CN115354031A - 一种从细胞上生物体液中提取高纯度外泌体制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供从细胞上生物体液中提取高纯度外泌体制备方法，根据以下步骤进行：首先用离心机离心除去样品中的大颗粒杂质，再通过分子筛层析柱对样品进行纯化，除去非外泌体大囊泡和大部分杂蛋白，将得到的外泌体馏分合并通过离子柱层析洗脱浓缩的外泌体，外泌体经过超滤换液提取到高纯度稳定的外泌体。本发明提供分子筛预装柱和浓缩柱料实现快速大规模提取高纯度外泌体的方法，通过该外泌体制备方法可以得到优于市面纯度的外泌体，且外泌体活性高，浓度大，既可应用于科研实验的小规模样品外泌体提取，也可放大应用于工业化规模的外泌体提取，方便下游的各种外泌体研究和临床医学使用。
Description
技术领域
本发明涉及医学检验领域，具体为一种从细胞上生物体液中提取高纯度外泌体制备方法。
背景技术
外泌体是生物体液分泌的一种外囊泡亚型，天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。外泌体在细胞间的递送领域发挥着重要的作用，今年来对外泌体递送药物研究越来越频繁，外泌体递送药物到指定的细胞对医学领域起到重要的研究意义。现有技术中，提取外泌体的金标准是超速离心法，通过使用超速离心设备将细胞内的外泌体进行分离，但是该方法对设备要求高，增加了设备成本需求，且提取时间长。因此普通实验室难以满足对外泌体的提取过程。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明目的是提供一种从细胞上生物体液中提取高纯度外泌体制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题,本发明即保证了高纯度，也减少了外泌体提取的时间，对设备要求不高，为临床应用，科研实验提供帮助。
为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：一种从细胞上生物体液中提取高纯度外泌体制备方法，包括以下步骤：
(1)待提取的含外泌体样本经过离心除去大颗粒、细胞碎片；
(2)将上述样本加入到凝胶过滤分子筛层析柱中，收集外泌体馏分；
(3)馏分合并加入平衡缓冲液；
(4)通过离心方法除去Q阴离子树脂保存液，用平衡缓冲液重悬；
(5)将馏分体系加入到Q阴离子树脂中，使外泌体与树脂结合；
(6)用洗涤液洗涤Q阴离子树脂；
(7)利用高浓度盐洗脱外泌体，外泌体经过超滤换液得到稳定外泌体。
进一步的，样本为终浓度0.5％-5％硫酸链霉素处理的细胞上清，血清，血浆，尿液，牛奶，精液，唾液。样本离心为3500g，4℃离心20-30min，弃沉淀，留取上清。血清血浆样本离心为12000g，4℃离心10-20min，弃沉淀，留取上清。
进一步的，硫酸链霉素在4℃搅拌20-30min，转速300rmp/min.血清血浆样本在摇床上摇晃20-30min。凝胶过滤分子筛填料孔径30-150nm，柱高10-15cm。外泌体收集馏分为馏分4，馏分5，馏分6，每个馏分0.5ml。
进一步的，平衡缓冲液为Tris-hcl缓冲液，tris浓度为20mM-200mM，PH 7.5-9.0。0.01M-0.1M的磷酸盐缓冲液，PH 6.5-8.0。
进一步的，平衡液与馏分混合时间为5-10min，并在室温下进行。
进一步的，所述清洗液为Tris-hcl缓冲液，tris浓度为20mM-200mM，Nacl 50mM-500mM，PH 7.5-9.0。0.01M-0.1M的磷酸盐缓冲液，Nacl 50mM-500mM，PH 6.5-8.0。
进一步的，结合树脂为弱阴离子树脂或者强阴离子树脂，弱阴离子树脂在PH6.0-8.5，5mM-50mMTris,0.01mM-0.1mM磷酸盐条件下结合目标分子。
进一步的，强阴离子树脂在PH6.0-8.0，5mM-50mMTris,0.01mM-0.1mM磷酸盐条件下结合目标分子。
进一步的，结合树脂与馏分的结合时间为20min，3500g在4℃离心2min。所述外泌体与树脂的结合的体积为0.1ml-1ml。所述洗涤液为10-100mM tris，PH6.5-9.0。0.01M-0.1M磷酸盐缓冲液，PH 6.3-7.5.洗涤液洗涤体积100ul-1mL。
进一步的，所述洗脱液为10-100mM tris,Nacl 100mM-500mM，Kcl 50mM-200mM，PH6.5-9.0。0.01M-0.1M磷酸盐缓冲液，Nacl 100mM-500mM，Kcl 50mM-200mM，PH 6.3-7.5。
进一步的，洗涤液洗涤体积100ul-200ul。超滤管规格为100KD-300KD，体积0.5ml-1ml。超滤体积为100ul-400ul.超滤离心力2000g-3500g，5-20min。
本发明的有益效果：
1.该从细胞上生物体液中提取高纯度外泌体制备方法可应用于科研实验的小规模样品外泌体提取，也可放大应用于工业化规模的外泌体提取，方便下游的各种外泌体研究和临床医学使用。
2.该从细胞上生物体液中提取高纯度外泌体制备方法解决大批量工业化细胞上清、尿液等生物样本提取外泌体的难题，提高外泌体的纯度与浓度，同时还可以解决小量血清，血浆样本的外泌体提取，同时提供了分子筛预装柱和浓缩柱料实现快速大规模提取高纯度外泌体的方法。
附图说明
图1为本发明一种从细胞上生物体液中提取高纯度外泌体制备方法的流程图；
图2为本发明凝胶过滤纯化细胞上清外泌体BCA蛋白鉴定图；
图3为本发明阴离子柱料纯化细胞上清外泌体凝胶过滤馏分WB鉴定图；
图4为本发明阴离子柱料纯化细胞上清外泌体凝胶过滤馏分NTA鉴定图；
图5为本发明阴离子柱料纯化细胞上清外泌体凝胶过滤馏分电镜鉴定图；
图6为本发明凝胶过滤纯化人血清BCA蛋白鉴定图；
图7为本发明人血浆外泌体标志蛋白WB鉴定图；
图8为本发明阴离子柱料纯化人血清外泌体凝胶过滤馏分NTA鉴定图；
图9为本发明阴离子柱料纯化人血清外泌体凝胶过滤馏分电镜鉴定图。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
本发明提供一种技术方案：基于分子筛和阴离子交换相互结合提取Hela细胞上清外泌体的方法，包括以下步骤：(1)对Hela细胞进行培养48h之后收取上清，经过3500g离心20分钟留取上清，上清液经过10KD浓缩管浓缩至1ml。(2)将浓缩的10mL细胞上清加入凝胶过滤预装柱，预装柱高度为5cm，上样开始后进行馏分的收集，总共收集25个馏分。(3)收集馏分5-9馏分进行合并，每个馏分0.2ml，收集1ml的外泌体。(4)馏分收集完成之后用1×PBS清洗凝胶过滤层析柱，清洗完成之后用20％乙醇保存层析柱。(5)1mL的外泌体加入100ul的平衡液，在室温混匀。(6)取400ul阴离子填料加入1ml洗涤液3500g离心2min，弃上清。(7)将(5)的外泌体混合液加入(6)中，室温进行摇匀20min。(8)将(7)中混合液3500g离心2min，弃上清，保存柱料。(9)用500ul洗涤液重悬柱料，将其转移至1ml层析柱中静止2min，3500g离心2min。弃去下层液。(10)用500ul洗涤液加入柱料，静止2min，3500g离心2min。弃去下层液。将层析柱转移至收集管，层析柱中加入200ul洗脱液，静置5min，3500g离心2min。收集管中即为再纯化的外泌体。(11)将200ul再纯化外泌体加入200ul 1×PBS混匀，转移至0.5ml100KD的超滤管中，3500g离心5min。洗去超离管上层液体即为精纯外泌体。
本实施例，凝胶过滤收集的馏分BCA蛋白定量检测，其步骤包括：配制工作液:根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。稀释标准品：取10微升标准品用PBS稀释至100微升，使终浓度为0.5mg/ml。将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20微升加到96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS补足到20微升。加适当体积样品到96孔板的样品孔中，补加PBS到20微升。各孔加入200微升BCA工作液，37℃放置30分钟。
本实施例，请参阅图2，用酶标仪测定A562，根据标准曲线计算出蛋白浓度，其步骤包括：通过BCA测定各个馏分蛋白的含量，从第10个馏分开始蛋白含量急剧增加，根据大分子从柱料外流出时间短，小分子从柱料内流出时间长的特征，从而判定外泌体集中在馏分10之前，馏分1-5蛋白含量很低，应为柱料缓冲液，判定外泌体在馏分5之后。
本实施例，请参阅图3，对阴离子柱和超滤管精纯的外泌体进行western blot鉴定，其步骤包括：配胶：用商品化试剂盒配置15％的下层胶和上层胶。制样：取10ul外泌体加入10ul 2×SDS上样缓冲液，混匀在100℃桌面加热器上加热10min。点样：取10ul煮过的样品128V150A的电流下2h进行跑胶蛋白分离。转膜：将胶上的样品通过湿转的方式在300A电流45min转移到PVDF膜上。染色与读片：将显色剂A与显色剂B分别取1ml混合，将PVDF膜进行染色，染色5min在显色液中读取WB条带位置。通过对外泌体的表面蛋白CD9，CD81及TSG101进行WB条带鉴定，两条带分子量,出现在25KD和44KD位置。
本实施例，请参阅图4，对阴离子柱和超滤管精纯的Hela细胞上清外泌体进行NTA鉴定，其步骤包括：用水对精纯的外泌体稀释2000倍，然后在NTA检测仪上405nm激光条件下拍摄外泌体的布朗运动的轨迹，测定外泌体的粒径和浓度。通过对外泌体精纯的外泌体粒径进行检测，粒径在145.1nm，测定浓度1.1E+11Particles/mL。
本实施例，请参阅图5，对阴离子柱和超滤管精纯的Hela细胞上清外泌体进行电镜鉴定，其步骤包括：取适量外泌体在戊二醛中固定，将5-10ul外泌体滴加到铜网上，室温吸附10min左右，用滤纸吸附多余的液体，然后向铜网上滴加10ul 2％磷钨酸溶液，在室温下对外泌体染色处理2min，小心用滤纸吸去多余的滤液，在铜网室温下晾干，电压120KV下观察外泌体形态。通过电镜观察，在500nm电镜观察到存在许多完整的外泌体囊泡，在200nm电镜下观察到完整的外泌体囊泡形态。
本实施例还提供一种技术方案：基于分子筛和阴离子交换相互结合提取人血浆外泌体的工艺方法，包括以下步骤：(1)取人全血置于EDTA收集管中静置过夜，经过12000g离心20分钟留取上清。(2)将处理的2mL人血浆加入凝胶过滤预装柱，预装柱高度为5cm，上样开始后进行馏分的收集，总共收集15个馏分。(3)将收集馏分4、5、6三个馏分进行合并，每个馏分0.2ml，收集0.6ml的外泌体。(4)馏分收集完成之后用1×PBS清洗凝胶过滤层析柱，清洗完成之后用20％乙醇保存层析柱。(5)0.6ml的外泌体加入60ul的平衡液，在室温混匀。(6)取400ul阴离子填料加入1ml洗涤液3500g离心2min，弃上清。(7)将(5)的外泌体混合液加入(6)中，室温进行摇匀20min。(8)将(7)中混合液3500g离心2min，弃上清，保存柱料。(9)用500ul洗涤液重悬柱料，将其转移至1ml层析柱中静止2min，3500g离心2min。弃去下层液。(10)用500ul洗涤液加入柱料，静止2min，3500g离心2min。弃去下层液。将层析柱转移至收集管，层析柱中加入200ul洗脱液，静置5min，3500g离心2min。收集管中即为再纯化的外泌体。(11)将200ul再纯化外泌体加入200ul 1×PBS混匀，转移至0.5ml 100KD的超滤管中，3500g离心5min。洗去超离管上层液体即为精纯外泌体。
本实施例，请参阅图6，对凝胶过滤收集的馏分BCA蛋白定量检测，其步骤包括：配制工作液:根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。稀释标准品：取10微升标准品用PBS稀释至100微升，使终浓度为0.5mg/ml。将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20微升加到96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS补足到20微升。加适当体积样品到96孔板的样品孔中，补加PBS到20微升。各孔加入200微升BCA工作液，37℃放置30分钟。用酶标仪测定A562，根据标准曲线计算出蛋白浓度。通过BCA测定各个馏分蛋白的含量，从第7个馏分开始蛋白含量急剧增加，根据大分子从柱料外流出时间短，小分子从柱料内流出时间长的特征，从而判定外泌体集中在馏分7之前，馏分1，馏分2，馏分3蛋白含量很低，应为柱料缓冲液，判定外泌体在馏分3之后。
本实施例，请参阅图7，对阴离子柱和超滤管精纯的外泌体进行western blot鉴定，其步骤包括：配胶：用商品化试剂盒配置15％的下层胶和上层胶。制样：取10ul外泌体加入10ul 2×SDS上样缓冲液，混匀在100℃桌面加热器上加热10min。点样：取10ul煮过的样品128V150A的电流下2h进行跑胶蛋白分离。转膜：将胶上的样品通过湿转的方式在300A电流45min转移到PVDF膜上。染色与读片：将显色剂A与显色剂B分别取1ml混合，将PVDF膜进行染色，染色5min在显色液中读取WB条带位置。通过对外泌体的表面蛋白CD9，TSG101进行WB条带鉴定，两条带分子量均出现在25KD位置。以此来鉴定外泌体。
本实施例，请参阅图8，对阴离子柱和超滤管精纯的外泌体进行NTA鉴定，其步骤包括：用水对精纯的外泌体稀释2000倍，然后在NTA检测仪上405nm激光条件下拍摄外泌体的布朗运动的轨迹，测定外泌体的粒径和浓度。通过对外泌体精纯的外泌体粒径进行检测，粒径在150.2nm，测定浓度1.7E+11Particles/mL。
本实施例，请参阅图9，对阴离子柱和超滤管精纯的外泌体进行电镜鉴定，其步骤包括：取适量外泌体在戊二醛中固定，将5-10ul外泌体滴加到铜网上，室温吸附10min左右，用滤纸吸附多余的液体，然后向铜网上滴加10ul 2％磷钨酸溶液，在室温下对外泌体染色处理2min，小心用滤纸吸去多余的滤液，在铜网室温下晾干，电压120KV下观察外泌体。通过电镜观察，在200nm电镜观察到完整的外泌体囊泡形状，在100nm电镜下观察到完整的外泌体囊泡。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点,对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (11)
1.一种从细胞上生物体液中提取高纯度外泌体制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)待提取的含外泌体样本经过离心除去大颗粒、细胞碎片；
(2)将上述样本加入到凝胶过滤分子筛层析柱中，收集外泌体馏分；
(3)馏分合并加入平衡缓冲液；
(4)通过离心方法除去Q阴离子树脂保存液，用平衡缓冲液重悬；
(5)将馏分体系加入到Q阴离子树脂中，使外泌体与树脂结合；
(6)用洗涤液洗涤Q阴离子树脂；
(7)利用高浓度盐洗脱外泌体，外泌体经过超滤换液得到稳定外泌体。
2.根据权利要求1所述的一种从细胞上生物体液中提取高纯度外泌体制备方法，其特征在于：样本为终浓度0.5％-5％硫酸链霉素处理的细胞上清，血清，血浆，尿液，牛奶，精液，唾液。样本离心为3500g，4℃离心20-30min，弃沉淀，留取上清。血清血浆样本离心为12000g，4℃离心10-20min，弃沉淀，留取上清。
3.根据权利要求2所述的一种从细胞上生物体液中提取高纯度外泌体制备方法，其特征在于：硫酸链霉素在4℃搅拌20-30min，转速300rmp/min.血清血浆样本在摇床上摇晃20-30min。凝胶过滤分子筛填料孔径30-150nm，柱高10-15cm。外泌体收集馏分为馏分4，馏分5，馏分6，每个馏分0.5ml。
4.根据权利要求1所述的一种从细胞上生物体液中提取高纯度外泌体制备方法，其特征在于：平衡缓冲液为Tris-hcl缓冲液，tris浓度为20mM-200mM，PH 7.5-9.0。0.01M-0.1M的磷酸盐缓冲液，PH 6.5-8.0。
5.根据权利要求4所述的一种从细胞上生物体液中提取高纯度外泌体制备方法，其特征在于：平衡液与馏分混合时间为5-10min，并在室温下进行。
6.根据权利要求1所述的一种从细胞上生物体液中提取高纯度外泌体制备方法，其特征在于：所述清洗液为Tris-hcl缓冲液，tris浓度为20mM-200mM，Nacl 50mM-500mM，PH7.5-9.0。0.01M-0.1M的磷酸盐缓冲液，Nacl 50mM-500mM，PH 6.5-8.0。
7.根据权利要求1所述的一种从细胞上生物体液中提取高纯度外泌体制备方法，其特征在于：结合树脂为弱阴离子树脂或者强阴离子树脂，弱阴离子树脂在PH6.0-8.5，5mM-50mMTris,0.01mM-0.1mM磷酸盐条件下结合目标分子。
8.根据权利要求7所述的一种从细胞上生物体液中提取高纯度外泌体制备方法，其特征在于：所述强阴离子树脂在PH值为6.0-8.0范围内，5mM-50mMTris,0.01mM-0.1mM磷酸盐条件下结合目标分子。
9.根据权利要求1所述的一种从细胞上生物体液中提取高纯度外泌体制备方法，其特征在于：结合树脂与馏分的结合时间为20min，3500g在4℃离心2min。所述外泌体与树脂的结合的体积为0.1ml-1ml。所述洗涤液为10-100mM tris，PH6.5-9.0。0.01M-0.1M磷酸盐缓冲液，PH 6.3-7.5.洗涤液洗涤体积100ul-1mL。
10.根据权利要求1所述的一种从细胞上生物体液中提取高纯度外泌体制备方法，其特征在于：所述洗脱液为10-100mM tris,Nacl 100mM-500mM，Kcl50mM-200mM，PH6.5-9.0。0.01M-0.1M磷酸盐缓冲液，Nacl 100mM-500mM，Kcl50mM-200mM，PH 6.3-7.5。
11.根据权利要求10所述的一种从细胞上生物体液中提取高纯度外泌体制备方法，其特征在于：洗涤液洗涤体积100ul-200ul。超滤管规格为100KD-300KD，体积0.5ml-1ml。超滤体积为100ul-400ul.超滤离心力2000g-3500g，5-20min。
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