CN115327132A - 一种用于评估下肢缺血患者病情严重度的生物标志物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种用于诊断Fontaine分级严重(III、IV级)的下肢缺血患者与非严重的下肢缺血患者的生物标志物及其用途。本研究通过采用含有56种凝集素的凝集素芯片检测下肢缺血患者中Fontaine分级严重(III、IV级)患者与非严重患者血清IgG与凝集素特异性结合的聚糖差异。结果显示，与非严重患者相比，Jacalin(AIA)凝集素结合聚糖的含量在Fontaine分级严重患者中是升高的。凝集素免疫印迹验证结果表明Jacalin凝集素结合聚糖的含量在Fontaine分级严重患者中依然是升高的。可见，Jacalin凝集素与IgG结合所形成的复合物可作为用于评估抗Fontaine分级严重与非严重下肢缺血患者的生物标志物。

Description

一种用于评估下肢缺血患者病情严重度的生物标志物及其 用途
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种用于诊断Fontaine分级严重(III、IV级)的下肢缺血患者与非严重的下肢缺血患者的生物标志物及其用途。
背景技术
下肢外周动脉疾病(Lower extremity peripheral artery disease， LEAD)又称下肢缺血，是一种由于动脉粥样硬化导致的下肢动脉管腔狭窄或阻塞，从而出现肢体血液供应不足症状和体征的疾病，可表现为间歇性跛行、肢体疼痛，严重者可发展为肢端溃疡、坏疽，最终致残、截肢。下肢缺血为外周动脉疾病(peripheral arterial disease，PAD) 的主要部分，中国人群60岁以上患病率约为15.3％。然而，PAD的知晓率、诊断率及治疗率很低。Fontaine分级是评价下肢缺血患者病情严重程度的常用方法：I期:轻微症状期；II期:间歇性跛行期；III期: 静息痛期；IV期:溃疡坏疽期；其中III、IV期患者定义为严重下肢缺血。然而，Fontaine分级依靠的临床症状与体征在患者中存在异质性，无法准确反映患者血管狭窄程度、外科治疗难度及预后。早期识别严重下肢缺血患者将有助于疾病的预防与提前干预。
在包括下肢缺血在内的动脉粥样硬化疾病中，炎症状态与血管重塑是重要的特点与发病机制。近年来，抗体与自身免疫反应在该过程中的作用受到日益关注。IgG是人体内含量最丰富的抗体。它参与多种体液免疫过程：抗原中和、补体激活和补体依赖性细胞毒(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒(ADCC)和超敏反应。多糖是由多达15 个单糖残基组成的复杂低聚糖，约占IgG重量的15％，是IgG不可分割的部分，它组成的变化会影响IgG的结构稳定性、构象和半衰期，以及它的效应器功能。事实上，如果多糖完全去除会导致IgG促炎活性和抗炎活性的丧失。已有越来越多的证据表明，IgG糖基化在自身免疫与炎症性疾病中发挥着重要的作用。拟通过高通量的糖基化分析技术——凝集素微阵列技术来探究Fontaine分级严重与非严重下肢缺血患者血清IgG聚糖差异，以期探讨糖基化两者在下肢缺血中的临床应用价值。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种用于用于诊断Fontaine分级严重(III、IV级)的下肢缺血患者与非严重的下肢缺血患者的生物标志物及其用途。
首先，本发明提供一种用于诊断Fontaine分级严重(III、IV级) 的下肢缺血患者与非严重的下肢缺血患者的生物标志物，其为Jacalin 凝集素与IgG结合所形成的复合物。
其中，所述的IgG含有半乳糖-乙酰半乳糖胺。
其次，本发明还提供所述生物标志物在用于制备诊断Fontaine分级的下肢缺血患者与非严重的下肢缺血患者的试剂中的用途。
具体地，所述诊断包括：测定待测的生物样品中Jacalin凝集素与IgG结合所形成的复合物；
与作为对照的Fontaine分级严重的下肢缺血患者的Jacalin凝集素与IgG结合所形成的复合物的水平进行比较，相对于所述对照数据，所述样品中Jacalin凝集素与IgG结合所形成的复合物的水平无显著性差异；并且与作为对照的Fontaine分级非严重的下肢缺血患者的 Jacalin凝集素与IgG结合所形成的复合物的水平进行比较，相对于所述对照数据，所述样品中Jacalin凝集素与IgG结合所形成的复合物的水平可检测地升高表明生物样品来自下肢缺血Fontaine分级严重的患者的可能性；或者
与作为对照的Fontaine分级严重的下肢缺血患者的Jacalin凝集素与IgG结合所形成的复合物的水平进行比较，相对于所述对照数据，所述样品中Jacalin凝集素与IgG结合所形成的复合物的水平显著性降低；并且与作为对照的Fontaine分级非严重的下肢缺血患者的 Jacalin凝集素与IgG结合所形成的复合物的水平进行比较，相对于所述对照数据，所述样品中Jacalin凝集素与IgG结合所形成的复合物的水平无显著差异，表明待测生物样品来自下肢缺血Fontaine分级非严重的患者的可能性。
其中，所述生物样品为血清样品。
优选的，Jacalin凝集素与IgG结合所形成的复合物的水平均通过以下步骤来测量，包括：
a.使来自患者的生物样品与Jacalin凝集素接触；
b.在生物样品中存在的IgG与Jacalin凝集素形成凝集素-聚糖复合物；
c.洗涤来除去任何未结合的IgG；
d.添加被标记的并且对来自生物样品的抗体为反应性的检测抗体；
e.洗涤来除去任何未结合的被标记的所述检测抗体；和
f.将所述检测抗体的标记物转化为可检测信号。
其中，所述的Jacalin凝集素沉积或固定在固相表面载体上，优选地，所述的固相表面载体是乳胶珠子、多孔平板或膜条、纳米管道、带二维码的薄片等的形式，优选地，所述检测抗体通过共价连接到酶、具有荧光化合物或金属的标记物、或具有化学发光化合物的标记物来标记。
本研究通过采用含有56种凝集素的凝集素芯片检测下肢缺血患者中Fontaine分级严重(III、IV级)患者与非严重患者血清IgG与凝集素特异性结合的聚糖差异。结果显示，与非严重患者相比，Jacalin 凝集素结合聚糖的含量在Fontaine分级严重患者中是显著升高的。由于Jacalin凝集素是特异性结合半乳糖-乙酰半乳糖胺(Galβ3GalNAc)，这表明Galβ3GalNAc水平在Fontaine分级严重的下肢缺血患者中的表达是增加的。为了证实这一结果的可靠性，本研究还采用凝集素免疫印迹验证结果。结果表明Jacalin凝集素结合聚糖的含量在Fontaine 分级严重患者中依然是增加的，与凝集素微芯片的结果相符合。
附图说明
图1 A为整张凝集素芯片；1B-1C为芯片微阵列56种凝集素的位置。
图2所示为凝集素芯片检测下肢缺血患者中Fontaine分级严重和非严重患者血清IgG与凝集素Jacalin特异性结合信噪比(*p<0.05)。
图3所示为凝集素Jacalin免疫印迹图示意。
图4所示为凝集素Jacalin免疫印迹荧光数值结果，Fontaine分级严重和非严重患者相比显著升高(p<0.05)。
图5所示为凝集素Jacalin凝集素芯片结果在区分Fontaine严重与非严重的下肢缺血患者中的ROC曲线分析。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1凝集素微阵列分析血清IgG糖基化
实验标本：本次研究下肢缺血患者：Fontaine分级严重(23例)， Fontaine分级非严重(30例)，见表1。其中下肢缺血患者的诊断均符合相应疾病的诊断标准。入组的人群均采集新鲜血液，并立即分离出血清，-80℃冻存备用。
表1凝集素芯片实验研究对象基本情况
Figure BDA0003789177160000041
Figure BDA0003789177160000051
采用含有56个凝集素的凝集素微阵列来检测实验标本中的糖基化状态。凝集素可特异性的结合糖蛋白末端的聚糖分子，形成复合物，通过不同的凝集素与聚糖的特异性结合来研究目的蛋白表面聚糖的种类与含量。凝集素微阵列因其高效的特点，现今已越来越广泛的应用到糖基化的研究。本研究采用的每张凝集素芯片上有14个凝集素微阵列，而凝集素微阵列包含了56种凝集素，每种凝集素一式三份固定到阵列中。然后，将稀释的血清标本加入到凝集素微阵列，与之反应，再加入Cy3标记的IgG抗体，可获得每个凝集素与IgG特异结合聚糖的信号值，信号值与结合亲和力以及结合强度相关，见图1。
将冻存的标本室温平衡后，将每个标本血清进行1:200稀释后加到微阵列中，4℃孵育过夜。然后,将Cy3标记的IgG抗体在避光环境下与微阵列中凝集素杂交1小时。对所有凝集素的荧光强度进行了独立分析。并将芯片图像转换为数字格式进行分析。利用各凝集素点的信噪比(点的前景值与背景值的差值)计算了各凝集素点的信噪比(S/N)。为了防止凝集素微阵列在阵列间的偏置,我们使用阵列之间的归一化来归一化S/N数据。根据以下规则,通过组间的数据分布来确定凝集素结合力的显著性差异:(1)组间比较>＝1.75或＝<0.571； (2)组间比较检验类型，若符合正态性，选择T检验，否则选择非参数检验，P值<0.05。
结果：S/N数据显示Fontaine分级严重与非严重患者血清IgG糖基化差异，见表2和表3。与非严重患者相比，Fontaine分级严重血清IgG与凝集素Jacalin的特异性结合增加(P<0.05)，见图2。
表2 Jacalin凝集素芯片结果
Figure BDA0003789177160000052
*p<0.05
表3Jacalin凝集素及相应聚糖结合特异性
Figure BDA0003789177160000061
结论：相对于非严重患者，下肢缺血患者中Fontaine分级严重者血清IgG与凝集素Jacalin的特异性结合显著升高，这表明半乳糖-乙酰氨基半乳糖水平在Fontaine分级严重的下肢缺血患者中的表达是显著增加的。
实施例2血清凝集素印记验证实验
实验标本和方法：为了进一步明确上述凝集素微阵列检测结论的可靠性，随机挑选采用凝集素微印迹对同批次的Fontaine严重与非严重患者(各9例)和进行了凝集素印迹验证。
血清标本1：100稀释后，加上样缓冲液混合，100℃煮沸10分钟后，在10％的预制胶中进行SDS-PAGE电泳，再将预制胶中蛋白电转移到PVDF膜中。将转印成功的PVDF膜进行封闭后，与cy3 标记的凝集素进行杂交，最后通过荧光呈像仪检测荧光信号。荧光信号的强度与凝集素结合的糖蛋白糖基的结合力呈正比。
结果：通过对随机挑选的患者标本(每组共9例)进行Jacalin 凝集素印迹的结果比较。血清IgG与Jacalin凝集素的免疫印迹图(图 3)，经过ImagJ软件条带灰度分析，与非严重患者相比，Fontaine严重患者血清IgG与Jacalin凝集素结合升高(P<0.05)(图4)。这表明，Fontaine严重的下肢缺血患者血清中Jacalin凝集素结合的聚糖——半乳糖-乙酰氨基半乳糖水平是异常的。ROC曲线分析显示，当选取cutoff值为1.174时，Jacalin在区分Fontaine严重与非严重的下肢缺血患者中AUC值为0.768.具有较好的诊断效能(图5)。
结论：凝集素印迹验证结果与凝集素芯片检测结果相符合，相对于下肢缺血患者中Fontaine分级非严重患者，严重下肢缺血患者的血清IgG高水平表达半乳糖-乙酰氨基半乳糖可作为两者之间的生物标志物。

Claims (9)

1.一种用于诊断Fontaine分级严重(III、IV级)的下肢缺血患者与非严重的下肢缺血患者的生物标志物，其为木菠萝凝集素Jacalin素与IgG结合所形成的复合物。
2.如权利要求1所述的生物标志物，其特征在于，所述IgG含有半乳糖-乙酰半乳糖胺。
3.权利要求1或2所述的生物标志物在用于制备诊断Fontaine分级严重的下肢缺血患者与非严重的下肢缺血患者的试剂中的用途。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述诊断包括：测定待测的生物样品中Jacalin凝集素与IgG结合所形成的复合物；
与作为对照的Fontaine分级严重的下肢缺血患者的Jacalin凝集素与IgG结合所形成的复合物的水平进行比较，相对于所述对照数据，所述样品中Jacalin凝集素与IgG结合所形成的复合物的水平无显著性差异；并且与作为对照的Fontaine分级非严重的下肢缺血患者的Jacalin凝集素与IgG结合所形成的复合物的水平进行比较，相对于所述对照数据，所述样品中Jacalin凝集素与IgG结合所形成的复合物的水平可检测地升高表明生物样品来自下肢缺血Fontaine分级严重的患者的可能性。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述生物样品为血清样品。
6.如权利要求4所述的用途，其特征在于，Jacalin凝集素与IgG结合所形成的复合物的水平均通过以下步骤来测量，包括：
a.使来自患者的生物样品与Jacalin凝集素接触；
b.在生物样品中存在的IgG与Jacalin凝集素形成凝集素-聚糖复合物；
c.洗涤来除去任何未结合的IgG；
d.添加被标记的并且对来自生物样品的抗体为反应性的检测抗体；
e.洗涤来除去任何未结合的被标记的所述检测抗体；和
f.将所述检测抗体的标记物转化为可检测信号。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的Jacalin凝集素沉积或固定在固相表面载体上。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的固相表面载体是乳胶珠子、多孔平板或膜条、纳米管道、带二维码的薄片等的形式。
9.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述检测抗体通过共价连接到酶、具有荧光化合物或金属的标记物、或具有化学发光化合物的标记物来标记。
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