CN115350282A - 靶向肝癌的载药外泌体、快速制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了靶向肝癌的载药外泌体、快速制备方法及其应用，属于生物医药技术领域。本发明以人脐带间充质干细胞MSC来源的外泌体作为载体，将传统化疗药物阿霉素通过超声辅助装入其中，得到高载药量的外泌体，然后使用神经氨酸酶处理外泌体，经酶催化作用水解唾液酸后表面大量暴露半乳糖或N‑乙酰半乳糖胺残基，得到去唾液酸化的载药外泌体，增加了其对肝肿瘤表面ASGPR的结合能力。本发明得到了有载药量高达25％的能够有效靶向肝癌细胞的载有阿霉素药物的外泌体，对肝细胞癌的治疗效果提高可达167％。本发明的靶向肝癌的载药外泌体，具有更好的生物相容性、低细胞毒性、肝癌靶向性，而且制备耗时短、方法简便、易于应用。

Description

靶向肝癌的载药外泌体、快速制备方法及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及靶向肝癌的载药外泌体、快速制备方法及其应用。
背景技术
肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上第三大恶性肿瘤，占原发性肝癌的 85-90％。实际治疗中，约有90％的肝癌患者需要接受药物治疗。阿霉素(Doxorubicin，Dox)、氟尿嘧啶、顺铂等细胞毒类抗肿瘤药物虽然可以有效延长肝癌患者的生存期，但在临床应用中普遍存在选择性低、对正常细胞毒副作用严重等问题，往往给患者的治疗带来极大的痛苦。即便是索拉菲尼等分子靶向药物，也存在长期使用后容易诱发肿瘤耐药性的问题。因此，在现有肝癌治疗方式的基础上，探索高靶向性低毒副作用的新方法是生物医学研究领域迫在眉睫的重大课题。
近年来，FDA获批的肝癌的临床一线靶向药有多种，如索拉非尼等，但其治疗效果并不出众，索拉非尼III期临床数据显示其客观缓解率为2％，治疗效果差强人意；因此亟需开发新的更有效的肝癌靶向药物实现更佳的治疗效果。目前，研究学者利用纳米颗粒作为药物载体能够在肝癌病灶形成相对较高的药物浓度，提高药物在体内的药效，而脂质体就是其中一种重要的纳米微粒，通过将各种配体，如抗体、适配体、肽段或糖肽等修饰脂质体，以受体- 配体的相互作用实现靶向作用。但是，基于脂质体的靶向药物递送系统，需要制备大量配体实现靶向性；且脂质体具有一定毒性，用量过多可能导致细胞膜被破坏，从而杀伤健康细胞；此外，脂质体具有免疫原性，容易被人体免疫系统所识别攻击。综上，开发低毒性、无免疫原性且容易制备的新型纳米药物载体是新的研究方向。
近年来，外泌体已成为输送治疗药物的非常有潜力的载体。外泌体是直径大小为30–200 nm纳米级囊泡，是细胞间通讯和各种病理生理状况调节的重要信使。目前外泌体作为天然的药物递送载体已被用来负载不同治疗药物，包括化疗药物、siRNA、反义寡核苷酸和免疫调节剂等，并用于多种疾病的治疗研究。相较于人工合成纳米颗粒，外泌体具有天然的生物相容性、固有的体内长循环能力、低细胞毒性、易穿过生理病理屏障和潜在特异归巢靶标等特点，这些独特的优势使外泌体成为用于癌症治疗的极具吸引力的药物递送系统。外泌体作为药物载体的研究很多，在肝癌的治疗应用中一般是通过分子生物学的手段，将特异性识别肝癌靶向抗原的抗体表达在外泌体的膜表面，利用抗原-抗体的特异性识别，实现外泌体的肝癌靶向性，但此种方法需要基因改造外泌体的供体细胞，操作复杂，耗时较长，不易于临床应用；或通过化学手段修饰连接相关配体小分子，来靶向肝癌表面高表达的某些受体，但是外源引入小分子修饰不仅改变了药物载体本身的性质和结构，也会带来潜在风险。
发明内容
为了解决脂质体等纳米颗粒作为药物载体存在的有一定毒性、有免疫原性、制备方法繁琐，以及现有外泌体载药存在的操作复杂、耗时长或需要引入外源修饰等问题，本发明提供了一种新的基于生物酶技术的靶向肝癌的载药外泌体，并有效地提高了靶向肝癌的效果。
本发明利用ASGPR介导的肝靶向递送模型，选用外泌体作为药物载体，可有效降低非生物纳米材料作为药物载体产生的高免疫原性；相比用化学手段连接靶向配体，本发明的载药外泌体的制备，是采用外源添加神经氨酸酶处理使载药外泌体表面糖蛋白去唾液酸化，从而暴露Gal或GalNAc残基来靶向肝癌细胞表面的ASGPR，这种方法方便快捷，大大缩短反应时间。另外，如何控制条件以暴露尽量多的Gal或GalNAc残基也是关键的问题；本发明通过对神经氨酸酶处理条件进行控制和优化，有效地提高了Gal或GalNAc残基的量，增加了靶向肝癌的效果。
本发明的第一个目的是提供一种靶向肝癌的载药外泌体，所述靶向肝癌的载药外泌体是将装载有药物的外泌体使用神经氨酸酶进行处理后得到。
所述靶向肝癌的载药外泌体，其制备方法包括：(1)获得初始外泌体；(2)在初始外泌体中装载药物，得到装载有药物的外泌体；(3)神经氨酸酶处理装载有药物的外泌体，得到去唾液酸化的载药外泌体，即为靶向肝癌的载药外泌体。
在一种实施方式中，所述外泌体来源于包括间充质干细胞、免疫细胞、肿瘤细胞、血液、牛奶等所有人或动物的各类细胞或体液。
在一种实施方式中，所述外泌体是来自人脐带间充质干细胞。
在一种实施方式中，所述初始外泌体的制备方法包括：选用人脐带间充质干细胞的培养上清液，除去死细胞、除去细胞碎片、除去细胞器及大囊泡，得到外泌体粗沉淀，重悬、离心，得到外泌体沉淀。
在一种实施方式中，所述初始外泌体的制备方法包括：选用人脐带间充质干细胞的培养上清液，于4℃500g离心收集上清以除去死细胞；于4℃2,000g离心20min收集上清以除去细胞碎片；于4℃11,000g离心30min收集上清以除去细胞器及大囊泡；于4℃110,000g离心70min去上清得到外泌体粗沉淀；用PBS重悬，4℃110,000g离心70min，得到外泌体沉淀；用PBS重悬。
在一种实施方式中，外泌体所载药物为肝癌的相关药物，包括化疗类药物、核酸类药物、蛋白类药物。
在一种实施方式中，所述药物为阿霉素。
在一种实施方式中，所述药物是通过如下方法装载到外泌体中：取盐酸阿霉素(Dox) 添加到外泌体中，轻轻吹吸混合；使用功率为80W的超声，按照超声时间40s、间隔时间20s、超声次数5次的方法进行超声处理，然后37℃孵育90min使外泌体膜恢复原状，再离心洗涤去除表面的阿霉素，得到装载有药物的外泌体。
在一种实施方式中，所述药物是通过如下方法装载到外泌体中：取盐酸阿霉素(Dox) 50μg，添加到100μL的外泌体(1mg/mL蛋白浓度)中，轻轻吹吸混合；使用超声波清洗机对反应体系进行超声，超声时间40s、间隔时间20s、超声次数5次，然后37℃孵育90min 使外泌体膜恢复原状，再离心洗涤去除表面的阿霉素，得到装载有药物的外泌体。
在一种实施方式中，所述超声的功率为80W。
在一种实施方式中，所述神经氨酸酶来源于微生物、动物或者人体内的神经氨酸酶。神经氨酸酶购买于上海源叶生物科技有限公司，产品型号是S10170。神经氨酸酶，别名神经氨酸苷酶、唾液酸苷酶、神经氨糖酸苷酶。
在一种实施方式中，所述神经氨酸酶处理的条件是：每30μg蛋白含量的载药外泌体中，添加4U的神经氨酸酶，37℃孵育2h。然后离心，得到去唾液酸化的载药外泌体。
在一种实施方式中，所述靶向肝癌的载药外泌体，其制备方法具体如下：
(4)制备初始外泌体；
(5)在初始外泌体中装载药物：按照每50μg盐酸阿霉素(Dox)，添加100μL的蛋白浓度1mg/mL的外泌体中，轻轻吹吸混合；使用超声波清洗机对反应体系进行超声，超声时间40s、间隔时间20s、超声次数5次，然后37℃孵育90min使外泌体膜恢复原状，再离心洗涤去除表面的阿霉素，得到装载有药物的外泌体；
(6)酶处理装载有药物的外泌体：每30μg蛋白含量的载药外泌体中，添加4U的神经氨酸酶，37℃孵育2h。然后离心，得到去唾液酸化的载药外泌体。
本发明的第二个目的是提供所述载药外泌体在制备靶向肝癌的药物中的应用。
可选地，所述药物，还可以包括药用载体、辅料或稀释剂。
可选地，所述药物为缓释制剂。
可选地，所述辅料为药学上可接受的辅料，选自稀释剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂及润滑剂中的至少一种。
可选地，所述稀释剂选自淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙及碳酸钙中的至少一种；及/或，所述粘合剂选自淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇中的至少一种；及/或，所述崩解剂选自淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠和聚氧乙烯中的至少一种；及/或，所述润滑剂选自滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、液体石蜡和聚乙二醇中的至少一种；及/或，所述湿润剂选自是水、乙醇及异丙醇中的至少一种。
可选地，所述药物的剂型为片剂、胶囊、颗粒、丸剂或注射剂。
可选地，所述药物为注射剂，所述药学上可接受的辅料选自增溶剂、pH调节剂及渗透压调节剂中的至少一种。
可选地，所述增溶剂选自乙醇、异丙醇、丙二醇、聚乙二醇、泊洛沙姆、卵磷脂和羟丙基-β-环糊精中的至少一种；及/或，所述pH调节剂选自柠檬酸盐、磷酸盐、碳酸盐、醋酸盐、盐酸和氢氧化物中的至少一种；及/或，所述渗透压调节剂选自氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、柠檬酸盐和醋酸盐中的至少一种。
可选地，所述药物的剂型为外用制剂或者口服制剂。
可选地，所述外用制剂为喷雾剂或气雾剂；可选地，所述口服制剂为颗粒剂、胶囊剂、片剂和囊泡剂中的任意一种。
本发明的优点和效果：
本发明选用人脐带间充质干细胞(MSC)来源的外泌体(A)作为载体，将传统化疗药物阿霉素通过超声辅助装入其中，得到高载药量的外泌体(B)，然后使用神经氨酸酶处理外泌体，经酶催化作用水解唾液酸后表面大量暴露半乳糖或N-乙酰半乳糖胺残基，得到载药外泌体(C)，增加了其对肝肿瘤表面ASGPR的结合能力。本发明有效控制超声条件得到的载药量高达25％的阿霉素外泌体，然后有效控制神经氨酸酶的处理条件(每30μg蛋白含量的载药外泌体中，添加4U的神经氨酸酶)获得了去除唾液酸修饰并能够有效靶向肝癌细胞的、保持外泌体的理化特征的载药外泌体；且在体内体外实验中证实靶向载药外泌体能够更好的杀伤肝癌细胞，与E-Dox处理组(细胞凋亡仅12.77％)相比，E-Dox+Neu处理组(细胞可达21.28％)的效果相对值提升了66.6％。本发明外源添加神经氨酸酶处理使载药外泌体表面糖蛋白去唾液酸化，获得的载药外泌体暴露Gal或GalNAc残基来靶向结合肝癌细胞表面大量表达的ASGPR，从而提高了对肝细胞癌的治疗效果。
与在人工合成的纳米材料如脂质体等通过表面修饰半乳糖或N-乙酰半乳糖胺来增加肝靶向性的方法相比，本发明使用细胞分泌的天然囊泡，并外源添加神经氨酸酶处理使半乳糖(Gal)或N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)残基大量暴露，更方便快捷的实现了外泌体的肝靶向性。与脂质体等人工合成的纳米颗粒相比，靶向外泌体具有更好的生物相容性、低细胞毒性，能更好的穿过生理病理屏障减少栓塞风险；通过生物酶技术处理后，对肝癌细胞有更好的靶向性。
与脂质体方法相比，本发明利用MSC来源外泌体作为药物载体，具有低免疫原性，无生物毒性，且无需制备大量的配体即可实现肝癌靶向性，操作简便，易于应用；与其他基于外泌体的靶向肝癌方法相比，本发明利用市售的神经氨酸酶处理2h后，即可实现外泌体的肝癌靶向性，无需进行繁琐且耗时的基因工程改造及化学修饰。综上本发明在操作简便，耗时短，生物安全性高等方面优于现有方法。
附图说明
图1为神经氨酸酶(Neuraminidase,Neu)处理外泌体后外泌体(ExtracellularVesicles,EVs) 表面唾液酸水平及Gal或GalNAc水平检测；A.0～8U神经氨酸酶处理外泌体后，用特异性识别唾液酸修饰的凝集素SNA及MAL II检测外泌体表面唾液酸水平变化；B.分别用特异性识别半乳糖的凝集素PNA及识别N-乙酰半乳糖胺的凝集素ECL，检测经神经氨酸酶处理后的外泌体(EVs+Neu)表面半乳糖及N-乙酰半乳糖胺修饰水平差异；其中，EVs：外泌体； EVs+Neu：经过神经氨酸酶处理的外泌体。
图2为去唾液酸化的载药外泌体的表征图；A图为动态光散射(DLS)检测外泌体的粒径大小；B图为透射电镜(TEM)观察外泌体的形态；C图为免疫印迹(Western blot)检测外泌体表面标志蛋白；其中，MSC：外泌体来源细胞间充质干细胞的蛋白裂解液；Exo：外泌体裂解液；Alix，CD63，TSG101，CD81：均为外泌体表面标志蛋白；Calnexin：高尔基体标志蛋白。
图3为利用流式细胞仪检测肝癌细胞对载药外泌体的摄入；图中，从上到下分别为向肝癌细胞中加入PBS(Ctrl)、游离的Dox(Dox)、装载Dox的外泌体(E-Dox)、装载Dox 且去唾液酸外泌体(E-Dox+Neu)后，检测肝癌细胞中Dox自发荧光的强度变化情况。
图4为利用Annexin-V/PI流式染色法，检测载药外泌体诱导的细胞凋亡作用；图中左上到右下分别为向肝癌细胞中加入PBS(Ctrl)、游离的Dox(Dox)、装载Dox的外泌体(E-Dox)、装载Dox且去唾液酸外泌体(E-Dox+Neu)后，肝癌细胞凋亡情况差异。
图5为小鼠体内实验检测载药外泌体治疗效果。肝癌细胞皮下注射入小鼠体内形成肿瘤后，按照大小均一分组，再分别注射PBS(Ctrl)、游离的Dox(Dox)、装载Dox的外泌体(E-Dox)、装载Dox且去唾液酸的外泌体(E-Dox+Neu)后，检测肿瘤体积和重量变化；其中，A图为小鼠肿瘤组织实拍图、B图为药物注射18天小鼠肿瘤体积的变化图、C图为药物注射18天肿瘤重量的变化图、D图为18天小鼠体重的变化图。
具体实施方案
下面通过具体实施例对本发明所述去唾液酸化的载药外泌体对肝癌的靶向抑制效果做进一步说明。以下实施案例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员根据上述发明内容，对本发明做出一些非本质的改进和调整进行具体实施，仍属于发明保护的范围。
实施例1：初始外泌体的收集
外泌体的收集：选用人脐带间充质干细胞的培养上清液，于4℃500g离心10min，收集上清以除去死细胞；于4℃2,000g离心20min，收集上清以除去细胞碎片；于4℃11,000g离心30min，收集上清以除去细胞器及大囊泡；于4℃110,000g离心70min；去上清得到外泌体粗沉淀；用PBS重悬，4℃110,000g离心70min，得到外泌体沉淀，即初始外泌体。
进一步地，可以用PBS重悬，用BCA试剂盒进行蛋白定量。
实施例2：装载有药物的外泌体的制备
选取实施例1制备的初始外泌体进行药物装载。
(1)取盐酸阿霉素(Dox)50μg，添加到100μL的外泌体(1mg/mL蛋白浓度)中，轻轻吹吸混合。使用超声波细胞破碎仪(超声波清洗机，功率80W)对反应体系进行超声。
(2)将超声后的混合液置于37℃，放置一定时间，使外泌体膜恢复原状。然后将混合液以14,000g的速度通过超滤管(Amicon Ultra-0.5,10kDa)4℃下离心15min，再加PBS离心洗涤三次，以去除负载在外泌体外表面上的阿霉素。将内管反向旋转，1000g离心5min 将内部液体回收，得到载药外泌体，即装载有药物的外泌体。
(3)使用酶标仪(Synergy2多功能酶标仪)通过比色法在480nm的吸收波长下测量得到阿霉素标准曲线，计算装载入外泌体中的阿霉素的量。
(4)计算和载药率(DL％)
Figure BDA0003771707220000061
实施例3：处理条件影响装载有药物的外泌体的药物装载率
选取实施例1制备的初始外泌体进行药物装载。
(1)取盐酸阿霉素(Dox)50μg，添加到100μL的外泌体(1mg/mL蛋白浓度)中，轻轻吹吸混合。使用超声波细胞破碎仪(超声波清洗机，功率80W)对反应体系进行超声。
(2)将超声后的混合液置于37℃孵育一定时间，使外泌体膜恢复原状。然后将混合液以14,000g的速度通过超滤管(Amicon Ultra-0.5,10kDa)4℃下离心15min，再加PBS离心洗涤三次，以去除负载在外泌体外表面上的阿霉素。将内管反向旋转，1000g离心5min将内部液体回收，得到载药外泌体。
其中，选择不同的超声时间、间隔时间、超声次数、孵育时间进行处理，参照实施例2 的(3)和(4)的方法比较不同反应体系下的载药率。结果如表1所示。结果显示，超声时间40s、间隔时间20s、超声次数5次，37℃孵育90min，药物装载效率可达25.28％。
表1不同处理条件下的载药率
编号 37℃孵育时间 超声时间 间隔时间 超声次数 载药效率
1 0min 5s 0s 3次 5.66％
2 0min 20s 10s 5次 4.37％
3 0min 30s 20s 8次 11.59％
4 0min 40s 60s 10次 8.26％
5 90min 5s 10s 8次 10.63％
6 90min 20s 0s 10次 18.26％
7 90min 30s 60s 2次 9.86％
8 90min 40s 20s 5次 25.28％
9 120min 5s 20s 10次 7.09％
10 120min 20s 60s 8次 3.36％
11 120min 30s 0s 5次 5.59％
12 120min 40s 10s 3次 7.65％
13 150min 5s 60s 5次 8.85％
14 150min 20s 20s 3次 5.59％
15 150min 30s 10s 10次 12.79％
16 150min 40s 0s 8次 8.50％
实施例4：靶向肝癌的载药外泌体(去唾液酸化的载药外泌体)的制备
(1)初始外泌体的制备：参见实施例1。
(2)装载有药物的外泌体的制备：选取实施例1制备的初始外泌体进行药物装载，具体是：取盐酸阿霉素(Dox)50μg，添加到100μL的外泌体(1mg/mL蛋白浓度)中，轻轻吹吸混合。使用超声波细胞破碎仪对反应体系进行超声，其中超声条件为超声功率80W，超声时间40s、间隔时间20s、超声次数5次；将超声后的混合液置于37℃孵育90min，使外泌体膜恢复原状。然后将混合液以14,000g的速度通过超滤管(Amicon Ultra-0.5,10kDa)4℃下离心15min，再加PBS离心洗涤三次，以去除负载在外泌体外表面上的阿霉素。将内管反向旋转，1000g离心5min将内部液体回收，得到载药外泌体；药物装载效率可达25.28％。
(3)去唾液酸化处理：如图1所示，分别用不同体积的神经氨酸酶(浓度1U/μL)去处理载药外泌体(30μg蛋白含量)，37℃孵育2h。并在110,000g超离70min以除去多余神经氨酸酶，用PBS重悬，重复离心一次，得到靶向肝癌的载药外泌体，即去唾液酸化的载药外泌体。
使用凝集素印迹的方法，利用凝集素可以识别糖链的特性检测糖链水平。取等量外泌体进行SDS-PAGE分离，随后将凝胶上的蛋白转到PVDF膜上，用20mL 3％(w/v)牛血清白蛋白溶液在室温下封闭1h，加入凝集素(v/v,1:1000)于4℃过夜孵育。第二天洗膜后加入ABC-HRP检测试剂(v/v,1:10)，室温下孵育1h，洗膜后用ECL化学发光检测试剂(上海天能，货号180-5001)显色，用化学发光成像仪扫描显影。凝集素均购买于Vector Laboratories公司，其中SAL(货号B-1305-2)和MALII(货号B-1265-1)凝集素能够识别唾液酸，PNA (货号BA-0074-.5)凝集素能够识别半乳糖链，ECL(货号B-1145-5)能够识别N-乙酰半乳糖胺。由图1可知，神经氨酸酶可以有效去除外泌体表面的唾液酸修饰(图1A)，且神经氨酸酶加入量在0-4U范围内增加时，泳道内条带数明显减少，而随着神经氨酸酶加入量的进一步升高(6-8U)，泳道内条带数并无进一步变化，说明4U的用酶量是最适用量；用4U 的神经氨酸酶处理外泌体，随着唾液酸修饰的去除，右侧泳道中条带增多颜色加深，表明外泌体表面暴露的半乳糖或N-乙酰半乳糖胺水平也显著增加(图1B)，说明神经氨酸酶可以有效暴露外泌体表面的半乳糖或N-乙酰半乳糖胺。
实施例5：靶向肝癌的载药外泌体的效果表征
在实施例1的初始外泌体的基础上，使用实施例3中最大装载效率的方法，即超声功率 80W、超声时间40s、间隔时间20s、超声次数5次，37℃孵育90min，将Dox装载进入外泌体；随后利用实施例4中效果最优的去唾液酸化方法，即4U神经氨酸酶处理上述载药的外泌体，超离后得到靶向肝癌的装载Dox的外泌体(E-Dox+Neu，即去唾液酸外的载药外泌体)进行性能表征。
(1)去唾液酸化的载药外泌体表征：
如图2所示，利用动态光散射(DLS)技术测量载药外泌体粒径分布是否符合标准；利用电镜观察载药外泌体的结构是否为典型的杯托状结构；利用蛋白质免疫印迹法检测得到的载药外泌体是否具有外泌体标志性蛋白。从图2A可以看出，去唾液酸化的载药外泌体粒径分布在100-150nm之间，符合外泌体的分布范围；图2B显示去唾液酸化的载药外泌体呈现典型的杯托状结构，具有典型的完整的细胞膜结构；图2C左侧条带是以供体细胞间充质干细胞(MSC)蛋白裂解液作为对照，右侧条带为外泌体(Exo)蛋白裂解液，右侧可以检测到外泌体特征性蛋白Alix、CD63、TSG101、CD81，而不含细胞内高尔基体标志物Calnexin，表明去唾液酸化的载药外泌体纯度很高，无细胞碎片的污染。以上说明，MSC外泌体经过载药及去唾液酸化后并未改变外泌体的理化特征，提取的外泌体符合符合JournalofExtracellular Vesicles杂志公布的外泌体鉴定要求。
(2)外泌体摄入：
如图3所示，将肝癌细胞HepG2接种于12孔板，加入PBS(Ctrl)、游离的Dox(Dox)、装载Dox的外泌体(E-Dox，即实施例4步骤(2)处理得到的外泌体)、装载Dox且神经氨酸酶处理后的外泌体(E-Dox+Neu，即本实施例的靶向肝癌的装载Dox的外泌体)，于CO2培养箱中孵育12h，用流式细胞仪检测外泌体摄入，横坐标代表细胞中摄入的Dox荧光强度，细胞摄入Dox越多，信号峰向右偏移越多；纵坐标表示细胞数量。从图3可以看出，肝癌细胞对E-Dox+Neu摄入量最多(与对照组相比，峰向右偏移最多)，对E-Dox摄入量次之，而对游离的Dox(Dox)摄入较少。说明神经氨酸酶处理后，增强了外泌体对肝癌细胞的靶向性。
(3)检测E-Dox对肝癌细胞凋亡水平的影响
如图4所示，分别用PBS，Dox(游离的Dox)，E-Dox(装载有Dox的外泌体)、E-Dox+Neu(神经氨酸酶处理的装载有Dox的外泌体，即E-Dox+Neu)与肝癌细胞HepG2在于CO2培养箱中共孵育48h，使用AnnexinV-EGFP/PI(购于江苏凯基生物技术有限公司，货号KGA104) 双染色法，通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况，选择FITC和PE荧光通道。
结果显示，E-Dox+Neu处理后，凋亡的肝癌细胞数量最多，可达21.28％，说明E-Dox+Neu 对肝癌细胞的杀伤力最强。与E-Dox处理组的细胞凋亡仅12.77％相比，效果相对提升了 66.6％，非常显著。
(4)小鼠体内治疗：
将HepG2细胞注射入小鼠皮下，构建皮下移植瘤小鼠模型，待肿瘤生长至约2cm3大小，取肿瘤体积相同的小鼠，将其分为4组，每组通过尾静脉分别注射Ctrl(PBS)，Dox(游离的Dox)，E-Dox(装载有Dox的外泌体)、E-Dox+Neu(神经氨酸酶处理的装载有Dox的外泌体)等药物，每三天注射一次，同时测量肿瘤的大小及小鼠体重。连续治疗15天，将小鼠安乐死，取出肿瘤，测量其大小及重量。
图5A为处理15天后每组小鼠肿瘤体积实拍图，与E-Dox处理组相比，E-Dox+Neu处理组的小鼠肿瘤体积更小；图5B和图5C为15天内，每个处理组肿瘤体积和肿瘤重量的变化情况，4组小鼠肿瘤体积和重量均有不同程度的增加，但与E-Dox处理组相比，E-Dox+Neu 处理组的小鼠肿瘤体积和重量变化更小，上述结果均说明神经氨酸酶处理后外泌体对肝癌细胞的靶向性更好，使其装载的Dox能更好的作用于肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞的生长；图5D 为15天内小鼠体重的变化情况，4个处理组小鼠体重均没有明显变化，说明加入装载药物的外泌体对小鼠生存无影响。总的来说，各组外泌体对小鼠体重并无显著影响，装载Dox且去唾液酸外泌体(E-Dox+Neu)对小鼠肝癌肿瘤的杀伤效果最佳。
实施例6：靶向肝癌的载药外泌体的应用
一种具有靶向肝癌的药物，含有本发明的靶向肝癌的载药外泌体。
可选地，所述药物，还可以包括药用载体、辅料或稀释剂。
可选地，所述药物为缓释制剂。
可选地，所述药物的剂型为片剂、胶囊、颗粒、丸剂或注射剂。
可选地，所述药学上可接受的辅料选自稀释剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂及润滑剂中的至少一种。
可选地，所述稀释剂选自淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙及碳酸钙中的至少一种；及/或，所述粘合剂选自淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇中的至少一种；及/或，所述崩解剂选自淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠和聚氧乙烯中的至少一种；及/或，所述润滑剂选自滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、液体石蜡和聚乙二醇中的至少一种；及/或，所述湿润剂选自是水、乙醇及异丙醇中的至少一种。
可选地，所述药物为注射剂，所述药学上可接受的辅料选自增溶剂、pH调节剂及渗透压调节剂中的至少一种。
可选地，所述增溶剂选自乙醇、异丙醇、丙二醇、聚乙二醇、泊洛沙姆、卵磷脂和羟丙基-β-环糊精中的至少一种；及/或，所述pH调节剂选自柠檬酸盐、磷酸盐、碳酸盐、醋酸盐、盐酸和氢氧化物中的至少一种；及/或，所述渗透压调节剂选自氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、柠檬酸盐和醋酸盐中的至少一种。
可选地，所述药物的剂型为外用制剂或者口服制剂。
可选地，所述外用制剂为喷雾剂或气雾剂；可选地，所述口服制剂为颗粒剂、胶囊剂、片剂和囊泡剂中的任意一种。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种靶向肝癌的载药外泌体，其特征在于，所述靶向肝癌的载药外泌体是将装载有药物的外泌体使用神经氨酸酶进行处理后得到。
2.根据权利要求1所述的靶向肝癌的载药外泌体，其特征在于，所述靶向肝癌的载药外泌体的制备方法包括：
(1)获得初始外泌体；
(2)在初始外泌体中装载药物得到装载有药物的外泌体；
(3)酶处理装载有药物的外泌体：每30μg蛋白含量的载药外泌体中，添加4U的神经氨酸酶，37℃孵育2h，离心，得到去唾液酸化的载药外泌体，即为靶向肝癌的载药外泌体。
3.根据权利要求1-2任一所述的靶向肝癌的载药外泌体，其特征在于，所述药物是通过如下方法装载到外泌体中：取盐酸阿霉素添加到外泌体中，轻轻吹吸混合；使用功率为80W的超声，按照超声时间40s、间隔时间20s、超声次数5次的方法进行超声处理，然后37℃孵育90min使外泌体膜恢复原状，再离心洗涤去除表面的阿霉素，得到装载有药物的外泌体。
4.根据权利要求1-2任一所述的靶向肝癌的载药外泌体，其特征在于，所述初始外泌体的制备方法包括：选用人脐带间充质干细胞的培养上清液，除去死细胞、除去细胞碎片、除去细胞器及大囊泡，得到外泌体粗沉淀，重悬、离心，得到外泌体沉淀。
5.根据权利要求1-2任一所述的靶向肝癌的载药外泌体，其特征在于，外泌体所载药物为肝癌的相关药物，包括化疗类药物、核酸类药物、蛋白类药物。
6.根据权利要求1-2任一所述的靶向肝癌的载药外泌体，其特征在于，所述药物为阿霉素。
7.根据权利要求1-2任一所述的靶向肝癌的载药外泌体，其特征在于，外泌体来源于包括间充质干细胞、免疫细胞、肿瘤细胞、血液、牛奶等所有人或动物的各类细胞或体液。
8.根据权利要求1-2任一所述的靶向肝癌的载药外泌体，其特征在于，所述神经氨酸酶来源于微生物、动物或者人体内的神经氨酸酶。
9.权利要求1-8任一所述靶向肝癌的载药外泌体在制备靶向肝癌的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药用载体、辅料或稀释剂。
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