CN111153999B - Ctla-4纳米抗体、制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医学技术领域，特别涉及CTLA‑4纳米抗体、制备方法及其应用。使用纳米抗体可以提高或者协同增强与抗原的结合能力。纳米抗体不具备完整的抗体结构，缺少Fc端以及Y型结构，抗原与纳米抗体结合后不容易被识别，可以轻易逃避免疫系统的捕捉。技术手段主要包括：抗原与载体连接；转入感受态细胞中，提取重组质粒；然后转染至宿主菌中进行表达；利用抗原蛋白对驼类动物进行免疫；采集外周血，抽提淋巴细胞样品的总RNA，反转录为cDNA，扩增得到VHH文库片段，将VHH文库片段插入表达载体，并转化至感受态细胞中，构建抗体免疫库；筛选抗体免疫库中的纳米抗体；验证筛选的纳米抗体与CTLA‑4抗原结合。

Description

CTLA-4纳米抗体、制备方法及其应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，特别涉及CTLA-4纳米抗体、制备方法及其应用。
背景技术
细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyteas-sociated antigen-4，CTLA-4)是一种T淋巴细胞跨膜蛋白，它最早在筛选小鼠杀伤性T细胞的cDNA文库时被发现。CTLA-4具有高度的内吞性，通常存在于胞内小体中，以二聚体的形式存在，与其配体结合不会改变它的构象。CTLA-4能够与抗原提呈细胞或者活化的T细胞表面B7受体结合，通过反向传导到信号抑制细胞的功能。研究发现高迁移率族蛋白B1能够显著降低小鼠调节性T细胞表达T淋巴细胞毒性相关抗原-4的表达水平，而用封闭TLR-4预处理后，再用高迁移率族蛋白B1作用的实验组表达的T淋巴细胞毒性相关抗原-4水平显著升高，而它升高的水平随着高迁移率族蛋白B1浓度的不同而不同。CTLA-4在免疫治疗领域受到了极大的关注。有研究者在2009年成功建立了猪CTLA-4实时荧光定量PCR检测方法，结果表明他们构建的重组质粒具有效果好、敏感性高等优良特性，这为检测被病毒感染后的猪的免疫细胞中CTLA-4的表达水平的变化及猪的免疫功能提供了技术上的支持。有研究称将鼠或人的CTLA-4IgV蛋白与目的抗原融合，能显著增强动物机体细胞和体液的免疫应答。有研究者为了研究猪的CTLA-4IgV作为分子佐剂的可行性，就通过猪的外周淋巴细胞得到CTLA-4IgV的编码序列来表达相应的蛋白，然后经过蛋白融合等一系列技术的应用分析得出猪的CTLA-4IgV能作为分子佐剂促进机体的免疫应答。
中国医学科学院研制出一种具有定向性、选择性杀伤肿瘤细胞的“单抗-药物”联结物，即以单克隆抗体为“载体”，携带药物精确地和肿瘤细胞结合，能在原位杀死癌细胞，而对其他正常细胞无损伤。这种综合性药物好比是专攻癌症的“生物导弹”，人们把这种治疗方法形象地比喻为导弹疗法。但是，单克隆抗体的联结物具有以下缺点：
(1)单克隆抗体存在异源性。如果用于小鼠单克隆抗体的单克隆抗体，对人体的应用会产生抗鼠单克隆抗体，它不可重复应用，影响其疗效。
(2)单克隆抗体体积相对较大，不能较好的进入肿瘤组织。
(3)单克隆抗体开发周期长，生产成本高，产量低。
(4)单克隆抗体类药物价格昂贵，研发复杂，人源化复杂，成功率有限。
(5)难以大规模生产，单克隆抗体药物在建厂和生产过程中消耗的资金非常巨大
(6)不稳定，容易降解，保存成本高；容易污染，维护成本高昂。在高温和强酸强碱的条件下会分解，须在低温下保存，否则就会在数周内完全失去活性。抗体能被消化系统很快降解，从而阻止了其进入大脑或其他有效作用部位。
生物免疫治疗相对传统化疗或靶向治疗，有一个本质逻辑区别:“免疫治疗”针对的是免疫细胞或者说是免疫系统，而不是癌症细胞。在癌症免疫治疗中，抑制免疫检查点通路被认为是最有前景的治疗方式之一，其机制是通过抑制通路中相关靶点解除T细胞活性受抑状态，活化后的T细胞能够进攻和消灭肿瘤细胞。抗体并不直接作用于肿瘤细胞，而是通过作用于T细胞类间接杀伤肿瘤细胞；另外，它们并不是针对肿瘤表面的某种特定物质，而是系统性地增强了全身的抗肿瘤免疫反应。
纳米抗体是由比利时科学家于1993年在自然杂志中首次报道，在羊驼外周血液中存在一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区，但却不像人工改造的单链抗体片段(scFv)那样容易相互沾粘，甚至聚集成块。更重要的是单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。VHH晶体为2.5nm，长4nm，分子量只有15KD，因此也被称作纳米抗体(Nanobody，Nb)。
纳米抗体包含3个高变区与4个骨架区，高变区均在同一侧。与人类抗体的VH有着同样的结构，测序显示与VH3同源性极高，但是纳米抗体的CDR1(Complementarity-determining region-1)与CDR3(Complementarity-determining region-3)相对较长。
因此，将相关抗原与纳米抗体结合，在肿瘤疾病的诊断和治疗方面具有广阔的应用前景。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了CTLA-4纳米抗体、制备方法及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
CTLA-4纳米抗体，所述CTLA-4纳米抗体的序列见SEQ ID NO.9。
CTLA-4纳米抗体的制备方法，包括以下步骤：
S1：合成CTLA-4免疫抗原序列片段，并进行扩增；
S2：将扩增后的CTLA-4产物片段与载体连接，得到连接液；
S3：将连接液转入感受态细胞中，并提取重组质粒；
S4：将重组质粒转染至宿主菌中，对抗原进行表达，并对表达的抗原蛋白进行纯化；
S5：利用步骤S4中得到的抗原蛋白对驼类动物进行免疫；
S6：采集免疫后的驼类动物外周血，分离淋巴细胞；
S7：抽提淋巴细胞样品的总RNA，反转录为cDNA，使用引物CAL-leader和CAL-CH2进行扩增，得到VHH文库片段，其中引物CAL-leader和CAL-CH2的序列分别见SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5；
S8：将VHH文库片段插入表达载体，并转化至感受态细胞中，构建抗体免疫库；
S9：用生物素化方法筛选抗体免疫库中的纳米抗体；
S10：验证筛选的纳米抗体与CTLA-4抗原结合。
进一步地，步骤S1中，对合成的CTLA-4免疫抗原序列片段进行扩增时，所用引物分别为CTLA-4上游引物和CTLA-4下游引物，序列分别见SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。
进一步地，步骤S2中，所用载体为PCDNA3.1+载体。
进一步地，步骤S3中，所用感受态细胞为HEK293感受态细胞。
进一步地，步骤S4中，所用宿主菌为HEK293细胞。
进一步地，用生物素化方法筛选得到的纳米抗体的序列见SEQ ID NO:9。
一种利用上述制备方法制备的CTLA-4纳米抗体。
上述的CTLA-4纳米抗体在制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂中的应用。
上述的CTLA-4纳米抗体在制备用于提高动物免疫水平的免疫佐剂或者有病毒和/或细菌传播时的免疫促进剂中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
与使用单克隆抗体相比，纳米抗体的CDR3具有突出，使用纳米抗体可以提高或者协同增强与抗原的结合能力。纳米抗体具有稳定的结构，保证了结合的稳定性。纳米抗体与抗原的结合位点也与单克隆抗体不同，纳米抗体可以更紧密的结合到抗原上，并且可以结合到传统抗原结合不到的地方。另一方面纳米抗体并不具备完整的抗体结构，缺少Fc端以及Y型结构，抗原与纳米抗体结合后不容易被识别，可以轻易逃避免疫系统的捕捉。
纳米抗体可以在严苛的环境中保持构象不变，抗热性能较好，可以在室温下存放一周以上。而超强的耐酸碱性可以使纳米抗体更好的抵抗不同的环境，也可以增加纳米抗体的作用范围。单域重链抗体微小的体积也使它获得了较低的免疫原性，使动物长期注射蛋白成为可能。
本发明使用人HEK293细胞株对抗原进行表达，使用哺乳动物表达系统表达人的蛋白可以最大化的保证蛋白的原始结构与活性，保证了蛋白拥有翻译后修饰以及糖基化等真核蛋白特有的修饰，可以使获取的蛋白具有较高活性。
本方法使用羊驼作为免疫动物可以更好的保定以及节约抗原的用量。本方法筛选得到的纳米抗体可以高效、特异性的结合到靶点上。
附图说明
图1是是CTLA-4纳米抗体构建流程图；
图2是CTLA-4PCR电泳结果；
图3是pcDNA3.1载体酶切电泳结果；
图4是CTLA-4酶切电泳结果；
图5是CTLA-4特异性Western-blot检测结果；
图6是总RNA样品电泳结果图；
图7是VHH片段电泳结果图；
图8是VHH片段电泳结果图；
图9是电转化后抗性平板培养结果；
图10是菌落PCR产物电泳结果图；
图11是CTLA-4经SDS-PAGE检测结果；
图12是CTLA-4生物素标记检测结果；
图13是CTLA-4纳米抗体的细胞毒性；BHK-21:BHK-21细胞组；Kidney:绵羊肾细胞组；MDBK:MDBK细胞组；数据表示为平均值±SD；
图14是CTLA-4对免疫细胞的NO分泌水平影响；negative:阴性对照组；PBS:PBS组；CTLA-4:CTLA-4纳米抗体组。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明披露了CTLA-4纳米抗体、制备方法及其应用，制备流程如图1所示，具体方案如下实施例所示。本实施例中所用试剂均市售可得；pcDNA3.1质粒、HEK293细胞和HEK293感受态细胞，获自新疆民族与地方高发病省部共建实验室，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不作为其他用途使用。
实施例1CTLA-4纳米抗体、制备方法
S1：合成CTLA-4免疫抗原序列片段，并进行扩增。
首先通过Uniprot数据库获得CTLA-4免疫抗原序列，具体见SEQ ID NO:1。然后，使用Primer Premier 5.0软件设计CTLA-4上游引物和CTLA-4下游引物，具体见下表及SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3。
Figure BDA0002404535720000051
将上述引物及抗原序列送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成，以合成片段为PCR模板进行扩增。
PCR体系为：(引物浓度为1OD溶于400ul ddH2O)
Figure BDA0002404535720000052
PCR程序：
Figure BDA0002404535720000053
PCR完成后进行1％琼脂糖凝胶电泳，并按照回收试剂盒的操作回收片段。
PCR结果如图2所示，经PCR扩增得到大小相符的目的条带，用1％琼脂糖凝胶电泳检测目的条带清晰，与预期大小相符，说明成功扩增出目的条带，目的片段全长552bp。
S2：将扩增后的CTLA-4产物片段与载体连接，得到连接液。
首先，对步骤S1中的回收产物进行酶切，酶切体系50ul，具体为：
Figure BDA0002404535720000054
Figure BDA0002404535720000061
以上体系放入37℃恒温水浴锅中反应2h。
之后，对载体进行酶切，本实施例中所用载体为PCDNA3.1+载体，载体酶切体系为：
Figure BDA0002404535720000062
以上体系放入37℃恒温水浴锅中反应2h，按照回收试剂盒回收酶切的载体片段。将回收的载体片段用1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，其中泳道1和2均为载体酶切泳道。得到大小为为5300bp的条带，与预期大小相符，说明回收片段酶切成功。
然后将回收的目的片段与载体连接，连接体系20ul，具体为：
Figure BDA0002404535720000063
将上述连接体系置于PCR仪中，22℃处理1h，得到连接液。将连接液用1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示，说明连接成功。
S3：将连接液转入感受态细胞中，并提取重组质粒。
本实施例中采用本领域标准公知的42℃热激法转入HEK293感受态细胞，检测筛选出阳性克隆，提取重组质粒。
S4：将重组质粒转染至宿主菌中，对抗原进行表达，并对表达的抗原蛋白进行纯化。
本实施例中，在转染前24h将宿主菌HEK293细胞进行铺板，当细胞生长状态良好且贴壁细胞密度达到50％～80％时进行转染。将10μL脂质体加到500μL DMEM培养基中，加入重组质粒5μg，轻轻混匀，常温温育30min。之后将得到的混合液体小心加到铺板的细胞培养皿中，分散均匀，置37℃、5％CO2培养箱中培养72h。吸干细胞培养液，离心收集细胞，加入细胞裂解液Lysis Buffer：50mM Tris(PH8.0)，300mM NaCl，1％Triton X-100，1mM DTT，5％甘油，200W冰浴超声10min；16 000r/min离心20min；收集裂解上清液进行10％SDS-PAGE电泳，判断蛋白是否表达。
SDS-PAGE电泳结果显示，细胞培养液经10％SDS-PAGE凝胶电泳分析显示，在目的条带，与预期大小相符，证明蛋白成功表达，同时证明该蛋白以可溶性形式表达。之后，将该蛋白使用镍柱纯化，具体步骤如下：
Flag标签纯化
(1)使用Flag填料，1ml柱子用于纯化；
(2)柱子事先用Binding Buffer：(50mM Tris(pH 8.0)，300mM NaCl，0.1％TritonX-100，1mM DTT，5％甘油)平衡10CV；
(3)裂解后的细胞上清液加入到平衡好的柱子上；
(4)样品上完，用Binding Buffer清洗柱子；
(5)用Wash Buffer：(50mM Tris(pH8.0)，500mM NaCl，1mM DTT，5％甘油)清洗柱子5-10CV，洗去若结合的非特异吸附的杂质。
(6)用Elution Buffer：(50mM Tris(pH8.0)，150mM NaCl，150μg/μl Flagpeptide，1mM DTT，10％甘油)洗脱目标蛋白，收集目标蛋白。
特异性Western-blot检测：将PVDF膜切成条浸在甲醇中，室温条件下在摇床中培养1min；去除甲醇后加入1×TBST进行SDS-PAGE电泳，用夹心法将蛋白电转移至PVDF膜。将滤纸浸泡在转印缓冲液预湿润后，300mA转印80min；于室温条件下用封闭液封闭1h；将一抗进行3 000倍稀释，4℃孵育过夜；用PBST洗涤3次，每次5min；然后用封闭液5000倍稀释二抗，室温条件下温育1h；用PBST洗涤3次，每次5min，使用TMB显色液显色。
CTLA-4一抗为Anti-CTLA4抗体(BNI3)(小鼠单克隆抗体BNI3 to CTLA4，Anti-CTLA4 antibody(BNI3)abcam公司ab19792)，二抗为山羊多克隆抗体二抗to小鼠IgG-H&L(HRP)抗体(abcam公司ab6789)。
Western-blot检测结果证明蛋白具有特异性。
S5：利用步骤S4中得到的抗原蛋白对驼类动物进行免疫。
本实施例中选用羊驼作为免疫动物，免疫方案如下所示。
初次免疫，使用弗氏完全佐剂0.5ml+蛋白0.5ml乳化，进行皮下与皮内注射免疫；弗氏不完全佐剂0.25ml+蛋白0.25ml乳化均匀，分别在28天(二免)、49天(三免)、70天(四免)皮下免疫羊驼；弗氏不完全佐剂0.125ml+蛋白0.125ml乳化均匀，分别在91天(五免)、112天(六免)、133天(七免)免疫羊驼。在第144天，分离淋巴细胞。
进行ELISA检测，根据检测结果继续加强免疫，待确定产生抗体效价达到一定水平后进行颈动脉采血分离淋巴细胞。
Figure BDA0002404535720000081
ELISA检测实验：抗原分别200ng/well，4度包被过夜；PBST(0.1％)洗板1次，1×bloker300μl/well，37度封闭2h。PBST(0.1％)洗板1次，0.5×blocker梯度稀释抗血清，100μl/wel加入板中，37度1h。PBST(0.1％)洗板3次，抗羊驼二抗用0.5×blocker稀释1:15000，100μl/孔加入板中37度1h。PBST(0.1％)洗板3次，PBS洗板3次，100μl/孔TMB显色约20min，50μl/孔2M H2SO4终止。酶标仪OD450-OD630nm读数。
检测结果如下表：
12800倍 25600倍 51200倍 102400倍 204800倍 409600倍 PBS
CTLA-4免疫前 0.047 0.042 0.041 0.042 / / 0.039
CTLA-4七免 OUT OUT 2.244 1.359 0.741 0.339 0.041
其中“OUT”代表OD450值超过3.000，OD值太高，属于强阳性；“/”表示OD450值低于0.042，信号低于PBS对照组，OD值太低，属于阴性。
S6：采集免疫后的驼类动物外周血，分离淋巴细胞；
对免疫后的羊驼颈动脉采血，淋巴细胞分离，具体操作为：将淋巴细胞分离液预热至22℃。使用肝素钠抗凝管，每只羊驼采集外周血200mL。使用等体积的组织稀释液稀释全血。在离心管中加入等体积的分离液。室温，水平转子1000g，离心30min。吸取白膜层，加入10mL PBS洗涤液洗涤白膜层细胞。250g，离心10min。弃上清，5mL的PBS重悬细胞，250g，离心10min。弃上清，5mL的PBS重悬细胞，250g，离心10min。弃上清，细胞使用Trizol重悬。
S7：抽提淋巴细胞样品的总RNA，反转录为cDNA，使用引物CAL-leader和CAL-CH2进行扩增，得到VHH文库片段，其中引物CAL-leader和CAL-CH2的序列分别如下：
引物CAL-leader序列：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG，见SEQ ID NO:4；
引物CA-CH2序列：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC，见SEQ ID NO:5
本实施例中，Trizol重悬抽提羊驼外周血淋巴细胞样品的总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的质量。结果如图6所示，M为DL2000 DNAmarker，总RNA样品存在非常轻微的降解现象，28S、18S及5S rRNA条带均清晰可见，且28S条带亮度大于18S，表明RNA的完整性较好。Nanodrop测定RNA样品的浓度，结果如下表所示：
Figure BDA0002404535720000091
结果表明RNA样品浓度及纯度符合要求。每个项目以10μg总RNA为模板，反转录合成cDNA。
然后，以cDNA为模板，使用引物CAL-leader和CAL-CH2扩增羊驼抗体片段，取适量PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。
PCR体系：
使用pfu高保真DNA聚合酶(TransStart FastPfu DNA Polymerase，AP221-01)。
Figure BDA0002404535720000092
PCR程序：
Figure BDA0002404535720000101
电泳结果如图7所示，样品有两条带，主带分子量大小约为600bp，另外在900bp处有一条非目标条带，此条带应为传统抗体的扩增片段。将足量的PCR产物进行电泳，切胶回收600bp的主条带，作为后续PCR的模板，使用VHH-back和PMCF引物扩增VHH，序列详见SEQID NO:6和SEQ ID NO:7。结果如图8所示，PCR扩增得到了分子量大小与预期一致，约为400bp的目的条带。
引物VHH-back序列：GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG，见SEQ ID NO:6
引物PMCF序列：CTAGTGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGACCTGGGT，见SEQ ID NO:7
PCR体系：
Figure BDA0002404535720000102
PCR程序：
Figure BDA0002404535720000103
Figure BDA0002404535720000111
S8：将VHH文库片段插入表达载体，并转化至感受态细胞中，构建抗体免疫库。
电转化和文库构建：在正式建库的连接实验中，按照连接和转化预实验得出的最佳比例，将载体与四种VHH片段进行连接反应。使用试剂盒纯化后的连接产物经电转化到大肠杆菌TG1，得到了15ml转化产物。取10μl(即为10-2ml)进行一系列10倍梯度稀释，并取10-4、10-5和10-6共三个梯度进行涂氨苄抗性平板计数，以评估文库库容，库容＝克隆数×稀释倍数×转化产物总体积(ml)。将剩下的转化产物全部涂布到15块直径为15cm的Amp抗性平板培养过夜，次日分别刮下来混匀后，加入20％终浓度的甘油，分装并冻存于-80℃。
电转化实验方案：
1)制备E.coli TG1电转化感受态细胞；
2)将纯化后的连接产物加入适量TG1感受态细胞，混合均匀后，分装至0.2cm电转化杯；
3)利用电转化仪进行电转化，BIORAD推荐转化条件：2.5kV，25μF，200Ω。
4)加入2YT培养基至电转化杯中，重悬感受态细胞，37℃，150rpm复苏30min。
图9中J、K和L分别为10-4、10-5和10-6梯度稀释在氨苄抗性平板的生长情况。CTLA-4文库-5和-6梯度的克隆数量分别为～1700和230个，故库容为：[230×15×106+(1700+230)×15×105]÷2＝3.2×109。
免疫文库质量分析：从每种文库的梯度稀释平皿上随机挑取20个单克隆，使用引物MP57和PMCF进行菌落PCR，并进行琼脂糖凝胶电泳检测分析。使用引物MP57的序列(ttatgcttccggctcgtatg)见SEQ ID NO:8，对这些克隆送至第三方公司进行测序。
PCR体系：
使用Taq DNA聚合酶(2×Taq Plus MasterMix，CW2849M)。
Figure BDA0002404535720000112
PCR程序：
Figure BDA0002404535720000121
结果如图10所示，所有的克隆都有分子量大小约为500bp的特异性条带，表明这些克隆均为阳性。使用引物MP57对这些克隆进行测序，CTLA-4文库得到20个有效测序克隆。对有效测序克隆的VHH片段氨基酸序列进行比对分析，并检查第37/44/45/47位置的氨基酸分布。分析结果显示，文库库容量高，所测序片段无重复。
S9：用生物素化方法筛选抗体免疫库中的纳米抗体。
使用生物素化方法将CTLA-4抗原包被至ELISA板筛选特异性纳米抗体文库获得特异性纳米抗体片段，具体实验方案如下：
CTLA-4抗血清效价检测，用梯度稀释ELISA方法检测CTLA-4免疫前后血清效价，包被CTLA-4(200ng/well)，加入梯度稀释抗血清，二抗为抗羊驼-HRP 1:15000稀释使用，最后用TMB底物显色。
CTLA-4蛋白样品SDS-PAGE、Western-blot和生物素标记，SDS-PAGE检测CTLA-4蛋白上样量为2μg，Western-blot检测，抗血清1:20000稀释，抗羊驼-HRP二抗工作浓度为1:2000，用化学发光法显色。方法同上。
靶点CTLA-4的生物素标记及效率检测，对CTLA-4进行生物素标记，条件为0.25mg/ml，pH 7.4，蛋白与生物素比例为1:15，室温标记1h。标记好的蛋白，采用PD-Midi脱盐柱去除游离生物素，置换buffer为PBS 5％甘油pH7.4，最后各分装后保存于-70℃。为了检测CTLA-4的生物素标记效率，取两份1.5μg标记后的b-CTLA-4蛋白，然后分别加入5μg链霉亲和素(SA)和5μl PBS；另外同样取5μg SA，加入5μl PBS作为SA样品对照。室温反应1h后，各加入5μl的非还原loading buffer，不加热变性，直接进行SDS-PAGE。
体外定向筛选，用构建好的免疫文库，针对CTLA-4进行3轮筛选。
实验结果如下：
CTLA-4项目抗血清效价检测结果抗血清效价高，达到1:102400。
羊驼免疫前后血清效价检测
Figure BDA0002404535720000131
*注：OUT代表OD450nm下的ELISA值大于3。
CTLA-4蛋白样品SDS-PAGE、Western-blot和生物素标记
1)筛选抗原SDS-PAGE和Western-blot检测，如图11所示；CTLA-4经SDS-PAGE检测，结果显示，蛋白纯度高，无降解，分子量约23kDa，满足后续标记和筛选要求。Western-blot检测结果抗血清特异识别CTLA-4。
2)CTLA-4生物素标记效率检测
生物素标记效率检测结果如图12所示，SA+b-CTLA-4泳道比SA+PBS有明显条带迁移，同时在23kDa附近的b-CTLA-4条带较等量的b-CTLA-4+PBS组有明显减少，几乎没有蛋白残留，因此估计标记效率为>90％。
体外定向筛选
用构建好的免疫文库，针对b-CTLA-4进行3轮筛选，策略和结果如下表：
Figure BDA0002404535720000132
Figure BDA0002404535720000141
筛选结果显示，在第二轮筛选时出现明显富集，在第三轮有一定程度的富集。
筛选获得的纳米抗体序列如下，并见SEQ ID NO:9。
CGGTTTGGGCGGGATACATTTCACAAGCTTAAGGAGACAGTACATATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGTTTGGATTATCGCATAGGCTGGTTCCGTCGGGCCCCAGGGAAGGAGCGTGAGGGGGTCTCATGTATAAGTACGACCGGTGGTACCACAACGTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAAAGACAACGCCAAGAAGACGGCTTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACAGGCGTTTATTACTGTGCAGCCGCCTTCGGTGGTGCCGATTACGTTTGTTCTGACCAAGGGTATAACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCATACCCGTACGACGTTCCGGACTACGGTTCCCACCACCATCACCATCACTAGACTGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAACCTCATACAGAAAATTCATTTACTAACGTCTGGAAAGACGACAAAACTTTAGATCGTTACGCTAACTATGAGGGCTGTCTGTGGAATGCTACAGGCGTTGTCGTTTGTACTGGTGACGAAACTCAGTGTTACGGTACATGGGTTCCTATTGGGCTTGCTATCCCTGAAAATGAGGGTGGTGGCTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGTACTAAACCTCCTGAGTACGGTGATACACCTATTCCGGGCTATACTTATATCAACCCTCTCGACGGCACTTATCCGCCTGGTACTGAGCAAAACCCCGCTAATCCTAATCCTTCTCTTGAGGAGTCTCAGCCTCTTAATACTTTCATGTTTCAGATAATAGGTTCCGAAATAGGCAGGGTGCATTAACTGTTTATACGGGCACTGTTACCTCAAGGCACTGACCTCGTTAAAACCT
S10：验证筛选的纳米抗体与CTLA-4抗原结合。
鉴定方法如下：
1)Monoclonal phage ELISAanalysis
将第二、三轮洗脱的富集产物中挑230个克隆进行Monoclonal phage ELISA验证，分别包被CTLA-4和BSA对照200ng/well。
2)Soluble ELISAanalysis
将CTLA-4序列独特克隆(in E.coli TG1)在30℃进行IPTG诱导表达，离心后收集菌体，进行周质腔抽提。将周质腔抽提样品用0.5×blocker稀释10倍加入包被并封闭好的CTLA-4和BSA中，同时设置TG1(不含phagemid)周质腔抽提物作为阴性对照。使用mouseanti-HA tag单克隆抗体(ProteinTech，1:5000稀释)作二抗，羊抗鼠-HRP(1:5000稀释)作为三抗，检测可溶性表达纳米抗体的活性。
构建pET28a-SUMO载体表达和纯化为提高纳米抗体的表达量和活性，将有活的纳米抗体CTLA-4克隆构建到pET28a-SUMO载体中，进行胞内表达，超声破菌后用Ni柱纯化。
将纯化的纳米抗体用0.5×blocker梯度稀释加入包被并封闭好的CTLA-4和BSA(200ng/well)中，同时设置PBS作为阴性对照。使用mouse anti-HAtag单克隆抗体(ProteinTech，1:5000稀释)作为二抗，羊抗鼠-HRP(1:5000稀释)作为三抗，检测可溶性纯化纳米抗体的活性。
鉴定结果
1)Monoclonal phage ELISAanalysis
ELISA检测结果显示，阳性率约64％，挑选其中50个强阳性克隆测序，结果共有7个独特序列克隆。
2)Soluble ELISAanalysis
结果见下表，纳米抗体能可溶性表达且有较好活性。相同的背景色标记的克隆的序列相似性较高。
编号 CTLA-4(200ng/well) BSA(200ng/well)
CTLA-4 0.452 0.033
E.coli TG1 0.052 0.046
实施例2 CTLA-4纳米抗体的检测
本实施例中的数据分析：结果表示为平均值±标准偏差(SD)。使用GraphPadPrism 8软件进行统计学分析通过Mann-Whitney U检验进行差异显著分析(*＝P<0.05，**＝P<0.01)。
1、纳米抗体细胞毒性实验
37℃温水复苏BHK-21细胞、MDBK细胞、羊的肾细胞，加入细胞培养液(90％DMEM+10％FBS)，传代到96孔板，6×103个细胞每孔。等待细胞贴壁，并孵育3小时。加入CTLA-4纳米抗体，终浓度梯度设置为：5μg/ml，10μg/ml，20μg/ml，40μg/ml。共4个梯度。将20μl/孔MTS试剂加入每个孔中37℃温育3小时。振荡后在492nm测量吸光度。
结果如图13所示，不同浓度的纳米抗体对小鼠(BHK-21细胞)、绵羊(绵羊肾细胞)以及牛的细胞(MDBK细胞)均没有细胞毒性。证明CTLA-4纳米抗体对动物细胞没有细胞毒性。
MTT商品名称噻唑蓝通过特定波长的分光光度测定，可对细胞存活及生长情况进行定量测定和分析。BioVision的MTS细胞增殖分析试剂盒是一种比色法，是MTT的升级版，用于在增殖和细胞毒性分析中灵敏定量活细胞，可以用于判断试剂对细胞有无毒性。通过验证纳米抗体对哺乳动物细胞BHK-21，MDBK或绵羊肾细胞没有毒性，可以安全的用于动物。
2、纳米抗体与噬菌体的NO检测实验
将小鼠免疫细胞加入96孔板3h后加入终浓度为1μg/mL的T7噬菌体，然后孵育24h。将CTLA-4纳米抗体使用培养液(90％DMEM+10％FBS)稀释加入孔中，终浓度调整为10μg/mL，20μg/mL，40μg/mL，80μg/mL，每个样品三个复孔。细胞培养箱中培养细胞38h。对照组加入提取液100μL，试剂一50μL，试剂二50μL(均为购自北京索莱宝生物技术有限公司NO水平检测试剂盒中的试剂)。测定实验组加入样品100μL，试剂一50μL，试剂二50μL。混匀然后室温静置15min，测定550nm处吸光值。
结果图如14所示，在免疫细胞中添加不同浓度的CTLA-4纳米抗体共同孵育24h后，显示CTLA-4纳米抗体对于NO浓度的增强与浓度呈正相关，CTLA-4纳米抗体浓度越高，NO检测值越大，NO的分泌水平越高。CTLA-4纳米抗体在10μg/mL时，增强作用极小。在第80μg/mL时达到最大值。
一氧化氮(Nitric Oxide，NO)作为细胞间及细胞内的信息传递物质，发挥了信号传递的作用，是一种新型的生物信使分子。中国农业科学院兰州兽医研究所农业部兽医病原生物学国家重点实验室和动物病毒学重点实验室研究表明T7噬菌体颗粒很容易由免疫细胞吞噬并促进免疫细胞的成熟和NO等细胞因子分泌，可以作为细胞模型验证FMDV与免疫细胞的相互作用关系与作用强度。使用试剂盒检测培养液中的NO含量，可以反映出免疫细胞与抗原相互作用的强度。
CTLA-4纳米抗体在高浓度时，对免疫细胞分泌NO的水平促进能力更好，解除了T细胞等免疫细胞受到的其他免疫细胞的抑制(通过CTLA-4受体与配体的结合)。对免疫细胞的促进能力，揭示了CTLA-4纳米抗体可以用于促进动物细胞免疫水平的提高，可以作为一种潜在的免疫佐剂或者有病毒传播时的免疫促进剂。CTLA-4免疫抑制性受体存在于其他免疫相关细胞中，虽然有很多机制没有研究清楚，但是阻断免疫检查点可以增强免疫相关细胞的活性已经验证清楚。
3、纳米抗体注射小鼠后，小鼠体内IL-4、IFN-γ细胞因子以及NO分泌变化水平
注射抗体BalB/C小鼠，每只0.1mg。每只注射0.2ml，浓度为0.5mg/mL。分组如下：(例如PBS对照组有两组，并非重复与错误，后续会用金黄色葡萄球菌与无乳链球菌分别攻毒，故每个抗体注射分了两组。)
Figure BDA0002404535720000171
免疫三天后，采血并分离血清，检测细胞因子IL-4、IFN-γ与NO水平(IL-4检测试剂盒、IFN-γ检测试剂盒与NO水平检测试剂盒均购自北京索莱宝生物技术有限公司)。
使用索莱宝IL-4细胞因子检测试剂盒检测小鼠血清中IL-4细胞因子水平，索莱宝IFN-γ细胞因子检测试剂盒检测小鼠血清中IFN-γ细胞因子水平，索莱宝NO检测试剂盒检测小鼠血清中NO水平，结果见下表。(每组检测8只，每个数据代表了1只小鼠检测的OD450值。)
Figure BDA0002404535720000181
4、黄色葡萄球菌和无乳链球菌攻毒保护实验
分别注射金黄色葡萄球菌与无乳练球菌，其中金黄色葡萄球菌注射150μl/1.9×109cfu(多次研究判定的小鼠最低致死剂量)。无乳练球菌注射无乳200μl/5.1×1010cfu(多次研究判定的小鼠最低致死剂量)。24小时后观察小鼠状态并记录。
每组8只小鼠，攻毒24小时后小鼠状态，见下表。
Figure BDA0002404535720000182
对小鼠免疫水平的促进能力，揭示了CTLA-4纳米抗体可以用于促进动物细胞免疫水平的提高，可以作为一种潜在的免疫佐剂或者有病毒/细菌传播时的免疫促进剂，用于动物的保护。CTLA-4免疫抑制性受体存在于其他免疫相关细胞中，虽然有很多机制没有研究清楚，但是阻断免疫检查点可以增强免疫相关细胞的活性已经验证清楚。本研究所制备的CTLA-4纳米抗体可以用于保护动物在接受金黄色葡萄球菌和无乳链球菌侵害时，增强小鼠存活的数量。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 石河子大学
<120> CTLA-4纳米抗体、制备方法及其应用
<150> 2019106042208
<151> 2019-07-05
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 483
<212> DNA
<213> CTLA-4(CTLA-4)
<400> 1
atggcttgcc ttggatttca gcggcacaag gctcagctga acctggctac caggacctgg 60
ccctgcactc tcctgttttt tcttctcttc atccctgtct tctgcaaagc aatgcacgtg 120
gcccagcctg ctgtggtact ggccagcagc cgaggcatcg ccagctttgt gtgtgagtat 180
gcatctccag gcaaagccac tgaggtccgg gtgacagtgc ttcggcaggc tgacagccag 240
gtgactgaag tctgtgcggc aacctacatg atggggaatg agttgacctt cctagatgat 300
tccatctgca cgggcacctc cagtggaaat caagtgaacc tcactatcca aggactgagg 360
gccatggaca cgggactcta catctgcaag gtggagctca tgtacccacc gccatactac 420
ctgggcatag gcaacggaac ccagatttat gtaattgatc cagaaccgtg cccagattct 480
gac 483
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(CTLA-4-F)
<400> 2
gacacgaatt cgccacc 17
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(CTLA-4-R)
<400> 3
gtgtcaagct ttcacttatc gtcatcatcc 30
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(CAL-leader)
<400> 4
gtcctggctg ctcttctaca agg 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(CA - CH2)
<400> 5
ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(VHH-back)
<400> 6
gatgtgcagc tgcaggagtc tggrggagg 29
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(PMCF)
<400> 7
ctagtgcggc cgctgaggag acggtgacct gggt 34
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(MP57)
<400> 8
ttatgcttcc ggctcgtatg 20
<210> 9
<211> 1030
<212> DNA
<213> 纳米抗体(Nanobody)
<400> 9
cggtttgggc gggatacatt tcacaagctt aaggagacag tacatatgaa atacctattg 60
cctacggcag ccgctggatt gttattactc gcggcccagc cggccatggc ccaggtgcag 120
ctgcaggagt ctgggggagg cttggtgcag cctggggggt ctctgagact ctcctgtgca 180
gcctctggat tcagtttgga ttatcgcata ggctggttcc gtcgggcccc agggaaggag 240
cgtgaggggg tctcatgtat aagtacgacc ggtggtacca caacgtatgc agactccgtg 300
aagggccgat tcaccatctc caaagacaac gccaagaaga cggcttatct gcaaatgaac 360
agcctgaaac ctgaggacac aggcgtttat tactgtgcag ccgccttcgg tggtgccgat 420
tacgtttgtt ctgaccaagg gtataactac tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc 480
tcagcggccg catacccgta cgacgttccg gactacggtt cccaccacca tcaccatcac 540
tagactgttg aaagttgttt agcaaaacct catacagaaa attcatttac taacgtctgg 600
aaagacgaca aaactttaga tcgttacgct aactatgagg gctgtctgtg gaatgctaca 660
ggcgttgtcg tttgtactgg tgacgaaact cagtgttacg gtacatgggt tcctattggg 720
cttgctatcc ctgaaaatga gggtggtggc tctgagggtg gcggttctga gggtggcggt 780
tctgagggtg gcggtactaa acctcctgag tacggtgata cacctattcc gggctatact 840
tatatcaacc ctctcgacgg cacttatccg cctggtactg agcaaaaccc cgctaatcct 900
aatccttctc ttgaggagtc tcagcctctt aatactttca tgtttcagat aataggttcc 960
gaaataggca gggtgcatta actgtttata cgggcactgt tacctcaagg cactgacctc 1020
gttaaaacct 1030

Claims (1)

1.CTLA-4纳米抗体，其特征在于：所述CTLA-4纳米抗体的序列如SEQ ID NO.9所示。
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