CN115300604A - 公主海葵多肽及其应用 - Google Patents

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CN115300604A CN202210960485.3A CN202210960485A CN115300604A CN 115300604 A CN115300604 A CN 115300604A CN 202210960485 A CN202210960485 A CN 202210960485A CN 115300604 A CN115300604 A CN 115300604A
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罗佳琳
李明
郭琦琦
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Abstract

本发明提供公主海葵多肽及其应用。本发明以公主海葵为材料，通过加细胞裂解液裂解海葵细胞以提取公主海葵的总蛋白，再采用酶解法通过碱性蛋白酶酶解、离心等，得到小分子公主海葵多肽。本发明所制备公主海葵多肽具有抗应激活性、抗缺氧活性、抗氧化活性，可应用于制备抗缺氧剂、抗热应激剂和抗氧化剂中应用，尤其可应用于制备抗缺氧药物以及抗热应激药物，对公主海葵资源的产业化开发提供进一步的帮助。

Description

公主海葵多肽及其应用
技术领域
本发明涉及海葵技术领域，特别涉及公主海葵多肽及其应用。
背景技术
海葵(sea anemone)别名海菊花，没有骨骼，属于腔肠动物门(Coelenterata)珊瑚虫纲 (Anthozoa)海葵目(actiniaria)动物。全世界已有记录的海葵目1100余种，分属于50科约400 属。中国目前发现的海葵种类数量约占全球种类的十分之一，各海域均有分布，并且明显呈 现出“由热带向温带递减”的态势。我国常见的海葵有:朴素侧花海葵、日本美丽海葵、中华 近瘤海葵、中华仙影海葵等。绝大部分海葵的体型呈圆筒状，触手以辐射对称状在口周围形 成数轮，上面布满刺细胞，用于御敌和捕食。
海葵具有滋阴壮阳、收敛固涩、除湿杀虫等效用，以前民间中医主要用来治疗肛门脱垂、 体癣、蛲虫病和痔疮等疾病。早在古代我国已经把海葵用于某些疾病的治疗，在《中华本草》 和《中国药用动物志》都有相应的记载。二十世纪七十年代人们才开始对海葵的化学成分进 行研究，海葵中含有丰富的细胞毒性和神经毒性物质，以及溶细胞作用的蛋白多肽化合物。 另外随着对海葵的不断深入研究，还从海葵中分离得到了甘油酯、甾醇、生物碱、倍半萜、 嘧啶等多种小分子化合物。此外，海葵化学成分还具有杀虫、降压、强心、抗菌、镇痛等广 泛生理活性，非常具有研究价值。
近年来，海洋生物活性肽在医药领域的功效引起越来越广泛的关注，海洋生物中含有种 类丰富的蛋白资源，然而由于我们对海洋的不了解，这些资源尚未得到很好的开发。随着技 术的提高，海洋天然产物在医药领域的开发利用已经成为热点，海葵的化学成分有多种活性 因此具有极高的药用价值和极为广阔的应用前景。已知张均顺等对海葵的海葵多肽神经毒素 结构与功能进行研究；郑淑贞等从采集于南海的斯氏花群海葵分离得到两种可有效增强离体 动物心肌收缩力的多糖物质，结果表明两者具有明显的降血压活性，有很好的药用研究价值； 袁琳等用碱性蛋白酶从套膜海葵蛋白酶解得到小分子多肽并验证其具有显著杀虫活性。可见 对于海葵化学成分及生理活性的研究已经取得一定的成果，但进一步作用机制及小分子化学 物质活性方面的研究还应加大力度。海葵种类繁多，很多种类海葵研究欠缺。本发明旨在挖 掘药用价值高的海葵，进一步提高海葵的开发价值。
发明内容
鉴于此，本发明提出公主海葵多肽及其应用，制备公主海葵多肽，并发现其在抗应激、 抗缺氧、抗氧化方面具有良好活性。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供公主海葵多肽在制备抗缺氧剂、抗热应激剂和抗氧化剂中应用，尤其应用于 制备抗缺氧药物以及抗热应激药物。所述公主海葵多肽为小分子公主海葵多肽，是以公主海 葵为原料制得的分子量小于1000Da的多肽复合物。
进一步的，所述公主海葵多肽在制备抗缺氧药物中应用，所述公主海葵多肽的药物浓度 为4-16g/kg。
进一步的，所述公主海葵多肽在制备抗热应激药物中应用，所述公主海葵多肽的药物浓 度为0.5-2.0mg/ml。
本发明还提供公主海葵多肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)去脂：将公主海葵用纯水冲洗，破碎，取破碎后的海葵用异丙醇浸泡，每浸泡3.5-4.5h 更换异丙醇，浸泡5-6次，再用纯水洗净异丙醇，沥干水分，得到去脂后的公主海葵。
(2)公主海葵蛋白干粉的制备：取步骤(1)去脂后的公主海葵，加纯水，再加入混合后的RIPA裂解液和PMSF蛋白酶抑制剂，超声破碎8-12min，室温静置25-35min，在2-5℃、9000-11000r/min条件低温高速离心15-25min，弃去沉淀；将收集的上清液冷冻后破碎成碎冰，冷冻干燥，得到公主海葵蛋白干粉；
上述公主海葵与纯水、RIPA裂解液和PMSF蛋白酶抑制剂的比例为5g：40-60mL：400-600 μL：4-6μL；
(3)公主海葵蛋白酶解：取步骤(2)公主海葵蛋白干粉加纯水，料液质量体积比g/L为1：4-6，加入碱性蛋白酶，在pH 8-9、加酶量为3500-4500U/g、酶解温度55-65℃条件下 水浴酶解，酶解后灭活；然后10000-12000r/min离心，上清液过滤后收集，将上清液的pH 调节为6.5-7.5，获得酶解多肽，冷冻干燥，即得公主海葵多肽。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明所制备公主海葵多肽具有抗应激活性、抗缺氧活性、抗氧化活性，可应用于 制备抗缺氧剂、抗热应激剂和抗氧化剂中应用，尤其可应用于制备抗缺氧药物以及抗热应激 药物，对海葵资源的产业化开发提供进一步的帮助。
(2)本发明以公主海葵为原料，制得产品具有多重药物活性，利于进一步开发了海葵的 药用价值。
(3)本发明以公主海葵为材料，通过加细胞裂解液裂解海葵细胞以提取公主海葵的总蛋 白，再采用酶解法通过碱性蛋白酶酶解、离心等，得到小分子公主海葵多肽。
附图说明
图1公主海葵。
图2公主海葵蛋白的SDS－PAGE电泳图；注：M为低分子量蛋白Marker；泳道1、2、 3、4、5均为公主海葵裂解液水提蛋白；泳道6、7为酶解后公主海葵蛋白多肽。
图3未酶解海葵蛋白和酶解后海葵多肽对DPPH·自由基的清除率；注：对照组为未酶 解的公主海葵蛋白；与对照组比较*表示P<0.05存在统计学差异，***表示P<0.001存在极显 著统计学差异。
图4公主海葵酶解多肽对小鼠常压缺氧条件下存活时间的影响；注：阴性对照组为0.9％ 生理盐水；阳性对照组为3×10-4g/kg盐酸氟桂利嗪；与阴性对照组比较，**表示P＜0.01， 存在显著差异。
图5公主海葵酶解多肽对线虫热应激寿命的影响。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例
1材料与方法
1.1实验原料
公主海葵，采集于南海海域，用去离子水洗净，置于实验室-20℃冰箱冷冻保存备用。具 体形态见图1。
1.2主要试剂
实验所需药品及试剂均见表1
表1主要实验药品及试剂
Figure BDA0003792910760000041
1.3实验设备
实验所需设备均见表2
表2主要实验设备
Figure BDA0003792910760000042
1.4公主海葵总蛋白的提取
将公主海葵用纯水多次冲洗，再用破碎机将其破碎成小组织，取破碎后的公主海葵用异 丙醇浸泡，每次浸泡4小时，浸泡5-6次，最终以异丙醇浸泡液不变色为标准，再用纯水洗 净异丙醇，在通风橱沥干水分，存放于-20℃备用。
取5g去脂后的公主海葵，加50mL的纯水，再加入混合后的500μL RIPA裂解液和5μLPMSF蛋白酶抑制剂，超声破碎10min，可观察到几乎不存在大块组织，室温静置30min后， 用低温高速离心机在4℃条件下10000r/min，离心20min，弃去沉淀。将收集的上清液 冷冻后破碎成碎冰，利用冷冻干燥机冷冻干燥获得公主海葵蛋白干粉，存放于-20℃的冰箱备 用。
1.5公主海葵总蛋白和多肽的测定
根据BCA检测盒说明书先配制BCA工作液，再配制BSA标准品，再利用微孔板法按步骤将适当体积的待测样品加入到微孔板中与工作液混匀后37℃恒温反应30min，记录在562nm处得到吸光度数值并绘制标准曲线。
1.6公主海葵总蛋白及其多肽的SDS-PAGE分析
按照说明书配制胶板，取16μL样品水溶液与4μL 5×Loading Buffer缓冲液混合均匀， 取蛋白Marker 20μL于离心管，将所有离心管于100℃煮沸5min，室温下1000r/min离心5 min后用移液枪取10μL上清液紧靠在加样槽内，缓慢上样，电泳约3.5h后，用考马斯亮蓝 染色液在摇床上染8h以上。染色完全后用配制好的脱色液反复脱色，脱至底胶蓝色消失， 此时可观察到明显的海葵蛋白条带，用全自动凝胶成像仪观察并记录电泳结果。
1.7公主海葵总蛋白的酶解
取公主海葵蛋白干粉2g加纯水10mL，加入碱性蛋白酶，在pH8、加酶量为4000U/g、60℃的条件下水浴酶解。酶解完全后高温煮沸，以达到灭活目的。然后11000r/min离心10min， 进行多次离心，上清液用0.45μm的微孔滤膜过滤后收集，用pH调节剂将上清液的pH调节 为7，获得酶解多肽，即得公主海葵多肽，为分子量小于1000Da的多肽复合物。电泳分析酶 解效果，计算酶解得率。剩余产物冷冻干燥，置于-20℃冰箱保存备用。
Figure BDA0003792910760000051
1.8酶解多肽的自由基清除实验
用实验试剂盒中的粉剂A根据使用说明加入无水乙醇制备工作液，对照管为400μL样 本加600μL80％甲醇混匀，测定管为400μL样本加600μL工作液混匀，空白管为400μL80％甲醇加600μL工作液混匀。并在锡纸包裹的暗处反应30min后4000r/min离心5min， 再取适量上清液置于比色皿之中用于测量吸光度，用无水乙醇调零，设置波长为517nm，测 定在该波长下的各组吸光度值。分别记为A空白，A对照，A测定。根据公式求得样品的 清除率。
Figure BDA0003792910760000061
1.9酶解多肽的抗缺氧活性实验
实验选用体重为30±2g的健康雄性小白鼠共30只，将小鼠随机分为5组，即盐酸氟桂 利嗪阳性药物组(盐酸氟桂利嗪胶囊参考人的服用剂量溶解)、阴性对照组(等体积的0.9％ 生理盐水)以及海葵酶解多肽高、中、低剂量组(分别为16g/kg、8g/kg、4g/kg)，一天灌胃一次，共10天，期间可自由进食和饮水。第十天时在灌胃3h后，将小鼠放入250mL 的广口三角烧瓶中同时将瓶口用橡皮塞盖紧外加保鲜膜在瓶口处缠紧，以确保营造常压密闭的缺氧条件，观察自瓶口密闭到最终小鼠停止呼吸的时间并记录。
1.10酶解多肽对线虫抗应激能力改善实验
1.10.1大肠杆菌培养液的制备
取蛋白胨2g，NaCl 2.4g置于1000mL三角烧瓶，加入1M磷酸缓冲液(108.3gKH2PO4和35.6gK2HPO4溶于1000mL去离子水中，调pH＝6)20mL，加去离子水定容至800mL(初 培养基)，121℃高压灭菌15min，再依次加入5mg/mL用乙醇溶解的胆固醇溶液(不灭菌)、 高压灭菌的1MMgSO4(246.47gMgSO4·7H2O定容至1000mL)、1MCaCl(111gCaCl2定容 至1000mL)各0.8mL摇匀得到完全培养基。接入大肠杆菌，置于37℃恒温摇床培养。可暂 时保存于4℃冰箱，需要使用时提前将其置于37℃恒温摇床培养1天，即可再次使用。
1.10.2线虫生长培养基的制备
取蛋白胨2g，琼脂16g，NaCl 2.4g置于1000mL三角烧瓶，加入1M磷酸缓冲液(108.3gKH2PO4和35.6gK2HPO4溶于1000mL蒸馏水中，调pH＝6)20mL和12.5mg/L的5-氟尿嘧 啶(抑制线虫生殖)，加蒸馏水定容至800mL。121℃高压灭菌15min，再依次加入5mg/L 用乙醇溶解的胆固醇溶液(不灭菌)、1M CaCl2(已灭菌)和1M MgSO4(已灭菌)各0.8mL 摇匀得到完全培养基。将提前一天放置到37℃恒温摇床的大肠杆菌培养液涂布到固体培养基 上，放置到37℃恒温培养箱培养1天使固体培养基上长满大肠杆菌，以便后续使用。
1.10.3线虫的同期化
实验选用秀丽隐杆线虫，通过前期挑选含有大量产卵期雌雄同体线虫的培养基，用M9 缓冲液(3g KH2PO4、5g NaCl、6g Na2HPO4溶解于1L的超纯水中，高压灭菌后加入1mL的1mol/L MgSO4)多次吹洗培养基，使菌苔中附着的线虫和虫卵脱落，用灭菌的2.0mL离 心管收集含线虫的洗液，加1mL的M9缓冲液冲洗虫体，1000r/min离心1min后尽可能用 移液枪移除上清液，重复3次，再加入1mL细胞裂解液裂解线虫，在显微镜下观察，直至大 部分虫体裂解，用离心机6000r/min下离心1min，尽可能弃去上清液，加适量的M9缓冲液 多次冲洗虫体并离心，将洗涤后的虫卵转移至事先准备好的线虫生长培养基上，在20℃下培 养两天后基本发育到L4期幼虫，即完成线虫同期化。
1.10.4海葵多肽对线虫热应激寿命的影响
将经过同期处理后的线虫随机分为5组，每组设置3个平行，每板30只，分别为空白组(0mg/mL)及不同质量浓度的公主海葵酶解多肽(0.5、1.0、2.0、2.5mg/mL)的实验组。 完成同期化的线虫在20℃恒温下培养2天后，将各组线虫转移至37℃培养箱中培养，每0.5 h记录一次线虫存活数量和死亡数量(用细铂金丝轻触线虫没有生理反应，即认为是线虫死亡)，直至线虫全部死亡，根据线虫生存的时间绘制线虫热应激状态下的生存曲线。
2结果与讨论
2.1海葵总蛋白提取及含量测定
从SDS-PAGE电泳结果(图2)可以看出，采用裂解液法提取获得的公主海葵具有较为 丰富的低分子量的蛋白，分子量主要分布在25kDa～17kDa之间，也有少量分布在30kDa附 近。因此，本研究为后续酶解多肽制备提供了便利条件。经BCA测定结果表明，从100g的公主海葵干粉中提取获得公主海葵总蛋白量为0.98g，其浓度为1.82mg/mL。
2.2DPPH·自由基清除实验
因为生物体内的自由基极不稳定存在时间非常短暂，而DPPH·是较为稳定的自由基，于 是利用DPPH·来产生自由基对生物体内的自由基进行替代，用来评估抗氧化物对自由基清除 能力。根据图3可知，酶解后海葵多肽与酶解前相比，自由基清除率有明显提高(P<0.05)。 并且随着海葵多肽质量浓度的增加其自由基清除能力增强，具有较明显的剂量-效应关系。表 明海葵酶解多肽可发挥有较好的抗氧化活性。
2.3酶解多肽的抗缺氧实验
将小鼠放入到广口的三角烧瓶中，用橡胶塞将瓶口塞紧，确保营造密闭环境，可观察到 小鼠刚开始表现较为平静，几分钟后出现挣扎、逃逸的行为，该行为持续数分钟后小鼠开始 蜷缩身体，倒地抽搐，呼吸由急促到缓慢，直到最后呼吸停止，四肢灰白。具体实验数据见 表3，与阴性对照组相比阳性对照组和低、中、高剂量实验组的生存时间都有不同程度延长， 特别是阳性对照组和高剂量组的生存时间分别达到了35.05±4.57min、39.04±9.03min，与阴 性对照组相比生存时间分别延长23.38％(P<0.01)和37.42％(P<0.01)。根据图4观察发现在 我们选定的给药浓度中，海葵多肽各剂量组小鼠的存活时间随着海葵酶解多肽质量浓度的升 高而延长，具有显著的剂量-效应关系，表明海葵酶解多肽可在常压密闭的缺氧环境下延长小 鼠的存活时间，发挥抗缺氧活性。
表3公主海葵酶解多肽对常压密闭缺氧环境下小鼠存活时间的影响
Figure BDA0003792910760000081
注：阴性对照组为0.9％生理盐水；阳性对照组为3×10-4g/kg盐酸氟桂利嗪；与阴性对照组比较， **P<0.01存在显著统计学差异
2.4酶解多肽对线虫热应激寿命的影响
大量研究证实线虫寿命的延长与其抵抗应激能力的提高密切相关，抗应激能力的提高是 线虫寿命延长的合理解释之一，由表4公主海葵酶解多肽对线虫热应激寿命的影响可知，空 白组线虫的平均寿命为3.60±0.52h，最长存活时间为4.5h；在37℃的环境下，不同质量浓度 的海葵酶解多肽对线虫抵抗热应激能力的分析结果显示，在设定的4个剂量中，0.5mg/mL 组线虫的平均寿命达到了4.13±0.27h，与空白组相比延长了14.5％，最长存活时间更是达到 了6.5h。1mg/mL组线虫的平均寿命达到了3.87±0.24h，相比空白组平均存活时间延长了 7.4％，而2mg/mL组线虫的平均寿命相比空白组仅仅延长了3.0％，表明公主海葵酶解多肽在 一定浓度范围内可以增强线虫的热应激抵抗能力，然而酶解多肽的浓度超过该范围反而不能 增强线虫的热应激抵抗能力。如图5，浓度为0.5mg/mL组分的线虫的寿命曲线相比空白组 明显右移，可在一定程度上表明一定浓度范围的海葵多肽可增强线虫热应激能力。
表4公主海葵酶解多肽对线虫热应激寿命的影响
Figure BDA0003792910760000082
Figure BDA0003792910760000091
注：与空白组相比较，*表示P<0.05，存在统计学差异；
3结论
本实验采用加裂解液水提法提取获得较为丰富的低分子量公主海葵蛋白，再通过碱性蛋 白酶对海葵蛋白进行酶解得到酶解多肽，水解度可达到60.2％。
(一)本次DPPH·自由基清除实验中也发现酶解后的海葵多肽自由基清除能力比未酶解 好，并且随着酶解多肽浓度的增大，相应的清除率也增大，表现两者存在明显的剂量-效应关 系。
(二)小鼠抗缺氧实验证明，海葵酶解多肽能发挥一定的抗缺氧活性，使小鼠在常压缺 氧环境中存活时间显著延长。
(三)线虫可以在实验室的琼脂培养基上生活，生命周期短，易于观察和计数是优秀的模 式生物。学术界公认线虫用于在抗氧化和延缓衰老研究领域中具有不可替代的优势。利用秀 丽隐杆线虫进行抗应激实验证实公主海葵酶解多肽在一定的浓度范围内，可以延长线虫在热 应激条件下的存活时间，即可增强线虫的热应激抵抗能力。
本发明所制备公主海葵多肽具有抗应激活性、抗缺氧活性、抗氧化活性，可应用于制备 抗缺氧剂、抗热应激剂和抗氧化剂中应用，尤其可应用于制备抗缺氧药物以及抗热应激药物， 对海葵资源的产业化开发提供进一步的帮助。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原 则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.公主海葵多肽的应用，其特征在于，所述公主海葵多肽在制备抗缺氧剂和/或抗热应激剂和/或抗氧化剂中应用。
2.根据权利要求1所述的公主海葵多肽的应用，其特征在于，所述公主海葵多肽在制备抗缺氧药物和/或抗热应激药物中应用。
3.根据权利要求1所述的公主海葵多肽的应用，其特征在于，所述公主海葵多肽为以公主海葵为原料制得的分子量小于1000Da的多肽复合物。
4.根据权利要求1所述的公主海葵多肽的应用，其特征在于，所述公主海葵多肽在制备抗缺氧药物中应用，所述公主海葵多肽的药物浓度为4-16g/kg。
5.根据权利要求1所述的公主海葵多肽的应用，其特征在于，所述公主海葵多肽在制备抗热应激药物中应用，所述公主海葵多肽的药物浓度为0.5-2.0mg/ml。
6.根据权利要求1-5任一项所述的公主海葵多肽的应用，其特征在于，所述公主海葵多肽的制备方法包括以下步骤：取公主海葵蛋白干粉加水，加入碱性蛋白酶，水浴酶解，酶解后灭活；然后10000-12000r/min离心，上清液过滤后收集，将上清液的pH调节为6.5-7.5，获得酶解多肽，冷冻干燥，即得公主海葵多肽；
所述公主海葵蛋白干粉和水的料液质量体积比g/L为1：4-6；所述水浴酶解的条件为酶解pH 8-9、加酶量为3500-4500U/g、酶解温度55-65℃。
7.根据权利要求6所述的公主海葵多肽的应用，其特征在于，所述公主海葵蛋白干粉包括以下步骤制得：取去脂后的公主海葵，加水，再加入混合后的RIPA裂解液和PMSF蛋白酶抑制剂，超声破碎8-12min，室温静置，用低温高速离心15-25min，弃去沉淀；将收集的上清液冷冻后破碎成碎冰，冷冻干燥，得到公主海葵蛋白干粉。
8.根据权利要求7所述的公主海葵多肽的应用，其特征在于，所述公主海葵与水、RIPA裂解液和PMSF蛋白酶抑制剂的比例为5g：40-60mL：400-600μL：4-6μL；所述低温高速离心的离心温度为2-5℃，离心转速为9000-11000r/min；所述室温静置的时间为25-35min；所述去脂的具体操作为：将公主海葵用水冲洗，破碎，取破碎后的海葵用异丙醇浸泡，每浸泡3.5-4.5h更换异丙醇，浸泡5-6次，再用水洗净异丙醇，沥干水分，即得。
9.公主海葵多肽，其特征在于，所述公主海葵多肽的制备方法包括以下步骤：
(1)将公主海葵用纯水冲洗，破碎，取破碎后的海葵用异丙醇浸泡，每浸泡3.5-4.5h更换异丙醇，浸泡5-6次，再用纯水洗净异丙醇，沥干水分，得到去脂后的公主海葵；
(2)取步骤(1)去脂后的公主海葵，加纯水，再加入混合后的RIPA裂解液和PMSF蛋白酶抑制剂，超声破碎8-12min，室温静置25-35min，在2-5℃、9000-11000r/min条件低温高速离心15-25min，弃去沉淀；将收集的上清液冷冻后破碎成碎冰，冷冻干燥，得到公主海葵蛋白干粉；
上述公主海葵与纯水、RIPA裂解液和PMSF蛋白酶抑制剂的比例为5g：40-60mL：400-600μL：4-6μL；
(3)取步骤(2)公主海葵蛋白干粉加纯水，料液质量体积比g/L为1：4-6，加入碱性蛋白酶，在pH 8-9、加酶量为3500-4500U/g、酶解温度55-65℃条件下水浴酶解，酶解后灭活；然后10000-12000r/min离心，上清液过滤后收集，将上清液的pH调节为6.5-7.5，获得酶解多肽，冷冻干燥，即得公主海葵多肽。
10.权利要求8所述的公主海葵多肽在制备抗缺氧剂和/或抗热应激剂和/或抗氧化剂中应用。
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