CN115336665B - 乳铁蛋白处理方法、装置以及有效性验证方法 - Google Patents

Abstract

本发明首要的是提供一种针对乳铁蛋白的处理方法、装置以及有效性验证方法，该处理工艺基于双层膜过滤技术，能够替代传统工业化制备过程采用的热杀菌技术，有效降低乳铁蛋白变性率，提高提取率至80%以上，最大限度保护原料中的乳铁蛋白的品质。进一步，本发明也提供了一种针对上述双层膜过滤技术的在线连续双保压测试验证方案保证整个生产过程除菌膜的完整性。此外，本发明也提供了一种用于进行上述乳铁蛋白处理工艺的设备。

Description

乳铁蛋白处理方法、装置以及有效性验证方法

技术领域

本发明涉及食品加工领域，具体而言，涉及蛋白类物质的加工或处理工艺，更具体而言，涉及一种乳铁蛋白制备中的处理方法及其使用的装置。

背景技术

食品中微生物的污染及其繁殖是引发食品变质的重要因素，因此杀菌成为了食品加工中最关键的环节，冷杀菌技术是一种新型技术，和传统的热杀菌技术有较大差别，它不但能杀灭食品中的微生物，保护食品功能的生理活性，还能保持食品的新鲜度以及原有的风味和营养成分。

膜过滤技术在学术界被公认为一种优良的“冷杀菌”技术，近年来在制药及食品领域已得到广泛应用，如纯净水、啤酒、疫苗及各类静脉注射液等。

乳铁蛋白是初乳形成阶段、泌乳期、涸乳期和患乳房炎期间乳牛乳房腺体分泌物中主要的糖蛋白之一。其具有多种生物活性功能，例如广谱的抗菌性质，增强机体的抗病毒、抗氧化和免疫能力，防治感染性疾病、刺激双歧杆菌生长、维持肠道菌群的平衡、增强铁的传递和吸收等，已经成为食品界，特别是乳品界关心的热点。

但是长期以来，研究者们认为乳铁蛋白容易受热失活，不利于乳品加工。因为乳铁蛋白属于糖蛋白，对热不稳定，有研究发现牛乳铁蛋白在pH值为6.6，温度为65～69℃时开始失活。此后又有报道70℃加热15～30min已使乳铁蛋白完全降解。另外的研究发现乳铁蛋白在63℃，30min条件下，变性率85.81%；72℃，15s条件下，变性率17.34%；120℃，4s条件下，变性率90.1%。由此可见，乳制品常见的热杀菌工艺对乳铁蛋白的变性率影响非常大，但GB1903.17-2016《食品营养强化剂乳铁蛋白》中规定，制备工艺必须经分离、杀菌、提取、精制、干燥等，其中杀菌工艺不可或缺。所以，高效、稳定的乳铁蛋白冷杀菌技术一直是当前行业技术难点，成为发展瓶颈，亟需解决。

目前行业内乳铁蛋白制备方法普遍采用热杀菌工艺，例如新西兰TATUA品牌采用分离脱脂、巴杀（72℃，15s）、离子交换、洗脱、浓缩工艺；新西兰SYNLAIT品牌采用脱脂、层析、巴杀（72℃，15s）、超滤、喷雾干燥工艺；澳大利亚SAPUTO品牌采用脱脂、巴杀（72℃，15s）、层析、超滤、干燥工艺。

引用文献1公开了制备乳铁蛋白的方法，其包括以下步骤：利用阳离子交换树脂对温度不超过60摄氏度的液体乳进行离子交换处理，并通过洗脱获得含有乳铁蛋白的盐溶液；以及对所述含有乳铁蛋白的盐溶液进行脱盐处理，以便获得所述乳铁蛋白。并且，还可以进一步使用0.2微米的膜进行除菌处理。

引用文献2公开了一种乳铁蛋白制备方法，其通过反复的阳离子树脂的层析分离方法，将乳铁蛋白与过氧化酶分离，以得到更纯的乳铁蛋白。

引用文献3公开了一种生产乳铁蛋白和乳过氧化物酶的方法，其将乳铁蛋白与过氧化酶保留在大孔阳离子树脂柱上，然后控制洗脱条件（温度和洗脱液浓度）以收集不同条件下洗脱下来的过氧化酶以及乳铁蛋白。

引用文献4公开了一种从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，通过先后使用阳离子交换树脂以及不溶性Fe³⁺螯合树脂进行处理和浓缩，以降低乳铁蛋白产品中铁离子（Fe³⁺）的含量。

引用文献5公开一种用于从脱脂牛奶中直接提取乳铁蛋白的方法，其包括(a)使新鲜的脱脂牛奶直接通过装填有阳离子交换填料的层析柱，所述阳离子交换填料具有一定的粒径和孔径；(b)用水和含第一浓度盐的水溶液清洗残留的牛奶和杂质；(c)用含第二浓度盐的水溶液或缓冲液以200-1000cm/h的流速洗脱，得到乳铁蛋白。

尽管现有技术中，已经对于从牛乳或者从乳清蛋白液中分离或浓缩乳铁蛋白的技术进行了研究，但对于乳铁蛋白的深加工的处理方法，例如杀菌处理工艺等在工业生产上出于生产效率的考量，大多仍然局限于热杀菌方式。因此，对于乳铁蛋白生产中的处理方法，尤其是例如过滤或杀菌技术等的探讨仍然有进一步提升的空间。

引用文献：

引用文献1：CN104926936A

引用文献2：CN113105542A

引用文献3：CN106008704A

引用文献4：CN106008703B

引用文献5：CN113372437A。

发明内容

发明要解决的问题

如前所述，目前传统的对于乳铁蛋白浓缩或纯化物的进一步加工处理主要仍然依照普通蛋白产品的处理方法，典型地，例如可以使用热处理杀菌（例如巴氏杀菌），这通常被认为有利于蛋白制品的标准化生产。尽管已知的是，乳铁蛋白对于温度更为敏感，但通常本领域中仅仅寄希望于控制热处理温度和时间来进行应对。

对于引用文献2～引用文献5，通过不同的分离过程和分离条件以期望从乳源中高效的分离出高纯度的或者满足特定要求的乳铁蛋白制品。但对于分离或纯化的乳铁蛋白的杀菌过程并没有进行针对的讨论。

进一步，引用文献1公开的乳铁蛋白的制备方法，公开了在得到浓缩的乳铁蛋白产品之后，可以进一步的使用0.2微米的膜进行除菌处理。但在实际操作时，也发现存在如下问题：

i. 使用该膜进行杀菌处理的效率不高，在进行杀菌过程中容易发生膜的堵塞，导致设备进出口压强差过大导致杀菌过程实质上停止。因此经常需要清洗过滤杀菌设备以防止由于膜孔的堵塞造成的消毒失败；

ii. 对于膜过滤杀菌的效果的评估几乎没有可行的方法，例如，即使对于在使用过程中由于发生的意外的膜破裂而导致的杀菌失败没有很好的监控方法。尽管可以通过最终的产品的检测来评估产品中细菌水平，但即使出现了菌群异常，也可能难以认定是由于杀菌失效（膜破裂）还是由于其他问题或工艺所造成。

因此，基于上述的现有技术的问题，本发明首要的是提供一种针对乳铁蛋白深加工的方法，在一些具体的实施方案中，其可以为一种过滤或杀菌的方法，例如，可以为一种冷杀菌工艺，本发明的方法基于双层膜过滤技术，能够替代传统工业化制备过程采用的热杀菌技术，有效降低乳铁蛋白变性率，提高提取率至80%以上，最大限度保护原料中的乳铁蛋白的品质。

进一步，本发明也提供了一种针对上述双层膜过滤技术的在线连续双保压测试验证方案保证整个生产过程除菌膜的完整性。

此外，本发明也提供了一种用于进行上述乳铁蛋白处理工艺的设备。

用于解决问题的方案

通过本发明发明人长期的研究，发现通过如下的技术方案的实施，能够解决上述技术问题：

[1]. 一种乳铁蛋白的处理方法，其中，所述方法包括：

将含有乳铁蛋白的原料通过包括双层膜的过滤元件的过滤处理，以得到处理后的乳铁蛋白制品，

所述包括双层膜的过滤元件包括：

朝向所述含有乳铁蛋白原料的一侧的孔径为0.35～0.55μm的多孔膜A，以及，

朝向所述乳铁蛋白制品的一侧的孔径为0.22μm以下的多孔膜B。

[2]. 根据[1]所述的方法，其中，所述含有乳铁蛋白的原料源自于脱脂牛乳或乳清蛋白液。

[3]. 根据[1]或[2]所述的方法，其中，所述过滤处理的温度T为20℃～55℃。

[4]. 根据[1]～[3]任一项所述的方法，其中，在所述过滤处理中，设所述过滤元件的含有乳铁蛋白的原料一侧的压强为P1，且所述乳铁蛋白制品一侧的压强为P2，则所述过滤处理的压强差△P=P1-P2，进而，△P与所述过滤处理的温度T的关系为：

△P = 0.0002T² - 0.0646T + 6.1826

其中△P以巴为单位，温度T以℃为单位。

[5]. 根据[1]～[5]任一项所述的方法，其中，所述过滤元件的含有乳铁蛋白的原料一侧的压强为P1，且P1不超过2.5巴。

[6]. 一种用于执行根据[1]～[5]任一项方法的装置，其中所述装置包括：

箱体，其中包括所述过滤元件，所述过滤元件将所述箱体分隔为原料容纳部和处理物容纳部，并且所述原料容纳部和处理物容纳部仅通过所述过滤元件进行传质；

入口和出口，

其中所述含有乳铁蛋白的原料从入口进入所述原料容纳部，所述乳铁蛋白制品从与所述处理物容纳部相连的所述出口排出。

[7]. 根据[6]所述的装置，其中，所述箱体内的原料容纳部的体积V1与所述处理物容纳部的体积V2的比例为V1：V2=1～100:1

[8]. 根据[6]或[7]所述的装置，其中，所述装置的入口和出口具有压力检测元件。

[9]. 根据[6]～[8]任一项所述的装置，其中过滤元件中的双层膜为有机物膜或者无机物膜。

[10]. 一种根据[1]～[5]任一项所述的杀菌方法，其中，所述验证方法包括：

i. 将所述过滤元件中的多孔膜使用水全部润湿；

ii. 保持所述过滤元件的多孔膜A一侧气体压强恒定为P，在测试时间T内测定过滤元件的气体逃逸量VD₁；

将所述气体逃逸量VD₁与在相同条件的气体逃逸理论值VD₀进行比较。

[11] 一种根据[6]～[9]任一项所述的装置的有效性的验证方法，其中，所述验证方法包括：

i. 将所述过滤元件中的多孔膜使用水全部润湿；

ii.保持所述装置的原料容纳部气体压强恒定为P，在测试时间T内测定过滤元件的气体逃逸量VD₁；

将所述气体逃逸量VD₁与在相同条件的气体逃逸理论值VD₀进行比较。

[12]. 根据[10]或[11]所述的方法，其中，所述P为2.5巴，所述t为5min，所述VD₀=1.8H，其中VD₀的单位为mL/min，所述H为所述过滤元件中双层膜的垂直高度，其以cm为单位。

发明的效果

通过上述技术方案的实施，本发明能够得到如下的技术效果：

1）本发明提供一种针对乳铁蛋白的新的处理工艺，其可以为过滤或杀菌工艺，尤其可以为冷杀菌工艺，其能够替代传统工业化制备过程采用的热杀菌技术，有效降低乳铁蛋白变性率，提高提取率至80%以上，最大限度保护原料奶中的乳铁蛋白。

2）本发明与以往尝试的处理处理不同，采用孔径不同的双层复合除菌膜，增加一层大孔径除菌膜可以提供对小孔径除菌膜进行保护，通过进行的微生物过滤精度挑战试验及细菌截留测试，结果显示微生物去除效率>10¹²，LRV（log reduction value，过滤前后微生物载量对数下降值）为12，可以达到更好的除菌效果，终产品微生物各项指标均满足国标要求。同时双层复合孔径除菌膜相比于单一层孔径除菌膜，将更多的杂质及体积较大微生物进行先期拦截，除菌膜使用周期延长30%以上。

3）本专利还创新了一种乳铁蛋白处理工艺尤其是过滤或杀菌有效性验证方法，以保证其在使用过程中运行持续稳定、有效。作为整个制备工艺的关键质量控制点，如不能实时保证其有效性，将存在巨大的食品安全风险。

附图说明

图1：本发明一种具体的实施方案中所述杀菌装置的结构示意图

1：入口；2：出口；3：箱体；4：多孔膜A（孔径0.45μm）；5：多孔膜B（孔径0.20μm）

具体实施方式

以下，针对本发明的内容进行详细说明。以下所记载的技术特征的说明基于本发明的代表性的实施方案、具体例子而进行，但本发明不限定于这些实施方案、具体例子。需要说明的是，除非另有定义，则：

本说明书中，使用“数值A~数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。

本说明书中，使用“基本上”或“实质上”表示与理论模型或理论数据的标准偏差在5%、优选为3%、更优选为1%范围以内。

本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。

本说明书中，使用“常温”/“室温”指的是23±2℃的室内温度。

本说明书中，使用“纯水”表示表面张力小于或等于70 dynes/cm的水。

本说明书中，在使用过滤元件进行过滤处理时的“处理温度T”，应当理解为被处理的物料所达到的相应的温度。

本说明书中，使用“巴”以表示压强的单位，其中，1巴（bar)=100千帕（kPa) =0.1MPa。

本说明书中，使用“D”表示分子量的单位“Dalton”，即“道尔顿”。

本说明书中，“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。

本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素（例如，特征、结构、性质和/或特性）包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。

<第一方面>

本发明的第一方面中，主要提供了一种乳铁蛋白的处理方法，尤其是一种乳铁蛋白的过滤或杀菌方法，本发明通过双层复合多孔膜对含有乳铁蛋白的原料进行过滤处理。

具体而言，本发明所述的处理方法，尤其是过滤或杀菌方法包括：将含有乳铁蛋白的原料通过包括双层膜的过滤元件的过滤处理，以得到处理后的乳铁蛋白制品。

所述包括双层膜的过滤元件包括：朝向所述含有乳铁蛋白原料的一侧的孔径为0.35～0.55μm的多孔膜A，以及，朝向所述乳铁蛋白制品的一侧的孔径为0.22μm以下的多孔膜B。

（含有乳铁蛋白的原料的来源）

本发明中，对于所述含有乳铁蛋白的原料的原始来源，原则上没有特别的限定，其可以为脱脂处理的动物乳或者乳清蛋白液。

对于脱脂的动物乳，通常可以为部分脱脂或者全脱脂，在本发明一些具体的实施方案中，对于脱脂后的动物乳，其脂肪含量为动物乳的1 %（质量）以下，优选为0.8 %（质量）以下，更优选为0.5 %（质量）以下。

对于上述动物乳的种类，没有特别限制，可以为牛乳、羊乳、马乳、骆驼乳等中的一种或多种。在本发明一些优选的实施方案中，优选的动物乳为牛乳或羊乳，更优选地，为牛乳。

对于乳清蛋白液，在本发明一些具体的实施方案中，可以为乳清蛋白与水形成的待进一步或再次杀菌处理的乳清蛋白液，也可以为上述的动物乳去除酪蛋白后的蛋白液。对于从动物乳去除酪蛋白的方法，典型地可以为在适宜的温度下，将动物乳调整到酪蛋白的等电点附近，进而使得酪蛋白发生沉淀，去除沉淀部分，并得到乳清蛋白液。

在本发明一些优选的实施方案中，优选地以上述乳清蛋白液作为本发明的含有乳铁蛋白的原料。

（纯化/浓缩处理）

对于上述的含有乳铁蛋白的原料的原始来源，其中作为脱脂处理的动物乳中，含有大量的酪蛋白、乳清蛋白等成分，对于乳清蛋白液中也存在大量的乳清蛋白，因此，为了进一步得到富集了乳铁蛋白的成分，需要对上述含有乳铁蛋白的原料进行纯化或浓缩处理。

对于上述纯化或浓缩处理的方法，没有特别限制，典型地，可以利用层析法进行针对乳清蛋白的纯化或浓缩。

在一些具体的实施方案中，可以使用阳离子树脂作为层析的固定相。对于可以用的阳离子树脂，可以列举的包括丙烯酸（酯）型阳离子交换树脂、聚苯乙烯型阳离子交换树脂、琼脂糖型阳离子交换树脂。对于这些树脂，可以通过化学改性的方法赋予树脂表面具有阳离子基团，优选的，这些阳离子基团包括磺酸基团。

对于上述阳离子树脂的使用形态，在本发明一些具体的实施方案中，可以为填充而使用树脂颗粒聚集体。进一步，对于树脂颗粒的粒径，从有利于对乳铁蛋白的保留角度考虑，可以为100～500μm，优选为150～300μm，更优选为180～250μm。

在使用上述阳离子树脂进行层析时，可以预先使用缓冲溶液将阳离子树脂浸润，进而将含有乳铁蛋白的原料与阳离子树脂进行接触并保留一段时间。对于保留时间，没有特别限制，但通常从处理效率的角度考虑，可以为30min以下，优选为20min以下，例如1～20min，2～15min，3～10min等。

保留时间结束后，可以借助不含有离子的流动相将未吸附的成分洗脱。对于这样流动相，典型地可以为去离子水。

进一步，可以借助具有一定离子强度的洗脱液将吸附于阳离子树脂表面的包括乳铁蛋白的成分洗脱，得到洗脱组分。对于洗脱液，典型地，可以使用钠盐或者钾盐，例如氯化钠或者氯化钾等。对于洗脱液的离子浓度，可以为0.05～0.8mol/L，优选地，可以为0.1～0.5 mol/L。

使用上述洗脱组分将吸附于阳离子树脂的乳铁蛋白成分洗脱至洗脱组分中，以完成对乳铁蛋白的一次纯化或者浓缩。

进一步为了提高洗脱组分中乳铁蛋白的纯度，可以进行多次的重复过程，即，将洗脱组分再次与上述阳离子树脂接触，并使用合适离子浓度的洗脱液进行洗脱，得到再浓缩的乳铁蛋白组分。

在本发明的一些优选的实施方案中，可以进行两次以上的阳离子树脂吸附-洗脱液洗脱的过程，优选地，可以进行2～3次该重复过程。

另外，对于将乳铁蛋白与过氧化酶进行一步分离的方法，本发明没有特别限制，典型地可以使用中国专利申请（公开号CN113105542A）中所提供的纯化或者浓缩的方法。

进一步，上述的纯化或浓缩通常在5～55℃，优选在15～30℃的条件下，更优选在室温条件下进行，在一些极端的条件下，温度过高则可能不利于阳离子树脂的对乳铁蛋白的吸附以发生不期望的蛋白变性，温度过低则可能会导致纯化或浓缩操作时间加长。

对于通过阳离子树脂吸附-洗脱处理后得到的乳铁蛋白组分，可以进一步的通过脱盐处理以得到脱盐的乳铁蛋白组分。对于脱盐的处理方法，本发明没有特别的限制，典型地，可以使用超滤膜进行超滤处理。通常，超滤膜的截留分子量可以为25～50KD，以保证去除乳铁蛋白组分中的盐而不损失乳铁蛋白。

通过上述阳离子树脂吸附-洗脱-脱盐处理即得到本发明的待进行杀菌处理的含有乳铁蛋白的原料。该含有乳铁蛋白的原料在本发明一些具体的实施方案中，乳铁蛋白的纯度可以90%（质量）以上，优选为92%（质量）以上，进一步优选为95%（质量）以上。

（过滤或杀菌处理）

对于上述阳离子树脂吸附-洗脱-脱盐处理的乳铁蛋白得到的本发明的含有乳铁蛋白的原料，可以进一步使用本发明的过滤或杀菌方法进行处理。任选地，为了有效进行本发明的过滤或杀菌处理，也可以根据实际需要对上述含有乳铁蛋白的原料进行稀释或者浓缩处理，以使得所述乳铁蛋白的原料具有适宜的固含量以及粘度等流变学性质。在本发明一些具体的实施方案中，所述待杀菌处理的含有乳铁蛋白的原料的固含量为3%（质量）~15%（质量），优选地为5%（质量）~13%（质量），更优选地为7%（质量）~11%（质量）。

本发明的过滤或杀菌处理，主要使用膜过滤的方法进行。所述膜过滤，本发明指的是将所述含有乳铁蛋白的原料通过包括双层膜的过滤元件的过滤处理，以得到过滤或杀菌处理后的乳铁蛋白制品。

对于上述的过滤元件，主要包括双层膜以及任意选用的支持性、或者密封性辅助部件。对于双层膜，在本发明中包括多孔膜A以及多孔膜B。

对于多孔膜A，其可以具有0.35～0.55μm孔径，优选为0.38～0.52μm，进一步优选为0.40～0.50μm。对于多孔膜B，其可以具有0.22μm以下的孔径，优选为0.17～0.21μm，进一步优选为0.19～0.21μm。

其中，多孔膜A具有较大的孔径，可以预先拦截分子量更高的组分，以减少这些组分对于多孔膜B的阻塞，即增加一层大孔径除菌膜可以提供对小孔径除菌膜进行保护，从而有利于提高整个过滤或杀菌过程的过滤或杀菌效果和效率。

对于上述两个多孔膜，在本发明一些具体的实施方案中，以相互接触层叠的方式结合，并且对于每个多孔膜的厚度，没有特别限制，典型地可以为1.2~1.4μm。相互层叠的双层膜以多孔膜A朝向待过滤的含有乳铁蛋白的原料，而多孔膜B朝向过滤或杀菌处理后的乳铁蛋白制品的方式而设置。

另外，对于上述两个多孔膜的材质，没有特别限制，可以为有机树脂薄膜，也可以是无机物形成的薄膜，例如多孔的陶瓷膜等。

此外，对于任选的辅助性部件，可以列举的包括，起到支撑作用的支撑部件，以在过滤或杀菌处理时，提供对双层膜的足够的支撑性；起到固定作用的部件，以将双层膜层叠固定或者将双层膜固定于所述过滤元件中。

在进行本发明的过滤或杀菌处理的工艺时，使得含有乳铁蛋白的原料在一定的温度和压强的条件下通过所述过滤元件。具体而言：

可以设所述过滤元件的含有乳铁蛋白的原料一侧的压强为P1，且所述乳铁蛋白制品一侧的压强为P2，则所述过滤处理的压强差△P=P1-P2，进而，△P与所述过滤处理温度T的关系为：

△P = 0.0002T² - 0.0646T + 6.1826

其中△P以巴为单位，温度T以℃为单位。

在本发明一些具体的实施方案中，从保证安全过滤的角度考虑，P1的压强为不超过2.5巴，优选地，从保证安全过滤以及保证过滤效率两方面考虑，P1的压强可以为1.8～2.5巴，进一步优选为2.0～2.4巴，更优选为2.1～2.3巴。

对于处理温度T，在本发明一些具体的实施方案中可以为20℃～55℃,优选为30℃～55℃，或40℃～55℃，或45~55℃，更优选地为50~55℃，再优选地可以为50~53℃。因此，本发明的上述处理尤其适合低温/冷杀菌处理。

对于通过上述过滤或杀菌处理的含有乳铁蛋白的产品，可以直接根据需要制备蛋白制品，或者经过进一步的加工，例如通过干燥工艺（例如喷雾干燥、冷冻干燥）等方式得到最终的乳铁蛋白固体（粉末）制品。

<第二方面>

尽管对于执行上述<第一方面>中所描述的处理的装置本身没有特别的限定，只要该装置具有以上描述的功能的配置即可。但从可操作性良好的角度考虑，本发明进一步的提供了一种可以应用于上述杀菌处理的膜过滤或者杀菌装置。

具体而言，所述装置包括：

箱体，其中包括所述过滤元件，所述过滤元件将所述箱体分隔为原料容纳部和处理物容纳部，并且所述原料容纳部和处理物容纳部仅通过所述过滤元件进行传质；和

入口和出口，其中所述含有乳铁蛋白的原料从入口进入所述原料容纳部，所述乳铁蛋白制品从与所述处理物容纳部相连的所述出口排出。

对于箱体，其可以具有任选的耐压材质，可以列举的为金属材质、无机物材质、有机物材质或者复合材质。对于箱体的形状，从耐压的角度考虑，可以为圆柱体，优选地，圆柱体的顶部为圆形穹顶以进一步增加耐压性。对于箱体的体积，没有特别限制，在本发明一些具体的实施方案中，以圆柱体箱体为准，其内部直径可以为10cm~20cm，优选为14cm~18cm，更优选地为15cm~17cm，其内部高度（以顶部最高点计）可以为55cm~74cm，优选地为57cm~72cm，更优选地为60cm~70cm。

对于箱体，其外部具有设置有物料的入口部和出口部，并且，在本发明一些具体的实施方案中，所述入口部和出口部连接有压力检测元件，以提供对相应区域的压强检测。

进一步，箱体内部中，设置所述过滤元件，并且通过所述过滤元件将箱体内部分隔为物理上不相连接的两个容纳部：原料容纳部和处理物容纳部。并且，所述原料容纳部与所述物料的入口相连接，而所述处理物容纳部与所述物料的出口相连接。

对于过滤元件的形状，没有特别设置，但从耐压的角度考虑可以为圆柱体，优选地，圆柱体的顶部为圆形穹顶以进一步增加耐压性。

此外，在本发明一些具体的实施方案中，通过所述过滤元件形成的所述原料容纳部的体积大于或等于所述处理物容纳部的体积。在一些优选的实施方案中，所述箱体内的原料容纳部的体积V1与所述处理物容纳部的体积V2的比例为V1：V2=1～100:1，进一步优选为2～50:1，更优选为5～20:1。

另外，在本发明其他一些优选的实施方案中，对于本发明的上述装置，还可以具有加热、温度控制或者温度检测元件等其他任选的辅助元件。

<第三方面>

本发明的第三方面中，提供了一种用于检测本发明的处理方法，以及用于检测本发明的处理装置工作的有效性的验证方法。

通过该验证方法，可以在连续或者半连续的过滤或杀菌工艺中，提供对过滤或杀菌装置，尤其是对于其过滤元件是否存在失效的有效判断或检测。

具体而言，所述验证方法包括：

i. 将所述过滤元件中的多孔膜使用水全部润湿；

ii. 保持所述过滤元件的多孔膜A一侧或者保持所述装置的原料容纳部气体压强恒定为P，在测试时间T内测定过滤元件的气体逃逸量VD₁；

iii. 将所述气体逃逸量VD₁与在相同条件的气体逃逸理论值VD₀进行比较。

其中，在步骤i中，将纯水在压缩空气的作用下被由过滤或杀菌装置的入口送入到过滤或杀菌装置内部，所述压缩空气的压强可以为小于等于所述过滤或杀菌装置的工作时过滤元件含有乳铁蛋白的原料一侧的压强P1，优选地，压缩空气的压强可以为0.9倍到1倍的压强P1，更优选地，所述压缩空气的压强可以为P1。

进一步，在该压强下的压缩空气的辅助下，使得纯水冲洗过滤元件的双层膜，以使得该双层膜完全润湿（对孔膜B一面全部透过水）。对于冲洗的时间，没有特别限定，通常为5min以上，优选为5～10min，冲洗的水量，没有特别限制，与装置体积相关。

在步骤ii中，停止纯水的供给，仅通过所述入口向所述原料容纳部注入压缩空气，以使得原料容纳部（即多孔膜A一侧）的压强保持恒定。这样恒定的压强优选的与过滤或杀菌装置的工作时过滤元件含有乳铁蛋白的原料一侧的压强P1的最大值即2.5巴相等。

进一步，维持2.5巴的压强情况下，保持时间t为可以为5min。进而通过检测进入到所述处理物容纳部的气体的压强来计算t时间内过滤元件的气体逃逸量VD₁（mL/min）。

得到VD₁后，可以将其与过滤元件的气体逃逸量的理论值VD₀进行对比，如果VD₁大于VD₀，则表示过滤元件可能出现破损，反之，则表明过滤元件状态正常。

对于所述过滤元件的VD₀的测量方法，原则上本发明没有特别限制，在本发明一些具体的实施方案中，例如附图1所示的情况下，所述VD₀=1.8H，所述H为所述过滤元件中双层膜的垂直高度（与双层膜最高点计，其与过滤元件底部平面的垂直距离），其以cm为单位。

以所述验证方法结束后，可以在对杀菌装置加热，并在110～140℃、优选在120～135℃的温度下进行蒸汽灭菌。

通过本发明第三方面所提供的验证方法可以在连续或者半连续针对乳铁蛋白进行过滤或杀菌过程中加入该验证程序，以保证整个生产过程中膜的完整性、保证过滤或杀菌过程的有效性，尤其地，可以利用本发明的验证方法在线检测乳铁蛋白杀菌的有效性。

实施例

以下，将通过具体的实施例对本发明的技术方案进行说明。

以下实施例根据附图1所示的装置进行处理，其中该装置的箱体形状为圆柱体结构，并且在顶端具有具有圆形的穹顶。并且，过滤元件形状为圆柱体结构，并且在顶端具有具有圆形的穹顶。

实施例1：

1、测试开始时，使用2.5bar压缩空气将纯水（纯水≤70dynes/cm）由进口端顶入腔体内，冲洗时间t_冲=5min，冲洗体积V=150L，使除菌膜完全润湿；

2、除菌膜完全润湿后，打开出口端阀门，从进口端向腔体内打入压缩空气，当进口端压力P_进达到2.5bar时，关闭进口端阀门，进行保压测试5min，保压过程如进口端压力P_进低于2.5bar时，打开进口端阀门进行补气直至达到2.5bar。计算单位时间内气体逃逸量VD₁值，当VD₁≤VD₀时，第一步有效性验证通过，当VD₁＞VD₀时，有效性验证失败，除菌膜失效，验证活动终止；

单位时间内气体逃逸量VD₀与除菌膜高度对应关系如下：

H=10cm

VD₀ = 18 mL/min；

3、系统泄压结束后，使用121℃蒸汽灭菌30min，进口端P_进=2.3 bar，出口端P_出=2bar；

4、灭菌结束后，进入正常冷杀菌过程，物料温度T=20℃，进口端P_进=2.5bar，出口端P_出=0.5bar；

5、冷杀菌过程结束后，执行清洗程序对除菌膜进行清洗；

6、使用2.5bar压缩空气将纯水（纯水≤70dynes/cm）由进口端顶入腔体内，冲洗时间t_冲=5min，冲洗体积V=150L，使除菌膜完全润湿；

7、除菌膜完全润湿后，打开出口端阀门，从进口端向腔体内打入压缩空气，当进口端压力P_进达到2.5bar时，关闭进口端阀门，进行保压测试5min，保压过程如进口端压力P_进低于2.5bar时，打开进口端阀门进行补气直至达到2.5bar。计算单位时间内气体逃逸量VD₁值，当VD₁≤VD₀时，第一步有效性验证通过，当VD₁＞VD₀时，有效性验证失败，除菌膜失效，验证活动终止；

单位时间内气体逃逸量VD₀与除菌膜高度对应关系如下：

H=10cm

VD₀ = 18 mL/min。

实施例2：

1、测试开始时，使用2.5bar压缩空气将纯水（纯水≤70dynes/cm）由进口端顶入腔体内，冲洗时间t_冲=5min，冲洗体积V=200L，使除菌膜完全润湿；

2、除菌膜完全润湿后，打开出口端阀门，从进口端向腔体内打入压缩空气，当进口端压力P_进达到2.5bar时，关闭进口端阀门，进行保压测试5min，保压过程如进口端压力P_进低于2.5bar时，打开进口端阀门进行补气直至达到2.5bar。计算单位时间内气体逃逸量VD₁值，当VD₁≤VD₀时，第一步有效性验证通过，当VD＞VD₀时，有效性验证失败，除菌膜失效，验证活动终止；

单位时间内气体逃逸量VD₀与除菌膜高度对应关系如下：

H=20cm

VD₀ = 36 mL/min；

3、系统泄压结束后，使用121℃蒸汽灭菌30min，进口端P_进=2.1 bar，出口端P_出=1.9bar；

4、灭菌结束后，进入正常冷杀菌过程，物料温度T=55℃，进口端P_进=2.5bar，出口端P_出=0.5bar；

5、冷杀菌过程结束后，执行清洗程序对除菌膜进行清洗；

6、使用2.5bar压缩空气将纯水（纯水≤70dynes/cm）由进口端顶入腔体内，冲洗时间t_冲=5min，冲洗体积V=200L，使除菌膜完全润湿；

7、除菌膜完全润湿后，打开出口端阀门，从进口端向腔体内打入压缩空气，当进口端压力P_进达到2.5bar时，关闭进口端阀门，进行保压测试5min，保压过程如进口端压力P_进低于2.5bar时，打开进口端阀门进行补气直至达到2.5bar。计算单位时间内气体逃逸量VD₁值，当VD₁≤VD₀时，第一步有效性验证通过，当VD₁＞VD₀时，有效性验证失败，除菌膜失效，验证活动终止；

单位时间内气体逃逸量VD₀与除菌膜高度对应关系如下：

H=20cm

VD₀ = 36 mL/min。

实施例3：

1、测试开始时，使用2.5bar压缩空气将纯水（纯水≤70dynes/cm）由进口端顶入腔体内，冲洗时间t_冲=5min，冲洗体积V=150L，使除菌膜完全润湿；

2、除菌膜完全润湿后，打开出口端阀门，从进口端向腔体内打入压缩空气，当进口端压力P_进达到2.5bar时，关闭进口端阀门，进行保压测试5min，保压过程如进口端压力P_进低于2.5bar时，打开进口端阀门进行补气直至达到2.5bar。计算单位时间内气体逃逸量VD₁值，当VD₁≤VD₀时，第一步有效性验证通过，当VD＞VD₀时，有效性验证失败，除菌膜失效，验证活动终止；

单位时间内气体逃逸量VD₀与除菌膜高度对应关系如下：

H=30cm

VD₀ = 54mL/min；

3、系统泄压结束后，使用134℃蒸汽灭菌30min，进口端P_进=2.3 bar，出口端P_出=2bar；

4、灭菌结束后，进入正常冷杀菌过程，物料温度T=53℃，进口端P_进=2.5bar，出口端P_出=0.5bar；

5、冷杀菌过程结束后，执行清洗程序对除菌膜进行清洗；

6、使用2.5bar压缩空气将纯水（纯水≤70dynes/cm）由进口端顶入腔体内，冲洗时间t_冲=5min，冲洗体积V=150L，使除菌膜完全润湿；

7、除菌膜完全润湿后，打开出口端阀门，从进口端向腔体内打入压缩空气，当进口端压力P_进达到2.5bar时，关闭进口端阀门，进行保压测试5min，保压过程如进口端压力P_进低于2.5bar时，打开进口端阀门进行补气直至达到2.5bar。计算单位时间内气体逃逸量VD₁值，当VD₁≤VD₀时，第一步有效性验证通过，当VD₁＞VD₀时，有效性验证失败，除菌膜失效，验证活动终止；

单位时间内气体逃逸量VD₀与除菌膜高度对应关系如下：

H=30cm

VD₀ = 54mL/min。

实施例4：

1、测试开始时，使用2.5bar压缩空气将纯水（纯水≤70dynes/cm）由进口端顶入腔体内，冲洗时间t_冲=5min，冲洗体积V=150L，使除菌膜完全润湿；

2、除菌膜完全润湿后，打开出口端阀门，从进口端向腔体内打入压缩空气，当进口端压力P_进达到2.5bar时，关闭进口端阀门，进行保压测试5min，保压过程如进口端压力P_进低于2.5bar时，打开进口端阀门进行补气直至达到2.5bar。计算单位时间内气体逃逸量VD₁值，当VD₁≤VD₀时，第一步有效性验证通过，当VD＞VD₀时，有效性验证失败，除菌膜失效，验证活动终止；

单位时间内气体逃逸量VD₀与除菌膜高度对应关系如下：

H=40cm

VD₀ = 72mL/min；

3、系统泄压结束后，使用134℃蒸汽灭菌30min，进口端P_进=2.3 bar，出口端P_出=2bar；

4、灭菌结束后，进入正常冷杀菌过程，物料温度T=38℃，进口端P_进=2.5bar，出口端P_出=0.5bar；

5、冷杀菌过程结束后，执行清洗程序对除菌膜进行清洗；

6、使用2.5bar压缩空气将纯水（纯水≤70dynes/cm）由进口端顶入腔体内，冲洗时间t_冲=5min，冲洗体积V=150L，使除菌膜完全润湿；

7、除菌膜完全润湿后，打开出口端阀门，从进口端向腔体内打入压缩空气，当进口端压力P_进达到2.5bar时，关闭进口端阀门，进行保压测试5min，保压过程如进口端压力P_进低于2.5bar时，打开进口端阀门进行补气直至达到2.5bar。计算单位时间内气体逃逸量VD₁值，当VD₁≤VD₀时，第一步有效性验证通过，当VD₁＞VD₀时，有效性验证失败，除菌膜失效，验证活动终止；

单位时间内气体逃逸量VD₀与除菌膜高度对应关系如下：

H=40cm

VD₀ = 72mL/min。

对具体实施例1-4组正常产品、1组异常产品（破损除菌膜，膜穿孔）及未安装除菌膜进行冷杀菌工艺有效性验证（单位时间内气体逃逸量），同时按照GB1903.17-2016《食品营养强化剂乳铁蛋白》要求，对微生物结果进行检测复核，且具体数据如下：

表1

由上述结果可见，当除菌膜破损时，VD值可以立即反馈异常，产品微生物结果异常；当除菌膜正常时，VD值满足理论要求，且产品微生物指标满足国标要求，证明该乳铁蛋白冷杀菌工艺有效。

需要说明的是，尽管以具体实例介绍了本发明的技术方案，但本领域技术人员能够理解，本公开应不限于此。

以上已经描述了本公开的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本文中所用术语的选择，旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术的改进，或者使本技术领域的其它普通技术人员能理解本文披露的各实施例。

产业上的可利用性

本发明提供的乳铁蛋白的杀菌方法和装置以及有效性验证的方法可以在工业上应用。

Claims (9)

1.一种乳铁蛋白的处理方法的有效性的验证方法，其特征在于，

所述乳铁蛋白的处理方法包括：

将含有乳铁蛋白的原料通过包括双层膜的过滤元件的过滤处理，以得到处理后的乳铁蛋白制品，所述包括双层膜的过滤元件包括：朝向所述含有乳铁蛋白原料的一侧的孔径为0.35～0.55μm的多孔膜A，以及，朝向所述乳铁蛋白制品的一侧的孔径为0.22μm以下的多孔膜B，

所述验证方法包括：

i. 将所述过滤元件中的多孔膜使用水全部润湿；

ii. 保持所述过滤元件的多孔膜A一侧的气体压强恒定为P，在测试时间t内测定过滤元件的气体逃逸量VD₁；

将所述气体逃逸量VD₁与在相同条件的气体逃逸理论值VD₀进行比较，当VD₁≤VD₀时，有效性验证通过，当VD₁＞VD₀时，有效性验证失败，

所述P为2.5巴，所述t为5min，所述VD₀=1.8H，其中VD₀的单位为mL/min，所述H为所述过滤元件中双层膜的垂直高度，其以cm为单位。

2.根据权利要求1所述的验证方法，其特征在于，所述乳铁蛋白的处理方法中所述含有乳铁蛋白的原料源自于脱脂牛乳或乳清蛋白液。

3.根据权利要求1或2所述的验证方法，其特征在于，所述乳铁蛋白的处理方法中所述过滤处理的温度T为20℃～55℃。

4.根据权利要求1或2所述的验证方法，其特征在于，所述乳铁蛋白的处理方法中，在所述过滤处理中，设所述过滤元件的含有乳铁蛋白的原料一侧的压强为P1，且所述乳铁蛋白制品一侧的压强为P2，则所述过滤处理的压强差△P=P1-P2，进而，△P与所述过滤处理的温度T的关系为：

△P = 0.0002T² - 0.0646T + 6.1826

其中△P以巴为单位，温度T以℃为单位。

5.根据权利要求1或2所述的验证方法，其特征在于，所述乳铁蛋白的处理方法中，所述过滤元件的含有乳铁蛋白的原料一侧的压强为P1，且P1不超过2.5巴。

6.一种用于乳铁蛋白处理的装置的有效性的验证方法，其特征在于，

所述用于乳铁蛋白的处理的装置为用于以下乳铁蛋白的处理方法的装置，所述乳铁蛋白的处理方法包括：将含有乳铁蛋白的原料通过包括双层膜的过滤元件的过滤处理，以得到处理后的乳铁蛋白制品，所述包括双层膜的过滤元件包括：朝向所述含有乳铁蛋白原料的一侧的孔径为0.35～0.55μm的多孔膜A，以及，朝向所述乳铁蛋白制品的一侧的孔径为0.22μm以下的多孔膜B，所述含有乳铁蛋白的原料源自于脱脂牛乳或乳清蛋白液，所述过滤处理的温度T为20℃～55℃，

所述装置包括：

箱体，其中包括所述过滤元件，所述过滤元件将所述箱体分隔为原料容纳部和处理物容纳部，并且所述原料容纳部和处理物容纳部仅通过所述过滤元件进行传质；入口和出口，其中所述含有乳铁蛋白的原料从入口进入所述原料容纳部，所述乳铁蛋白制品从与所述处理物容纳部相连的所述出口排出，

所述验证方法包括：

i. 将所述过滤元件中的多孔膜使用水全部润湿；

ii.保持所述装置的原料容纳部气体压强恒定为P，在测试时间t内测定过滤元件的气体逃逸量VD₁；

将所述气体逃逸量VD₁与在相同条件的气体逃逸理论值VD₀进行比较，当VD₁≤VD₀时，有效性验证通过，当VD₁＞VD₀时，有效性验证失败，

所述P为2.5巴，所述t为5min，所述VD₀=1.8H，其中VD₀的单位为mL/min，所述H为所述过滤元件中双层膜的垂直高度，其以cm为单位。

7.根据权利要求6所述的验证方法，其特征在于，所述装置中所述箱体内的原料容纳部的体积V1与所述处理物容纳部的体积V2的比例为V1：V2=1～100:1。

8.根据权利要求6或7所述的验证方法，其特征在于，所述装置的入口和出口具有压力检测元件。

9.根据权利要求6或7所述的验证方法，其中过滤元件中的双层膜为有机物膜或者无机物膜。

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