CN115337395A - 一种广谱中和新型冠状病毒的喷剂及其制备方法、应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种广谱中和新型冠状病毒的喷剂，包括能够识别中和SARS‑CoV‑2RBD蛋白的全人源化单克隆抗体hMab‑7F，所述hMab‑7F由利用巢式PCR扩增编码RBD特异性记忆B细胞的免疫球蛋白G重链和轻链可变区和恒定区基因片段，并利用真核表达系统筛选制得。本发明利用抗体工程技术制备具有RBD特异性的单克隆抗体，能够对RBD蛋白进行有效的中和；同时采用经鼻腔直接肺部进行给药，能够使中和抗体快速到达呼吸道以及肺组织，并长时间在其局部产生高浓度的抗体保护，在降低用药成本的同时，也降低了毒副作用，为临床上有效预防新型冠状病毒的传播提供一种可行方式。

Description

一种广谱中和新型冠状病毒的喷剂及其制备方法、应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及一种广谱中和新型冠状病毒的喷剂及其制备方法、应用。
背景技术
新型冠状病毒肺炎(COVID-19)是由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的新型传染性疾病，其典型临床症状为急性呼吸窘迫综合征，偶尔引发其它如肾脏损伤、腹泻等临床症状，在免疫力低下感染人群中仍具有较高的死亡率。
接种预防性疫苗是控制其传播的重要方式，但随着病毒多个变种的出现，需要更加及时的预防手段，中和抗体具有极高的抗原特异性，能在短期内清除SARS-CoV-2，是另一种特效治疗方式。经研究发现，刺突蛋白(Spike protein，S)对于SARS-CoV-2识别并进入宿主细胞至关重要，其中，位于C端的RBD负责识别并结合宿主细胞膜上的ACE2受体。目前普遍认为，针对RBD蛋白的中和抗体在体液免疫应答中发挥了主要作用。虽然COVID-19康复患者的血浆治疗可以有效缓解SARS-CoV-2感染患者的临床症状，但该血浆疗法因抗体浓度及活性不同，非抗体成分不可控等因素存在生物安全风险。
同时传统的抗体都是通过注射方式系统性给药，但这种方式的抗体主要分布在血液里，到达病灶部位却十分有限。因此，全身给药往往需要提高抗体剂量，这不仅增加了药物成本，同时也增高了副作用的风险。
有鉴于此，特提出本申请。
发明内容
为了解决上述问题，本发明目的在于提供一种广谱中和新型冠状病毒的喷剂及其制备方法、应用，利用抗体工程技术制备具有RBD特异性的单克隆抗体，能够对RBD蛋白进行有效的中和；同时采用经鼻腔直接肺部进行给药，能够使中和抗体快速到达呼吸道以及肺组织，并长时间在其局部产生高浓度的抗体保护，在降低用药成本的同时，也降低了毒副作用，为临床上有效预防新型冠状病毒的传播提供一种可行方式。
本发明通过下述技术方案实现：
一种广谱中和新型冠状病毒的喷剂，包括能够识别中和SARS-CoV-2RBD蛋白的全人源化单克隆抗体hMab-7F，所述hMab-7F由利用巢式PCR扩增编码RBD特异性记忆B细胞的免疫球蛋白G重链和轻链可变区和恒定区基因片段，并利用真核表达系统筛选制得。
进一步的，所述喷剂包括白蛋白纳米粒-抗体复合物HAS&hMab-7F，所述白蛋白纳米粒-抗体复合物为抗体hMab-7F与多聚-L-赖氨酸偶联后通过静电力作用结合在白蛋白纳米粒表面制得的复合物。
进一步的，所述喷剂还包括超纯甘油和溶解缓冲液。
进一步的，所述溶解缓冲液中包括NaCl、KCl、KH2PO4和Na2HPO4，具体配比如下：2.67mM KCl,1.47mM KH2PO4,137.93mM NaCl,8.06mM Na2HPO4，pH值为7.4±0.1。
进一步的，白蛋白纳米粒-抗体复合物、超纯甘油和溶解缓冲液的组分配比为：0.2～1mg/ml白蛋白纳米粒-抗体复合物溶于20％～50％超纯甘油和50％～80％溶解缓冲液，优选的，1mg/ml白蛋白纳米粒-抗体复合物溶于50％超纯甘油和50％溶解缓冲液。
本发明还提供一种广谱中和新型冠状病毒的喷剂制备方法，单克隆抗体hMab-7F的制备包括如下步骤：
1)采集COVID-19新冠肺炎康复患者的外周血，分选RBD蛋白特异性记忆B细胞；
2)利用巢式PCR分别扩增编码免疫球蛋白G重链以及轻链可变区和恒定区的基因片段，分别将获得的表达载体转染至293T细胞，利用真核表达系统制备全人源化IgG抗体；
3)利用联免疫吸附实验筛选得到能够识别SARS-CoV-2RBD蛋白并具有中和活性的单克隆抗体，hMab-7F。
进一步的，白蛋白纳米粒-抗体复合物的制备方法包括如下步骤：
1)将多聚-L-赖氨酸溶解于磷酸盐缓液中，使终浓度为0.1mg/mL；
2)将hMab-7F抗体与多聚-L-赖氨酸偶联得到hMab-PLL偶联物；
3)将白蛋白纳米粒溶于蒸馏水中，加入hMab-PLL偶联物，在静电力作用下，将hMab-PLL连接物结合在白蛋白纳米粒表面，得到白蛋白纳米粒-抗体复合物HAS&hMab-7F。
进一步的，扩增编码重链及轻链可变区和恒定区的方法是，使用重链(IgH)和轻链(Igκ)的前导区特异性正向引物，以及恒定区特异性的反向引物进行首轮PCR反应,然后，利用IgH、Igκ骨架区(FWR1)特异性的正向引物和恒定区特异性的反向引物进行次轮PCR反应。
本发明还提供一种广谱中和新型冠状病毒的喷剂在中和新型冠状病毒中的应用。
进一步的，所述喷剂从鼻腔处喷入经呼吸道进入肺部。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1、本发明实施例提供的一种广谱中和新型冠状病毒的喷剂及其制备方法、应用，包含能够针对SARS-CoV-2RBD蛋白的中和抗体hMab-7F，能够在对SARS-CoV-2病毒起到一定的清除作用，起到一定的SARS-CoV-2病毒预防效果；
2、本发明实施例提供的一种广谱中和新型冠状病毒的喷剂及其制备方法、应用，将hMab-7F抗体与人白蛋白进行复合，人白蛋白作为机体的内源性物质，具有无毒，无抗原性，稳定性好等特点，并且半衰期时间较长，能够提高中和抗体的稳定性与持久性；
3本发明实施例提供的一种广谱中和新型冠状病毒的喷剂及其制备方法、应用，白蛋白纳米粒-抗体复合物能够有效中和新型冠状病毒以及变种病毒，具体包括Alpha(B.1.1.7)，Beta(B.1.351)，Gamma(P.1)，Delta(B.1.617.2)和Omicron(B.1.1.529)；
4、本发明实施例提供的一种广谱中和新型冠状病毒的喷剂及其制备方法、应用，将白蛋白纳米粒-抗体复合物通过鼻腔喷入，使中和抗体能够快速到达呼吸道以及肺组织，并长时间在其局部产生高浓度的抗体保护；
5、本发明实施例提供的一种广谱中和新型冠状病毒的喷剂及其制备方法、应用，抗体计量相比注射给药低，降低了用药成本，同时毒副作用风险低，使用起来简单便捷，实现了无创特效预防，为临床上有效预防新型冠状病毒的传播提供一种可行的策略。
附图说明
为了更清楚地说明本发明示例性实施方式的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例提供的中和抗体hMab-7F与白蛋白纳米粒结合形成HAS&hMab-7F复合物的流程结构图；
图2为本发明实施例提供的HAS&hMab-7F复合物的细胞毒性实验数据图；
图3为本发明实施例提供的接受不同喷剂后在动物肺组织中的抗体水平检测数据图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
在以下描述中，为了提供对本发明的透彻理解阐述了大量特定细节。然而，对于本领域普通技术人员显而易见的是：不必采用这些特定细节来实行本发明。在其他实施例中，为了避免混淆本本发明，未具体描述公知的结构、电路、材料或方法。
在整个说明书中，对“一个实施例”、“实施例”、“一个示例”或“示例”的提及意味着：结合该实施例或示例描述的特定特征、结构或特性被包含在本发明至少一个实施例中。因此，在整个说明书的各个地方出现的短语“一个实施例”、“实施例”、“一个示例”或“示例”不一定都指同一实施例或示例。此外，可以以任何适当的组合和、或子组合将特定的特征、结构或特性组合在一个或多个实施例或示例中。此外，本领域普通技术人员应当理解，在此提供的示图都是为了说明的目的，并且示图不一定是按比例绘制的。这里使用的术语“和/或”包括一个或多个相关列出的项目的任何和所有组合。
在本发明的描述中，术语“前”、“后”、“左”、“右”、“上”、“下”、“竖直”、“水平”、“高”、“低”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明保护范围的限制。
实施例1
一种广谱中和新型冠状病毒的喷剂，包括能够识别中和SARS-CoV-2RBD蛋白的全人源化单克隆抗体hMab-7F，所述hMab-7F由利用巢式PCR扩增编码RBD特异性记忆B细胞的免疫球蛋白G重链和轻链可变区基因片段，并利用真核表达系统筛选制得。
所述喷剂包括白蛋白纳米粒-抗体复合物HAS&hMab-7F，所述白蛋白纳米粒-抗体复合物为抗体hMab-7F与多聚-L-赖氨酸偶联后通过静电力作用结合在白蛋白纳米粒表面制得的复合物。
所述喷剂还包括超纯甘油和溶解缓冲液。
所述溶解缓冲液中包括NaCl、KCl、KH2PO4和Na2HPO4，具体配比如下：2.67mM KCl,1.47mM KH2PO4,137.93mM NaCl,8.06mM Na2HPO4，pH值为7.4±0.1。
白蛋白纳米粒-抗体复合物、超纯甘油和溶解缓冲液的组分配比为：0.2～1mg/ml白蛋白纳米粒-抗体复合物溶于20％～50％超纯甘油和50％～80％溶解缓冲液，优选的，将1mg/ml白蛋白纳米粒-抗体复合物溶于50％体积超纯甘油和50％体积溶解缓冲液的混合溶液中。
本发明还提供一种广谱中和新型冠状病毒的喷剂制备方法，单克隆抗体hMab-7F的制备包括如下步骤：
1)采集COVID-19新冠肺炎康复患者的外周血，分选RBD蛋白特异性记忆B细胞；
2)利用巢式PCR分别扩增编码免疫球蛋白G重链以及轻链可变区和恒定区的基因片段，分别将获得的表达载体转染至293T细胞，利用真核表达系统制备全人源化IgG抗体；
3)利用联免疫吸附实验筛选得到能够识别SARS-CoV-2RBD蛋白并且具有中和活性的单克隆抗体，hMab-7F。
其中，扩增编码重链及轻链可变区和恒定区的方法是，使用重链(IgH)和轻链(Igκ)的前导区特异性正向引物，以及恒定区特异性的反向引物进行首轮PCR反应,然后，利用IgH、Igκ骨架区(FWR1)特异性的正向引物和恒定区特异性的反向引物进行次轮PCR反应。
白蛋白纳米粒-抗体复合物的制备方法包括如下步骤：
1)将多聚-L-赖氨酸溶解于磷酸盐缓液中，使终浓度为0.1mg/mL；
2)将hMab-7F抗体与多聚-L-赖氨酸偶联得到hMab-PLL偶联物；
3)将白蛋白纳米粒溶于蒸馏水中，加入hMab-PLL偶联物，在静电力作用下，将hMab-PLL连接物结合在白蛋白纳米粒表面，得到白蛋白纳米粒-抗体复合物HAS&hMab-7F。
本发明还提供一种广谱中和新型冠状病毒的喷剂在中和新型冠状病毒中的应用，具体为将所述喷剂从鼻腔处喷入经呼吸道进入肺部。
实施例2
本发明实施例提供的一种广谱中和新型冠状病毒的喷剂制备方法，具体如下：
1、全人源化单克隆抗体hMab-7F的制备
采集COVID-19康复患者的外周血作为样本，分选获得针对RBD蛋白的单个特异性记忆B细胞；利用巢式PCR分别扩增编码免疫球蛋白G(IgG)重链以及轻链可变区(V区)的恒定区(C区)基因片段；分别将获得的表达载体转染至293T细胞，利用真核表达系统制备全人源化IgG抗体；最后，通过联免疫吸附实验(ELISA)筛选出若干株能够识别SARS-CoV-2RBD蛋白的单克隆抗体，接着利用RBD-hACE2结合干扰实验以及SARS-CoV-2型假病毒中和实验筛选得到针对SARS-CoV-2RBD蛋白具有较强中和活性的全人源化单克隆抗体，命名为hMab-7F，其具体步骤如下所示
1.1流式细胞术分选RBD蛋白特异性的记忆型B淋巴细胞
1)采集COVID-19康复患者的外周血，经分层离心获得单核淋巴细胞；
2)向细胞中加入0.5mg生物素标记的RBD蛋白(Biotin-RBD)，混匀后置于4℃，避光孵育30min；
3)加入5ml以上的MACS液(PBS+0.5％BSA+2mMEDTA)，1500rpm离心5min，弃掉上清，重复3次；
4)将多种流式抗体均按照1:100加入染色缓冲液，其中，流式抗体包括FITC-IgG,PE-Stepavidin,APC-CD19,APC-Cy7-live/dead；置于4℃避光孵育30min
5)清洗未结合的抗体后，利用流式分选仪得到RBD蛋白特异性记忆B细胞，同时将单个细胞捕获至96孔板中。
1.2扩增IgG重链及轻链可变区及恒定区的基因片段
1)将分选在96孔板中的单个记忆B细胞离心处理并提取其RNA，接着逆转录成cDNA；
2)按如表1和2分别配置PCR的反应体系，扩增IgG重链及轻链可变区和恒定区的基因片段；
表1
Figure BDA0003812830910000061
表2
Figure BDA0003812830910000062
3)取5μl的PCR反应产物加入1ul的6X loading buffer，140V电压，进行琼脂糖凝胶电泳25min；
4)切胶回收目的片段，并进行验证，大小在20-300bp处；
5)按100μl的体系进行双酶切，加入0.5μl Age1和Sal1限制性内切酶，在37℃金属浴酶切3小时；
5)酶切产物回收后进行纯化，体系中加入2μl T4连接酶将IgH/IgL基因片段连接至质粒中(含hCMV启动子和Amp抗性)。
1.3制备全人源化IgG抗体
1)将293T细胞均匀的铺在6孔板里，待密度生成至80％时进行半换液处理；
2)将获得的IgH/IgL表达载体按2:1(2μg:1μg)与Pcl-ECO混合后加入200ulOptiMEM，室温作用15min；孵育完成后，加入9ul/孔的转染试剂，继续作用20min；
3)将含有IgH/IgL表达载体的转染混合液滴加至293T细胞，48小时后收集细胞上清并离心获得全人源化IgG抗体。
1.4制备SARS-CoV-2RBD蛋白特异性中和抗体hMab-7F
通过联免疫吸附实验(ELISA)筛选出若干株能够识别SARS-CoV-2RBD蛋白的单克隆抗体，接着利用RBD-hACE2结合干扰实验以及SARS-CoV-2型假病毒中和实验筛选得到针对SARS-CoV-2RBD蛋白具有较强中和活性的全人源化单克隆抗体。
基于流式细胞术的RBD-hACE2结合干扰实验步骤如下：
1)50ul的293T表达上清中加入0.25ng/ul的RBD(mouse-Fc)蛋白溶液50ul，于96孔板中混匀后室温孵育1小时；
2)加入20ul制备的293T-ACE2单细胞悬液，混匀后置于冰上孵育40min；
3)经3次清洗后，利用Alex647 anti-mouse-IgG-Fc进行流式染色，冰上孵育30min；
4)染色完成后进行清洗，转移至流式管进行上机。
SARS-CoV-2型假病毒中和实验步骤如下：
1)取100ul梯度稀释的抗体和SARS-CoV-2假病毒上清等量混合，在37℃温箱孵育1h；
2)将混合液加入293T-ACE2细胞中，置于培养箱中培养12小时；
3)弃掉上清，加入培养基继续培养48小时，使用荧光素酶报告系统检测试剂盒进行检测。
2、白蛋白纳米粒-抗体复合物(HAS&hMab-7F)的制备
1)首先将多聚-L-赖氨酸(PLL)溶解于磷酸盐缓液中(pH＝4.5)，使终浓度为0.1mg/mL；
2)将hMab-7F抗体加入步骤1)的溶液中偶联得到hMab-PLL，其中hMab-7F抗体和PLL的质量比1:5，利用PD-10脱盐柱去除溶液中的杂质，然后采用冷冻干燥法收集偶联产物；
3)将白蛋白纳米粒溶于蒸馏水中，加入hMab-PLL偶联物，在静电力作用下，将hMab-PLL连接物结合在白蛋白纳米粒表面，形成白蛋白纳米粒-抗体复合物HAS&hMab-7F；其结构如图1所示，hMab-7F抗体偶联在多聚-L-赖氨酸的链上，然后hMab-PLL连接物以hMab-7F抗体在外，多聚-L-赖氨酸在内的结构包覆在白蛋白纳米粒表面上。
3、具有广谱中和SARS-CoV-2的鼻喷剂的制备
1)以白蛋白纳米粒-抗体复合物HAS&hMab-7F为原料，然后将1mg/ml白蛋白纳米粒-抗体复合物溶于50％超纯甘油和50％溶解缓冲液的混合溶液中，得到本发明具有广谱中和SARS-CoV-2的喷剂；所述溶解缓冲液具体配比如下：2.67mM KCl,1.47mM KH2PO4,137.93mM NaCl,8.06mM Na2HPO4，pH值为7.4±0.1。
实施例3
1、评估白蛋白纳米粒-抗体复合物HAS&hMab-7F的细胞毒性
1)将MLE-12细胞按10000/孔接种到96孔板中培养，12小时后，在细胞培养基中加入0.01～20μg/mL的hMab-7F、HAS(白蛋白纳米粒)、HAS&hMab-7F，共孵育48h；
2)在每孔中加入20μL(2mg/mL)的MTS染色剂，在37℃孵育2小时后进行检测并计算细胞活力(％)。结果如图2所示，白蛋白纳米粒-抗体复合物对细胞并没有明显毒性。
2、评估白蛋白纳米粒-抗体复合物喷剂的抗体维持水平
1)取数只Balb/c小鼠分为两组，其中一组从小鼠鼻腔处喷入只含有hMab-7F的喷剂，另一组从小鼠鼻腔处喷入含有HAS&hMab-7F的喷剂进行处理；
2)分别在0.5小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时、48小时，取小鼠的肺组织进行抗体浓度检测。
结果如图3所示，从图中可以看出，接受两组喷剂的小鼠均能够在短时间0.5h内从肺组织中检测到高水平的中和抗体，同时在48h之内均能够持续的检测到中和抗体，这说明从鼻腔喷入能够使抗体快速到达呼吸道以及肺组织，并能够在肺组织局部持续产生较高浓度的抗体保护；另外对比两组数据可以发现，接受HAS&hMab-7F喷剂的小鼠，其肺组织中的中和抗体水平更高，且在48h时仍有较高的抗体水平，说明持续效果更久。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种广谱中和新型冠状病毒的喷剂，其特征在于，包括能够识别中和SARS-CoV-2RBD蛋白的全人源化单克隆抗体hMab-7F，所述hMab-7F由利用巢式PCR扩增编码RBD特异性记忆B细胞的免疫球蛋白G重链和轻链可变区和恒定区基因片段，并利用真核表达系统筛选制得。
2.根据权利要求1所述一种广谱中和新型冠状病毒的喷剂，其特征在于，所述喷剂包括白蛋白纳米粒-抗体复合物HAS&hMab-7F，所述白蛋白纳米粒-抗体复合物为抗体hMab-7F与多聚-L-赖氨酸偶联后通过静电力作用结合在白蛋白纳米粒表面制得的复合物。
3.根据权利要求2所述一种广谱中和新型冠状病毒的喷剂，其特征在于，还包括超纯甘油和溶解缓冲液。
4.根据权利要求3所述一种广谱中和新型冠状病毒的喷剂，其特征在于，所述溶解缓冲液中包括NaCl、KCl、KH2PO4和Na2HPO4，具体配比如下：2.67mM KCl,1.47mM KH2PO4,137.93mM NaCl,8.06mM Na2HPO4，pH值为7.4±0.1。
5.根据权利要求3所述一种广谱中和新型冠状病毒的喷剂，其特征在于，超纯甘油和溶解缓冲液以体积比1:1～4混合，白蛋白纳米粒-抗体复合物在混合溶液中的配比浓度为0.2～1mg/ml。
6.一种权利要求1-5任一所述一种广谱中和新型冠状病毒的喷剂制备方法，其特征在于，单克隆抗体hMab-7F的制备包括如下步骤：
1)采集COVID-19新冠肺炎康复患者的外周血，分选RBD蛋白特异性记忆B细胞；
2)利用巢式PCR分别扩增编码免疫球蛋白G重链以及轻链可变区和恒定区的基因片段，分别将获得的表达载体转染至293T细胞，利用真核表达系统制备全人源化IgG抗体；
3)利用联免疫吸附实验筛选得到能够识别SARS-CoV-2RBD蛋白并具有中和活性的单克隆抗体，hMab-7F。
7.根据权利要求6所述一所述广谱中和新型冠状病毒的喷剂制备方法，其特征在于，白蛋白纳米粒-抗体复合物的制备方法包括如下步骤：
1)将多聚-L-赖氨酸溶解于磷酸盐缓液中，使终浓度为0.1mg/mL；
2)将hMab-7F抗体与多聚-L-赖氨酸偶联得到hMab-PLL偶联物；
3)将白蛋白纳米粒溶于蒸馏水中，加入hMab-PLL偶联物，在静电力作用下，将hMab-PLL连接物结合在白蛋白纳米粒表面，得到白蛋白纳米粒-抗体复合物HAS&hMab-7F。
8.根据权利要求6所述一种广谱中和新型冠状病毒的喷剂制备方法，其特征在于，扩增编码重链及轻链可变区和恒定区的方法是，使用重链(IgH)和轻链(Igκ)的前导区特异性正向引物，以及恒定区特异性的反向引物进行首轮PCR反应，然后利用IgH、Igκ骨架区(FWR1)特异性的正向引物和恒定区特异性的反向引物进行次轮PCR反应。
9.权利要求1-5任一所述一种广谱中和新型冠状病毒的喷剂在中和新型冠状病毒中的应用。
10.根据权利要求9所述一种广谱中和新型冠状病毒的喷剂在中和新型冠状病毒中的应用，其特征在于，所述喷剂从鼻腔处喷入。
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