 제조한 바이오폴리머 마이크로캡슐 4 ml을 각각 pH 2 또는 pH 7의 완충용액이 들어있는 삼각플라스크에 넣고, 37℃의 온도에서 10 일 동안 배양하여 지방 산패도를 측정하였다. 상기 지방 산패도는 상기 시료에 벤젠 10ml를 가하여 혼합한 후 티오바르비탈산(thiobarbituric acid, TBA)을 첨가하고 15분 동안 가열하였다. 그 다음 가열한 혼합액을 흐르는 물에 냉각한 후 3,000 rpm에서 원심분리하고 상층액 1ml를 취하여 532nm에서 흡광도를 측정한 후, 표준정량곡선을 이용하여 지질 과산화물인 말론디알데이드의 생성 농도를 구하였다. 상기 표준정량곡선은 각 농도별 TBA-TCA 용액(0.25 N HCl, 0.375% 2-thiobarbituric acid in 15% trichloroacetic acid 9 ml + MDA의 전구체인 1,1,3,3-tetraethoxypropane 1 ml)을 제조한 후 90℃의 온도에서 15 분 간 중탕하여 532 nm에서 흡광도를 측정한 값을 사용하여 작성하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.

실험 결과, pH 2의 경우, 48 시간까지 비슷한 지방 산패도를 보이다가 72시간 이후부터 급격하게 증가하여 240 시간 후 0.02 μg의 말론디알데이드를 생성하였다. pH 7에서는 120 시간 이후부터 말론디알데이드의 생성량이 증가하기 시작하였고, 240 시간 후에 0.012 μg의 말론디알데이드를 생성하였다.

Claims (9)

1. (a) 단백질 및 식이섬유질의 용액을 각각 준비하는 단계; (b) 상기 (a)단계의 단백질 용액에 핵물질을 첨가한 후 균질화하여 유중수적형(O/W)형태의 1차 에멀젼을 형성하는 단계; (c) 상기 (b)단계의 유중수적형(O/W)형태의 1차 에멀젼에 상기 (a)단계의 식이섬유질 용액을 첨가한 후 50 내지 160 rpm의 교반속도로 10 내지 100 초 동안 균질화하여 유중수중수적형(O/W/W)형태의 에멀젼을 형성하는 단계; 및 (d) 상기 (c)단계에서 제조한 O/W/W형태의 에멀젼에 응고제를 첨가하여 겔화시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오폴리머 마이크로캡슐의 제조방법.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 단백질 용액 및 식이섬유질 용액은 pH 2.0 내지 pH 10.0인 것을 특징으로 하는 바이오폴리머 마이크로캡슐의 제조방법.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 단백질은 단백질 용액의 총 중량에 대하여 2 내지 20중량%의 함량으로 이루어진 것을 특징으로 하는 바이오폴리머 마이크로캡슐의 제조방법.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 식이섬유질은 식이섬유질 용액의 총 중량에 대하여 0.5 내지 4중량%의 함량으로 이루어진 것을 특징으로 하는 바이오폴리머 마이크로캡슐의 제조방법.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 유청단백질, 대두단백, 젤라틴 및 카제인으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 바이오폴리머 마이크로캡슐의 제조방법.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 식이섬유질은 구아검, 고메톡실 펙틴 및 카파-카라기난으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 바이오폴리머 마이크로캡슐의 제조방법.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 핵물질은 어유, 비타민, 카로티노이드, 식물성스테롤, 미네랄, 계란, 효소, 유산균, DHA, EPA, DPA, 포화지방산 및 불포화지방산으로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 물질인 것을 특징으로 하는 바이오폴리머 마이크로캡슐의 제조방법.
   
8. 제1항에 있어서, 상기 (d)단계의 응고제는 NaCl, CaCO₃, CaCl₂, Glucono-delta-lactone(GDL) 및 NaH₂PO₄로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 바이오폴리머 마이크로캡슐의 제조방법.
   
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된 바이오폴리머 마이크로캡슐.

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